CN104312194A - 一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料及其应用，所述的近红外荧光染料为NIR染料PC-002，该染料能够被犬肿瘤细胞自发吸收和累积，特异性聚集于肿瘤部位，而不是正常细胞，从而可用于肿瘤特异性靶分子成像。所述的近红外荧光染料，与肿瘤细胞NIR的特异性结合依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子完成。克服了肿瘤细胞的异质性，可依据肿瘤细胞缺氧和OATP高表达的特点设计具有共性的特异性靶分子结合物，通过观察NIR染料与其它肿瘤细胞的特异性结合从而将近红外活体成像技术应用于更多肿瘤的早期预警和快速诊断。
Description
技术领域
本发明属于近红外荧光染料技术领域，涉及一种七甲川菁染料，特别涉及一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料及其应用。
背景技术
近红外荧光染料(near infrared dye,NIR)是一类聚甲基菁染料的杂环化合物，它是由两端或中间的杂环、芳环与分子内部的多次甲基链组成的一个大π共轭体系，吸收及发射光谱均处于近红外区(700-1000nm)之间。其固有特征包括：自发荧光低，但与体内大分子结合后由于荧光团的聚集展示出强的荧光素；具有了良好的组织渗透性，吸收的近红外光在生物组织中的穿透深度较大，而激发的荧光受生物组织本底的影响较少，所以可检测到深层组织的荧光信号；无毒性和放射性；游离荧光染料清除快，这些特点恰好弥补了传统荧光技术的弱点。另外，利用NIR技术进行活体成像本身又具有诸多的优势，主要表现在：基团标记能力强，信号强度大，成像材料广，可实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像；通过成像设备能够从深层组织中检测到肿瘤。因此运用NIR染料进行肿瘤识别临床应用前景巨大，也是肿瘤诊断技术研究领域中的热点。
NIR染料来自染色体的青兰荧光染料，如五次甲基菁和七次甲基化菁染料，最具有代表的是吲哚菁绿(ICG)。该化合物是一种具有近红外特征吸收峰的三碳花菁染料，是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的可用于临床诊断的近红外荧光染料。分子量为775道尔顿，静脉注入体内后，迅速和蛋白质结合，随血循环迅速分布于全身血管内，高效率、选择地被肝细胞摄取，又从肝细胞以游离形式排泄到胆汁中，经胆道入肠，随粪便排出体外。用于诊断肝硬化、肝纤维化和胃肠道血管缺损等。ICG的吸收光在近红外线范围(800～840nm)，可穿透皮肤深层，深达真皮深层和皮下脂肪层，可用于深度烧伤的检测。近红外荧光检测技术在癌症诊断研究中可实现癌症原位、实时、靶向的无损监测。但ICG的稳定性较差，在极性溶剂中会迅速聚集并分解，且在光照环境下会加速分解。同时，ICG在水溶液中的不稳定性及在血浆中的快速清除率限制了它在荧光成像、目标组织定位方面的应用。
事实上利用荧光染料进行肿瘤的检测和诊断还面临一系列的问题，如常用的肿瘤呈像是用NIR与肿瘤特异性的靶向片断化学结合，形成特异性菁染料标记复合物，这些靶向片断包括代谢底物，寡核苷酸，生长因子和抗体等；还有一些膜表面分子，如膜受体、胞外基质、肿瘤特异性标志物等。但这些方法用于肿瘤成像均有其局限性，因为靶向片段只能检测到部分特异性肿瘤细胞，这些细胞具有明确的表面分子特性，仅是多样性肿瘤细胞中的少部分。而且化学结合可能会改变靶分子的特异性和亲合力。因此有必要发展简单且可直接用于非侵入性肿瘤成像的新型NIR染料。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料及其应用，这种染料能够被肿瘤细胞自发吸收和累积，特异性聚集于肿瘤部位，具有了肿瘤特异性靶分子和成像的双重功能，可用于临床肿瘤检测和诊断。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料，该近红外荧光染料的化学结构式为：
