JP6552509B2 - 選択的atp阻害剤をカプセル化するシクロデキストリン組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
この出願は、2014年1月14日に出願された米国仮出願第61/927,259号および2014年5月13日に出願された米国仮出願第61/992,572号(これらは、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
この発明は、National Institutes of Healthによって付与された助成金番号R01 CA160771、P30 CA006973およびNCRR UL1 RR 025005の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。この声明は、米国特許法施行規則§401.14(a)(f)(4)にしたがうためだけに含まれたものであり、本出願が1つの発明しか開示および/または権利主張していないとの表明とも承認ともみなされるべきものではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
シクロデキストリン、および一般式:
で表される医薬剤を含む組成物であって、式中、出現毎に独立して、
Xは、ハロゲン化物、スルホネート、カルボキシレート、アルコキシド、またはアミンオキシドを表し、
R 1 は、OR、H、N(R”) 2 、C1〜C6アルキル、C6〜C12アリール、C1〜C6ヘテロアルキル、またはC6〜C12ヘテロアリールを表し、
R”は、H、C1〜C6アルキル、またはC6〜C12アリールを表し、
Rは、H、アルカリ金属、C1〜C6アルキル、C6〜C12アリール、またはC(O)R’を表し、
R’は、H、C1〜C20アルキル、またはC6〜C12アリールを表し、
ここで前記シクロデキストリンは、前記医薬剤をカプセル化する、組成物。
(項目2)
前記シクロデキストリンの少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位が、イオン化可能な化学基で置き換えられた少なくとも1つのヒドロキシル化学基を有する、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位の前記少なくとも1つのヒドロキシル化学基が、C2、C3、およびC6ヒドロキシル化学基からなる群より選択される、項目2に記載の組成物。
(項目4)
前記シクロデキストリンの少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位の前記C2、C3、およびC6ヒドロキシル化学基が、イオン化可能な化学基で置き換えられている、項目3に記載の組成物。
(項目5)
前記シクロデキストリンの前記少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位が、前記シクロデキストリンの2、3、4、5、6、7、8、およびすべてのα−D−グルコピラノシド単位からなる群より選択される、項目1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(項目6)
前記イオン化可能な化学基が、すべての置き換えられた位置で同じである、項目1から5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
前記イオン化可能な化学基が、弱塩基性官能基または弱酸性官能基である、項目1から6のいずれか一項に記載の組成物。
(項目8)
前記弱塩基性官能基(X)が、CH3−X − によって6.5から8.5の間のpK a を有する、項目7に記載の組成物。
(項目9)
前記弱酸性官能基(Y)が、CH 3 −Yによって4.0から6.5の間のpK a を有する、項目7に記載の組成物。
(項目10)
前記弱塩基性官能基または前記弱酸性官能基が、アミノ官能基、エチレンジアミノ官能基、ジメチルエチレンジアミノ官能基、ジメチルアニリノ官能基、ジメチルナフチルアミノ官能基、スクシニル官能基、カルボキシル官能基、スルホニル官能基、およびスルフェート官能基からなる群より選択される、項目7に記載の組成物。
(項目11)
前記シクロデキストリンが、4.0から8.5の間のpK a1 を有する、項目1から10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目12)
液体医薬製剤または固体医薬製剤である、項目1から11のいずれか一項に記載の組成物。
(項目13)
前記医薬剤が、中性に荷電している、または疎水性である、項目1から12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目14)
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンからなる群より選択される、項目1から13のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
(項目15)
前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンである、項目14に記載のリポソーム組成物。
(項目16)
前記医薬剤が、3−ハロピルベートである、項目1から15のいずれか一項に記載の組成物。
(項目17)
前記医薬剤が、3−ブロモピルベートである、項目1から16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
全身投与のために製剤化されている、項目1から17のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
抗がん治療剤をさらに含む、項目1から18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目20)
項目1から19のいずれか一項に記載の組成物、および使用するための指示書を含む、キット。
(項目21)
がんを有する被験体を処置する方法であって、治療有効量の項目1から20のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
(項目22)
