CN110087649A - 用辛伐他汀和化疗药物与七甲川花菁染料偶联体提高肿瘤对激素拮抗剂和药物的敏感性 - Google Patents

用辛伐他汀和化疗药物与七甲川花菁染料偶联体提高肿瘤对激素拮抗剂和药物的敏感性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种染料‑药物偶联体，能够用于癌细胞以及/或者肿瘤的成像、定位和治疗。

Description

用辛伐他汀和化疗药物与七甲川花菁染料偶联体提高肿瘤对 激素拮抗剂和药物的敏感性
技术领域
本发明涉及一种染料-药物偶联体，能够用于癌细胞以及/或者肿瘤的成像、定位和治疗。
优先权
本申请还包括申请日为2016年10月21日、申请号为62/410960的美国临时专利申请中所述的各项权利要求，应该将该专利申请视为构成本专利申请书的有机组成部分。
背景技术
在本专利申请书中专门、独立引用的每份专利或者专利申请书都应该视为本专利申请书的有机组成部分。下文内容中包含有能够帮助理解本发明内容的信息。本申请书下文中提供的任何信息都不得视为属于现有技术、或者与本发明权利要求相关；本申请书专门、独立引用的每份专利或者专利申请书也不得视为属于先有技术。
当前缺乏对癌症和癌症转移瘤的有效治疗药物，尤其是具有耐药性的癌症。因此，亟需一种全新的癌症治疗药物和显像剂，以便能够观察患者体内的活体癌细胞和癌症组织。
辛伐他汀(SM)是一种他汀类药物，能够通过宿主的肝脏降低血清中的胆固醇水平，是一种很有潜力的心血管疾病预防药物。在本发明的研究过程中，我们发现辛伐他汀在与近红外(NIR)有机染料(例如七甲川花菁羰花青)结合形成偶联体之后，能够安全地递送到癌细胞中，通过一系列的有机阴离子转运肽(OATP)载体的转运，可以有效地定位癌细胞。我们还发现近红外-SM偶联体是一种很有潜力的癌症治疗药物。例如，在本发明研究过程中，我们将诸如化疗药物等治疗药物和诸如NIR有机染料等染料进行偶联，合成了多种独特的染料-治疗性基团偶联体(染料-THM偶联体)。我们发现，所有合成的染料-治疗性基团偶联体均具有独特的抗癌功效，同时还不会对宿主产生毒性。本发明所述的染料-治疗性基团偶联体、以及其各种具体实施方案有着非常广泛的应用领域，其中包括但不限于用作现有治疗药物的增强剂、直接用作肿瘤的定位剂、以及用作显示活体细胞以及/或者肿瘤的显影剂、用于治疗肿瘤及其转移瘤、用于治疗具有耐药性的肿瘤及其转移瘤、用作其他药物的增效剂、用于肿瘤细胞和组织的成像、在手术过程中用作辅助药物、以及用于肿瘤及其转移瘤的显影剂。
发明内容
下文中所述的具体实施方案和实例，以及其中介绍的具体成分和方法具有示例性和解释性，不会对本发明的范围造成任何影响或者限制。本专利申请涉及一种用于癌细胞以及/或者肿瘤成像、定位和治疗的染料-治疗性基团偶联体，具体如下文相关内容所述。
附图说明
下面将通过附图来结合说明本发明的示例性实施方案。需要说明的一点是，本申请书中提供的具体实施方案和附图具有示例性、但不具有任何限制性。
本申请书中提供的附图用于解释具体实施方案，但并没有对所有具体实施方案进行说明。也可以补充或者替换使用其他具体实施方案。为了减少篇幅、更有效地进行解释，具有显而易见性的、或者不必要的细节在本发明中将不进行说明。在部分具体实施方案中，可以增加额外的成分或者步骤，以及/或者去除掉其中的部分成分或步骤。附图中提供的数值仅供参考，不得以任何方式限制或者影响本发明的范围。
图1中显示了本发明的各种具体实施方案中，近红外-SM能够提高AA、EZ和DT的敏感性，在3DCTCs培养球状细胞中诱导产生细胞毒性，但辛伐他汀并没有上述效果。
图2中显示了本发明的各种具体实施方案中，辛伐他汀和近红外-SIM偶联体的化学结构。
图3中显示了本发明的各种具体实施方案中，3DCTC球状体细胞(A)、骨骼和肾脏转移瘤细胞(B)的形貌，以及PCCDX模型的免疫组织化学染色结果(C)，其中PSMA、AR和PSA为正染色。
图4中显示了本发明的各种具体实施方案中，两个具有代表性的体外扩增CTC球状体细胞，带有EMT表达、神经内分泌、干细胞特性和前列腺癌生物标记物。
图5中显示了本发明的各种具体实施方案中，表明近红外-SM会被PC3细胞(右上)、3DCTCs球状体细胞(底部)的2D细胞层吸收并保留；同时会被植入到小鼠皮下区域内的PC-3肿瘤保留(左上)。
图6中显示了本发明的各种具体实施方案中的NIR肿瘤成像结果，从中可以看到近红外-SM能够确定KPC小鼠(在腹膜内注射近红外-SM偶联体之后的三天后成像)体内PDAC肿瘤的位置。在成像时，PDAC肿瘤的尺寸约为1.1毫米(箭头处)。
图7中显示了本发明的各种具体实施方案中，将近红外-链接剂-SM与HMGR结合袋连接的概念设计。
图8中显示了本发明的各种具体实施方案中，向小鼠(每组九只)皮内注射LNRANKL /Luc/RFP细胞。之后，每隔两周进行一次成像，并通过离心涂片测定其CTC计数。值得注意的一点是，在第12周时，与正常饲料的小鼠(左侧)相比，饲料中胆固醇含量较高的小鼠(右侧)的生物荧光法测定的转移瘤数量较高、同时其CTC计数也相对更高。
图9中显示了本发明的各种具体实施方案中，雄性激素应答、胆固醇体内平衡、以及他汀类药物反应之间的相关关系。其中曲线图上的红色数字代表斯皮尔曼相关系数。在PC组中，所有上述三个特征都具有显著正相关关系(P<0.01)。
图10中显示了本发明的各种具体实施方案中，近红外七甲川花菁羰花青染料近红外-783的原型，从中可以看出在体外环境下，其对于肾脏(ACHN,o-786,SKRC,Caki-1)、乳房(MCF-7)、肺(H358)、肝脏(HepG2)、前列腺(PC3,LNCaP,C4-2B)、胰腺(MIAPaCaII)和胶质母细胞瘤(U87)等癌细胞并没有明显的细胞抑制效应。
图11中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-辛伐他汀和辛伐他汀对培养的前列腺、乳房、B细胞淋巴瘤、胰腺和胶质母细胞瘤癌细胞系的半数抑制浓度对比。
图12中显示了本发明的各种具体实施方案中，在体外环境下，2微摩尔每升的染料-辛伐他汀偶联体能够提高多西他赛对去势难治性前列腺癌细胞系C4-2B细胞的细胞抑制效应。
图13中显示了本发明的各种具体实施方案中，在体外环境下，2微摩尔每升的染料-辛伐他汀偶联体能够提高抗雄激素恩扎鲁胺(Enz)和醋酸阿比特龙(Abi)对去势难治性C4-2B细胞的细胞抑制效应。
图14中显示了本发明的各种具体实施方案中，将降胆固醇药物染料-辛伐他汀偶联体直接递送到癌细胞(拉莫斯细胞，B细胞淋巴瘤)、培养的3-D球形体细胞处之后，其效果比未偶联的辛伐他汀提高了将近五倍，同时能够将顺铂的细胞毒性提高约190倍。
图15中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-辛伐他汀偶联体比未偶联的辛伐他更加有效，能够大幅提高多西他赛抑制以3-D球形体细胞生长的前列腺癌CTC细胞生长的细胞毒性，且与浓度具有相关关系。
图16中显示了本发明的各种具体实施方案中，在抑制以3-D球形体细胞生长的胰腺癌和乳腺癌CTC细胞生长方面，染料-辛伐他汀偶联体比未偶联的辛伐他更加有效。
图17中显示了本发明的各种具体实施方案中，在强化醋酸阿比特龙和恩扎鲁胺诱导的抑制以3-D球形体细胞生长的前列腺癌CTC细胞生长的细胞毒性方面，染料-辛伐他汀偶联体比未偶联的辛伐他更加有效。
图18中显示了本发明的各种具体实施方案中，在抑制以3-D球形体细胞生长的前列腺癌CTC细胞生长的细胞毒性方面，染料-辛伐他汀偶联体比多西他赛和醋酸阿比特龙更加有效，使用caspase 3/7分析法进行分析。首先让前列腺癌细胞CTC 864暴露在多西他赛(1.25微摩尔每升)、醋酸阿比特龙(3.125微摩尔每升)、或者染料-辛伐他汀偶联体(4微摩尔每升)中，持续24小时。之后使用caspase 3/7分析法测定细胞凋亡率。与对照组、多西他赛组(*，p<0.01)和醋酸阿比特龙组(**，p<0.05)相比，染料-辛伐他汀偶联体组均具有更高的细胞凋亡率。
图19中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-辛伐他汀偶联体能够选择性地在前列腺癌PC3肿瘤异种移植体内累积，使用IVIS Lumina XR成像系统(a)检测。使用红外显微镜观察新鲜冷冻切片(b-DAPI,c-Cy7)和从患者体内获取的循环肿瘤细胞CTC 864(d-DAPI,e-Cy7,f融合)时，均发现了染料-辛伐他汀偶联体在PC3肿瘤细胞中累积的证据。
图20中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-吉西他滨酰胺偶联体与吉西他滨具有基本相同的半数抑制浓度。染料-顺铂酰胺偶联体能够显著降低半数抑制浓度，同时能够有效克服进行过测试的多种细胞系的顺铂耐药性。
图21中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-顺铂酯类偶联体对于肾脏癌(顶部)和B细胞淋巴瘤细胞系(底部)具有更强的抗癌疗效。肾脏癌细胞系ACHN、Caki-1、o-786、SKRC，以及永生化B细胞淋巴瘤细胞系纳马瓦、Raji、CA46、拉莫斯、Daudi都使用RPMI1640介质进行培养，在其中加入10％胎牛血清、1％链霉素，放置在37摄氏度、含有5％二氧化碳的潮湿环境中进行培养。使用96孔板进行培养，每个孔中装有5,000个肾脏癌细胞和10,000个淋巴瘤细胞，每个孔中加入100微升的介质，之后培养24小时。之后让细胞系在浓度在0.25微摩尔每升到64微摩尔每升范围内按指数增长的顺铂或者DZ-顺铂酯类中暴露72小时。之后，肾脏癌细胞使用3.7％的多聚甲醛固定15分钟，再使用结晶紫溶液(0.5％，溶剂在25％甲醇)染色30分钟。用水洗脱，待细胞层干燥之后，使用索伦森柠檬酸盐溶液洗脱，边摇晃边洗脱，持续20分钟时间。之后，在595纳米波长下测定提取的上清液的光吸收率。在培养4小时之后，使用MTT测定淋巴瘤细胞的生长率。加入100微升的异丙醇，之后在595纳米波长下测定提取的上清液的最大光吸收率。
图22中显示了本发明的各种具体实施方案中，在体外环境下，染料-顺铂偶联体能够诱导永生化B细胞淋巴瘤细胞系纳马瓦和肾脏癌细胞系Caki-1发生细胞凋亡，但只使用顺铂时并没有上述效果。纳马瓦细胞使用RPMI 1640介质进行培养，在其中加入10％胎牛血清、1％链霉素，放置在37摄氏度、含有5％二氧化碳的潮湿环境中进行培养。使用96孔板进行培养，每个孔中装有10,000-15,000个细胞，每个孔中加入100微升的介质，之后培养24小时。让细胞系在顺铂或者染料-顺铂偶联体中暴露24小时，之后加入100微升的Caspase-Glo3/7分析试剂并读取荧光强度。Caki-1使用RPMI 1640介质进行培养，在其中加入10％胎牛血清、1％链霉素，放置在37摄氏度、含有5％二氧化碳的潮湿环境中进行培养。使用96孔板进行培养，每个孔中装有5,000个细胞，每个孔中加入100微升的介质，之后培养24小时。让细胞系在顺铂或者染料-顺铂偶联体中暴露24小时，之后加入100微升的Caspase-Glo 3/7分析试剂并读取荧光强度。
图23中显示了本发明的各种具体实施方案中，在抑制免疫缺陷小鼠体内的肾脏癌细胞系(ACHN)异种移植体生长方面，在摩尔浓度相同的情况下，染料-顺铂偶联体比顺铂更加有效：通过皮下注射的方式向四周大的NCR-NU小鼠注射8x106Caki-1细胞。在肿瘤生长到50立方毫米之后，开始使用10毫克每千克的近红外-783染料、7毫克每千克的顺铂，或者等摩尔剂量的染料-顺铂偶联体进行治疗，每周皮内注射三次。之后每周测定两次肿瘤尺寸。肿瘤尺寸计算反应式为：(长度x宽度2)/2。
图24中显示了本发明的各种具体实施方案中，在同系小鼠模型中，在抑制免疫完整Balb/c小鼠体内的肾脏癌细胞系(Renca)生长方面，染料-顺铂偶联体比顺铂更加有效：通过皮下注射的方式向四周大的BALB/c小鼠注射500 000个Renca细胞。在肿瘤生长到约50立方毫米之后，开始使用10毫克每千克的近红外-783染料、7毫克每千克的顺铂，或者等摩尔剂量的染料-顺铂偶联体进行治疗，每周皮内注射三次。之后每周测定两次肿瘤尺寸。肿瘤尺寸计算反应式为：(长度x宽度2)/2。值得注意的一点是，在抑制小鼠体内Renca肿瘤生长方面，染料-顺铂偶联体比单独使用顺铂更加有效。
图25中显示了本发明的各种具体实施方案中，在抑制小鼠体内的B细胞淋巴瘤(纳马瓦细胞系)生长方面，染料-顺铂偶联体比顺铂更加有效：通过皮下注射的方式向四周大的NCR-NU小鼠注射107纳马瓦个细胞。在肿瘤生长到50立方毫米之后，开始使用10毫克每千克的近红外IR-783染料、7毫克每千克的顺铂，或者等摩尔剂量的染料-顺铂偶联体进行治疗，每周皮内注射三次。之后每周测定两次肿瘤尺寸。肿瘤尺寸计算反应式为：(长度x宽度2)/2。
图26中显示了本发明的各种具体实施方案中，在体外环境下，与未偶联的辛伐他汀和顺铂相比，染料-辛伐他汀和染料-顺铂偶联体对于卵巢肿瘤细胞OV90和OVCA433具有更强的细胞生长抑制效应。
图27中显示了本发明的各种具体实施方案中，使用苏木精和苏木素伊红对甲醛固定的肾脏切片进行染色，之后使用半定量量表来评估AKI相关的肾小管损伤(肾小管上皮细胞损失、坏死、肾小管上皮单纯化、肾小管间碎片、以及管型)。NIR染料-顺铂能够有效保证小鼠肾脏的完整性和正常形貌(右侧)；相反，在只使用顺铂进行治疗时会诱发小鼠肾脏损伤，具体参阅使用顺铂治疗的小鼠的组织病理学分析结果(左侧)。
图28中显示了本发明的各种具体实施方案中，将小鼠杀死之后，从NCR-NU小鼠体内提取B细胞淋巴瘤(纳马瓦细胞系)的皮下肿瘤异种移植体。之后使用近红外荧光(NIFR)显微镜和IVIS Lumina XR成像系统对肿瘤对的NIR染料-顺铂偶联体的吸收情况进行观察。观察结果表明，在异种移植体中观察到的NIR染料-顺铂偶联体吸收率比小鼠肾脏(p<0.0001)和肺部(p<0.0001)高出了7到15倍。
图29中显示了本发明的各种具体实施方案中，染料-青蒿素偶联体能够大幅强化青蒿素对对中类型肿瘤的生长抑制效果，具体表征方式为其3D培养循环肿瘤细胞的半数抑制浓度。其中包括CTC球形体肿瘤细胞(CTC752-S-1)、B细胞淋巴瘤(纳马瓦)、去势难治性前列腺癌细胞(C4-2B)、以及肾脏癌细胞(Caki-1)。
图30中显示了本发明的各种具体实施方案中，在体外环境下，NIR染料-青蒿素偶联体能够大幅强化不经胃肠道药物对CTC(C752-S-1)、B细胞淋巴瘤(纳马瓦)、前列腺癌细胞(C4-2B)、以及肾脏癌细胞(Caki-1)的细胞毒性，但NIR染料-嘌呤霉素和NIR染料-阿霉素偶联体并没有上述效果。
图31中显示了无痛前列腺癌细胞与侵入性前导细胞之间相互作用示意图，在相互作用过程中表达了三种分子标记物：角蛋白13(KRT13)、G蛋白偶联受体排序相关蛋白-1(GASP-1)、以及神经毒素2(NXN2)。其中LNCaP和CTC可以使用红色荧光蛋白(RFP)进行基因标记。在不受下列理论限制的情况下，可以认为侵入性前导细胞会将上述三种分子标记物转运给无痛前列腺癌细胞，进而对无痛前列腺癌细胞产生致肿瘤效果、或者提高其潜在转移性。
图32中显示了KRT13的表达情况，使用免疫组织幻化学法(IHC)在人前列腺癌组织的扩散前沿测定。
图33中显示了分子标记物KRT13、GASP-1和NXN2的表达情况，这些标记物与通过三个人血液样品(CTC-19、CTC-27和CTC-9)细胞培养获得的侵入性前列腺癌细胞相关。上述血液样品来自于具有EMT(上皮细胞间质转变)、NE(神经内分泌)、干细胞特性和前列腺标记物(A)表达的前列腺癌患者，在使用免疫组织幻化学法(IHC)进行染色后，发现KRT13、GASP-1和NXN2区域均为正染色，且以3-D球形体的形式生长，属于肿瘤异种移植体。
图34中显示了图31中所述的无痛前列腺癌细胞与侵入性前导细胞之间相互作用的实验确认结果。将具有侵入性的ARCaPBM1或ARCaPBM2细胞与无痛DC-1细胞同时培养，之后确定一系列编程基因、EMT、NE和干细胞标记物对无痛DC-1细胞的表达情况(与培养的DC-1单层细胞进行比较，A)。结果表明，DC-1细胞能够表达编程基因，导致细胞培养生长潜力增加(B)，在使用荧光素酶生物发光活性检测时在小鼠体内发现了转移瘤(C)。与上述观察结果一致的是，在编程后的DC-1细胞(D)中也观察到了与侵入性前列腺癌细胞相关的三种标记物基因(KRT13、GASP-1和NXN2)的表达。
图35中显示了使用GASP-1肽作为人前列腺癌患者伴随诊断标记物的情况。与对照组(平均为0.047纳克每毫升；两个星号表示其肿瘤尺寸极小、其血清中的GASP-1水平没有增加的患者)相比，前列腺癌患者体内的GASP-1肽的水平明显更高(平均为0.223纳克每毫升)。
图36中显示了从人前列腺癌患者体内选取并培养的循环肿瘤细胞(CTCs)在RANKL、KRT13、KRT4、EpCAM和AR表达方面的异质性，使用多元量子点法和半定量分析法测定。
图37中显示了针对GASP-1和NXN2的抗体对于对多西他赛具有耐药性的培养前列腺癌细胞均具有抑制生长的细胞毒性。
图38中显示了小鼠体内的人肺肿瘤的PET成像，使用DZ1-18FDG成像，同时使用不具有放射性的DZ1-19FDG进行证实。
本发明的详细说明
本发明引用的所有参考文献均具有完整性，就像完整地列出一样。除非另有定义，本发明中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属的技术中的一种普通技能所共同理解的相同的含义。《微生物学与分子生物学词典》，第3版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY2006)；《高级有机化学反应，机理与结构》第7版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)为本发明申请中使用的许多术语提供了专业人士可以参考的通用指南。
一个专业人士会认识到许多方法和材料与本发明描述的方法和材料相似或等效，这些方法和材料可以用于本发明的实践。本发明的其他特征和优点将通过以下详细描述和附图变得更为明显，附图通过实例说明本发明实施方案的各种特征。事实上，本发明并不限于所述的方法和材料。为了方便起见，本发明收集了规范、实例和附加的权利要求中使用的某些术语。