所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
所述的肿瘤诊断试剂是能够与肿瘤细胞特异性结合，并诱发荧光的肿瘤诊断试剂。
所述的肿瘤诊断试剂是靶向依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子的肿瘤细胞或肿瘤组织。
所述的肿瘤诊断试剂是显示肿瘤形成部位的诊断试剂。
所述的肿瘤诊断试剂是用于在活体成像仪中对肿瘤细胞或组织显示近红外荧光的肿瘤诊断试剂。
所述的肿瘤诊断试剂是被核素68Ga标记，用于PET/CT扫描显示肿瘤的影像的肿瘤诊断试剂。
所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料的制备方法，包括以下操作：
1)将化合物4的羧基活化之后，与Nα-t-BOC-赖氨酸结合，然后使用三氟乙酸除去t-BOC保护基，生成化合物5；
所述的化合物4的结构式为：
所述的化合物5的结构式为：
2)将化合物5的乙腈溶液与DOTA-SulfoNHS 6的BH3-水缓冲溶液混合，搅拌过夜；经分离纯化得到所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料。
所述的分离纯化是使用HPLC反相C-18柱分离提纯，检测波长276nm，流动相包括A相和B相，A＝水+0.1％TFA，流动相B＝乙腈+0.1％TFA，流速＝1ml/min，二元梯度洗脱，B相＝20-80％，洗脱时间为40min，目标物出峰时间25min，收取目标峰，得到所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料，为七次甲基化菁染料(Heptamethine cyanine dyes，七甲川菁染料)，自发荧光非常低，但一旦与生物分子结合后，由于化学修饰提高了分子团的稳定性，促发强的荧光形成。这种染料能够被肿瘤细胞自发吸收和累积，特异性聚集于肿瘤部位，而不是正常细胞，从而成为肿瘤特异性靶分子成像。该染料可与犬的乳腺癌细胞13a，5b和前列腺癌细胞ACE1特异性结合，而不是正常的犬肾组织细胞MDCK。并且当将人的前列腺癌新鲜肿瘤标本移植到裸鼠体内，当荷瘤裸鼠注射PC-002结合NIR成像可观察到这种染料能够被肿瘤组织特异性吸收，因此说明该染料具有成像和靶分子的双重功能。
本发明提供的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料，与肿瘤细胞NIR的特异性结合依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子完成，肿瘤细胞用HIF1α稳定剂处理后对NIR的吸收增加，HIF1α下游靶分子VEGF和Glut1表达增加，用OATP抑制剂处理后对NIR的吸收减弱而且HIF1α特异性shRNAs(shHIF1α)作用于肿瘤细胞，NIR染料的吸收减弱。由于以HIF1α为核心的缺氧是肿瘤细胞普遍发生的现象，缺氧和活化HIF1α/OATPs信号是大部分肿瘤细胞普遍存在的机制。肿瘤缺氧与其代谢、侵袭、新血管行程、转移、耐药和差的临床预后密切相关。所以本发明提供的PC-002染料为基础的近红外活体成像技术克服了肿瘤细胞的异质性，可依据肿瘤细胞缺氧和OATP高表达的特点设计具有共性的特异性靶分子结合物，通过观察NIR染料与其它肿瘤细胞的特异性结合从而将近红外活体成像技术应用于更多肿瘤的早期预警和快速诊断。
目前国内和国际上已开展的近红外肿瘤成像研究主要采取的方法是将NIR与肿瘤特异性的靶向片断化学结合，形成特异性菁染料标记复合物，这些靶向片断包括代谢底物，寡核苷酸，生长因子和抗体等；还有一些膜表面分子，如膜受体、胞外基质、肿瘤特异性标志物等。这些方法用于肿瘤成像具有较高的特异性，但均有其局限性，因为靶向片段只能检测到具有特异性标志的肿瘤细胞，这些细胞具有明确的表面分子特性，仅是多样性肿瘤细胞中的少部分。而本发明提供的PC-002染料为基础的近红外活体成像技术克服了肿瘤细胞的异质性，是具有广谱特异性的肿瘤标志，能够实现染料与更多肿瘤细胞特异性结合的目的；而且是可用于活体肿瘤成像的新型NIR染料。