前記組成物が、全身投与される、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記全身投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記被験体が、少なくとも1つの追加の抗がん療法で処置される、項目21から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記少なくとも1つの追加の抗がん療法が、放射線療法である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記がんが、固形腫瘍である、項目21から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記がんが、肝がん、膵がん、肺がん、および乳がんからなる群より選択される、項目21から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記がんが、肝がんである、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記被験体が、哺乳動物である、項目21から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目29に記載の方法。
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語および語句を以下に、かつ明細書全体にわたって定義する。
用語「シクロデキストリン」は、トロイダルトポロジー構造を有するC1〜C4結合によって一緒に連結された5つまたはそれ超のα−D−グルコピラノシド単位から構成される環状オリゴ糖のファミリーをいい、トロイドのより大きい開口部およびより小さい開口部が、α−D−グルコピラノシド単位のある特定のヒドロキシル基を周囲環境(例えば、溶媒)に曝露する(例えば、図1を参照)。用語「不活性なシクロデキストリン」は、基本式C6H12O6を有するα−D−グルコピラノシド単位およびいずれの追加の化学的な置換も含まないグルコース構造を含有するシクロデキストリン(例えば、6つのグルコースモノマーを有するα−シクロデキストリン、7つのグルコースモノマーを有するβ−シクロデキストリン、および8つのグルコースモノマーを有するγ−シクロデキストリン)を指す。用語「シクロデキストリン内相」は、シクロデキストリン構造のトロイドトポロジー内に封入されている(すなわち、それによってカプセル化されている)相対的により低い親水性の領域を指す。用語「シクロデキストリン外相」は、シクロデキストリン構造のトロイドトポロジーによって封入されておらず、例えば、in vivoでの全身投与中に存在する水性環境を含むことができる領域、またはそれ自体で選択的ATP産生阻害剤/シクロデキストリン複合体をカプセル化する構造の内相を指す。シクロデキストリンは、疎水性組成物を可溶化するのに有用である(例えば、AlbersおよびMuller(1995年)、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst.、12巻:311〜337頁;ZhangおよびMa(2013年)、Adv. Drug Delivery Rev.、65巻:1215〜1233頁;Laza−Knoerrら(2010年)、J. Drug Targ.、18巻:645〜656頁;Challaら(2005年)、AAPS PharmSci. Tech.、6巻:E329〜357頁;Uekamaら(1998年)、Chem. Rev.、98巻:2045〜2076頁;Szejtli(1998年)、Chem. Rev.、98巻:1743〜1754頁;StellaおよびHe(2008年)、Toxicol. Pathol.、36巻:30〜42頁;RajewskiおよびStella(1996年)、J. Pharm. Sci.、85巻:1142〜1169頁;Thompson(1997年)、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys.、14巻:1〜104頁;ならびにIrieおよびUekama(1997年)、J. Pharm. Sci.、86巻:147〜162頁を参照)。シクロデキストリン内相内に位置した任意の物質は、「カプセル化」されていると言われる。
本発明の一部の実施形態は、シクロデキストリン内のATP産生の選択的阻害剤のカプセル化に関する。用語「ATP産生の選択的阻害剤」は、ATPを生成する酵素プロセスを妨害することによってATP産生を阻害する抗代謝産物剤(例えば、3−ブロモピルベートのような3−ハロピルベートなどのGAPDH阻害剤)を指す。一部の実施形態では、ATP産生の選択的阻害剤は、「抗腫瘍性アルキル化剤」であり、これは、アルキル基による水素の置き換えを引き起こすがん処置で使用される薬剤を指す。本明細書において、用語「アルキル」は、1個の水素原子の除去によって1から20個の間の炭素原子を含有する炭化水素部分から得られる、両端を含むC1〜20の、線状の(すなわち「直鎖」)、分枝状の、または環状の、飽和した、または少なくとも部分的に、および一部の場合では完全に不飽和の(すなわち、アルケニルおよびアルキニル)炭化水素ラジカルを指す。代表的なアルキル基としては、それだけに限らないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、sec−ペンチル、iso−ペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、sec−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−デシル、n−ウンデシル、ドデシルなど、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアレニル基が挙げられる。「分枝状の」は、低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、またはプロピルが、線状アルキル鎖に付着しているアルキル基を指す。「低級アルキル」は、1〜約8個の炭素原子(すなわち、C1〜8アルキル)、例えば、1、2、3、4、5、6、7、または8個の炭素原子を有するアルキル基を指す。「高級アルキル」は、約10〜約20個の炭素原子、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の炭素原子を有するアルキル基を指す。ある特定の実施形態では、「アルキル」は、特に、C1〜8直鎖アルキルを指す。他の実施形態では、「アルキル」は、特に、C1〜8分枝鎖アルキルを指す。