除非另有说明，或从上下文隐含，以下术语和短语包含以下含义。除非另有明确规定，或从上下文来看，下列术语和短语并不排除该术语或短语在其所属的专业领域中所获得的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施方案，并不打算限制所述发明，因为本发明的范围仅受所述权利要求的限制。除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属的技术中的一位普通专业人士所共同理解的含义相同。
在本发明中使用的术语“包含”是指化学组分、方法及其各自的成分，这些化学组分、方法和成分对实施方案有用，但可包含未指明的元素，无论有用与否。专业人士可以理解,通常来说,本发明中使用的词语一般是“开放”的(例如,词语“包括”应该解释为“包括但不限于,”词语“有”应理解为“至少有”，词语“包括”应理解为“包括但不限于,等等)。
除非另有说明，“a”、“an”和“the”等术语以及在描述发明申请的特定实施方案上下文中使用的类似引用(特别是在权利要求上下文中)均可解释为单数和复数。本发明所述的数值范围仅仅是作为一种速记法，对所属范围内的单个数值进行个别引用。除非在本发明中另有说明，否则每个单独的数值都包含到规范中，如同它们被单独引用一样。本发明描述的所有方法都可以按任何适当的顺序执行，除非本发明另有说明或上下文有明显的矛盾。对于本实施方案所提供的任何和所有实例或示例性语言(比如，“例如”)的使用，仅仅是为了更好地说明发明申请，并不对发明申请的范围构成限制。缩写词,“e.g”。源自拉丁语“exempli gratia”(例如)，在本发明中用来表示非限定的实例。因此，缩写为“e.g.”的含义是“例如”的同义词。规格说明书内的任何语言，均不应被解释为对发明申请的实践有至关重要作用的未声明部分。
本发明所述的的偶联体是指两个或两个以上的化合物结合而形成的化合物。本发明所述的非限制性偶联体包括染料-治疗性基团偶联体(染料-THM偶联体)、近红外-治疗性基团偶联体(近红外-染料-THM偶联体)、染料-药物偶联体、近红外-染料-药物偶联体、染料-化疗药物偶联体、近红外-染料-化疗药物偶联体、染料-治疗药物偶联体。本发明所述偶联体的非限制性实例包括染料-辛伐他汀偶联体、染料-吉西他滨酰胺偶联体、染料-顺铂偶联体、染料-顺铂酯类偶联体、染料-青蒿素偶联体、近红外-染料-辛伐他汀偶联体、近红外-染料-吉西他滨酰胺偶联体、近红外-染料-顺铂酰胺偶联体、近红外-染料-顺铂酯类偶联体、近红外-染料-顺铂偶联体、近红外-染料-青蒿素偶联体、近红外-染料-治疗药物偶联体。
THM指的是治疗性基团。非限制性的治疗性基团可以从任何治疗药物中选取，包括铂基药物、化疗药物、小分子、多肽、蛋白质、聚合物、小干扰RNA、微RNA、纳米颗粒、药物、生物活性分子、生物活性基团。从他汀类药物(如辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、皮他汀、普伐他汀、罗伐他汀)、顺铂、奥沙利铂、阿霉素、青蒿素和普霉素及其衍生物中可以选择非限制性的治疗药物。可以从辛伐他汀、奥沙利汀、阿霉素、青蒿素和普霉素及其衍生物中选取非限制性的治疗性基团。可以从辛伐他汀、奥沙利汀、阿霉素、双氢青蒿素和普霉素及其衍生物中选取非限制性的治疗性基团。
染料-治疗性基团偶联体的实例包括但不限于，
本发明使用的“烷基”、“烯基”和前缀“alk-”包括直链和支链基团以及环烷基和环烯基。除非另有规定，这些基团含有1至20个碳原子，烯烃基含有2至20个碳原子。首选基团总共有10个碳原子。环状基团可以是单环的，也可以是多环的，可以有3到10个环碳原子。典型循环基团包括环丙基、环戊基、环己基、环丙基甲基、强化剂和去冰片烯。这也适用于前缀为“烷基-”的基团，如烷基羧酸、烷基醇、烷基羧酸酯、烷基芳基等。合适的烷基羧酸基团有甲基羧酸、乙基羧酸等。合适的烷基醇的实例有甲醇、乙基醇、异丙醇、2-甲基丙醇-1-醇等。合适的烷基羧酸盐有甲基羧酸盐、乙基羧酸盐等。合适的烷基芳基有苄基、苯丙基等。
这些可以是直链或支链、饱和或不饱和脂肪烃，可选择性地与N、O或s插入。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。
本发明使用的“烯基”一词是指上文定义的烷基，其相邻碳原子之间至少有一个双键。烯基包括顺式异构体和反式异构体。代表性的直链支链烷烃有乙烯基、丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊基、2-戊基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
本发明使用的“烷基”一词是指任何烷基或烯烃，如上文所定义，相邻碳之间还含有至少一个三键。代表性的直链和支链烷基包括乙炔基、丙基、1-丁基、2-丁基、1-戊基、2-戊基、3-甲基-1丁基等。
“烷氧基”是指-OR基团，其中R为烷基或取代烷基，优选为C1-c20烷基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄氧基等)，优选为C1-C7。
“PEGyl”是指含有重复基团(–CH2-CH2-O-)n的聚乙烯链。n从2到20。PEG的远端与氨基、羧酸盐、磺酸盐、炔、巯基、羟基或任何其他官能团功能化，以增强亲水性或便于化合物的偶联。
“非干扰取代基”是指当存在于一个分子中时，通常与分子内的其他官能团无反应的基团。
“取代”一词，如在“取代烷基”中，指由一个或多个不干扰取代基取代的部分(如烷基)，比如但不限于:C3-C8环烷基，如环丙基、环丁基等；晕，如氟、氯、溴和碘；含氰基的；烷氧基；苯；取代苯基，等等。
本发明使用的“芳基”包括碳环芳香族环或环系。芳基是指芳香族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环体系。芳基的实例包括苯基、萘基、联苯、芴基和茚酮基。
取代芳基是具有一个或多个非干扰基团作为取代基的芳基。对于苯环上的取代基，取代基可以是任意方向的(正、偏或邻)。
“杂环”或“杂环类”是指由5-12个原子组成的一个或多个环，优选为5-7个原子，具有或不具有不饱和或芳香性，且至少有一个非碳的环原子。首选的杂原子包括硫、氧和氮。多环可以熔融，如喹啉或苯并呋喃。特别首选的杂循环基团是5-10个由1-3个杂原子组成的元环，它们分别从O、S和N中选取。
“取代杂环”是由非干扰取代基形成一个或多个侧链的杂环。
异芳基是由1～4个N、O或S原子组成的芳基或其组合，异芳基可在碳原子或氮原子处与C1-6烷基-CF选择性地取代3、苯基、苄基或噻吩基，或杂芳基中的碳原子与氧原子形成羰基，或杂芳基可选地与苯环熔融。
异芳基环也可以与一个或多个环状烃、杂环、芳基或异芳基环熔融。异芳基包括但不限于具有一个杂原子的5元杂芳基(如噻吩、吡咯、呋喃)；具有两个杂原子在1,2或1,3个位置的5元杂环(如恶唑、吡唑、咪唑、噻唑、嘌呤)；具有三个杂原子(如三唑、噻二唑)的5元杂环；具有3个杂原子的5元杂环；一个杂原子的六元异芳基(如吡啶、喹啉、异喹啉、苯甲酸、5,6-环庚烯吡啶)；具有两个杂原子的六元杂环(如吡啶、噌啉、酞嗪、吡嗪、嘧啶、喹唑啉)；含有三个杂原子(如1,3,5-三嗪)的六元芳基；以及带有四个杂原子的六元杂环。特别首选的杂芳基是5-10元环，其中1-3个杂原子选自O、S和N。
取代异芳基是指具有一个或多个非干扰基团作为取代基的异芳基。
“药物”、“生物活性分子”、“生物活性基团”、“活性物质”和“生物活性物质”的每一术语，在本发明中使用时，均指能够影响生物有机体的任何物理或生化特性的任何物质，包括但不限于病毒、细菌、植物、动物和人类。特别地，正如本发明所使用的，生物活性分子包括用于诊断、治疗、缓解、处理或预防人类或其他动物疾病的任何物质，或用于增强人类或动物的身体或精神健康。生物活性分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂类、核苷类、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。适用于本发明的生物活性药物包括但不限于:抗生素、杀菌剂、抗病毒药物、抗炎药物、抗肿瘤药物、心血管药物、抗焦虑药物、激素、生长因子、甾体类药物等。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包含在本发明化学组分中的赋形剂，且不会对患者产生显著的毒理学不良影响。
在本发明中交替使用的“药物有效量”、“生理有效量,”和“治疗有效量”是指本发明药物制备中的一种药剂和/或偶联体需要在血液中或在目标组织中达到期望的水平。精确的数量将取决于许多因素,例如,特定的活性剂,药物制剂的成分和物理特性,预期患者人群,病人考虑,可以很容易由一专业人士基于所提供的信息做出决定。
“前药”一词指的是一种化合物，它作为一种前体化合物，在给药后通过化学或生理过程(例如，在达到生理pH值或通过酶活性)在体内激活或释放该化合物的活性成分。Higuchi和Stella对前药的合成和使用进行国讨论，其论文是《作为新型传递系统的前药》，“ACS研讨会系列”第14卷，以及《药物设计中的生物可再生载体》，Edward B.Roche，美国制药协会，Pergamon出版社，1987。因此，“前药”一词是指可以通过某些化学或生理过程(如酶过程和代谢水解)转化为非活性形式的化合物，这种化合物可以在体内被某些共化合物或特定的环境条件(如pH等)激活。前药在提供给一个对象(如酯)时可能是无效的，但在体内可转化为活性化合物，例如，通过水解成游离羧酸或游离羟基。前药化合物通常具有溶解性、组织相容性或延迟释放的优点。
“活性代谢物”是本发明的化合物或其前药在给哺乳动物使用该化合物或前药时代谢所产生的生理活性化合物。
“多肽”或“多肽(氨基酸)”是指由一系列氨基酸残基组成的分子，通常至少有5-20个残基，通过沿着碳链的酰胺键(也称为肽键)连接。虽然在某些情况下，这些术语在本发明中可能是同义词，多肽是一种分子量通常高达10,000Da的肽，而分子量超过10,000Da的肽通常被称为蛋白质。肽侧链可能存在改性，伴随着糖基化、羟基化等。此外，其他非肽性分子，包括脂类和小药物分子，也可能附着在多肽上。多肽可以包括氨基酸残基的任何组合或序列。本发明的聚合物适用于共价结合在多肽和蛋白质上。
“氨基酸”是指同时含有碱性胺基和酸性羧基的有机酸。这个术语包括必需氨基酸和非必需氨基酸，以及天然产生和合成的或改性过的氨基酸。本发明列出了最常见的氨基酸，可以是它们的名称，也可以是三个字母或单个字母的缩写:甘氨酸(Gly,G),丙氨酸(Ala,A),缬氨酸(Val,V),亮氨酸(Leu,L),异亮氨酸(Ile,I),蛋氨酸(Met,M),脯氨酸(Pro,P),苯基丙氨酸(Phe,F),色氨酸(Trp,W),丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),天冬酰胺(Asn,N),谷氨酸盐(Gln,Q),酪氨酸(Tyr,Y),半胱氨酸(Cys,C),赖氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R),组氨酸(His,H),冬氨酸(Asp,D)和谷氨酸(Glu,E)。
“残基”是指分子与一个或多个分子反应后剩余的部分。例如，多肽链中的氨基酸残基是与相邻氨基酸残基形成肽键后剩余的氨基酸部分。
“吸电子基团”(EWG)是指通过降低环的亲核性来去除环上电子密度的官能团。这一类可以通过邻近于与更多电负原子有多个键的л系统的原子或形式电荷的存在来识别。这些基团的实例包括卤素、醛、酮、酯、羧酸、酸氯化物、腈、亚硝基和磺酸。
“供电子基团”或EDG是指通过使环更亲核而增加电子密度的官能团。这个类可以被邻近于л系统的原子上的孤对电子识别。这些基团的实例包括烷基、烯基、烷基、酰胺、醚、醇氧基、醇和胺。
“患者”一词是指患有或易于患有本发明的制剂或结合物(包括其各种实施方案)可以预防或治疗的活生物体，包括人类和动物。
“可选”意味着随后描述的情况可能发生，也可能不发生，因此描述包括发生的实例和不发生的实例。
在各种实施方案中，本发明的化合物是染料-治疗性基团偶联体。
本发明的染料-治疗性基团偶联体由下列反应式表示：
R1和R2可以从氢、烷基、芳基、芳基、烷基磺基、烷基羧基、烷基氨基、OH、NH2、CN、卤素、磺酸根基组成的基团，任何吸电子基团(EWG)和供电子基团(EDG)中独立选择，并可独立附着于3、3′、4、4′、5、5′、6、6′等芳香环上；
R3和R4可以从氢、烷基、芳基、芳烷基、烷基磺酸盐、烷基羧基、烷基氨基、ω-烷基胺基、ω-炔基、聚乙二醇、聚乙二醇羧酸盐、ω-聚乙二醇胺基、ω-酰-NH、ω-酰基赖氨酸、ω-酰基三唑、ω-聚乙二醇羧-NH-、ω-聚乙二醇羧基赖氨酸、ω-聚乙二醇羧基三唑和烷基羧-thm组成的基团中独立选择；
X可以从氢、卤素、CN、Me、NH2、OH、4-O-Ph-CH2CH2COOH和SH组成的基团中选取；
反负离子A可以从碘化物、溴、芳基磺胺、烷基磺胺、四氟硼酸盐、氯和任何药物可接受的阴离子组成的基团中选取；
THM是从铂类药物、化疗药物、小分子、多肽、蛋白质、聚合物、小干扰RNA、微RNA、纳米颗粒、药物、生物活性分子、生物活性分子、他汀类药物(如辛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、皮他汀、普伐他汀、罗伐他汀)、顺铂、奥沙利铂、多柔比星、青蒿素、双氢青蒿素、普伐他汀及其衍生物中选取的治疗性基团。
在一些实施方案中，从碘化物、溴、芳基磺胺、烷基磺胺、四氟硼酸盐和氯组成的基团中选取对负离子A。在一些实施方案中，A是氯化物。在一些实施方案中，A是溴化物。
在一些实施方案中，X可以从氢、卤素、CN、Me、NH2、OH、4-O-Ph-CH2CH2–COOH和SH中选取。一些实施方案中，X是氢。在一些实施方案中，X是F、Cl、Br或I。
在某些实施方案中，R1和R2都是一样的。在某些实施方案中，R1和R2是不同的。在某些实施方案中R1和R2都是从氢、SO3、F、Cl、Br、I和CN组成的基团中独立选取出来的。
在某些实施方案中，R1和R2连接成一个环。
在某些实施方案中，R3和R4都是一样的。在某些实施方案中，R3和R4是不同的。
在某些实施方案中，R3和R4是从下列分子式组成的基团中独立选取的：,
在某些实施方案中R3和R4是从下列分子式组成的基团中独立选取的：
其中R5是一种治疗性基团(THM)。
在某些实施方案中，R3或者R4至少有一个是从下列分子式组成的基团中独立选取的：
其中R5是一种治疗性基团(THM)。
在某些实施方案中，R3和R4是从下列分子式组成的基团中独立选取的：其中R5是从下列分子式选取的：
在某些实施方案中,R3或R4至少有一个是从下列分子式组成的基团中选取的：其中R5是从下列分子式选取的：
在某些实施方案中，R3和R4是从下列分子式中选取的：
其中R5是从下列分子式中选取的：
在一些实施方案中，染料-治疗性基团偶联体是从下列分子式组成的基团中选取的：
本发明的染料-治疗性基团偶联体可以是酯、酰胺、盐、溶剂或代谢物的形式。
任何一种已被普通专业人员所知晓的合成方法，都可以用来合成本发明的化合物(例如，染料-治疗性基团偶联体)。合成实例在本发明的实例部分中进行了说明。
本发明还提供本发明化合物的药学上可接受的盐。根据本发明的化合物的药学上可接受的盐的实例包括酸添加盐。本发明所述的适宜的酸添加盐包括有机酸和无机酸。优选盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、草酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸和异硫酸形成的盐。其他有用的酸添加盐包括丙酸、乙醇酸、草酸、苹果酸、苹果酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸等。医药上可接受的盐的特殊实例包括但不限于:硫酸盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸盐、偏磷酸盐、偏磷酸盐、偏磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、癸酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、亚磷酸盐、癸二酸盐、马来酸盐、丁炔-i、4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐，苯甲酸盐，氯苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，羟基苯甲酸盐，甲氧基苯甲酸酯，邻苯二甲酸酯，磺酸酯，二甲苯磺酸酯，苯乙酸酯，苯丙酸酯，苯基丁酸酯，柠檬酸酯，乳酸酯，γ-羟基丁酸酯，乙醇酸酯，酒石酸酯，甲磺酸酯，丙磺酸酯，萘-1-磺酸酯，萘-2-磺酸酯和扁桃酸酯。
酸添加盐可以通过适当的碱处理而转化为游离碱。可使用药学上可接受的无机或有机碱以类似方式制备可能存在于本发明化合物上的酸基团的碱性盐，如胺(初级,二级或三级),一种碱金属或碱土金属氢氧化物等。
适宜的盐的说明性实例包括但不限于：来自甘氨酸和精氨酸等氨基酸、氨,初级,二级和三级矿山的有机盐,循环胺如哌啶、吗啉和哌嗪和源自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
实例碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三乙胺等。
本发明化合物的酯类可以通过在该化合物的分子结构中可能存在的羟基和/或羧基功能化而制备。本发明化合物的酯和酰胺可以通过与羰基化剂(例如甲酸乙酯、乙酸酐、甲氧基乙酰氯)、苯甲酰氯、甲基异氰酸酯、氯甲酸乙酯、甲磺酰氯)和合适的碱(例如4-二甲基阿诺吡啶、吡啶、三乙胺、碳酸钾)在适宜的有机溶剂(例如四氢呋喃、丙酮、甲醇、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺)中，在0℃至60℃温度下反应制备。