附图说明
图1A为PC-002染料在各种犬自发性肿瘤组织中吸收后的成像结果图(箭头所指红色部位为肿瘤组织，未有箭头标注的白色为正常组织)；
图1B为HE染色和NIR荧光显微镜对犬不同肿瘤组织的病理诊断(HE染色为石蜡切片；NIR成像为冰冻切片)；
图1C为PC-002/68Ga对犬自发性睾丸肿瘤的PET成像结果，PET/CT扫描在PC-002/68Ga化合物注射1小时后成像(箭头所指部位为肿瘤组织)；
图2A为犬肿瘤细胞对NIR染料PC-002的特异性吸收结果图；
图2B为NIR染料PC-002在犬肿瘤细胞裸鼠移植模型中的特异性吸收结果图；
图2C为不同标记检测到的裸鼠移植模型中的犬肿瘤细胞信号的结果图；
图3A为HIF1α在犬肿瘤组织和正常组织中的差异表达；
图3B为OATP在犬肿瘤组织和正常组织中的差异表达；
图4A为犬的肿瘤细胞用HIF1α稳定剂、OATP抑制剂处理后的NIR吸收检测结果；
图4B为HIF1α稳定剂处理犬乳腺癌细胞13a后，HIF1α下游靶分子VEGF和Glut1表达增加p<0.05；
图4C为HIF1α稳定剂处理犬前列腺癌细胞ACE1后，HIF1α下游靶分子VEGF和Glut1表达增加p<0.05；
图4D为HIF1α特异性shRNAs(shHIF1α)作用于犬肿瘤细胞，HIF1α下游靶分子VEGF和Glut1表达减少p<0.05；
图4E HIF1α特异性shRNAs(shHIF1α)作用于犬乳腺癌细胞13a后，NIR染料的吸收减弱；
图5A为人的前列腺癌新鲜标本移植到裸鼠肾包膜后注射PC-002，在肿瘤部位检测到NIR荧光信号
图5B为免疫组织化学法检测HIF1α和OATP在肿瘤组织中高表达；
图6A为100倍剂量的PC-002染料注射后大鼠心、肝、脾、肺、肾大体观；
图6B为100倍剂量的PC-002染料注射大鼠后脏体的大鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色。
具体实施方式
本发明提供的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料PC-002，是一种不对称近红外化菁染料，具有肿瘤特异性靶分子和成像的双重功能，该染料可被肿瘤组织和细胞特异性吸收；通过非侵入性NIR成像，可观察到肿瘤组织特异性吸收NIR染料。该染料与犬肿瘤细胞的特异性结合依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子完成。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、近红外荧光染料PC-002的合成：
按照以下所示合成路线来进行NIR染料PC-002的合成：
近红外荧光染料PC-002是基于如化合物4所示的非对称花菁染料(其两侧的杂环中，一侧的亚甲基链被磺酸化修饰，另一侧的亚甲基链被羧基化修饰)；
化合物4所示的多次甲基花菁染料，可以使用2,3,3-三甲剂-1-(4-磺丁基)-3氢吲哚(化合物1)与维尔斯迈尔-哈克反应试剂(化合物2)和1-(5-羧基戊基)-2,3,3-三甲剂-3H-假吲哚溴化物(化合物3)通过系列缩合反应而生成。
PC-002的合成制备：首先，通过N-羟基琥珀酰亚胺活化化合物4的羧基，与Nα-t-BOC-赖氨酸结合，然后使用三氟乙酸除去t-BOC保护基，生成化合物5。
将含0.1摩尔化合物5的乙腈溶液与0.12摩尔的DOTA-SulfoNHS 6的BH3-水缓冲溶液(pH 8.55)混合，搅拌过夜。反应混合物使用制备型HPLC反相C-18柱子分离提纯，流动相A＝水+0.1％TFA(体积浓度)，流动相B＝乙腈+0.1％TFA(体积浓度)，λ＝276，流速＝1ml/min，二元梯度洗脱，B＝20-80％，40min，目标物出峰时间25min，收取目标峰，质谱分析。将HPLC收集液浓缩干燥获得蓝色粉状的PC-002。
所得PC-002的化学结构式为：
2、PC-002用于犬自发性肿瘤的诊断