X−CH2−CO−COOH、
によって表されるATP産生の阻害剤を提供し、式中、Xは、ハロゲン化物、スルホネート、カルボキシレート、アルコキシド、またはアミンオキシドを表す。ある特定の実施形態では、Xは、ハロゲン化物であり、フッ化物、臭化物、塩化物、およびヨウ化物からなる群より選択され得る。一実施形態では、阻害剤は、3−ハロピルベートである。ある特定の実施形態では、3−ハロピルベートは、3−フルオロピルベート、3−クロロピルベート、3−ブロモピルベート、および3−ヨードピルベートからなる群より選択される。一実施形態では、3−ハロピルベートは、3−ブロモピルベートである。他の実施形態では、Xは、トリフレート、メシレート、およびトシレートからなる群より選択されるスルホネートである。さらに別の実施形態では、Xは、ジメチルアミンオキシドであるアミンオキシドである。
本発明は、不活性なかつ/または修飾されたシクロデキストリン内にカプセル化された上述したATP産生の選択的阻害剤を含む医薬組成物を提供する。このような複合体は、シクロデキストリン/ATP阻害剤組成物と本明細書で呼ばれる。ATP産生の選択的阻害剤とシクロデキストリンとの比は、1:1であり得、その結果、1つの阻害剤分子は、1つのシクロデキストリン分子と複合体を形成する。代わりに、比は、2:1、3:1、4:1、5:1、またはそれ超であり得る。
シクロデキストリン/ATP阻害剤組成物、およびこれらの製剤を調製する方法は、本発明の化合物を担体、および任意選択で1種または複数の副成分と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、本明細書に記載のATP産生の選択的阻害剤をシクロデキストリンと均一かつ密接に会合させることによって調製される。一般に、このような複合体は、治療剤(例えば、ATP産生の選択的阻害剤を含有する溶液)を滴下添加してシクロデキストリン(例えば、シクロデキストリンを含有する溶液)を攪拌および混合するか、または逆の場合も同様にすることによって得ることができる。阻害剤およびシクロデキストリンを組み合わせることの助けになる多くの混合手段、例えば、限定することなく、超音波処理、ボルテックス、撹拌、加熱、共沈、中和、スラリー化、混練、粉砕などが、当技術分野で公知である。治療剤の物理的性質によって治療剤として溶媒中に溶解した物質または固体物質を使用することが可能である。溶媒についての特定の制限事項はなく、例えば、シクロデキストリン外相と同一の物質を使用することができる。シクロデキストリンと混合される治療剤の量は、組込みの所望レベルに応じて等モル量または異なる比であり得る。一部の実施形態では、ATP産生の選択的阻害剤の絶対量は、シクロデキストリンの量に対して、0.001〜10mol当量、0.01〜1mol当量の間の範囲、または両端を含む任意の範囲であり得る。また、加熱温度についての特定の制限事項はない。例えば、5℃またはそれ超、室温またはそれ超(例えば、20℃またはそれ超も好ましい)は、すべて許容される。
本発明はさらに、がん性腫瘍を含めたがんを防止し、遅延させ、低減し、かつ/または処置する新規治療法を提供する。一実施形態では、処置の方法は、有効量のシクロデキストリン/選択的ATP産生阻害剤組成物を被験体(例えば、それを必要とする被験体)に投与することを含む。それを必要とする被験体として、例えば、前がん性腫瘍、がんを含めた腫瘍と診断された被験体、または以前の処置に対して難治性であった被験体を含めた、処置されている被験体を挙げることができる。
本明細書に記載の選択的ATP産生阻害剤/シクロデキストリン複合体および組成物を組み立てて、がんなどの疾患を処置または防止するのに使用するためのキットまたは医薬品システムにすることができる。一部の実施形態では、3−BrPA−シクロデキストリン複合体および組成物は、がんによって引き起こされる固形悪性疾患を防止または処置するのに使用することができる。一般に、本開示のキットは、本開示の主題による方法を実行するための構成要素、試薬、備品などの一部またはすべてを含有する。キットは、典型的には、望まれない疾患(例えば、固形悪性疾患)を防止し、遅延させ、低減し、または処置するための有効量の複合体を含む。一実施形態では、キットは、本明細書に記載の選択的ATP産生阻害剤/シクロデキストリン複合体および/またはその組成物を含む、少なくとも1つの容器(例えば、カートン、ボトル、バイアル、チューブ、またはアンプル)を含む。典型的には、複合体および/または組成物は、1つまたは複数の容器で供給され、各容器は、固形悪性疾患が後退し、減速し、または停止されるのを可能にする有効量の複合体を含有する。
A.修飾β−シクロデキストリンを合成するための一般的な方法
スクシニル−β−シクロデキストリンは、Sigma Chemical(St.Louis、MO、USA;カタログ番号85990)から購入した。無修飾β−シクロデキストリンおよびα−シクロデキストリンを購入した(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)。
1:1の比のスクシニル−β−シクロデキストリン内にカプセル化した3−BrPAを調製した。3−BrPA(150mg、1mmol)を、スクシニル−ベータ−シクロデキストリンの撹拌溶液(蒸留水中1,500mg)に少しずつ(それぞれ10mg)添加した。添加が完了した後、溶液を室温で1時間超音波処理した。次いで超音波処理した溶液を、25℃にてサーモミキサー(thermomixer)上で一晩振盪させ、ドライアイス−アセトン浴中でフラッシュ凍結させ、凍結乾燥させた。
3−BrPAおよびβ−シクロデキストリン(ビヒクル)は、Sigma Chemical(St.Louis、MO、USA)から購入した。生存度アッセイのために、MiaPaCa−2細胞およびSuit−2細胞を、1ウェル当たり5×103細胞の密度で96−ウェルプレート中に三連で播種した。12時間後、細胞を3−BrPA、CD−3BrPA(0〜150μm)、およびビヒクルの濃度を上昇させて処置した。細胞内ATPレベルを、製造者のプロトコールに従って、Cell Titer−Glo Luminescence Cell Viabilityアッセイキット(Promega、Durham、NC、USA)を使用して測定した。測定は、処置後24時間および72時間に実施した。