药学上可接受的溶剂的实例包括但不限于根据本发明与水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸或乙醇胺结合的化合物。
对于染料-治疗性基团偶联体前体的固体制剂来说，应理解，本发明化合物可以不同形式存在，例如稳定的和可转移的结晶形式以及各向同性和非晶形形式，所有这些形式都包含在本发明的范围内。本发明还包括本文所述化合物的立体异构体(如适用)，可以单独存在或以任何比例混合。
立体异构体包括但不限于对映体、非对映体、外消旋混合物及其组合。这种立体异构体可以用传统的技术制备和分离，可以通过反应对映体原料，也可以通过分离本发明化合物的异构体。异构体可以包括几何异构体。几何异构体的实例包括但不限于，通过双键的顺式异构体或反式异构体。本发明的化合物中还考虑了其他异构体。这些异构体可以以纯形式使用，也可以与本发明所述化合物的其他异构体混合使用。
本发明所称异构体，是指分子式相同，结构分子式不同的化合物。异构体不一定具有相似的性质，除非它们也具有相同的官能团。异构体的种类很多，如立体异构体、对映体、几何异构体等。
名称“R”和“S”用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。名称可以显示为前缀或后缀；它们可以或不可以用连字符与异构体分开；它们可以或不可以连字；它们可以或不可以被括号括起来。
如发明所使用的术语“S异构体”是指根据Cahn-Ingold-Prelog优先权规则(CIP)基于原子序数的具有手性中心S的对映体，根据该体系，其取代基各自被赋予优先权。当原子序数的优先级在逆时针方向减少时，它是S对映体(来自拉丁语Sinestra，意思是“左”)。在不希望受局限于理论的情况下，如果中心被定向使得四个中的最低优先级指向远离观察者，则观察者将看到两种可能性：如果其余三个取代基的优先级在顺时针方向上减小，它标记为R(来自拉丁语Rectus，意为“右”)，如果它以逆时针方向减小，则为S(来自拉丁语Sinestra，意为“左”)。
包括染料-治疗性基团偶联体的药物化学组分。
本发明还提供用于兽医和人类医学用途的药物制剂或组合物，其包含本发明的化合物(或其酯，酰胺，盐，溶剂化物，代谢物或其衍生物)与一种或多种药学上可接受的载体。在与制剂的其他成分相容并且对其接受者不过度有害的意义上，载体必须是药学上可接受的。这种载体在本领域中是已知的。参见Wang等人(Wang 1980)通过引用整体并入本文。本发明的制剂可包括短期，快速起效，快速补偿，控制释放，持续释放，延迟释放，尤其取决于接受者的状况和所治疗的病症。
本发明的化合物和药物组合物可以通过合适的途径给药。合适的给药途径包括但不限于口服，腹膜内，皮下，肌肉内，透皮，直肠，舌下静脉内，口腔或吸入。在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，其适于使化合物或混合物通过口服，肠胃外，静脉内，皮内，肌肉内或皮下，直肠，通过吸入或通过口腔给药或透皮给药。在一些实施方案中，药物组合物可通过泌尿生殖途径施用以到达靶标，例如内部器官，局部损伤或器官，可通过滴注(例如膀胱，阴道通道)更有效和更有效地获得。
可以将活性成分与常规的药学上可接受的赋形剂混合或合成。本领域技术人员将理解，常规使用的给药方式，载体，赋形剂或载体，其对活性剂是惰性的，可用于制备和给予本发明的药物组合物。这些方法，载具，赋形剂和载体的例子在Remington的《药物科学》，第18版(1990)中进行了介绍，公开内容在此引用作为参考。用于受试者的本发明制剂包含药剂，以及一种或多种可接受的赋形剂和任选的其它治疗剂。赋形剂在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。
药物制剂可以方便地以单位剂型获得，这样的制剂可以通过制药领域中通常已知的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括(通过各种方法)将活性剂(例如本发明的化合物(或其药学上可接受的酯，酰胺，盐或溶剂化物)与合适的载体或其他佐剂组合，它可以由一种或多种成分组成。然后对活性成分与一种或多种佐剂的组合进行物理处理，以便以合适的形式提供制剂用于递送(例如，形成水性悬浮液)。
由于肠胃外剂型的施用通常绕过患者对污染物的天然防御，因此肠胃外剂型可以是无菌的或能够在给予患者之前进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于用于注射的溶液，用于溶解或悬浮在药学上可接受的注射用载体中的干燥产品，用于注射的悬浮液和乳液。此外，可制备受控释放的肠胃外剂型供患者服用，包括但不限于给予型剂型和剂量倾卸。
用于本发明制剂的佐剂或辅助成分可包括本领域通常认为可接受的任何药物成分，例如混合物，缓冲剂，溶解度增强剂等。
可用于提供本发明化合物的肠胃外剂型的合适载体包括但不限于：无菌水；注射用水USP；生理盐水；葡萄糖溶液；含水载体，包括但不限于氯化钠注射液，林格氏注射液，右旋糖注射液，右旋糖和氯化钠注射液，以及乳酸林格氏注射液；可与水混溶的载体包括但不限于乙醇，聚乙二醇和丙二醇；非水性载体，包括但不限于玉米油，棉籽油，花生油，芝麻油，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。改变或改性本发明公开的化合物中药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以掺入到肠胃外剂型中，包括常规和受控释放胃肠外剂型。
用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以进一步含有另外的试剂，例如抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质，这些试剂可以使制剂与预期接受者的血液保持等渗。制剂可包括含水和非含水的无菌悬浮液，其含有悬浮剂和增稠剂。
可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液，悬浮液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是水，林格氏溶液，U.S.P和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸也用于制备注射剂。
可注射制剂可以灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长药物的作用，通常需要减缓皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用液体悬浮液或水溶性差的结晶或无定形材料来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性载体中来实现胃肠外给药的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊基质来制备长效注射制剂。取决于药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括(聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效注射制剂。
用于直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂，其可以通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体如可可脂，聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体内为液体，因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。
适于口服或舌下给药的形式包括通过本领域公认的方法制备的片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂，口香糖等。在这种治疗上有用的组合物或制剂中活性化合物的量使得可以获得合适的剂量。糖浆制剂通常由化合物或盐在液体载体(例如乙醇，甘油或水)中的悬浮液或溶液与调味剂或着色剂组成。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊，片剂，丸剂，粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙进行混合，和/或与下列载体混合：a)填充剂或增量剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基壳聚糖，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂如甘油，d)崩解剂如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂如石蜡，f)吸收促进剂如季铵化合物，g)润湿剂如鲸蜡醇和甘油单酯，h)吸收剂如高岭土和膨润土，和i)润滑剂如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基硫酸钠及其混合物。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可用作软、硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂，糖衣丸，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其它包衣。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某一部分或优选地以延迟的方式在肠道的某一部分释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
活性化合物也可以是具有一种或多种上述赋形剂的微囊形式。片剂，糖衣丸，胶囊，丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣，释放控制包衣和药物配制领域熟知的其它包衣。在这种固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖，乳糖和淀粉混合。如在通常的实践中，这些剂型还可以包含除惰性稀释剂之外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某一部分或优选地以延迟的方式在肠道的某一部分释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
在一些实施方案中，如本文所述的本发明化合物可通过控释或延迟释放方式施用。控释药物产品的共同目标是改善药物治疗，而不是通过非控释药物治疗。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征在于在最短的时间内使用最少的药物来治愈或控制病症。控释制剂的优点包括：1)药物的延长活性；2)减少剂量频率；3)提高患者依从性；4)使用较少的总药物；5)减少局部或全身副作用；6)药物积累最小化；7)血液水平波动减少；8)治疗效果的改善；9)减少药物活动的增强或丧失；10)改善疾病或病症的控制速度。Kim，Cherng-ju，《控制释放剂型设计》，2(宾夕法尼亚州兰开斯特技术出版社：2000)。
常规剂型通常提供从制剂中快速或立即释放药物。取决于药物的药理学和药代动力学，使用常规剂型可导致患者血液和其他组织中药物浓度的大幅波动。这些波动可影响许多参数，例如剂量频率，作用开始，功效持续时间，治疗血液水平的维持，毒性，副作用等。从有利的方面来讲，控释制剂可用于控制药物的起效，作用持续时间，治疗窗内的血浆水平和血液峰值水平。特别地，可以使用控释或延长释放剂型或制剂来确保实现药物的最大有效性，同时减少潜在的不良反应和安全性问题，这可能由于剂量不足而发生(即，低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平所造成。
大多数控释制剂被设计成最初释放一定量的药物(活性成分)，迅速产生所需的治疗效果，并逐渐和持续释放其他量的药物，以在较长时间内维持这种水平的治疗或预防效果。为了在体内维持这种恒定的药物水平，药物必须以一定的速率从剂型中释放出来，该速率将取代被代谢和从体内排出的药物量。可以通过各种条件刺激活性成分的控制释放，包括但不限于pH，离子强度，渗透压，温度，酶，水和其他生理条件或化合物。
各种已知的控释或延长释放剂型，制剂和装置可适用于发明本公开的盐类和组合物。实例包括但不限于以下美国专利中所描述的实例：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5059595；5,591,767；5120548；5073543；5639476；5,354,556；5,733,566；和6,365,185 B1；其中的每项专利都通过引用并入本文。这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放，例如使用羟丙基甲基纤维素，其他聚合物基质，凝胶，渗透膜，渗透系统(例如(美国加利福尼亚州Mountain View的Alza公司))或其组合，以不同的比例提供所需的释放曲线。
应理解，本发明的化合物和药物组合物可以配制并用于联合疗法中，即，化合物和药物组合物可以与一种或多种其它化合物和药物组合物一起配制或同时给药，或在其之前给药。在组合方案中使用的特定治疗组合(治疗剂或程序)将考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及要实现的所需治疗效果。应当理解，所采用的疗法可以对相同的病症实现期望的效果(例如，本发明的化合物可以与另一种癌症治疗剂同时施用)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制不良反应)。
例如，可以与本发明的化合物组合使用的其他疗法、成像剂和/或癌症治疗剂，用于成像，靶向，检测和/或治疗肿瘤，包括放射疗法，外科手术，吉西他滨，顺铂，紫杉醇，卡铂，硼替佐米，AMG479，伏立诺他，利妥昔单抗，替莫唑胺，雷帕霉素，ABT-737，PI-103；烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺；氨基磺酸盐，例如白消安，硫丹和硫丹；氮杂环丙烷，例如苯并二唑，卡波醌，美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基精胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三聚氰胺，三乙烯基磷酰胺，三乙烯基硫代磷酰胺和三羟甲基胺；多聚乙酰(特别是泡番荔枝辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；抑素；卡利司他汀；CC-1065(包括其阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多米卡新(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；一种匍枝珊瑚醇；海绵抑制；氮芥，例如苯丁酸氮芥，氯苯哒嗪，氯膦胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥，盐酸甲氧氮芥，美法仑，新恩比兴，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲洛磷胺，尿嘧啶芥末；亚硝基脲类，例如卡莫司汀，氯嘧菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀和雷尼莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；一种拉霉素；以及新生素抑制素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)，阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，卡拉宾，卡霉素，嗜铬蛋白，色霉素,达西霉素,柔红霉素,去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧阿霉素)，表柔比星，依索比星，伊达比星，马塞霉素，丝裂霉素C，丝裂霉素C，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，胃蛋白酶，波非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，新生霉素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶呤，三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，多西氟尿苷，依那西班，氟尿苷；卡普睾酮，屈他雄酮丙酸酯，环硫雄醇，美雄酮胶囊，睾内酯等雄激素；抗肾上腺素，如氨基乙酰亚胺，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂如氟喹啉酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；百垂布西；比生群；乙茎去氮氨蝶呤；地佛法明；美可辛；地吖醌；依洛尼塞；醋酸乙烯酯；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类，如美登素和安沙霉素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；苯来美特t；吡柔比星；洛索；鬼臼毒素；2-乙基酰肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亚胺；根霉素；西佐喃；螺环锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺；2,2’，2”-trichlorotriethylamine；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉醇，例如，紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)，无氢化蓖麻油，紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，IL)和多西紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，法国安东尼)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂，奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；减瘤；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基；希罗达；伊班膦酸钠；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，如维甲酸；卡培他滨；考布他丁；亚叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(奥沙利铂)；拉帕替尼(拉帕替尼.。)；PKC-α，Raf，H-Ras，EGFR(例如厄洛替尼())和VEG的抑制剂。