四只自发性肿瘤犬均来自第四军医大学实验动物中心，分别诊断为乳腺癌，多脏器转移瘤(分别转移至肺、肝和十二直肠)，结肠癌和表皮肉瘤。手术前三天，肿瘤犬通过下肢静脉注射NIR染料PC-002，剂量为(1.5μmol/Kg)，手术后取出肿瘤组织，利用活体成像仪(IVIS Lumina XR成像系统)对部分组织进行NIR成像；部分肿瘤组织用10％福尔马林固定后，制备病理切片，H&E染色确认肿瘤诊断；同时取一部分组织做冰冻切片在NIR显微镜下观察。
NIR成像结果如图1A所示，HE染色及NIR显微镜观察结果如图1B所示，可以看到在NIR成像结果中可观察到肿瘤组织部位有强的NIR染料吸收(发红色荧光)，而正常组织几乎观察不到(无荧光发生)；切片HE染色和冰冻切片NIR确认了肿瘤组织的病理形态。
将2.6mCi标记有同位素68Ga的PC-002/68溶于1.5ml无水乙醇中，加入3.5ml水稀释，左前肢静脉注射患睾丸肿瘤的犬，实验过程中保持插入导尿管。1小时后通过PET/CT进行检测(同时进行H&E染色确认肿瘤诊断)，结果如图1C所示，可以看到在睾丸肿瘤组织部位发生了NIR染料的吸收和聚集，而正常组织未发生聚集，NIR染料聚集部位的HE染色确认为肿瘤组织。
进一步进行肿瘤组织和正常组织中SUVs的比对，在自发性睾丸肿瘤犬通过PET/CT扫描后获得肿瘤部位平均、最小和最大标准吸收值(SUV)，并进行肿瘤和正常组织标准吸收值的比率(T/M)，具体结果如表1所示，可以看到肿瘤组织中SUV比例显著增高，而肿瘤和正常组织标准吸收值的比率(T/M)至少在3倍以上。
表1.肿瘤组织和正常组织中SUVs的比对
3、PC-002与犬肿瘤细胞特异性结合
将两种犬乳腺癌细胞5b、13a和犬前列腺癌细胞ACE1、犬正常的肾细胞MDCK(阴性对照)人前列腺癌细胞PC-3(阳性对照)分别接种到24孔板中，培养液为含10％小牛血清的RPMI-1640，分别加入HIF1α稳定剂二甲氧乙二酰甘氨酸(dimethyloxaloylglycine，DMOG,1mM)或氯化钴(CoCl2，200μM)；OATP抑制剂利福平(rifampicin，RIF,25μM)或溴磺酚酞(bromosulfophtjalein，BSP,250μM)持续培养24h。然后在培养液中加入NIR染料PC-002，浓度为20μM，37℃培养30分钟后，用PBS洗去多余未结合的染料，再用10％福尔马林固定。细胞用PBS洗涤后加入4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸核苷酸染料(DAPI)染色，在荧光显微镜(Olympus 1×71；Olympus,Melville,NY)下进行观察。结果如图2A所示，其中DAPI均染色可以看到5b、13a、ACE1和PC34种肿瘤细胞和犬正常肾细胞(MDCK)，而NIR观察结果只有4种肿瘤细胞可以看到，犬正常的肾细胞未有荧光出现，而在两者图像合并之后，4种肿瘤细胞的DAPI与NIR相重合。结果表明犬肿瘤细胞对NIR染料PC-002能够特异性吸收，而正常细胞不吸收，两者的荧光信号差别可以明显观察到。
将两种犬肿瘤细胞5b和ACE1分别皮下接种裸鼠，细胞数量均为1×106/裸鼠，注射8天后肉眼可见肿瘤形成。将NIR染料PC-002腹腔注射荷瘤裸鼠，剂量为50nM/裸鼠，注射24h后通过活体成像仪可以检测到强的NIR荧光信号，而作为对照的接种正常犬肾细胞的裸鼠，注射NIR染料后，未能检测到NIR荧光信号，结果如图2B所示，结果表明犬肿瘤细胞对NIR染料PC-002能够特异性吸收。
将犬乳腺癌细胞13a和前列腺癌细胞ACE1同时标记荧光素酶和GFP，分别注射裸鼠皮下成瘤后(细胞数量1×106/裸鼠)，将NIR染料PC-002腹腔注射荷瘤裸鼠(剂量50nM/裸鼠)。注射24h后进行全身生物发光和NIR/GFP荧光成像，可以看到3中标记分别在相同部位检测到特异性荧光素酶信号、NIR信号和GFP信号(图2C所示)，证明肿瘤部位不仅能够特异性的吸收NIR染料PC-002，而且NIR信号具有可信赖的准确性。