合計15匹の動物を、5mg/kgのベータ−CD−3BrPA(1:1の比での)(N=10)またはビヒクル対照(N=5)で毎日注射を受けるようにランダム化した。ベースライン生物発光イメージングにより、すべての動物において腫瘍成長を確認した(5匹の代表的な動物を図4および図5に示す)。腹腔内注射をして2週間後に、すべての動物をフォローアップイメージングに供した。ビヒクルで処置した動物は、生物発光シグナルの強い増大を実証し、腫瘍進行を表した。
ヒト膵がんの2種の細胞株、すなわちMiapaCa−2およびSuit−2を、3−BrPAおよびCD−3−BrPAに対するこれらの応答について試験した。MiaPaCa−2は、局所的に浸潤性のヒト腺癌に由来し、膵臓内に典型的な充実性結節を形成する。これは、ゲムシタビンを含めたいくつかの標準治療抗がん剤に対して顕著な耐性を示すことが公知である。Suit−2は、転移性の肝臓腫瘤から単離された高度に侵襲性の膵臓腫瘍に由来する。これは、浸潤および遊走などの高度に侵襲性の表現型の性質を有する。細胞応答または細胞生存度を、標準的なATP生存度アッセイを使用してアッセイした。各実験は、三連の生体試料を用いて少なくとも2回繰り返した。
ヒト膵がんの胸腺欠損マウスモデルをin vivo試験に使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を安定に発現するヒト膵がん細胞株、MiaPaca−2を、膵臓に同所性に移植した。腫瘍成長および応答を、生物発光イメージングによって監視した。
実施例2〜3に記載した実験を、以下の材料および方法を使用してこれらから得た結果を進めるために拡張した。例えば、膵管腺癌(PDAC)は、世界におけるがん関連死の4番目に最も一般的な原因として並ぶ(Siegelら(2014年)、CA Canc. J. Clin.、64巻:9〜29頁)。患者の大部分は、進行期で診断されるので、治療選択肢は、限られたままであり、予後は、芳しくなく、5年生存率は、5%未満である(Hidalgo(2010年)、New Engl. J. Med.、362巻:1605〜1617頁)。この20年は、膵がんにおける腫瘍形成および疾患進行の理解の著しい前進をもたらし、それは、現在では多様な、かつ多因性の新生物過程として見ることができる(Hidalgo(2010年)、New Engl. J. Med.、362巻:1605〜1617頁;HanahanおよびWeinberg(2011年)、Cell、144巻:646〜674頁)。膵臓腫瘍組織は、コラーゲンに富む、不十分に血管化した、かつ高度に低酸素の、非新生物間質を含めたいくつかの独特の細胞および非細胞要素から構成されている(Chuら(2007年)、J. Cell. Biochem.、101巻:887〜907頁;MahadevanおよびVon Hoff(207)、Mol. Canc. Therapeut.、6巻:1186〜1197頁)。これらの特性は、ゲムシタビンなどの最も一般に使用される全身適用可能な抗がん剤に対する深刻な化学療法耐性と関連する(Muerkosterら(2004年)、Cancer Res.、64巻:1331〜1337頁;YokoiおよびFidler(2004年)、Clin. Canc. Res.、10巻:2299〜2306頁)。特に、エネルギー代謝の変化が、腫瘍微小環境の組織化の原理に最近加えられており、現在では、膵がんの「顕著な特色」として見ることができる(HanahanおよびWeinberg(2011年)、Cell、144巻:646〜674頁;Guillaumondら(2014年)、Arch. Biochem. Biophys、545巻:69〜73頁。がん細胞のエネルギー供給の主軸としての解糖に対する酸素に無関係な依存は、「Warburg効果」として長く知られているが、この状況はまだ、治療目的のために臨床的に活用されていない(Warburgら(1927年)、J. Gen. Physiol.、8巻:519〜530頁;Ganapathy−KanniappanおよびGeschwind(2013年)、Mol. Cancer、12巻:152頁)。3−ブロモピルベート(3−BrPA)、酵素グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)の高度に強力な低分子阻害剤は、モノカルボン酸トランスポーター1(MCT1)によって選択的にがん細胞に入ることができる唯一利用可能な抗解糖薬候補である(Ganapathy−Kanniappanら(2009年)、Anticancer Res.、29巻:4909〜4918頁;Birsoyら(2013年)、Nature Genet.、45巻:104〜108頁)。3−BrPAの抗腫瘍効果は、局所領域療法の設定におけるいくつかのマウス腫瘍モデルにおいて広範に試験および確認されており、腫瘍への供給動脈(tumor−feeding artery)によって、または直接の腫瘍内注射を用いて送達されている(Otaら(2013年)、Target. Oncol.、8巻:145〜151頁;Geschwindら(2002年)、Canc. Res.、62巻:3909〜3913頁)。しかし、そのアルキル化の性質に起因して、3−BrPAは、治療用量で全身送達される場合、有意な毒性を実証しており、これはひいては、がん患者におけるこの薬物の臨床開発および使用を妨害し得る(Changら(2007年)、Acad. Radiol.、14巻:85〜92頁;Caoら(2008年)、Clin. Canc. Res.、14巻:1831〜1839頁)。