在某些实施方案中，本发明的药物化学组分还包括一个或多个额外的治疗活性成分(例如，化疗和/或姑息性药物)。就本发明而言，“姑息性”一词是指侧重于缓解疾病症状和/或治疗方案的副作用，但不具有治疗性的治疗。
本发明的化合物可能在治疗癌症方面特别有用，尽管其他患者治疗也在本发明的范围内。
预期可以使用本发明的化合物治疗多种癌症，尤其是实体瘤癌症。此类实体瘤癌症的实例包括头部癌症，例如脑癌，以及颈部，子宫内膜，肝脏，乳房，卵巢，肾脏，子宫颈和前列腺的癌症。涉及本发明化合物的盐类在本发明实施方案中特别适用于治疗癌症。本发明的盐类可以多种形式给予患者，这取决于具体的给药途径，所涉及的特定盐类，所治疗的特定癌症等。在近距离放射治疗的情况下，可以使用本领域技术人员熟知的技术给予盐类，包括手术植入。在以含水组合物或悬浮液形式给予盐的情况下(下文将更全面地讨论)，含水组合物或悬浮液可以通过在所需部位注射给药。此外，本发明的盐类可以以药物基质的形式给药(下文将更全面地讨论)，也可以通过在所需部位注射或手术植入。用于施用基质的特定技术取决于所涉及的基质的形状和尺寸。在一些实施方案中，将盐类基本上均匀地引入肿瘤中以使冷(未治疗)区域的肿瘤发生率最小化。在某些实施方案中，盐类与药学上可接受的载体组合施用。可获得多种药学上可接受的载体，并且可与本发明的盐类组合。基于本发明公开信息，这些载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方案中，用作载体的任何材料都是生物相容的。
如本文所述，“生物相容”是指通常对生物功能无害并且不会导致任何程度的不可接受的毒性的材料，包括过敏反应和疾病状态。合适的载体包括但不限于水，缓冲液或盐水溶液。其他合适的载体描述参见Remington所著《药物科学》，Gennaro，A.R，ed，MackPublishing Co.，Easton，Pa.(1985)和《美国药典》-TheNational Formulary，22ndRevision，Mack Printing公司，Easton，Pa.(1990)，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。
药物组合物中使用的盐的浓度和/或给予患者的盐的量可以变化，并且取决于多种因素，包括所用的特定盐和/或药学上可接受的载体，正在治疗的特定疾病，疾病的程度，患者的身高和体重等。通常，盐可以用于药物组合物中，并且可以将组合物给予患者以提供最初较低水平的剂量，其可以增加直至达到所需的治疗效果。在某些实施方案中，药学上可接受的载体还可包含增稠剂。
本发明所用“增稠剂”是指各种通常亲水性材料中的任何一种，当掺入本发明组合物中时，其可用作粘度调节剂，乳化剂和/或增溶剂，悬浮剂和/或张力增强剂。可适用于本发明药物组合物的增稠剂包括：明胶，淀粉，树胶，果胶，酪蛋白和藻胶体，包括角叉菜胶，藻酸盐和琼脂，半合成纤维素衍生物；聚乙烯醇和羧基乙烯基化物；和膨润土，硅酸盐和胶体二氧化硅。上述材料的实例包括碳水化合物，例如甘露醇，葡萄糖和右旋糖，及其磷酸化和磺化衍生物；琼脂糖；聚醚，包括分子量为约400至约100,000的聚醚；二羟基烷烃和三羟基烷烃及其聚合物的分子量为约200至约50,000；金合欢；二乙醇胺；甘油单硬脂酸酯；羊毛脂醇；卵磷脂；甘油单酯和甘油二酯；单乙醇胺；油酸；油醇；聚氧乙烯50硬脂酸酯；聚氧乙烯35蓖麻油；聚氧乙烯10油基醚；聚氧乙烯20十六十八烷基醚；聚氧乙烯40硬脂酸酯；丙二醇二乙酸酯；丙二醇单硬脂酸酯；硬脂酸钠；硬脂酸；三乙醇胺；乳化蜡；琼脂；海藻酸；单硬脂酸铝；膨润土；岩浆；卡波姆934P；羟乙基淀粉；羧甲基纤维素；钙和钠和钠12；角叉菜胶；纤维素；葡聚糖；明胶；瓜尔豆胶；刺槐豆胶；硅酸镁铝；羟乙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；铝酸镁-硅酸盐；甲基纤维素；果胶；聚环氧乙烷；聚维酮；丙二醇海藻酸盐；二氧化硅；海藻酸钠；黄蓍胶；黄原胶；葡萄糖酸内酯；甘油；甘露醇；聚乙二醇(PEG)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚乙烯醇(PVA)；聚丙二醇；聚山梨酯；山梨糖醇；丙二醇；甘油；和聚氧乙烯聚氧丙烯二醇嵌段共聚物。聚氧乙烯-聚氧丙烯乙二醇共聚物中的优选是：α-羟基-w-羟基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)嵌段共聚物。后一种嵌段共聚物通常称为泊洛沙姆共聚物。泊洛沙姆共聚物的实例包括，泊洛沙姆F68，泊洛沙姆L61和泊洛沙姆L64。这些泊洛沙姆共聚物可从Spectrum 1100(Houston，TX)商购获得。上面列出的增稠剂中的优选是明胶，聚乙烯吡咯烷酮和聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇嵌段共聚物。基于本发明公开的内容，除了上面列举的那些之外，其他增稠剂对于本领域技术人员而言是显而易见的。
当存在于本发明的组合物中时，增稠剂的浓度可以变化并且取决于各种因素，包括所用的特定增稠剂，盐，药学上可接受的载体等。在一些实施方案中，增稠剂的浓度至少足以赋予组合物所需的性质，包括改变组合物的粘度。一般而言，增稠剂的浓度可以为每mL药物组合物约0.1至约500毫克(mg)，以及该范围内的所有组合和子组合。在某些实施方案中，增稠剂的浓度可以为约1至约400mg/mL。在一些实施方案中，浓度范围为约5至约300mg/mL。在一些实施方案中，增稠剂的浓度可为约10至约200mg/mL。在一些实施方案中，浓度范围为约20至约100mg/mL。增稠剂的浓度为约25至约50mg/mL。可由盐，药学上可接受的载体和任选的增稠剂制备的组合物包括悬浮液，乳液和分散体。在一些实施方案中，可以配制盐并作为悬浮液给予患者。
本发明所称悬浮液，是指在液体中由细小的胶体颗粒混合、分散或乳化而成。
本发明所使用的“胶体”是指物质细分的状态，其包含单个大分子的颗粒或较小分子的聚集体。颗粒可以在显微镜下测定尺寸并且一起包含分散相。该分散相通常被不同的物质包围，通常称为分散介质或外相。例如，可以通过将盐与惰性载体材料混合来获得悬浮液。
本发明所称“惰性”是指通常耐化学或物理作用的物质。在一些实施方案中，惰性物质也是生物相容的。在一些实施方案中，惰性载体材料是吸附剂和/或吸收性固体，盐可以在其上吸附和/或吸收。在一些实施方案中，惰性固体可包含颗粒。在一些实施方案中，颗粒是细碎的颗粒。这种载体材料在本文中称为“颗粒状载体材料”。可适合用作本发明组合物中的惰性固体载体的颗粒载体材料包括由碳衍生的材料，包括通常称为炭黑(油烟)和/或活性炭等炭材料，以及细粉状氧化物和硅藻土。在一些实施方案中，载体材料包含炭黑或活性炭。颗粒状载体材料颗粒的尺寸可以变化，并且取决于所用的特定载体材料，盐，增稠剂等。通常，颗粒状载体材料60可包括尺寸范围为约0.1微米(mm)至约50mm的颗粒，以及该范围内的所有组合和子组合。在一些实施方案中，粒度可为约0.5至约25mm。在一些实施方案中，粒度范围为约1至约10mm。在一些实施方案中，颗粒状载体材料的粒度可为约2至约5mm。Geigy Corp.(Brawater,N.Y.)。
所用盐的浓度可以变化并取决于多种因素，包括所用的特定盐和/或聚合树脂，在树脂混合物中使用的其它试剂，如固化剂和/或硬化剂，所治疗的特定疾病，疾病的程度，患者的身高和体重等。通常，盐可以用于聚合物树脂或树脂中，因此，基质可以施用于患者以提供最初较低水平的剂量，其可以增加直至达到所需的治疗效果。一般而言，基于树脂和任选的固化剂或硬化剂的总重量，盐可以以大于0至约50％的浓度，以及该范围内的所有组合和子组合使用。在一些实施方案中，盐的浓度为约0.5至约40％。在一些实施方案中，浓度范围为约1至约30％。在一些实施方案中，盐的使用浓度为约1.5至约20％。在一些实施方案中，浓度范围为约2至约10％。在一些实施方案中，盐的浓度为约3至约5％。在一些实施方案中，浓度为约4％。
可以将盐，聚合物树脂和任选的其他成分的混合物混合直至均匀，并且可以将所得混合物引入生物相容性套管，例如套管，使得套管基本上围绕树脂混合物。将树脂混合物引入套管中可以通过使用合适的机械和/或真空泵将混合物泵入套管中来实现。用于此目的的合适的泵是容易获得的，并且基于本发明公开内容对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
所用的具体泵可能取决于各种因素，包括树脂混合物的粘度，以及所用套管的尺寸，即其长度和内径和外径。所使用的套管的尺寸可以变化并且取决于多种因素，包括所用的特定盐和/或聚合树脂，所治疗的特定疾病，疾病的程度，患者尺寸和重量。一般而言，所使用的套管的长度可以为约0.1cm至约5cm，以及该范围内的所有组合和子组合。在一些实施方案中，套管长度可以为约0.3cm至约3cm。在一些实施方案中，长度为约0.8cm至约2cm。在一些实施方案中，套管长度可为约1cm。套筒的外径可以在约0.2mm至约2mm的范围内，包括该范围内的所有组合。在一些实施方案中，外径可以为约0.5mm至约1.5mm。在一些实施方案中，外径为约1mm。套筒的内径可在约0.1mm至约1.8mm的范围内，包括该范围内的所有组合。在一些实施方案中，内径可以为约0.3mm至约1.3mm。在一些实施方案中，内径可以为约小于约1mm，例如约0.8mm。
在一些实施方案中，在引入套管后，将含有盐的树脂混合物固化以提供本发明的固体基质。所用的固化方法可以变化，并且取决于特定的聚合树脂和任选的固化和/或硬化剂。一般而言，树脂混合物可以通过施加热或紫外(UV)光来固化。在一些实施方案中，通过热固化进行固化。之后可以按本发明所述将所得到的基质给予患者。
本发明还提供了方便的药物试剂盒。此类试剂盒可包含本发明化合物的盐(即，染料-治疗性基团偶联体)，并且通常包含药学上可接受的载体。该试剂盒还可以进一步包含常规试剂盒组分，例如用于注射组合物的针，用于混合组合物组分的一个或多个小瓶等，其对于本领域技术人员是显而易见的。此外，试剂盒中还包括以插页或标签形式提供的说明书，说明组分的数量，混合组分的指南和给药方案。
使用本发明的染料-治疗性基团偶联体的方法
本发明化合物在环境给药时会作为药剂优先进入和保留在体内癌细胞。因此，据信所述化合物可用于识别和治疗或预防或降低任何可能对本发明化合物的优先进入和保留性质有反应的病症。
可以成像或治疗的受试者包括动物受试者，通常是脊椎动物，包括哺乳动物(例如，人，猫，狗，牛，马，绵羊，猪，猴，猿等)和禽类受试者(例如，鸡，火鸡，鸭，鹅，鹌鹑，野鸡等)。
例如，本发明的化合物可用于治疗癌组织及其相关肿瘤，包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌和皮肤癌。
在本发明的一个方面，向受试者施用有效量的本发明化合物可以对癌组织进行探测。另外，本发明的相同或其他化合物可在癌组织中具有细胞毒性。因此，本发明可提供检测和治疗受试者肿瘤的方法，其中本发明化合物可以提供给有需要的受试者，以有效识别和/或治疗此类肿瘤。
“治疗或预防”一词旨在表示减轻疾病的体征，症状或原因，或生物系统的任何其他期望的改变。因此，本发明方法“预防”(即，延迟或抑制)和/或“减少”(即，减少，减缓或改善)接受治疗的哺乳动物的癌症或肿瘤疾病或病症的有害作用。
如本发明所述，“肿瘤疾病或病症”的特征在于一种或多种以下性质：细胞生长不受环境中正常的生物化学和物理影响的调节；间变性(即缺乏正常的协调细胞分化)；在某些情况下，转移。此外，本发明所述，术语“癌症”应理解为意指以细胞异常生长为特征的疾病，其不受环境中正常的生物化学和物理影响的调节。因此，本发明所述，术语癌症和肿瘤形成是可互换的。
能够根据本发明治疗的肿瘤疾病包括，肛门癌，膀胱癌，乳腺癌，子宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓性白血病，子宫内膜癌，毛细胞白血病，头颈癌，肺(小细胞)癌，多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，卵巢癌，脑肿瘤，结直肠癌，肝细胞癌，卡波西氏肉瘤，肺癌(非小细胞癌)，黑色素瘤，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，导管癌，胃癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌和软组织肉瘤。其他肿瘤性疾病可以在Isselbacher等人的文章中找到。(1994)Harrison S《内科学原理》1814-1877，其内容在本发明中被引用。
通过施与本发明药物有效活性的化合物药物组分，可以获得本发明化合物的药物有效活性的递送。“药物有效活性”或“剂量”是指本发明标明构建体的浓度，其足以根据本发明所述的各种治疗方法引发所需的治疗效果。因此，在一个实施方案中，治疗有效活性是有效治疗癌症的活性，例如抑制或减缓癌组织的生长。任何特定化合物的治疗有效剂量在化合物与化合物，患者与患者之间会有所不同，并且取决于患者的状况和递送途径。预期任何特定化合物的有效活性根据受试者的体重，性别，年龄和病史而变化。影响有效剂量的其他因素可包括但不限于患者病情的严重程度，所治疗的疾病或病症，本发明化合物的稳定性，以及与本发明化合物一起给药的其他抗肿瘤治疗剂。确定功效和剂量的方法是本领域技术人员所知晓的。参见，Isselbacher等人(1996)HarrisonS《内科学原理》13版，1814-1882，其内容在本发明中被引用。
有效量，毒性和治疗效力可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定，例如，用于测定LD50(对50％人群致死的剂量)和ED50(对50％的人群具有疗效的剂量)。剂量可根据使用的剂型和所用的给药途径而变化。毒性和治疗效果之间的剂量比即为治疗指数，可以表示为LD50/ED50。在一些实施方案中，组合物和方法表现出大的治疗指数最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。此外，可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中或者在适当的动物模型中测定的IC50(即，实现对症状的半数-最大抑制的本发明化合物的浓度)。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。可以通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的影响。剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
在某些实施方案中，可以将有效剂量的包含本发明化合物的组合物给予患者以便对癌细胞和肿瘤进行识别，显影或定位。在一些实施方案中，本发明化合物可以一次给予患者。在某些实施方案中，可以将有效剂量的包含本发明化合物的组合物重复给予患者。可以按一定治疗量给患者施用包含本发明化合物的组合物。包含本发明化合物的组合物可以在一段时间内给药，例如每隔5分钟，10分钟，15分钟，20分钟或25分钟。如果有必要，可以定期重复给药，例如每小时给药，连续3小时，6小时，12小时或更长时间，或每两周给药，连续一个月，两个月，三个月，四个月或更长时间。在一些情况下，在初始治疗方案之后，可以降低给药频次。例如，在每两周给药一次持续三个月后，可以每月重复施用一次，持续六个月或一年或更长时间。
如本文所述的组合物的剂量可由医师确定，并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时产生疗效，并确定是否增加或减少剂量，增加或减少给药频率，停止治疗，恢复治疗，或对治疗方案进行其他改变。给药方案可以从每周一次到每天一次，这取决于许多临床因素，例如受试者对本发明化合物的敏感性。
在某些实施方案中，可施用有效剂量的包含本发明化合物的组合物以治疗，抑制或预防患者的癌症。在某些实施方案中，包含本文所述的本发明化合物的有效剂量的组合物可以一次给予患者。在某些实施方案中，可以将有效剂量的包含本发明化合物的组合物重复给予患者。在某些实施方案中，包含本发明化合物的有效剂量的组合物可以通过皮肤贴剂给患者施用，通过尿道植入，通过尿道或阴道通道进入膀胱。可以按一定治疗量给患者施用包含本发明化合物的组合物。包含本发明化合物的组合物可以在一段时间内给药，例如每隔5分钟，10分钟，15分钟，20分钟或25分钟。如果有必要，可以定期重复给药，例如每小时给药，持续3小时，6小时，12小时或更长时间，或例如每两周给药，持续一个月，两个月，三个月，四个月或更长时间。在一些情况下，在初始治疗方案之后，可以减少给药频次。例如，在每两周给药持续三个月后，可以每月重复给药一次，持续六个月或一年或更长时间。施用包含本发明化合物的组合物可降低生物标志物的水平或癌症的症状。