4、犬肿瘤细胞与PC-002的特异性结合依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子完成
缺氧和活化HIF1α/OATPs信号是大部分肿瘤细胞普遍存在的机制，HIF1α和OATP在犬的乳腺癌、十二指肠肿瘤、肝癌、肺癌、结肠癌和皮下肉瘤中均高表达，HIF1α和OATP在犬正常的乳腺、十二指肠、肝、肺、结肠和皮肤中均表达较低(如图3A、图3B所示)。
将HIF1α的稳定剂DMOG(浓度为1mM)或CoCl2(浓度为200μM)与犬肿瘤细胞共培养24h后加入PC-002染料，荧光显微镜(Olympus 1×71；Olympus,Melville,NY)观察细胞对PC-002染料的吸收。
同时，提取细胞的总RNA，实时逆转录定量PCR(RT-PCR)测定HIF1α下游调控分子血管内皮生长因子(VEGF)和葡萄糖转运蛋白1(Glut1)转录水平的变化。并测定OATP家族相关分子OATP1B3,OATP2B1,OATP4A1和OATP5A1的表达。
如图4A所示，DMOG和CoCl2均能有效增加犬肿瘤细胞对NIR染料的吸收(与对照相比，荧光信号增强)，但是OATP抑制剂RIF和BSP可显著较减少肿瘤细胞对NIR染料的吸收(与对照相比，荧光信号减弱)。
进一步的发现，HIF1α下游调控分子VEGF和Glut1转录水平能够被DMOG或CoCl2有效提升，同时OATP2B1和OATP1B3基因的表达增加(如图4B所示为HIF1α稳定剂处理犬乳腺癌细胞13a后的检测结果，图4C所示为HIF1α稳定剂处理犬乳腺癌细胞ACE1后的检测结果，结果均显示下游分子表达增加p<0.05)。
为了确定HIF1α是否介导犬肿瘤细胞对PC-002染料的吸收。使用犬乳腺癌细胞系13a稳定转染HIF1α特异性短发夹RNA(shRNAs，序列为5’-CUUAUAUCCCAAUGGAUGAUG-3’)形成shHIF1α。该shRNAs能特异性抑制HIF1α表达，减弱犬肿瘤细胞在缺氧环境对PC-002染料的吸收(如图4E所示，在转染shRNAs之后荧光信号明显减弱)；同时Glut1转录减少，OATP1B3和OATP2B1基因的表达降低如(图4D所示,p<0.05)。
上述检测结果表明，犬肿瘤细胞对PC-002染料的吸收依赖HIF1α/OATP信号通路。
5、人前列腺癌新鲜手术标本裸鼠肾包膜移植模型对NIR染料的吸收
将新鲜的人的前列腺癌手术标本移植到裸鼠肾包膜，建立肿瘤移植模型。将PC-002染料通过腹腔注射裸鼠，剂量为50nM/鼠。48h后通过荧光活体成像仪可检测到在肿瘤移植部位有强的NIR荧光染料聚集(如图5A所示)。通过组织HE染色确认移植物中的肿瘤组织，免疫组织化学法检测到移植肿瘤组织中高的HIF1α和OATP表达(如图5B所示)。
结果表明，在进行肿瘤细胞的移植之后，NIR荧光染料PC-002能够被肿瘤组织吸收并可进行荧光显示；而且其依然与HIF1α和OATP表达相关。
综上所述，通过对诊断为患有肿瘤的犬，包括乳腺癌，结肠癌，表皮肉瘤和多器官转移瘤的NIR荧光成像，并结合部分肿瘤组织HE染色确认病理诊断对照。表明NIR荧光染料PC-002可被肿瘤组织特自发吸收和累积，特异性聚集于肿瘤部位，而不是正常细胞，从而成为肿瘤特异性靶分子成像。该染料可与犬的乳腺癌细胞13a，5b和前列腺癌细胞ACE1特异性结合，而不是正常的犬肾组织细胞MDCK。
并且当将人的前列腺癌新鲜肿瘤标本移植到裸鼠体内，当荷瘤裸鼠注射PC-002结合NIR成像可观察到这种染料能够被肿瘤组织特异性吸收，因此说明该染料具有成像和靶分子的双重功能。
犬肿瘤细胞实验结果表明，HIF1α和OATP在介导NIR染料吸收中起重要作用。肿瘤细胞对NIR染料的特异性吸收能够被OATP竞争性抑制物溴磺酚酞(bromosulfophthalein，BSP)明显减弱，而缺氧相关分子调控了肿瘤细胞对NIR染料的吸收。