以下の一次抗体を使用した:ウサギ抗−MMP−9ポリクローナル抗体(pAB)#3852(Cell Signaling)、DAPI #D1306(Invitrogen)、Alexa Fluor 568 Phalloidin #12380(Life Technologies)、GAPDH(14C10)モノクローナルAB(mAB)Alexa Fluor 488 Conjugate #3906(Cell Signaling)、GAPDH pAB #sc−47724(Santa Cruz)、切断カスパーゼ−3 pAB #9661(Cell Signaling)、MCT−1 pAB #sc50324(Santa Cruz)、およびKi−67キット/抗体(Dako Inc.)。以下の二次抗体を使用した:ヤギ抗ウサギIgG HRP−結合体化 #7074(Santa Cruz)、抗ウサギIgG(H+L)、F(ab’)2断片PE結合体 #8885(Cell Signaling)、およびヤギ抗マウスIgG−FITC #sc2010。以下の化学物質を使用した:3−ブロモピルビン酸(3−bromopyruvatic acid)(3−BrPA、Sigma Aldrich)、ゲムシタビン塩酸塩(LC Laboratories)、スクシニル−β−シクロデキストリン(β−CD、Sigma Aldrich)、およびD−ルシフェリンカリウム塩(Gold Biotechnology、St Louis、MO、USA)。以下の細胞培養試薬を使用した:RPMI−1640(Life Technologies)、MEM(Life Technologies)、ウシ胎児血清(FBS、Thermo Scientific)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma Aldrich)、コラーゲンIラット尾部(BD Biosciences、#354326)、および制御雰囲気チャンバー(controlled atmosphere chamber)(Plas.Labs)。以下の浸潤アッセイ試薬を使用した:マトリゲル基底膜マトリックス(BD Biosciences)、およびマトリゲル浸潤チャンバートランスウェルポリカーボネート膜インサート(Corning)。以下のキットを使用した:CellTiter−Glo発光細胞生存度アッセイキット(Promega)、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイキット(Promega)、2D quantキット(GE Healthcare)、histostain plus 3rd gen ICH検出キット(Invitrogen)、およびdiff quik染色キット(Polysciences Inc.)。以下のイメージング装置を使用した:Zeiss 700 LSM共焦点顕微鏡、Olympus IX81倒立顕微鏡、Eclipse TS100倒立顕微鏡(Nikon)、およびIVIS200(Xenogen Corp.、Alameda、CA)。
β−CD中にカプセル化された3−BrPAを調製するために、3−BrPA(166mg、1mM)を、β−CDの撹拌溶液(DI水20ml中918mg)に少しずつ(それぞれ10mg)添加した。添加が完了した後、溶液を50℃で1時間超音波処理した。次いで超音波処理した溶液を、25℃にてサーモミキサー上で一晩振盪させ、ドライアイス−アセトン浴中でフラッシュ凍結させ、凍結乾燥させた。凍結乾燥した複合体を、さらなる生物学的および生物物理学的試験のためにそのまま使用した。1H NMR実験を、Bruker Avance分光計で400MHzにて実施した。NMRスペクトルを99.9% D2O中で記録した、これをテトラメチルシラン(tetramethysilance)(TMS)と比べた百万分率の低磁場で報告する。β−CD単独、3−BrPA単独、または3−BrPAおよびβ−CDの複合体の10mM溶液を、内部標準として1% DSS(3−(トリメチルシリル)−1−プロパンスルホン酸、ナトリウム塩;Sigma Aldrich)を用いて調製した。スペクトルを、32スキャンで25℃にて記録した。メチレンプロトンの高磁場シフト(0.1ppm)が、複合体化の後に観察された(図7を参照)。
2種のヒト膵腺癌細胞株、lucMiaPaCa−2(ルシフェラーゼ−アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子を安定にトランスフェクトした、Phuoc T.Tran博士によって快く提供された)およびSuit−2(Shinichi Ota博士、日本によって快く提供された)を、ともに10% FBSおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した、それぞれRPMIまたはMEM培地中で培養した。細胞生存度に対する異なる薬物の効果を、発光ベースキット(CellTiter−Glo、Promega)およびマルチラブル(multilable)96−ウェルプレート(Costar)を使用して細胞内アデノシン三リン酸(ATP)レベルを定量化することによって決定した。lucMiaPaCa−2細胞におけるこの発光(luminiscence)ベースキットを使用する生存度測定の精度および再現性を、デュアルレポーターアッセイキット(Promega)を使用して確認した。簡単に説明すると、5×103個の細胞を三連で播種し、正常酸素または低酸素(1% O2−レベル、制御雰囲気チャンバー内でCO2および窒素でバランスを取った)条件下で72時間インキュベートした。示した量の遊離3−BrPA、1:1−β−CD−3−BrPA、または対照としてのβ−CDを、PBS中に溶解させ、24時間の処置にわたって培地に添加した。ゲムシタビンを用いた実験については、細胞を24時間インキュベートした後、薬物に72時間曝露した。細胞生存度を製造者のプロトコールに従って決定した。
コラーゲン1−ベース3D器官型細胞培養物を使用して、細胞外マトリックス(ECM)に富む環境(environement)を模倣し、腫瘍浸潤に対する3−BrPAの効果を試験した(Cheungら(2013年)、Cell、155巻:1639〜1651頁;Nguyen−NgocおよびEwald(2013年)、J. Microscop.、251巻:212〜223頁)。具体的には、初期に10×DMEM 25μlおよびコラーゲンI(3.83mg/ml)217μlからなっていたコラーゲン溶液を氷上で調製した。pH値は、pH=7.0に到達するように水酸化ナトリウム(Sigma Aldrich)を滴下添加することによって調整した。次いでコラーゲンIを、DMEM F12/GlutaMAX(Life Technologies)を使用して希釈して、3mg/mlの最終濃度にした。コラーゲン溶液15μlを使用して、覆われていないガラス底24ウェルプレート(InVitroScientific)の各ウェルの底部に下層を作り出し、次いでこれを37℃で少なくとも1時間重合させた。残りのコラーゲン溶液を氷上で3〜5時間保って、初期重合を可能にした。合計65×103個のlucMiaPaCa−2または45×103個のSuit−2細胞を、体積150μlのコラーゲン溶液中に再懸濁させた。0.5cmの高さを有するしずく(drop)を作り出すことによって、細胞懸濁液を予熱した下層の上に配置した。コラーゲン−細胞懸濁液を37℃で1時間重合させ、引き続いて細胞培養培地で覆った(Nguyen−NgocおよびEwald(2013年)、J. Microscop.、251巻:212〜223頁)。