如本文所述的组合物的剂量可由医师确定，并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时起效，并确定是否增加或减少剂量，增加或减少给药频率，停止治疗，恢复治疗，或对治疗方案进行其他改变。给药方案可以从每周一次到每天一次，这取决于许多临床因素，例如受试者对本发明化合物的敏感性。
本发明的实施方案涉及羰花青染料，特别是使用染料-治疗性基团偶联体，包括但不限于研究活体动物和人类中药物的原位药代动力学和药效学。该应用具有重要意义，因为直到现在，药代动力学和药效学是使用体液进行检测的。可以利用染料-治疗性基团偶联体被肿瘤组织特异性吸收的能力，通过测量原位药代动力学和药效学，在临床上将其用作体内和肿瘤部位的显像剂和治疗药物。染料-治疗性基团偶联体可用作肿瘤细胞的化学标签。可以通过FACS筛选分离被标记的肿瘤细胞。可以进一步表征来自生物液体的被分离出来的肿瘤细胞。染料-治疗性基团偶联体也可用于标记干细胞、推定的肿瘤干细胞或任何用来改善实时成像而穿透器官、组织或细胞区室的生物制品。
染料-治疗性基团偶联体可以与药物，有机和无机分子化学偶合，其中已知配体与正常细胞结合，用于正常器官，组织修复和再生。由于其独特的性质，它可以在药物作用部位可视化，并且可以评估关联组织和器官对这些试剂的生物反应。
染料-治疗性基团偶联体可以作为一种试剂，在个性化的基础上成像和治疗病人。众所周知，药物在个体患者中的积累和代谢是不同的，但不幸的是，很难以理想的精度监测药物的药代动力学和药效学特性。染料-治疗性分子偶联体可以解决这一问题，因为这种化合物可以在肿瘤部位成像，从而为药物的药代动力学和药效学特性提供重要信息。
在一种实施方案中，GASP-1和NXN2可以用作本发明所述癌症类型的伴生生物标记物。
在一种实施方案中，如本文所述的方法可以进一步包括测定一种或多种伴随生物标志物的浓度，特别是测定患者一种或多种流体、血清和组织中的GASP-1肽或NXN2肽的浓度的步骤。最好是，在将染料-治疗性基团偶联体给予患者之前进行这种测定。因此，利用这一优点，可以在疾病进展之前非常早期阶段鉴别使用染料-治疗性基团偶联体的癌症类型和患者。伴随生物标志物可用于任何癌症，包括患有前列腺癌，胰腺癌，肺癌或肾癌的患者，并且可能对患有前列腺癌的患者，特别是多西紫杉醇抗性前列腺癌特别有用。在任何这些患者中，可以升高GASP-1和/或NXN2，由此鉴定癌症的存在，并开始施用染料-治疗性基团偶联体和/或癌症药物。例如，根据GASP-1或NXN2浓度的测定，通过如实例16中所述的ELISA，可以将本发明所述的染料-治疗性基团偶联体施用于患者，用于治疗或成像。可以以一种或多种方式测定升高的水平，包括与非癌症患者进行对照比较，以及对从同一患者纵向获得的血清样本进行比较。纵向意指在不同时间从患者获得血清样品，例如，在手术之前和之后，治疗之前和之后，或在放射线照相确定肿瘤进展或消退之前和之后。因此，纵向测定可以确认可靠性和/或用作血清GASP-1的标准，以确定癌症存在，癌症进展或消退。升高可以是增加约2至约100倍的，例如，约5倍至约75倍或通常约10至约30倍增加。
染色-治疗性分子偶联体可用于标记循环干细胞，用于评估骨髓或其他重要器官的干细胞移植。正常细胞可以有一个较低的摄取率，这可以通过使用内化细胞表面配体与染色治疗分子偶联体偶联而得到改善，这可能增加进入干细胞群体的摄取量。
按照同样的思路，可以通过将染料-治疗性基团偶联体与其他组织和器官特异性细胞表面分子偶合以用于潜在的成像和细胞毒性目的。例如，可以使用前列腺细胞表面配体加细胞毒性药物偶联体将染料-治疗性基团偶联体引导至人BPH组织中用于肿瘤消融。
同样，许多难以手术解决的良性肿瘤也可以使用染料治疗性基团偶联体作为显像剂和细胞毒剂，达到选择性肿瘤消融的目的。
本发明的各种实施方案提供了一种药物化学组分，该药物化学组分包括本发明的染料-治疗性基团偶联体和药学上可接受的载体。
在本发明的一个方面，提供了药物组合物，其包含一种或多种(例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多种)本发明所述的化合物(或前药，药学上可接受的盐或其它药学上可接受的形式)，和任选的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，这些组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。或者，可以将本发明化合物配合施用一种或多种其他治疗剂，给予有需要的患者。例如，在皮肤色素沉着的调节中，用于联合给药或与本发明化合物一起包含在药物组合物中的额外治疗剂可以作为批准的皮肤色素沉着剂。
药物组合物中一种或多种化合物的量可以基于重量，摩尔或体积。在一些实施方案中，药物组合物包含至少0.0001％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少0.1％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少0.5％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少1％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少2％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少3％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少4％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少5％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少10％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.01％-99％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.05％-90％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-85％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.5％-80％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含1％-75％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含2％-70％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含3％-65％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含4％-60％的本发明化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含5％-50％的本发明化合物。
各种实施方案提供了鉴定，成像或定位有此需要的患者的癌细胞和肿瘤的方法。该方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；将染料-治疗性基团偶联体给予患者；并进行光学成像。
各种实施方案提供了一种方法，用于识别、成像或定位需要该方法的患者体内的癌细胞和肿瘤。所述方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；给患者施用染料-治疗性基团偶联体；并在近红外光谱区域内成像肿瘤位置。在各种实施方案中，在注射后约6至48小时对肿瘤进行成像。
各种实施方案提供了一种为需要的患者治疗或预防癌症的方法。所述方法可包括提供本发明的染-治疗性基团偶联体；并给患者施用染料-治疗性基团偶联体。
各种实施方案提供了一种为需要的患者治疗或预防癌症的方法。所述方法可包括提供本发明的染-治疗性基团偶联体；并给患者施用染料-治疗性基团偶联体。
本发明所述的组合物和方法可以施用于患有或诊断为患有癌症的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向受试者施用一定量的本发明所述的组合物以治疗或预防癌症。例如，与同等的未治疗对照相比，通过任何标准技术测量，症状减少至少5％，10％，20％，40％，50％，60％，80％，90％，95％，99％或更多。用于向受试者施用本发明所述组合物的多种方法是本领域技术人员所知晓的。此类方法可包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内，肌肉内，皮下，透皮，气道(气溶胶)，肺部或肿瘤内。给药可以是局部的或系统的。
本发明所称有效量，是指减轻癌症所需要的即时发明的化合物的量，涉及提供所需要的药理成分的足够量。因此，“治疗有效量”一词是指本发明的一种化合物的量，该化合物在对典型的受试者使用时足以产生特定的抗癌效果。本发明所述的有效量,在不同的情况下,其数量足以延迟疾病症状的发展,改变疾病症状(例如但不限于,减缓疾病的一种症状)的进展,或逆转疾病的症状。因此，通常不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，一个适当的“有效量”可以由一位普通的专业人员仅通过常规实验来决定。
有效量，毒性和治疗效力可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定，例如，用于测定LD50(对50％人群致死的剂量)和ED50(对50％人群有疗效的剂量)。剂量可根据使用的剂型和所用的给药途径而变化。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50比。在一些实施方案中，组合物和方法表现出较大的治疗指数，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。此外，可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC50(即，实现对症状的半数最大抑制的本发明化合物的浓度)。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。任何特定剂量的作用可以通过合适的生物测定来监测，例如，抑制癌细胞增殖的测定等。剂量可由医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
如本发明所述的组合物的剂量可由医师确定，并在必要时调整以适应观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常监测受试者以确定治疗何时起效，并确定是否增加或减少剂量，增加或减少给药频率，停止治疗，恢复治疗，或对治疗方案进行其他改变。给药方案可以从每周一次到每天一次，这取决于许多临床因素，例如受试者对本发明化合物的敏感性。
各种实施方案提供了用于检测肿瘤或正常细胞、肿瘤或正常组织中的分子的方法。所述方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；成像肿瘤或正常细胞，肿瘤或正常组织。
各种实施方案提供了一种在肿瘤或正常细胞或组织中对本发明的染料-治疗性基团偶联体及其药物有效载荷进行原位药代动力学和药效学分析的方法。所述方法可以包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体及其药物有效载荷；将本发明的染料-治疗性基团偶联体及其药物有效载荷与肿瘤或正常细胞或组织接触；以及肿瘤或正常细胞或组织的成像。
各种实施方案提供了一种对有需要的肿瘤患者进行外科切除的方法。所述方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；给患者施用染料-治疗性基团偶联体；对患者进行成像，以便在手术时在手术边缘原位检测癌细胞；手术切除肿瘤。
各种实施方案提供了一种标记细胞、微生物和小分子的方法。所述方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；染料-治疗性基团与细胞、微生物或小分子接触；对与细胞、微生物或小分子结合的染料-治疗性基团进行成像，以跟踪其在活体中的运动。
各种实施方案提供了研究常规统动物或转基因动物癌症转移的方法。所述方法可包括提供本发明的染料-治疗性基团偶联体；将染料-治疗性基团偶联体注射到携带小鼠或人类肿瘤的常规或转基因动物体内；并利用光学成像技术对肿瘤进行监测。
本发明的各种实施方案还提供了合成染料-治疗性基团偶联体的方法，其在以下实例中进行详述。
实施实例
下面的实施实例只是用于解释特定的具体实施方案，不得以任何方式限制本发明的权利要求范围。如果该领域内的技术人员对实例中所述的方法进行了任何变更，则相关变更也在本发明的范围之内。
下面将通过具体实施实例对本发明进行深入说明，相关实例仅用于解释本发明内容，不会以任何方式限制本发明的范围。下列实例只是为了更好地说明本发明及其权利要求，不会限制本发明的范围。其中提及的具体材料仅供参考，不会限制本发明的范围。在不背离本发明精神和范围的情况下，本发明领域内的技术人员可以对实例中的具体方法或试剂进行修改，但这种修改并不具备创新性。
材料和方法
辛伐他汀从Ark Pharm,Inc.(阿灵顿高地，伊利诺伊州)处购买。本实例中使用的DZ-1(1)按照之前报导的方法自行合成。顺铂和阿霉素从MedKoo Biosciences,Inc.(教堂山，北卡罗来纳州)处购买，双氢青蒿素从TCI America(波特兰，俄勒冈州)处购买。所有其他化学品和试剂都是从Sigma-Aldrich以及/或者VWR处采购的，都是可以购买到的最高质量级别。二盐酸嘌呤霉素从Alfa Aesar(图克斯伯里，马萨诸塞州)处购买。用于制备溶液的去离子水(18.2欧姆)是从使用Millipore(比勒立卡，马萨诸塞州，美国)处采购的Milli-Q直接超纯水系统制备的。所有中间产物都使用1H NMR和质谱分析法进行分析，化合物的纯度使用高效液相色谱法分析。使用Bruker 400MHz光谱仪，在标准参数条件下采集1HNMR数据；相对于非氘化溶剂的化学位移使用ppm(δ)表征。新化合物的质谱使用Thermo FisherLTQ Orbitrap Elite系统进行ESI质谱分析。
实例1
DZ-1-辛伐他汀偶联体3的合成：DZ-11(407mg，0.58mmol)，辛伐他汀2(387mg，0.92mmol)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(172mg，0.89)将DMAP(65mg，0.53mmol)混合并溶于无水二氯甲烷(15mL)中。将所得混合物搅拌18小时。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩。将残余物溶于5mL甲醇中，并通过C18-RP硅胶色谱法纯化，用甲醇-水洗脱，得到所需产物3，为深绿色固体(269mg，收率42％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.23(m，2H)，7.61-7.56(m，2H)，7.47(d，1H)，7.42-7.36(m，3H)，7.29-7.19(m，2H))，6.4-0(d，1H)，6.24(d，1H)，5.89(d，1H)，5.73(m，1H)，5.71(s，1H)，5.43(m，1H)，5.12-5.07(m，2H)，4.32(m，1H)，4.21(m，2H)，4.14(m，2H)，2.82(m，1H)，2.69(m，4H)，2.27(m，4H)，1.83(m，6H)，1.70(m，3H)，1.63(s，6H)，1.62(s，6H)，1.53(m，6H)，1.38(m，6H)，1.23(m，4H)，1.14(m，4H)，1.01(s，1H)，0.97(s，6H)，0.77(q，2H)，0.67(t，3H)。质谱(ESI)m/z1105.58[M+H]+。
方案1。DZ-1辛伐他汀偶联体的合成
实例2
DZ-1-顺铂偶联体6的合成：染料-顺铂偶联体的化学合成描述详见方案2。根据文献方法(Journal of Inorganic Biochemistry 107(2012)6-14)合成奥沙利铂(Oxoplatin)5。向化合物5(350mg，1.05mmol)的DMSO(20mL)悬浮液中加入DZ-11(500mg，0.71mmol)，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(136mg)，0.0.71)和DMAP(80mg，0.65mmol)，将混合物在室温下搅拌20小时，得到绿色溶液。过滤溶液，通过冷冻干燥除去DMSO。用C18-RP硅胶色谱法纯化产物，用甲醇-水洗脱，得到DZ-1-顺铂6，为深绿色固体(275mg，收率38％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.22(m，2H)，7.61-7.56(m，2H)，7.48(d，1H)，7.39(m，3H)，7.26(m，2H)，6.37(d，1H)，6.24(d，1H)，4.15(m，4H)，2.68(m，4H)，2.15(m，2H)，1.80(m，4H)，1.70(m，6H)，1.63(s)，6H)，1.62(s，6H)，1.51(m，2H)，1.40(m，2H)。质谱(ESI)m/z1020.69(M+H)+。
方案2。DZ-1顺铂偶联体的合成
实例3