由于以HIF1α为核心的缺氧是肿瘤细胞普遍发生的现象。肿瘤缺氧与其代谢、侵袭、新血管行程、转移、耐药和差的临床预后密切相关。所以在实验中发现HIF1α的稳定剂可通过活化其下游分子血管内皮生长因子(VEGF)和葡萄糖转运蛋白1(Glut1)，诱导OATP相关基因的表达，从而增加犬肿瘤细胞对NIR染料的吸收，相反，用HIF1α-特异性的短发夹RNA(shRNAs)作用于肿瘤细胞可以显著降低OATPs基因的转录水平，减少肿瘤细胞对NIR染料的吸收。犬肿瘤细胞与NIR染料的特异性结合依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子完成。
虽然只使用犬乳腺癌、结肠癌、肝癌、表皮肉瘤、肺癌、睾丸癌和十二指肠肿瘤模型，以及人体肿瘤标本裸鼠移植模型，但由于缺氧和活化HIF1α/OATPs信号是大部分肿瘤细胞普遍存在的机制，因此，以PC-002染料为基础的近红外活体成像技术克服了肿瘤细胞的异质性，可依据肿瘤细胞缺氧和OATP高表达的特点设计具有共性的特异性靶分子结合物，通过观察NIR染料与其它肿瘤细胞的特异性结合从而将近红外活体成像技术应用于更多肿瘤的早期预警和快速诊断。
6、PC-002化合物的安全性试验
12只6周龄的SD大鼠，体重为200±10g，腹腔注射PC-002染料50mM/只大鼠，四周后处死大鼠，肉眼观察大鼠心、肝、脾、肺和肾有无变化，10％福尔马林固定组织，切片做HE染色。结果如图6A、图6B所示，大鼠心、肝、脾、肺和肾有无明显变化，组织病理与正常对照大鼠无显著差别，该剂量约为小鼠成像检测使用剂量的100倍(小鼠体重为20g，小鼠实验剂量为50nmol/只)，证明该剂量的安全性。
结果表明，该染料对动物和细胞均没有毒性，用于临床肿瘤检测和诊断显示出良好的潜能。
Claims (9)
1.一种具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料，其特征在于，该近红外荧光染料的化学结构式为：
2.权利要求1所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断试剂是能够与肿瘤细胞特异性结合，并诱发荧光的肿瘤诊断试剂。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断试剂是靶向依赖缺氧和活化HIF1α/OATPs信号分子的肿瘤细胞或肿瘤组织。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断试剂是显示肿瘤形成部位的诊断试剂。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断试剂是用于在活体成像仪中对肿瘤细胞或组织显示近红外荧光的肿瘤诊断试剂。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤诊断试剂是被核素68Ga标记，用于PET/CT扫描显示肿瘤的影像的肿瘤诊断试剂。
8.权利要求1所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，包括以下操作：
1)将化合物4的羧基活化之后，与Nα-t-BOC-赖氨酸结合，然后使用三氟乙酸除去t-BOC保护基，生成化合物5；
所述的化合物4的结构式为：
所述的化合物5的结构式为：
2)将化合物5的乙腈溶液与DOTA-SulfoNHS 6的BH3-水缓冲溶液混合，搅拌过夜；经分离纯化得到所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料。
9.如权利要求8所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，所述的分离纯化是使用HPLC反相C-18柱分离提纯，检测波长276nm，流动相包括A相和B相，A＝水+0.1％TFA，流动相B＝乙腈+0.1％TFA，流速＝1ml/min，二元梯度洗脱，B相＝20-80％，洗脱时间为40min，目标物出峰时间25min，收取目标峰，得到所述的具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光染料。
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