3−BrPAの、腫瘍浸潤を阻害する能力を、マトリゲル浸潤アッセイおよびゼラチンザイモグラフィを使用して試験した(HuおよびBeeton(2010年)、J. Visual. Exp.、45巻:2445頁;Scottら(2011年)、J. Visual. Exp.、58巻:e3525頁)。マトリゲル浸潤アッセイについては、0.01M Trisおよび0.7%塩化ナトリウムを含有するコーティング緩衝液を調製し、マトリゲル基底膜(BD Biosciences、#356234)を300ug/mlに希釈するのに使用した。引き続いて、Boydenチャンバー(Transwell、Corning;直径6.5mm、孔サイズ8um)を、マトリゲル溶液100μlでコーティングし、37℃で2時間貯蔵して膠化させた。およそ7.5×104個の細胞を、FBS不含培地500μl中に再懸濁させ、インサートの上方チャンバー中に蒔き、次いでこれを、FBS含有培地750μlを含有する24ウェルプレート中に配置した。37℃で一晩インキュベートした後、PBS中に溶解させた様々な量の3−BrPAを上方チャンバーに添加した。48時間の後に、非浸潤性の細胞を綿スワブでマトリゲルから除去した。透過性インサートの底部側に接着した浸潤した細胞を固定し、Diff Quik Stain Kit(Polysciences Inc.)で染色した。光学顕微鏡法を、4倍、10倍、および20倍の倍率でカラー倒立顕微鏡(Eclipse TS 100)を使用して実施した。細胞の浸潤を、10倍の倍率で、未処置の試料と比較して、処置後の染色された細胞の面積を測定することによって定量化した。
雄の胸腺欠損ヌードマウス(体重、20〜25g;4週齢;Crl:NU(NCr)−Foxn1nu;Charles River Laboratory、Germantown、MD、USA)を、承認された動物管理使用委員会のプロトコール下で施設の指針に従って使用した。マウスを、食物および水を自由に与えて、一定の温度および湿度にて層流室内で維持した。同所性異種移植片腫瘍を、PBS 50μl中に懸濁させた1.5×106個のlucMiaPaCa−2を、麻酔したマウス中の膵臓の尾部に移植することによって生成した。これを達成するために、マウスを、清潔な麻酔導入チャンバー(酸素流量、1リットル/分;3〜4%のイソフルラン濃度)内に配置した。立ち直り反射を喪失した後、動物を外科手術表面上に配置し、そこでノーズコーンを使用して麻酔を維持した(酸素の流れ、0.8リットル/分;イソフルラン濃度、1.5〜2%)。小さい左腹部脇腹切開を行い、膵臓を外面化させて、30G Hamiltonシリンジを使用して細胞溶液を注射した。成功裏の被膜下膵臓内注射は、腹腔内漏出を伴わない流体ブレブの出現によって特定した。腹腔を、非吸収性縫合材料の二重層を用いて閉じた(Kimら(2009年)、Nat. Protocol.、4巻:1670〜1680頁)。
腫瘍生存度を、外科的移植後7日目にin vivo生物発光イメージング(BLI)を介して確認した。麻酔した腫瘍担持マウスに、D−ルシフェリン150mg/kgを腹腔内に注射し、IVIS200システム(Xenogen)を使用して5分後に光学的に画像化した。光子の空間分布を表す疑似カラー画像を、以前に取得したグレースケール写真画像に重ねた。目的の領域(ROI)を、光学的な腫瘍画像を含むように作り出した。シグナル強度を、Living Imageソフトウェア(Xenogen)を使用して、10秒露光した後に、光子/秒/平方センチメートル/ステラジアン(p/s/cm2/Sr)でROI内で定量化した。さらに、腫瘍の同所性の成長を、小動物超音波イメージング(USI)を使用する処置の前に確認した。簡単に説明すると、麻酔したマウスを、40MHz(22〜55MHzを伴う広帯域)でMS−550D MicroScanトランスデューサープローブを適用することによって、VEVO2100(Visual Sonics Inc.、Toronto、カナダ、Harry C.Dietz博士によって快く提供された)を使用する検査に供した。腫瘍局在化を、解剖的な目印として左の腎臓の頭側先端および脾臓の尾側先端を使用して確認した(Otaら(2013年)、Target. Oncol.、8巻:145〜151頁;Tuliら(2012年)、Translat. Oncol.、5巻:77〜84頁)。
LIおよびUSIの両方によって確認された腫瘍を有する動物を、4つの群にランダム化した:群1(N=21匹の動物)は、β−CD−3−BrPA複合体(1:1の分子比の、生理食塩水500μl中に溶解した、26mg/kgのβ−CD中の5mg/kgの3−BrPAでの)の毎日の腹腔内注射を受け、群2(N=7匹の動物)は、ゲムシタビン(文献、例えば、LiauおよびWhang(2008年)、Clin. Canc. Res.、14巻:1470〜1477頁;Larbouretら(2010年)Annal. Oncol.、21巻:98〜103頁に一般に報告されているように、生理食塩水200μl中に溶解した150mg/kg、3回の注射/週)の腹腔内注射を受け、群3(N=7)は、β−CD(生理食塩水500μl中に溶解した26mg/kgのβ−CD)の毎日の腹腔内注射を受け、群4(N=7匹の動物)は、3−BrPA単独(生理食塩水500μl中に溶解した5mg/kg)の毎日の腹腔内注射を受けた。すべての動物を、4週間の期間中断することなく処置した。BLIは、最初の注射後7、14、21、28日目に取得した。動物は、最後のイメージングセッション後28日目に、または瀕死の場合、屠殺した。