DZ-1-阿霉素偶联体7的合成：DZ-11(103mg，0.15mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(40mg，0.21mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(24mg，0.18mmol)混合物溶解在5.0mLDMF溶液中。将混合物搅拌15分钟，然后加入多柔比星(85mg，0.15mmol)并在室温下再搅拌15小时。加入乙醚(50ml)。收集沉淀物并通过C18-RP硅胶色谱法纯化，并用甲醇-水洗脱，得到所需产物7，为深绿色固体83mg(46％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.18(m，2H)，7.90(m，2H)，7.62(m，2H)，7.49(m，2H)，7.41(m，2H)，7.32(s，1H)，7.29(m，1H)，7.25(m，1H)，6.37(d，1H)，6.24(d，1H)，5.45(s，1H)，5.18(s，1H)，4.92(m，1H))，4.80(m，1H)，4.67(m，1H)，4.52(m，2H)，4.21(m，2H)，4.11(m，2H)，3.93(s，3H)，2.96(s，1H)，2.63(m，4H)，2.15(m，2H)，2.00(m，4H)，1.76(m，6H)，1.64(s，6H)，1.63(s，6H)，1.56(s，3H)，1.55(s，3H)，1.48(m，2H)，1.20(m，2H)，1.08(m，2H)。质谱(ESI)m/z1230.47[M+H]+。
方案3。DZ-1-阿霉素偶联体的合成
实例4
DZ-1-青蒿素偶联体9的合成(方案4)：向染料1(250mg，0.35mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入二氢青蒿素8(110mg，0.39mmol)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(82mg，0.43)和DMAP(20mg，0.16mmol)，混合物在室温下搅拌12小时，得到绿色溶液。过滤溶液，减压除去溶剂。通过C18-RP二氧化硅柱色谱法纯化染料-青蒿素偶联体，用甲醇-水洗脱，得到DZ-1-青蒿素9，为深绿色固体179mg(52％)。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ8.22(m，2H)，7.58(m，2H)，7.47(d，1H)，7.38(m，3H)，7.25(m，2H)，6.38(d，1H)，6.25(d，1H)，5.60(d，1H)，5.50(s，1H)，4.55(m，2H)，4.21(m，4H)，2.68(m，6H)，2.35(m，2H))，2.17(m，2H)，1.86(m，6H)，1.73(m，6H)，1.64(s，6H)，1.63(s，6H)，1.57(m，2H)，1.37(m，2H)，1.24(m，2H)，1.22(s，3H)，0.84(m，3H)，0.67(m，2H)。质谱(ESI)m/z971.46[M+H]+。
方案4。DZ-1-青蒿素偶联体的合成
实例5
DZ-1-普罗霉素偶联体11的合成:将DZ-11(130mg,0.18mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(52.8mg,0.28mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(29.8mg,0.22mmol)的混合物溶于5.0mLDMF溶液中。搅拌15min，加入盐酸普罗霉素(340mg,0.18mmol)，室温下搅拌15h，加入乙醚50ml。收集沉淀物，经C18-RP二氧化硅柱色谱法纯化，甲醇-水洗脱，得到需要的产品11为深绿色固体94mg(44％)。质谱(ESI)m/z1158.52[m+H]+。
方案5。DZ-1-普罗霉素偶联体的合成
实例6
使用顺铂与肿瘤细胞定位近红外(NIR)羰花青染料的偶联体来克服肾细胞癌(RCC)的耐药性和避免肾脏毒性
背景：尽管当前已经开发出了免疫疗法和分子定位疗法，但转移性、复发性或者不可切除的透明和非透明肾细胞癌的存活率依然较低。对于转移性疾病(mRCC)患者而言，临床试验是较为优选的方案。由于mRCC对于化疗药物具有耐药性，因此我们希望提高顺铂对肾细胞癌的细胞毒性、同时尽可能降低其肾脏毒性。通过在小鼠体内的研究，我们发现将顺铂与肿瘤细胞定位NIR染料偶联之后，相关偶联体能够进入癌症细胞中、但不会进入正常细胞中，这主要是因为肿瘤细胞具有较高的有机阴离子转运肽(OATPs)表达水平。我们比较了顺铂和NRI染料-顺铂偶联体在小鼠Renca和人RCC肿瘤模型中的细胞毒性，同时测定了其在小鼠体内的肾脏毒性。
方法：让永生化的肾细胞癌细胞系Caki-1、o-786、ACHN和SK-RC，人肾脏上皮细胞和小鼠Renca细胞在普通顺铂和NIR染料-顺铂偶联体中分别暴露72小时，并比较了其生长率和存活率。使用caspase3/7荧光分析法测定细胞凋亡率。使用免疫印迹法测定凋亡基质的裂解率。细胞和肿瘤对NIR染料-顺铂偶联体的吸收率使用荧光放大镜和IVISLuminaXR成像系统成像并观察。通过皮内注射的方式分别向携带有ACHN或Renca肿瘤的NCr雄性小鼠或者BALB/c小鼠注射等摩尔剂量的NIR染料-顺铂偶联体或顺铂，每周注射三次，持续四周。之后使用甲醛固定肿瘤、肝脏和肾脏切片，再使用H&E进行染色，之后使用半定量分析法对肾脏切片进行评分。
结果：测试范围内的所有肾细胞癌细胞对于NIR染料-顺铂偶联体均具有敏感性，但对于单纯的顺铂没有敏感性，其半数抑制浓度分别在1.94-3.71微摩尔每升和>64微摩尔每升范围内(p<0.0001)。在药物中暴露24小时之后，根据caspase3/7荧光分析结果，NIR染料-顺铂偶联体会诱发细胞凋亡，但单纯的顺铂并不会；根据免疫印迹法分析结果，在NIR染料-顺铂偶联体浓度为8、16和32微摩尔每升时，都在Caki-1细胞中观察到了与细胞凋亡相关的标记物(p<0.0001到p＝0.01)。在向携带有Renca肿瘤、以及ACHN细胞系获得的异种移植体的小鼠注射NIR染料-顺铂偶联体之后，可以观察到肿瘤抑制效应，以及与细胞凋亡相关的细胞核破碎/碎片现象，且与只注射顺铂的对照组相比具有显著差异(p<0.05)。另外，NIR染料-顺铂偶联体能够有效保持小鼠肾脏的完整性和正常形貌，而顺铂会诱发小鼠肾脏损伤。NIR染料-顺铂偶联体在肿瘤中累积的浓度是背景浓度的7-15倍，且在治疗之后能够在肿瘤中停留约43天。
结论：NIR染料-顺铂偶联体能够在肾细胞癌细胞中累积，且在药物暴露之后24小时内即能诱发细胞凋亡。只使用顺铂对于肾细胞癌和肿瘤生长完全无效，而且和NIR染料-顺铂偶联体不同，顺铂还具有较强的肾脏毒性。
实例7。
三维前列腺癌循环肿瘤细胞(CTC)球体在培养中具有化学和激素拮抗剂抗性，可通过靶向近红外染料-药物偶联物重新敏化
背景:与大多数实体瘤细胞系相反，体内和体外前列腺癌(PC)循环肿瘤细胞(CTC)表现出3D形态，表达干细胞标志物并显示出极端的耐药性。我们研究了有机阴离子转运肽(OATP)和多重耐药基因(ABCB1)在PC细胞和CTC中生长为2D与3D球体的关系。我们用新型近红外七亚甲基羰花青染料-吉西他滨或顺铂偶联体重新敏化以3-D球状体生长的耐药性PC细胞。
使用永生化PC细胞系(PC3，LNCaP，C4-2，C4-2B，22Rv1)和表现为3-D球状体生长的小鼠骨髓来源的LNCaP和C4-2B以及来自患者的离体扩增的CTC。通过MTT测定和药物暴露于顺铂、吉西他滨、多西他赛、恩杂鲁胺或醋酸阿比特龙72小时后的结晶紫染色评估生存力。通过半胱天冬酶3/7发光测定评估细胞凋亡诱导性能。比较2-D和3-D之间的生长抑制作用。来自小鼠骨髓的衰老荧光素酶标记的LNCaP和C4-2B细胞在体外作为3D球状体繁殖时重新获得生长潜力。补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基用于体外培养CTC。
结果：作为2D单层生长的永生化前列腺癌细胞系对多西紫杉醇，吉西他滨，恩杂鲁胺和醋酸阿比特龙敏感。相反，来自PC患者的离体扩增的CTC和来自作为3-D球体生长的小鼠骨髓的LNCaP和C4-2B细胞表达干细胞标记物Nanog，CD133，c-Myc，FOXM1，FOXM2，CD44和ALDH1，以及在长期暴露于多西紫杉醇，醋酸阿比特龙和恩杂鲁胺后，显示出没有细胞凋亡迹象的抗性。然而，体外培养为3-D球状体的衰老C4-2B细胞和CTC对新型近红外染料-吉西他滨和近红外染料-顺铂偶联体变得极其敏感。近红外-染料药物偶联体的摄取和保留部分原因是由于负责PC细胞中的药物流入和保留的OATP和ABCB1基因的表达增加。
结论：衰老的LNCaP和C4-2细胞在骨髓中作为3D球状体保持休眠状态，但在体外培养时重新获得增殖潜力。与作为2D单层生长的PC细胞不同，体外扩增的CTC的3D球体对化学和激素拮抗剂具有完全的抗性。我们表明，近红外染料-吉西他滨和近红外染料-顺铂偶联体使作为3-D球体生长的PC细胞对化疗药物重新敏感。
实例8
新型近红外七叶嘧啶萤光素荧光染料-顺铂偶联体显示出显著的抗肿瘤活性并克服了MYC驱动的TP53突变侵袭性B细胞伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤中对顺铂的耐药性。
简介：伯基特氏淋巴瘤(BL)由高度增殖的成熟B细胞组成，这种细胞表达为生发中心表型(Cai，Oncotarget 2015)。它是增长最快的人类肿瘤之一，存在于结外和淋巴结部位。BL的遗传标志是MYC易位，MYC和TP53突变分别在～60％和40％的病例中发生(Ott，Blood 2014)。尽管多药免疫化疗方案的及时给药与大多数患者的有利结果相关，但难治性或复发性疾病的预后很差(Jacobson，Blood 2014)。在这里，我们描述了新合成的近红外-染料-顺铂偶联体(近红外-染料-顺铂)对小鼠肿瘤中培养的MYC驱动的TP53突变侵袭性B细胞BL细胞系的作用。
方法：在暴露于常规顺铂(Cis)和近红外-染料-顺铂72小时后，通过MTT评估永生化B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa，Raji，CA46，Ramos，Daudi的生长和活力。使用半胱天冬酶3/7发光测定评估细胞凋亡的诱导。通过蛋白质印迹法测定细胞凋亡底物的分裂和c-myc的抑制作用，图像经GAPDH归一化后由imagej定量。通过NIRF显微镜和IVIS Lumina XR成像系统分别对细胞和肿瘤中的近红外-染料-顺铂摄取进行成像。雄性NCR裸鼠和nod/scid小鼠携带s.c.namalwa肿瘤，每周注射3次等摩尔剂量的近红外-染料顺铂和常规顺铂，持续4周。福尔马林固定的肿瘤和肾脏切片用苏木精和埃索辛染色，肾脏切片用半定量量表评分，以评估AKI相关的小管损伤(小管上皮细胞丢失、坏死、小管上皮简化、小管内碎片和脱落)。
结果：1)所有BL细胞系均对近红外-染料-顺铂抑制生长敏感，但对IC50分别在720-2.53μm和>64μm(p<0.0001)范围内的顺铂不敏感。2)通过半胱氨酸蛋白酶3/7的发光测定和Namalwa和Raji细胞系提取物中凋亡相关标记物(半胱天冬酶9，半胱天冬酶3和PARP)的蛋白质印迹分析所评估，用8、16、32μm浓度的近红外-染料-顺铂处理24小时后，近红外-染料-顺铂诱导细胞凋亡，p＝0.0001至p＝0.01；当这些细胞暴露于传统的顺铂中时，没有观察到凋亡活性增加的迹象。3)近红外-染料-顺铂(而非顺顺铂)抑制了在BL细胞系中高度表达的抗凋亡蛋白c-myc；在近红外-染料-顺铂和顺铂处理的BL细胞系中，未发现抗凋亡蛋白bcl-2的最低表达有显著变化。4)发现近红外-染料-顺铂在细胞系衍生的异种移植物中的累积量比小鼠肾脏(p<0.0001)和肺部(p<0.0001)多7至15倍，并且这些结果通过NIRF显微镜和IVISLuminaXR成像所证实。5)当注射到携带Namalwa细胞系的异种移植物的小鼠中时，近红外-染料-顺铂与载体或顺铂处理组相比，显示肿瘤生长抑制和凋亡核分叶/碎片化(p<0.05)。6)近红外-染料-顺铂保留了小鼠肾脏的完整性和正常形态，相反，通过顺铂处理的小鼠的组织病理学评估，观察到顺铂诱导了明显的肾损伤。
结论:可以通过近红外-染料-顺铂安全地处理侵袭性B细胞BL细胞系。发现该试剂在BL细胞和肿瘤异种移植物中积累，并且与顺铂相反，近红外-染料-顺铂诱导小鼠体内BL肿瘤异种移植物细胞凋亡和缩小。近红外-染料-顺铂诱导细胞凋亡，抑制c-myc并克服MYC驱动的TP53突变侵袭性B细胞BL细胞系对顺铂的耐药性。该药物可能在复发/难治性重度预处理(为了提高疗效和降低肾毒性)患者中具有潜在的临床效果。近红外-染料-顺铂可用作治疗复发/难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤的辅助药剂。
实例9
简介:为了解他汀类药物对前列腺癌(PC)细胞可能的直接影响，我们开展了一项研究，其中我们合成了一种辛伐他汀(SM)-近红外染料偶联体[即SM与肿瘤靶向近红外(NIR)七甲基碳菁有机染料化学结合，在本申请中称为NIR-SM，其可以绕过肝脏直接靶向PC细胞。我们发现NIR-SM在抑制培养中的PC细胞生长方面优于SM。此外，还发现NIR-SM，而不是SM，使PC细胞对临床上目前常用药物的细胞毒性作用敏感，这些药物用于治疗去势治疗失败的前列腺癌(CRPC)及其转移形式mCRPC，包括：醋酸阿比特龙(AA)，恩杂鲁胺(EZ)和多西紫杉醇(DT)。
方法:1)确定为什么NIR-SM而不是SM可以使PC肿瘤对AA、EZ或DT导致的生长抑制作用重新变得敏感，特别是当PC细胞作为3D球体培养时；2)评估NIR-SM使人体PC对AA，EZ或DT的疗效重新増敏的潜在分子机制。我们的方法强调NIR-SM对以下方面的影响：1)肿瘤细胞作为3D球体和肿瘤异种移植物的生长；3)NIR-SM和SM在经AA，EZ或DT处理并培养的PC细胞中的摄取，保留和代谢，2D单层培养与3D球体培养的对比，4)NIR-SM和SM对细胞粘附、生长、生存、EMT和转移的影响比较，5)使用计算方法预测或监测NIR-SM促进PC细胞对AA，EZ或DT疗效増敏的效果。由于我们的最终目标是开发NIR-SM作为一种对CRPC治疗失败的PC患者进行重新増敏的有效药物，我们首创了一种新方法，即创造了一种可以生物口服的近红外-交联-辛伐他丁(NIR-Linker-SM)，它可以置入HMGCR酶的活性部位。
我们在DT，AA或EZ存在或不存在的情况下合成、表征和评估NIR-SM偶联体在PC细胞和肿瘤上的生物活性。在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM偶联体在克服PC细胞和宿主体内的肿瘤异种移植物针对雄激素拮抗剂或化疗药物(AA，EZ或DT)表现出的耐药性方面比SM更有效且毒性更低。我们通过以下研究来检验这个假设：
此外，我们还想研究为什么NIR-SM可以增强三维球体中PC细胞的生长抑制，而SM却不能，以及为什么在体外在增强PC细胞生长对AA、EZ或DT的敏感性方面，NIR-SM优于SM:OATPs和ABC转运体的作用是什么？
结果:我们使用了一系列常用的人类PC细胞系，发现SM和NIR-SM之间的IC50没有明显差异，范围从1到7μM，差异取决于用于测定的细胞类型。我们使用0.25μM低浓度NIR-SM，这对PC细胞的生长具有边际效应，但它使C4-2B背景中的控制PC细胞和AA/EZ耐药PC细胞对AA和EZ的细胞毒性作用的敏感性增加4-5倍(表1)。
表1 NIR-SM增强对AA和EZ耐药型(原初型)C4-2BPC细胞(体外2D单层培养)的敏感性
使用来自人类PC患者的体外繁殖的CTC，我们发现NIR-SM的IC50值比SM低约4倍，分别为5和20μM。最显着的是，我们发现当PC细胞暴露于等量摩尔浓度的这些他汀类药物时，NIR-SM(而非SM)显着增强AA，EZ或DT所施加的细胞毒性(增强21至122倍)，这是治疗CRPC和mCRPC患者最常用的三种药物(图1)。
我们通过记录BSP，OATP携带者的竞争性抑制剂或特定异构体的基因敲除可以完全消除癌症细胞中NIR-药物结合物的摄取和保留，证实了OATP在介导PC细胞中NIR-药物结合物摄取中的作用。OATPs药物载体。我们证实了OATP在介导PC细胞摄取近红外药物偶联体的作用，记录发现近红外药物偶联体在癌细胞中的摄取和保留可通过BSP(一种OATP载体的竞争性抑制剂)或通过特异亚型的OATP药物载体基因阻断而完全消除。
此外，我们进行了研究，其中通过液相色谱质谱(LC-MS)在PC细胞中识别了NIR染料、SM和NIR-SM。NIR、SM和NIR-SM的HPLC保留时间分别为25.5,27.5和35分钟。通过MS测定，这些化合物在细胞中的相应分子量为705,419和1,105道尔顿。通过在782nm处对NIR-SM信号进行紫外吸收，我们得到了一条标准曲线，吸光度线性范围从1到14μM(r＝0.99)，发现NIR-SM在PC细胞中的累积在PC3D球体中比PC2D单层球体中平均高出5倍。
方法:不受理论束缚的情况下，PC细胞作为3D球体生长是NIR-SM研究的首选模型，原因如下：1)体外繁殖的CTC生长为3D球体，表达干细胞，NE和EMT基因，在具有攻击性和抗药性的PC细胞中代表性很强。我们观察到CTC培养为3D球状体，在小鼠的培养和转移中表现出侵袭性迁移表型；2)具有干细胞表型的PC细胞可能在癌症生长、转移和对治疗的抗性中具有起始作用，并且是靶向的重要细胞群。这些细胞通常对激素和化疗有抵抗力；3)我们观察到，生长为3D球状体的PC细胞在治疗反应和増敏方面，NIR-SM跟SM相比表现出显着的差异，CTC生长为3D球体，在体外受AA，EZ或DT的攻击(图1)；4)PC对激素和化学疗法的治疗抗性可以通过PC细胞的3D球状体生长来解释。由于CTC不能作为2D单层生长，我们建立了CRPC细胞系C4-2B，在3D球体和2D单层中生长，细胞在基础培养基(2D)中生长，转换为富含bFGF和EGF的培养基(3D)，数据未显示)。我们已经验证了这种细胞系以及来源于患者的CTC。我们还进行了表征研究，其中使用常规细胞遗传学方法确定细胞系的染色体G-带。在不受理论束缚的情况下，我们发现，与CTC相比，在2D和3D培养条件下使用C4-2B细胞可以提供与通常生长为2D单层的其他PC细胞系的更好比较。培养CTC/C4-B并暴露于SM或NIR-SM(图2，化合物1和2的化学结构)1小时。通过LC-MS测定NIR-SM和SM及其代谢物的摄取和保留，以确认PC细胞中母体化合物及其代谢物的化学结构。将PC细胞暴露于NIR-SM和SM，持续15分钟(摄取)至2小时(保留)，并在用乙腈和水(亲水性部分)提取，然后用氯仿：甲醇(3：1v/v)(疏水性部分)提取后定量分析细胞中的母体化合物及其代谢物。最后，将沉淀物超声处理，离心并蒸发，以通过MS分析大分子结合部分。使用标准方式进行化学分析。