動物を屠殺した後、腫瘍を得、少なくとも72時間の期間4%ホルムアルデヒド溶液で固定し、免疫組織化学的分析のためにパラフィン中に包埋した。スライドのヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を、CasadonteおよびCaprioli(2011年)、Nat. Protocol.、6巻:1695〜1709頁に記載されたものなどの標準プロトコールに従って実施した。厚さ18μmの腫瘍切片を、Histostain Plus 3rd Gen IHC Detection Kit(Invitrogen)、およびKi−67キット(Dako Inc.)を使用して、以下の標的、すなわち、GAPDH、MCT−1、切断カスパーゼ−3、およびKi−67について染色した。具体的には、標本を、キシレンを使用して脱パラフィン化し、下降エタノール希釈系列を使用して再び湿潤化させた(rehydrate)。脱イオン水で洗浄した後、試料を、クエン酸塩を含有する沸騰中の回復溶液(retrieval solution)(Dako)中で、95°で40分間透過化した。標本をRTまで冷却し、2滴(合計約100ul)のペルオキシダーゼクエンチング溶液とともに5分間インキュベートし、20分間ブロックした。一次抗体(GAPDH、1:500;MCT−1、1:250;Ki−67およびHIF−1α;1:50、切断カスパーゼ−3、1:1,500;PBS中)とのインキュベーションを、湿室チャンバー内でRTにて60分間行った。ビオチン化二次抗体およびストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体を、それぞれ10分間順に試料に添加した。3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)色素原26.5ulを、DAB基質緩衝液(subtrate buffer)1mlと十分混合し、100ulを5分間各標本に添加した。ヘマトキシリンを対比染色として使用した。インキュベーションステップの後、それぞれ2分間、蒸留水(destilled water)で洗浄し、PBSで2回洗浄した。試料を退色防止封入剤を使用して密閉し、カバースリップで覆った。すべてのスライドを、高分解能Aperio(登録商標)スキャナーシステム(Vista、California、USA)を使用して、20倍の倍率でスキャンし、デジタル化した。次いでデジタル化したスライドを、Aperio ImageScope(登録商標)ソフトウェアを使用して評価した。Ki−67染色組織切片については、合計5〜10の視野を10倍で眺め、Ki−67−陽性細胞の数、および細胞の総数を記録して、Ki−67標識指数(式:指数[%]=[陽性細胞の数/合計細胞数]×100)を計算した。
すべての実験は、独立して実施し、少なくとも3回繰り返した。実験からのデータは、平均±平均の標準誤差でまとめた。データセットの統計的な比較を、スチューデントt−検定および一元配置ANOVA検定によって実施した。報告されたBLIシグナル強度を、動物間で正規化し、ベースライン値に対する倍数として報告した。
3−BrPAとβ−CDとの間の複合体化をNMRで分光学的に確認した後(図7)、薬物のマイクロカプセル化製剤を、さらなる実験のために使用した。用量依存的なATP枯渇および細胞死を達成するマイクロカプセル化3−BrPA(β−CD−3−BrPA)の有効性を評価するために、2種のヒト膵がん細胞株を使用した。MiaPaCa−2は、原発性膵腺癌(PDAC)に由来し、Suit−2は、異なる患者からの転移性原発性膵腺癌に由来した(Kitamuraら(2000年)、Clin. Exp. Metast.、18巻:561〜571頁)。β−CD−3−BrPAの用量依存的効果を遊離3−BrPAおよびゲムシタビンと比較し、β−CDを対照として使用した。低酸素がPDACにおける化学療法耐性(chemooresistance)と関連することが多いので、低酸素曝露を実験設計に加えた(YokoiおよびFidler(2004年)、Clin. Canc. Res.、10巻:2299〜2306頁;Kasuyaら(2011年)、Oncol. Rep.、26巻:1399〜1406頁;Onozukaら(2011年)、Canc. Sci.、102巻:975〜982頁;Zhaoら(2014年)、Canc. Res.、74巻:2455〜2464頁))。β−CD−3−BrPAおよび遊離3−BrPAは、正常酸素(50〜75μM)および低酸素(12.5〜25μM)条件下で同様の細胞傷害性プロファイルを実証し、興味深いことに、低酸素のとき薬物に対してより感受性であることが見出された(図8)。β−CD単独で処置した細胞株は、非常に高い濃度(confentration)に曝露したときでさえ、実験全体にわたって完全に生存可能であった。同様の結果がSuit−2細胞について観察されたが、正常酸素条件と低酸素条件との間の差異はそれほど顕著でなかった(図8)。ゲムシタビンの有効性を評価する場合、MiaPaCa−2細胞およびSuit−2細胞におけるIC50は、正常酸素条件(0.1μM)下でほとんど達成されず、どの濃度も完全な殺傷を達成せず、低酸素は、薬物に対する耐性を増大させるようであった。
全身送達されるβ−CD−3−BrPAの抗がん有効性を、胸腺欠損ヌードマウスにおけるヒト膵がんの異種移植片モデルを使用して試験した。より詳細な試験のための治療用量を選択する前に、腫瘍を担持していない動物における比較による用量漸増試験を、β−CD−3−BrPAおよび遊離3−BrPAの両方について実施した。それに応じて、20mg/kgのβ−CD−3−BrPAおよび10mg/kgの遊離3−BrPAが、単回注射後の半数致死量(LD50)として特定され、5mg/kgのβ−CD−3−BrPAが、7日の過程にわたって全身に、かつ毎日与えたとき、何の毒性も引き起こさなかった安全な用量として特定された。次いで、同所性に移植し、BLIおよびUSIで確認したMiaPaCa−2腫瘍を有する合計42匹の動物を、β−CD−3−BrPA(N=21)、ゲムシタビン(N=7)、またはβ−CD(N=7)の腹腔内(i.p.)注射を受けるようにランダム化した。同所性移植片を有する追加の群の動物(N=7)を遊離3−BrPAで処置した。遊離3−BrPA(生理食塩水500μl中5mg/kg)の毎日の腹腔内(i.p.)注射で処置した動物は、高い処置関連毒性を実証し、3/7(43%)匹の動物が、最初のフォローアップBLIを取得する前に死亡した(図12C)。実験の最後で(28日目)、わずか2/7匹の遊離薬物で処置された動物(28%)が依然として生存していた(図12C)。このような死亡率は、残りの群のいずれについても観察されなかった。β−CD−3−BrPA(生理食塩水500μl中5mg/kg)の毎日のi.p.注射は、強い抗がん効果を実証し、最初の注射後14日目に目に見える早期の効果を伴った(図12B)。4週間の処置の後に、群間のBLIシグナル強度の比較を実施した。β−CD対照で処置した動物は、ベースラインと比較して140倍のシグナル増大を実証した。腫瘍成長の中等度の減速がゲムシタビン処置動物で観察され、時間をわたって60倍シグナルが増大した。