为了确定OATP和ABC转运蛋白在CTC/C4-2B中的流入/流出作用，我们在CTC/C4-B模型中对选定的OATP，OATP1B3，OATP1A4和ABC转运蛋白1B1进行基因阻断。在单独的实验中，我们还将细胞暴露于OATP竞争性抑制剂，BSP和/或ABC转运蛋白抑制剂(干扰膜脂和吩噻嗪)，以确定OATP和ABC转运膜载体的作用，这种载体将量化NIR-SMSM的流入和流出。我们还通过暴露于NIR-SM或SM的PC细胞中的LC-MS分析AA，EZ或DT及其代谢物的存在。这些研究使我们能够评估NIR-SM或SM是否可能与AA，EZ或DT竞争，充当OATP或ABC转运蛋白载体以进入PC细胞。或者，NIR-SM或SM可降低膜胆固醇水平，改变膜载体分布和药物转运的亲合力，以增强细胞中AA，EZ或DT的摄取和保留。我们将细胞内的药物浓度与其在PC细胞中的生长抑制相关联，以确定NIR-SM增强AA，EZ或DT的敏感性是否可以通过增加细胞中的总体药物摄取和保留来解释。
在不受理论束缚的情况下，我们假设与3DCTC球体中的SM相比，NIR-SM的摄取增加。这种增加的摄取可以通过3DCTC球体中升高的OATP和ABC转运蛋白来解释。在不受理论束缚的情况下，我们假设这些膜载体对于PC细胞中NIR-SM和SM的转运和保留是重要的。在不受理论束缚的情况下，通过分别用BSP或吩噻嗪或通过基因沉默方法干扰OATP或ABC转运蛋白，我们假设NIR-SM和SM的摄取将被抑制。在不受理论束缚的情况下，我们假设相较于2DC4-2B条件下，3DCTC/C4-2B球体中NIR-SM的保留水平显著高于SM的保留水平，这可能是由于3D条件下的缺氧使得OATP和ABC转运蛋白表达水平更高。或者，在不受理论束缚的情况下，3DCTC/C4-2B球体中NIR-SM积累增加而SM没有增加，其原因可以通过NIR-SM的结构特征来解释，因为一旦NIR-SM进入PC细胞，它就会形成一个不与细胞内的核酸和蛋白质共价的紧密复合体。在不受理论束缚的情况下，我们假设用NIR-SM处理的细胞中AA，EZ或DT平行增加，但在SM处理的细胞和2D中增长较小，可能是由于升高的OATP和ABC转运蛋白造成。在不受理论的束缚情况下，我们假设单靠药物浓度不能解释所观察到的増敏作用，而是细胞内药物积累加上细胞内SM对细胞生长，存活和凋亡机制的直接作用所产生的综合效应，可以解释PC细胞对AA、EZ或DT的敏感性增强。
实例10
简介：我们的目标是比较NIR-SM和SM在AA，EZ或DT治疗的小鼠PC异种移植物生长増敏方面的有效性。与在体内肝脏中随机分布并作用于肝脏以降低血清胆固醇的SM不同，与其肿瘤靶向配体相比，NIR-SM优先保留在肿瘤中并在肿瘤细胞上局部发挥其细胞毒性作用。由于NIR-SM而非SM对耐药性肿瘤细胞对AA，EZ或DT的生长抑制的敏感作用，在本研究中我们测试了在小鼠的PC肿瘤异种移植物中是否观察到类似的作用。本研究在增强AA，EZ或DT在小鼠PC肿瘤模型中的疗效方面，通过SM和NIR-SM面对面的直接比较收集数据。
方法：我们已经从PC患者中建立了11个体外繁殖的CTC。这些细胞系在sc、原位和骨内部位形成肿瘤的能力很强，效率范围为50-100％。代表性CTC来源的s.c.异种移植物(缩写为CDX)，对PC标记物AR，PSA和PSMA染色呈阳性(图3)。我们用荧光素酶对其中一个CTC进行遗传标记，当原位注射时，它会转移到远处的器官。我们分析了CTC的基因表达，并将它们与惰性PC细胞(如LNCaP)进行了比较，我们发现这些细胞表达的基因通常与侵袭性表型相关，即转移起始细胞(MIC)。这是来自两个不同患者的两个CTC克隆的蛋白质谱(图4)。当与惰性系DC-1(通过患有局部疾病的PC患者建立)或LNCaP细胞相比时，发现CTC克隆表达通过蛋白质印迹检测的基因，通常与侵袭性致癌功能相关，例如上皮至间质转换(EMT)、干细胞特性和神经内分泌(NE)。这些CTC和CDX模型用于测试NIR-SM的有效性。不受理论的束缚，我们假设其直接作用于PC肿瘤。图5显示培养的NIR-SM染色的PC细胞，以2D单层(PC-3细胞)或3DCTC球状体生长。发现NIR-SM仅在体内存在于肿瘤中，通过小鼠皮下PC-3肿瘤的荧光成像可以检测到。
荧光素酶标记的CTC和C4-2B用于本发明体内研究。这些细胞在体外被表征为3D球状体，通过显著降低它们对AA、EZ或DT施加的细胞毒性作用的IC50，这些细胞在体外对NIR-SM有反应。它们还在肿瘤细胞接种部位形成稳健的孤立异种移植肿瘤或CDX。为了保存本研究中使用的小鼠数量，我们采用两步法：首先，我们进行了一项试验性研究，以解决皮下PC肿瘤是否对NIR-SM对当前PC治疗方案AA和EZ或DT敏感的问题。四组雄性无胸腺裸鼠(CharlesRiver，Inc)在6至8周龄之间(48只小鼠/组，每只小鼠接种两只肿瘤/小鼠)，接受皮下注射。肿瘤细胞接种(1x106个CTC)。在胰腺癌中转基因KrasLSL.G12D/+；p53R172H/+；PdxCretg/+(或KPC)模型中，我们检测到具有NIR-SM荧光成像的肿瘤，估计为1.1mm(图6)。小鼠随机每日给予载体AA(15mg/kg，x5)，EZ(10mg/kg，x5)或DT(15mg/kg，x3)(12只小鼠/组)。在这些随机治疗中，将小鼠分为两组，一半小鼠(每组6只小鼠或12个肿瘤)接受载体，另一半每日接受NIR-SM(8mg/kg，x2)以测试NIR–SM是否比AA，EZ或DT对肿瘤消退效果更好。我们每两周通过生物发光成像监测肿瘤大小，肿瘤大小也通过每周一次的卡尺测量。在12周观察期结束时，杀死小鼠并收留肿瘤进行常规H/E和IHC分析。特别关注细胞增殖(Ki67)，细胞凋亡(TUNEL，半胱天冬酶)，血管生成(CD34)，以及与肿瘤侵袭性相关的肿瘤标志物的表达；标志物对PC(AR，PSMA，PSA)具有指示作用。
在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM在抑制小鼠CDX生长方面比SM更有效。在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM进一步增强了CDX肿瘤的消退。在不受理论的束缚的情况下，不同的治疗剂在増敏方面可能存在差异，如果体外发现的这种差异在小鼠体内重现，我们假设NIR-SM在逆转抗性方面最有效，对DT有更大的疗效，其次是AA，对EZ増敏效果较差。在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM诱导的肿瘤消退增强趋势在CDXs和C4-2B肿瘤中相同，前提是我们用于接种的C4-2B肿瘤细胞系保持为3D球体体外生长。在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM可能使作为3D球体生长的PC特别敏感，但2D单层的敏感性较低，原因在于OATP和ABC转运蛋白的表达，其可以通过缺氧调节。与2D单层培养相比，3D球体在这种情况下更具相关性。
在不受理论束缚的情况下，我们假设从用NIR-SM+AA，EZ或DT(而非SM)组合处理的小鼠收留的肿瘤的凋亡基因表达增加，而增殖、存活和血管生成基因和生物标记物表达降低。在不受理论束缚的情况下，我们还假设NIR-SM可以减少PC细胞中侵袭性相关基因的表达。在不受理论束缚的情况下，我们假设与载体对照相比，经过治疗的肿瘤会发生PC表型逆转，即肿瘤中的PC细胞可能会经历EMT逆转(称为MET)，并伴随干细胞性和NE生物标志物表达减少。
体外繁殖的CTC及其CDX是新的肿瘤模型，其行为需要仔细监测和记录。例如，我们注意到一些CTC在培养中不表达AR和AR靶向基因，但在CTC来源的CDX中获得AR和AR靶向基因表达。
实例11
简介：我们的目标是开发口服生物可利用的NIR-交联-SM，将其置入HMGCR酶的活性袋并使用PC细胞和动物模型进行临床前研究。我们需要解决的挑战是，我们是否可以开发一种口服生物可利用的替代品，可用于对PC患者进行AA，EZ或DT治疗的増敏。我们检查了他汀类药物靶标HMGCR的晶体结构，并基于这种结构，我们设计了一种稳定且可以口服的生物可利用的SM偶联体NIR-Linker-SM(图2，不含交联体的化合物3和带交联体的化合物4)，在上述模型系统中合成、表征和测试。
我们已经基于HMGCR的晶体结构合成并表征了两种新的SM偶联体(图7)。我们将有或没有交联体的NIR-Linker-SM(近红外-交联体-辛伐他汀)的生物学活性与肿瘤靶向近红外染料进行比较。活性SM通过醚而不是酯键与近红外染料连接，所述酯键具有可变长度和亲水性的交联体，所述交联体由线性饱和烃链(-CH2n-，n＝3-8)或聚乙二醇组成(-CH2CH2O)n-，n＝2,4,6,8,12)。通过LC-MS确认这些偶联体的身份，并使用常规方案测试其准备口服递送的酸稳定性。
方法：我们研究化学合成的和LC-MS表征的NIR-Linker-SM的生物活性，其具有如上所述的可变交联体。我们描述了它们在3D CTC球体上的生物活性。基于它们协同AA，EZ或DT的生长抑制作用的活性，我们选择最佳的偶联体用于额外的体外和体内研究。主要研究内容包括：1)确保生物活性物NIR-Linker-SM可在PC细胞中检测到，而无需酶降解的证据；2)比较2D和3D培养的CTC/C4-2B中NIR-Linker-SM与NIR-SM的IC50；3)确定NIR-Linker-SM和NIR-SM的体外酸稳定性，并确保口服途径给予生物的可利用性；4)确定在小鼠的PC肿瘤和CDX中是否可以检测到NIR-Linker-SM但不能检测到完整或水解的NIR-SM。
在不受理论约束的情况下，基于HMGCR的晶体结构，我们假设具有交联体的NIR-SM将比没有交联体的NIR-SM更有效。在不受理论约束的情况下，我们假设NIR-Linker-SM是酸稳定的。在不受理论约束的情况下，当口服给药时，我们假设NIR-Linker-SM(而非SM)能作为完整分子在细胞和肿瘤中检测到。这些结果支持这样的观点，即只要SM能够进入HMGCR的活性中心，新的NIR-Linker-SM在口服递送时达到目标并且作为完整的偶联体发挥其活性，而不需要在肿瘤细胞中对SM进行局部酶释放。
虽然我们具有合成和表征新NIR-Linker-SM的能力，但是只能在没有酶消化的情况下通过该偶联体直接抑制HMGCR的活性，并只能在细胞中进行生物学测试和确认。我们应用额外的计算模型来使用具有不同化学特性的不同交联体合成额外的NIR-Linker-SM。我们选择基于肽的交联体进行进一步的合成改进以优化NIR-SM偶联体的药代动力学参数。使用分子建模来帮助设计和评估肽键。交联体模块包括具有单个或多个氨基酸的可切割和不可切割的肽序列，以优化药物结合，溶解度和清除特性。
实例12
简介：我们的目标是确定NIR-SM偶联体在PC细胞系和体内肿瘤模型中通过AA，EZ或DT重新増敏生长抑制的分子机制。在不受理论束缚的情况下，我们假设NIR-SM偶联体是通过增加SM的摄取和积累来克服治疗抗性，并且似乎与AA和EZ协同作用以中断AR信号传导，并且用DT阻断有丝分裂和细胞间信号中的微管组装。此外，AA，EZ或DT抑制作用通过SM直接作用得到增强，其可以阻断小G蛋白(如Ras，Rho和Rac)的异戊二烯化和脂筏介导的PC细胞中PI3K-Akt的活性。可以使用胆固醇特征检测NIR-SM在AA、EZ或DT治疗方面的増敏效果，这在评估PC毒力和NIR-SM响应性方面具有预测价值。
实例13
简介：我们的目标是确定NIR-SM在抑制小G蛋白，Ras，Rho和Rac异戊二烯化中阻断AR细胞和Akt介导的PC细胞中的信号传导和微管动力学方面是否比SM更有效。通过降低宿主肝脏中的胆固醇生物合成，已经识别了大量SM靶标。在此，我们验证NIR-SM是否比SM更有效地增强AA和EZ阻断AR信号通路和抵抗DT诱导的微管信号网络。我们证实了NIR-SM对G蛋白异戊烯化和脂筏微区的PI3K-Akt活化的直接作用，并最终改变PC细胞，3D CTC球体和CDX的生长、存活、侵袭和转移。Freeman实验室以前的工作表明，高胆固醇饮食可以增加PC肿瘤的生长，降低血清胆固醇可以减少PC生长，降低PI3K-Akt通路活性，抑制肿瘤血管生成。我们通过证明高胆固醇血症小鼠显示PC骨转移的发生率和早期发作以及CTC数量增加来扩展这些观察结果(图8)。在过去的一年中，Chung和Freeman研究了是否可以使用反映胆固醇体内平衡和他汀类药物反应性的基因表达特征来预测对PC细胞的SM效应。You博士和Freeman最近描述了一种基于使用前所未有的大型转录组数据集开发的算法新型PC子类型系统。在该研究中识别的三种亚型显示出不同的基因本体谱，这意味着对胆固醇代谢的操纵具有不同的敏感性。在另外的实验中，我们定义了对NIR-SM敏感性的基因表达特征，并且我们使用动物模型和临床标本测试该特征的预测值。
方法：为了检查AR信号是否可被NIR-SM加AA或EZ比SM加AA或EZ更有效地扰乱，我们使用充分表征的ARE-报告系统，例如PSA-荧光素酶(PSA-Luc)。稳定转导C4-2B 3-D球体作为评估AR转录活性的模型。在分别用R1881或载体处理的细胞中测量该模型的阳性和阴性对照。PSA-Luc在稳定的PSA-luc表达的C4-2B 3-D球状体中测量，在存在或不存在NIR-SM或SM的情况下用AA或EZ处理。
根据公开的方案，在存在或不存在DT的情况下，在NIR-SM或SM处理的PC细胞中测量微管动力学。通过荧光成像方法评估微管动力学，其中免疫标记的微管蛋白是用于使用已建立的方案在DT存在下测量的极化强制产生，收缩性和对基质硬度响应的测量读数。我们已经证明DT增强微管极化并抑制微管长度的收缩。我们测试了其他药剂，如诺考达唑和长春新碱，在不受理论束缚的情况下，我们假设这些药剂能阻断微管蛋白聚合成微管，冷温可导致微管快速解聚。通过这些对照，我们确定NIR-SM或SM在增强DT活性方面以及促进PC细胞中的微管聚合方面是否可能不同。
为了确定蛋白质异戊烯化是否可能受到NIR-SM加AA、EZ或DT与SM加AA、EZ或DT的不同影响，我们使用非放射性液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法。通过使用Cu催化的炔叠氮化物环加成(CuAAC)反应，用荧光或亲和标签生物正交标记异戊二烯基蛋白来测定蛋白质异戊烯化。简而言之，用C15Alk-OPP(一种类异戊二烯类似物)预先将细胞暴露于代谢标记。将标记的细胞透化，然后通过CuAAC反应与荧光探针，5-Fam-PEG-N3或亲和标签，偶氮-偶氮-生物素进行化学反应。为了对亚苯基进行成像和定量，通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析荧光标签标记的细胞。对于异戊二烯化水平的蛋白质特异性定量，亲和标记标记的蛋白质通过链霉抗生物素蛋白亲和纯化，然后进行蛋白质消化和LC-MS/MS特异性富集。随后，进行无标记定量以确定在不同条件下>100个异戊烯化蛋白的相对异戊二烯化水平。
为了确定NIR-SM在抑制脂筏部分中的PI3K-Akt磷酸化和诱导PC细胞凋亡方面是否比SM更有效，我们使用先前确定的方法，通过无细胞提取物试验检测PI3K-Akt磷酸化和激酶活性，使用DNA片段化、TUNEL和半胱天冬酶活性试验检测细胞凋亡。
在不受理论约束的情况下，我们假设NIR-SM在生长抑制和凋亡活性，减少AR介导的转录活性，微管蛋白聚合和小G蛋白如Ras，Rho和Rac的异戊烯化，和PI3K-Akt在细胞和脂筏组分中的活性方面优于SM。在不受理论束缚的情况下，我们假设通过共同管理AA，EZ或DT进一步增强这些广泛的活动。为了确定这些由NIR-SM和SM(加或不加AA，EZ或DT)改变的细胞功能是否是特别因为细胞膜胆固醇的降低造成的，我们调查外源性添加胆固醇或4-甲羟戊酸是否可以逆转这些细胞的改变功能。
实例14
简介:我们的目标是在培养的3-D CTC/C4-2B球体和CDX/C4-2B中使用NIR-SM和SM确立胆固醇敏感特征。评估胆固醇对其他过程的敏感性之间的关系，包括雄激素反应和微管动态特征。测试胆固醇敏感性特征与PC患者相关的程度。基因表达谱与计算方法相结合，以解决我们在初步研究中观察到的NIR-SM和SM的差异作用机制。Freeman小组最近使用大量人类PC转录组谱和基于已知疾病相关性的途径激活特征的新算法来开发和验证用于PC的新型亚型系统。他们表明PC可分为三种类型，分别为PCS1，PCS2和PCS3，它们具有腔(PCS1和PCS2)和基础(PCS3)表型。PCS1预后不良，更有可能发展为转移性疾病，包括低Gleasonsum肿瘤。这项研究表明我们能够使用基因表达模式的综合分析来揭示具有临床相关性的新型PC生物学。在这里，我们通过在小鼠中进行NIR-SM和SM处理的3-D CTC/C4-2B球状体和肿瘤植入物的RNA表达谱来采取类似的方法。从这个大型数据集中，我们开发了一个标记，报告对胆固醇操纵的敏感性。我们测试该特征是否可用于预测PC患者的疾病进展。
方法:为了定义胆固醇敏感性特征，我们首先通过使用RNA测序(RNA-seq)用NIR-SM和SM(和适当的对照)处理后分析3-D球状体和异种移植肿瘤来产生全局基因表达谱。评估序列读数的质量，并使用来自Rbioconductor(版本3.3)的FastQC工具(BabrahamBioinformatics，Cambridge，UK)和ShortRead(版本1.30.0)包过滤低质量读数。为了确定转录物的表达水平，我们通过使用Kallisto和tximport R软件包以及(Homo sapiens)基因组的UCSC hg38构建来量化和总结它们。为了减少样本之间的系统偏差，我们将修剪后的M值(TMM)归一化方法应用于基因表达数据。鉴于标准化的表达数据集，我们通过比较NIR-SM，SM和对照处理条件来鉴定差异表达的基因(DEG)。我们使用基于负二项分布的方法，使用错误发现率(FDR)<0.05和倍数变化≥2的标准。来自用NIR-SM处理的DEG表示胆固醇敏感基因，来自SM处理的DEG表示对胆固醇不敏感的基因。然后，我们通过在NIR-SM治疗中从胆固醇敏感基因中减去SM治疗中的胆固醇不敏感基因来定义胆固醇敏感性(CS)特征。减法步骤允许我们通过去除与NIR-SM依赖性基因表达变化无关的SM驱动的基因表达变化来改进胆固醇敏感性特征。我们通过qRT-PCR和使用3D球体培养物的蛋白质印迹分析来验证CS特征中基因子集的基因和蛋白质表达。