最も重要なことに、β−CD−3−BrPAで処置した動物は、ゲムシタビンおよび対照群と比較してシグナルの最小限の進行または進行なしを示した(図12)。このエンドポイントを達成した後、動物を屠殺し、さらなる分析のために腫瘍を回収した。すべての動物を剖検に供し、臓器(脳、心臓、肺、腸、肝臓、および腎臓)を、潜在的な組織損傷を分析するために回収した。臓器毒性も組織損傷も、β−CD−3−BrPAで処置した動物において観察されなかった(図12D)。腫瘍病理の分析により、β−CD−3−BrPAで処置した動物において液化性壊死の中心エリアを伴った広大な腫瘍破壊が実証された(図13)。インタクトな細胞接合部を有する腫瘍領域は、切断カスパーゼ−3の高い発現を実証し、劇症性腫瘍アポトーシスを示した。β−CD−3−BrPAで処置した動物は、Ki67免疫組織化学検査で評価した場合、増殖の有意な低減を実証し、平均は、それぞれ17%および51%であった(図13)。さらに、β−CD−3−BrPAで処置した動物は、β−CDまたはゲムシタビン群と比較して、処置された腫瘍内でMCT1およびGAPDHのより低い発現レベルを実証した。
本願全体にわたって引用したすべての参考文献、特許出願、特許、および公開済み特許出願、ならびに図および配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。いくつかの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書に参照されているが、このような参考文献は、これらの文書のいずれもが、当技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成するという承認を構成するものではないことが理解される。
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣例的な実験しか使用せずに確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるように意図されている。
Claims (22)
- β−シクロデキストリン、および医薬剤を含む組成物であって、ここで、前記医薬剤は3−ハロピルベートであり、前記シクロデキストリンの少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位が、負電荷または正電荷をもたらす化学基で置き換えられた少なくとも1つのヒドロキシル化学基を有し、ここで前記シクロデキストリンは、前記医薬剤をカプセル化し、負電荷または正電荷をもたらす前記化学基が、アミノ官能基、エチレンジアミノ官能基、ジメチルエチレンジアミノ官能基、ジメチルアニリノ官能基、ジメチルナフチルアミノ官能基、スクシニル官能基、ヒドロキシプロピルエーテル官能基、カルボキシル官能基、スルホニル官能基、およびスルフェート官能基からなる群より選択される、組成物。
- 前記少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位の前記少なくとも1つのヒドロキシル化学基が、C2、C3、およびC6ヒドロキシル化学基からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記シクロデキストリンの少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位の前記C2、C3、およびC6ヒドロキシル化学基が、負電荷または正電荷をもたらす化学基で置き換えられている、請求項2に記載の組成物。
- 前記シクロデキストリンの前記少なくとも1つのα−D−グルコピラノシド単位が、前記シクロデキストリンの2、3、4、5、6、7、8、およびすべてのα−D−グルコピラノシド単位からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 負電荷または正電荷をもたらす前記化学基が、すべての置き換えられた位置で同じである、請求項1に記載の組成物。
- 負電荷または正電荷をもたらす前記化学基が、CH3−X−によって6.5から8.5の間のpKaを有する塩基性官能基(X)またはCH3−Yによって4.0から6.5の間のpKaを有する酸性官能基(Y)である、請求項1に記載の組成物。
- 前記シクロデキストリンが、4.0から8.5の間のpKa1を有する、請求項1に記載の組成物。
- 液体医薬製剤または固体医薬製剤である、請求項1に記載の組成物。
- 前記医薬剤が、中性に荷電している、または疎水性である、請求項1に記載の組成物。
- 前記β−シクロデキストリンが、6’モノ−スクシニル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびスクシニル−β−シクロデキストリンからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記医薬剤が、3−ブロモピルベートである、請求項1に記載の組成物。
- 全身投与のために製剤化されている、請求項1に記載の組成物。
- 抗がん治療剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む、キット。
- がんを有する被験体を処置する方法において使用するための組成物であって、治療有効量の請求項1に記載の組成物を含む、組成物。
- 前記組成物が、全身投与される、請求項15に記載の使用のための組成物。
- 前記全身投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与からなる群より選択される、請求項16に記載の使用のための組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1つの追加の抗がん療法と組み合わせて投与される、請求項15に記載の使用のための組成物。
- 前記少なくとも1つの追加の抗がん療法が、放射線療法である、請求項18に記載の使用のための組成物。
- 前記がんが、固形腫瘍である、請求項15に記載の使用のための組成物。
- 前記がんが、肝がん、膵がん、肺がん、および乳がんからなる群より選択される、請求項15に記載の使用のための組成物。
- 前記被験体が、哺乳動物であり、必要に応じてヒトである、請求項15に記載の使用のための組成物。
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