接下来，我们评估CS签名与我们从文献和/或公共或专有数据库检索(并且有时提炼)的其他签名之间的关系，包括AR响应性，微管动力学以及我们指定为与此相关的其他签名。使用我们已经组合和描述的1,321名PC患者的基因表达谱提取三种特征的表达水平。我们计算CS特征与其他疾病相关特征的关系，以及我们之前使用Z评分方法在这个大型队列中进行的子类型分配。使用散点图和回归曲线显示和检查相关模式(图9)。
为了确定CS特征是否预测人PC中的“胆固醇敏感性”或“胆固醇抗性”，我们调查基于CS特征的分类器是否可以使用应用于PC群组的朴素贝叶斯算法将PC患者(以上1,321名患者)分成两类。在同一群组中使用10倍交叉验证方法和ROC曲线分析评估分类器准确度。此外，我们分析来自癌症细胞系百科全书(CCLE)和11个PC小鼠模型的8个人PC细胞系，并评估病理特征与分类结果之间的任何相关性，以确定CS特征衍生分类是否与预先的PC临床模型相关。
为了确定CS特征的预后相关性，我们研究了来自CS特征的分类器在DecipherGRIDTM群组中改进了多少临床结果的预测。具体而言，我们使用肿瘤分级，转移率和PC特性死亡率(PCSM)的Cox比例风险模型评估CS特征在ADT治疗后预测临床进展风险的能力。通过10倍交叉验证方法的ROC分析证实了与显著的进展风险相关的CS特征的危害模型。我们还提供了存活ROC曲线下的区域，以便与解密GRIDTM队列直接比较。除了评估ADT反应性后预后的预测能力外，我们还评估了CRPC患者CTC对EZ的反应性。为此，我们进行无监督聚类分析以研究CTC数据集中CS特征中基因的表达模式，其包含来自13个患者的77个完整CTC的单细胞RNA-seq数据。我们应用CS签名派生的分类方案通过分层方法对77个CTC进行聚类。通过具有响应信息的优势比测试，评估来自CS特征的分类器具有高概率和低概率的CTC组是否代表对抗雄激素的不同反应。
在不受理论约束的情况下，这些实验提供了当HMGCR被抑制时在PC细胞中引起生长抑制和凋亡的机制的新见解。他们揭示了NIR-SM与SM的差异生物学效应，并提供了一个全面的分析框架来测试NIR-Linker-SM试剂的效力和特异性。
实例15
使用DZ1-18FDG或DZ1-19FDG对肿瘤进行改进的正电子发射断层扫描(PET)成像，DZ1-19FDG的结果显示在图38中。该图显示暴露于DZ1-19FDG的小鼠中的人肺肿瘤(右图)，与左图所示的含有64Cu(DZ-1-DOTA)的成像剂相比，其显示了小鼠肝脏中解离的64Cu的大量累积物。19FDG(以及类似的18FDG)显示改善的肿瘤PET成像并避免肝脏中不希望的积聚。荧光图像(本发明中，例如，来自小鼠异种移植物的人肺肿瘤信号)可以在3.5小时获得，使用稳定同位素19F代替18F以避免不必要的辐射(两者产生的FDG化合物或其偶联体用于同样的目的，除了没有辐射)。因此，19F结果证明了成像剂的临床可行性，其有利地允许使用18FDG与已知成像剂相比在短时间后成像肿瘤，即在注射后小于约4小时(基于已知的18FT1/2＝110)分钟)后成像。通常，替代品需要更长时间，例如48小时显示在左侧面板上获得的64Cu标记的DZ-1-DOTA图像。由于18F或19F与DZ1-偶联体具有相似性和共价键，DZ1-18FDG或DZ1-19FDG同时具有超过64-Cu标记DOTA的时间减少的优势，进一步消除了放射性核素对肝脏的脱金属作用(避免肝脏毒性)，同时在理想的时间范围内提供良好的成像信号。因此，DZ-1-18FDG可以大大减少在患者中进行PET成像的时间，这可以在注射DZ-1-18FDG作为成像探针后不到一天，少于8小时，少于4小时，少于2小时，小于1小时内或更快的时间内完成。
显像剂的合成:显像剂的合成方法如下。葡萄糖的DZ-1-18FDG或DZ-1-19FDG如下图所示。DZ-1-18FDG或DZ-1-19FDG如下所示形成葡萄糖。18FDG也称为氟脱氧葡萄糖(18F)，氟脱氧葡萄糖F18，氟脱氧葡萄糖，或缩写为[18F]FDG，18F-FDG)。同样地，19FDG同样是氟脱氧葡萄糖F19。
使用相应的FDG溶液，如下图6所示合成了DZ1-18FDG偶联体，同样合成了DZ1-19FDG偶联体。
方案6合成DZ-1-18FDG
DZ-11(100mg，0.14mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(40mg，0.21mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(23mg，0.17mmol)的混合物溶于5.0ml CH2Cl2溶液中。将混合物搅拌15分钟，然后加入t-boc-酰肼(19mg，0.14mmol)并在室温下再搅拌2小时。减压除去溶剂，产物经C18-RP硅胶色谱纯化，用甲醇-水洗脱，得到DZ-1-Boc-酰肼，为深绿色固体。将产物溶于20％TFA的CH2Cl2(5ml)溶液中2小时，并加入40ml乙醚。收集沉淀物，用乙醚洗涤，真空干燥，得到所需的酰肼产物13,31mg(31％)。质谱(ESI)m/z719.33[M+H]+。
将DZ1-酰肼13(100μg)溶于0.2ml30％冰醋酸的甲醇(v/v)溶液中。将该溶液添加到FDG溶液中。将混合物在60℃下反应30分钟，并通过RPHPLC纯化产物。使用C18反相柱(5μ，150×4.6mm)进行分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定。将流动相从60％溶剂A(0.1％TFA水溶液)和40％溶剂B0.1％三氟乙酸(在80％乙腈水溶液中)改变为100％溶剂B，历时30分钟，流速1ml/分钟。保留时间14.07分钟。对于半制备HPLC分离，可以使用半制备反相色谱柱(5μ，250×10mm)和流速3ml/min。收集合适的反应物并冻干。相同的方法可用于合成[18F]FDG或[19F]FDG。
实例16
ELISA法测定GASP-1或NXN2血清水平及免疫组化染色。
采用Proplex技术的ELISA试剂盒测定血清浓度。试剂盒中包含用于涂覆ELISA板的涂层肽，标准曲线布置的标准肽、生物素化的抗-GASP-1免疫球蛋白(与GASP-1肽形成络合物)，粘接在生物素化免疫球蛋白上的链亲和素-HRP(从Thermo Fisher Scientific购买)，检测ELISA中HRP活性的三甲超色试剂(从Thermo Fisher Scientific购买)。其他使用的溶液包括1％牛血清白蛋白(BSA)置于磷酸盐缓冲液(PBS)中，无菌，缓血酸胺盐溶液含0.05％吐温-20(TBST)，1N硫酸(作为颜色反应的停止液)。ELISA板(微孔板,96孔,PS,ELISA,Microlon 600,高密度结合蛋白，F-底,晶体透明)均可从Microlon公司等市场上买到。
可以类似地使用抗NXN2免疫球蛋白测定NXN2来实施该方法。GASP-1(例如独特的16个氨基酸肽序列EEASPEAVAGVGFESK)抗体或NXN-2抗体可以通过如下方法制备：在兔子中注射选择的核心蛋白肽，收集和纯化血清，比如通过亲和层析获得免疫球蛋白，用于如上所述酶联免疫吸附测定(ELISA)。
用被500μg肽包覆ELISA板(96孔)，在室温下振荡孵育过夜(或者，在室温下孵育2小时)。用BSA封闭未占用的部位，然后用TBST进行洗涤。做两次货三次ELISA实验。用TBST将血清样品1:20稀释。将50μl稀释的血清样品(或标准溶液)加入到涂覆板的孔中。然后将50μl稀释的生物素化抗体依次加入每个孔中。当将稀释的生物素化抗体加入不含肽的孔(对照孔)时启动计时器。将抗体在室温下振荡温育1小时。然后吸出溶液，用TBS-Tween缓冲液洗涤板三次。吸出缓冲液并依次向孔中加入100μl稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP，并振荡孵育1小时。然后吸出溶液，用TBS-Tween缓冲液洗涤板三次。吸出溶液，依次加入100μlTMB超溶液，振荡孵育约30分钟。向每个孔中加入50μl1N硫酸终止液。在450nm处读取孔的吸光度。如果血清样品含有过多的肽/抗原，它们可能提供低读数并且可能必须稀释超过1至20(例如1至40)。用软件分析结果以绘制标准曲线，并且从生成的标准曲线中插入未知数，例如，使用GraphPad，La Jolla，California的一个站点总方程式。细胞和组织的免疫组织化学染色可以通过标准方法进行，如Wu等人所述的方法，见《癌细胞》2017，Vol.31，第3期，第368-382页，其内容作为整体在本发明申请中引用。
实例17
DZ-SIM酰胺可以如下面的反应方案所示合成：向辛伐他汀(1g，2.39mmol，1当量)的乙腈溶液中加入丙烷-1,3-二胺(1mL，11.95mmol，5当量)。将混合物回流并连续搅拌4小时。减压除去溶剂，将产物在高真空下干燥。所得产物5无需进一步纯化即可使用。将DZ1(500mg，0.71mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(204mg，1.07mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(115mg，0.85mmol)的混合物溶解于10.0mLCH2Cl2溶液。将混合物搅拌15分钟，然后加入化合物5(350mg，0.71mmol)并在室温下再搅拌2小时。减压除去溶剂，产物经C18-RP硅胶色谱纯化，用甲醇-水洗脱，得到所需产物6，为深绿色固体327mg(39％)。质谱(ESI)1179.65[M+H]+。
方案2-DZ-SIM酰胺合成的反应方案示意图。
上述各种方法和技术提供了许多方式来执行本发明申请。当然，应该理解，根据申请描述的任何特定实施方案，不一定能够实现所描述的所有目标或优点。例如，本领域技术人员将认识到，可以以实现或优化本申请所指导的一个优点或一组优点的方式执行所述方法，而不必实现本申请所指导或建议的其他目的或优点。本申请提到了各种替代方案。应当理解，一些首选实施方案具体包括一个，另一个或几个特征，而其他首选实施方案具体地排除一个，另一个或几个特征，还有其他首选实施方案通过包括一个，另一个或几个有利特征来弱化特定特征。
此外，专业技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特性的适用性。同样，上述讨论的各种要素、特征和步骤，以及每一种要素、特征或步骤的其他已知对等物，都可以由本领域内的普通技术人员按照本发明描述的原理以各种组合方式使用。在各种要素、特性和步骤中，有些将在不同的实施方案中具体包含，有些则在不同的实施方案中具体排除。
尽管发明申请已在某些实施方案和实例的上下文中公开，但本领域的专业人士将理解，发明申请的实施方案超出了具体公开的实施方案，扩展到其他可选的实施方案和/或用途和修改及其等同物。
本文描述了本申请的首选实施方案，包括发明人已知的用于实施本申请的最佳方式。在阅读前面的描述后，对首选实施方案的变形对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。预期技术人员可以适当地采用这些变化，并且可以以不同于本文具体描述的方式实施本申请。因此，本申请的许多实施方案包括适用法律所允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本申请另有说明或上下文明显矛盾，否则本申请涵盖上述元素的所有可能变型的任何组合。
本发明引用的所有专利，专利申请，专利申请出版物和其他材料，例如文章，专著，说明书，出版物，文件，物品和/或类似物，在此通过整体引用写入本发明。但与有关资料相关的诉讼档案，与本申请不一致或相冲突的任何资料，或者对于现在或今后与本申请权利要求最宽范围可能具有限制性影响的任何资料除外。举例来说，如果与引用资料相关的描述，定义和/或术语使用与本申请的描述，定义和/或术语使用存在任何不一致或冲突，则以本申请的相关内容为准。
可以理解的是，本发明公开申请中的实施方案说明了本申请的实施方案的原理。可以在本申请的范围内作出其他修改。因此，作为示例而非限制，可以根据本申请的教义采用本申请的替代实施方案。因此，本申请的实施方面不仅仅限于所展示和描述的那些实施方案。
以上在具体实施方式中描述了本发明的各种实例。虽然直接描述了上述实例，但是应该理解，本领域技术人员可以设想对本发明给出和描述的特定实施例进行修改和/或更改。落入本说明书范围内的任何此类修改或变化应包含在本发明的范围之内。除非特别说明，否则发明人的意图是说明书和权利要求书中的词语和词句是相关领域内普通技术人员所普遍理解和习惯的含义。
如前所述，申请人对在提交本申请时已知的本发明的各种实施例进行了介绍，其目的在于对内容进行说明和描述。本说明书并非旨在穷举，也不将本发明限制于所公开的精确形式，并且可以根据上述说明进行许多修改和变更。所描述的实例用于解释本发明的原理及其实际应用，并且使得本领域的其他技术人员能够在各种实施中利用本发明并且具有适合于预期的特定用途的各种修改。因此，本发明的意图是不局限于所公开的特定实施方案。
虽然已经显示和描述了本发明的特定实例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本发明的说明，可以在不脱离本发明及其更广的范围内进行改变和修改，因此，所附权利要求在其范围内应包含所有的此类变化和修改，只要这些变化和修改不背离本发明的精髓和范围。

Claims (19)

1.本发明的权利要求包括：
一种染料-治疗性基团偶联体，其基本结构如下图中的分子式所示：
其中：
其中R1和R2可以分别从下列官能团中选取：氢原子、烷基、芳基、芳烷基、烷基磺酸基、烷基羧基、烷氨基、羟基、氨基、氰基、卤素、磺酸基、任何吸电子官能团、以及任何给电子官能团；且可以独立连接到芳香环的任何位置上，例如3,3’,4,4’,5,5’,6,6’；
其中R3和R4可以分别从下列官能团中选取：氢原子、烷基、芳基、芳烷基、烷基磺酸基、烷基羧基、烷氨基、ω-烷氨基、ω-炔基、羟乙氧基、羟乙氧基羧基、ω-羟乙氧基氨基、ω-酰基胺基、ω-酰基赖氨酸基、ω-酰基三唑、ω-羟乙氧基羧基氨基、ω-羟乙氧基羧基赖氨酸基、ω-羟乙氧基羧基三唑、烷基羧基以及治疗性基团；
其中X可以从下列官能团中选取：氢原子、卤素、氰基、甲基、氨基、羟基、4-(2-羧基乙基)苯氧基、以及巯基；
对阴离子A可以从下列官能团中选取：碘、溴、芳基磺酸基、烷基磺酸基、四氟硼酸根、氯、以及与药物配方成分兼容的其他任何阴离子；以及
治疗性基团是一类具有治疗效果的基团，可以从下列物质中选取：铂类药物、化疗药物、小分子物质、肽、蛋白质、聚合物、siRNA、微RNA、纳米颗粒、药物、生物活性分子、生物活性基团、辛伐他汀、顺铂、奥沙利铂、阿霉素、青蒿素、双氢青蒿素和嘌呤霉素，以及上述物质的衍生物。
2.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
3.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
4.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
5.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
6.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
7.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构之一：
8.一种药物配方，其中含有权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，以及至少一种与药物配方兼容的载体。
9.一种在患者体内识别、成像或定位癌细胞或肿瘤的方法，其中包括下列步骤：
提供权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体；
让患者摄入上述染料-治疗性基团偶联体；以及
在癌细胞或者肿瘤位置进行成像。
10.一种治疗或者抑制患者体内癌症的方法，其中包括下列步骤：
提供权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体；以及
让患者摄入上述染料-治疗性基团偶联体。
11.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构：
12.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构：
13.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构：
14.权利要求1中所述的染料-治疗性基团偶联体，具有下列结构：
15.一种在患者体内识别、成像或定位癌细胞或肿瘤的方法，其中包括下列步骤：
提供权利要求14中所述的染料-治疗性基团偶联体；
让患者摄入上述染料-治疗性基团偶联体；以及
在癌细胞或者肿瘤位置进行成像。
16.权利要求9中所述的方法，其中还包括在患者摄入染料-治疗性基团偶联体之前、摄入过程中以及之后的特定时间点上，测定一种或多种流体、血清、患者组织中的GASP-1或NXN2浓度的步骤。
17.权利要求10中所述的方法，其中还包括在患者摄入染料-治疗性基团偶联体之前、摄入过程中以及之后的特定时间点上，测定一种或多种流体、血清、患者组织中的GASP-1或NXN2浓度的步骤。
18.权利要求13中所述的方法，其中患者为具有较高风险的前列腺癌、胰腺癌、肺癌或肾脏癌患者。
19.权利要求14中所述的方法，其中患者为具有较高风险的前列腺癌、胰腺癌、肺癌或肾脏癌患者。
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