CN117715645A - 用于癌症治疗的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。由此，本发明提供一种新的用于癌症治疗的药物组合物等。

Description

用于癌症治疗的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于癌症治疗的药物组合物等。
背景技术
癌症是日本国内的死亡原因第一位的疾病。一部分的癌症存活率有所改善，但是晚期癌症还没有适当的治疗法，需要开发更有效的治疗法。
环糊精(cyclodextrin:CyD)是一种将葡萄糖以α-1,4键合相连而成的环状麦芽寡糖，并且是能够将各种药物摄取至疏水腔内的单分子的主体分子(Host molecule)。此外，CyD与胆固醇牢固地结合，从细胞膜的脂筏中拔出胆固醇，破坏其结构，因此作为筏(raft)抑制剂被广泛使用。例如，着眼于针对细胞内胆固醇的作用，将2-羟丙基-β-环糊精(2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin:HP-β-CyD)临床应用于遗传性的脂质积蓄病尼曼匹克病(Niemann-Pick)C型(NPC)。
专利文献1(国际公开第2014/087778号)和非专利文献1(Yokoo et al.,PLo SOne,(2015)10(11):e0141946.)中，胆固醇对于肿瘤细胞的增殖、功能保持是必须的，由此假设HP-β-CyD本身具有抗肿瘤作用，通过体外(in vitro)证实了HP-β-CyD本身对白血病细胞的增殖抑制作用。
此处，除了对于癌症细胞有较高的杀细胞效果的抗癌药之外，还期待特别是使抗癌药选择性地且效率良好地送达至目标部位的药物送达系统(Drug delivery system:DDS)的构建。DDS是指控制药物的体内动态且以药物治疗最优化为目标，分类为药物释放行为的控制、药物的吸收促进、向药物的目标组织的靶向等。作为将靶向能力赋予到载体上的方法，已知抗体、糖链、叶酸、转铁蛋白等配体修饰。
其中，叶酸，由于以下优点而作为配体分子被广泛使用：1)价格较低；2)叶酸受体(Folate receptor:FR)由于在各种上皮癌症细胞中过量表达，在正常细胞中表达较低，因此通过FR介导的胞吞作用而癌症细胞选择性地被摄取；3)由于没有抗原性因此可以重复给药；4)由于分子量相对较小因此不易影响载体的细胞内动态等。
专利文献2(日本特开2014-1204号公报)中记载了：对甲基-β-环糊精修饰叶酸，将叶酸修饰甲基化-β-环糊精(FA-M-β-CyD)作为肿瘤细胞选择性的抗癌药来使用。
此外，专利文献3(日本特开2016-69520号公报)中记载了：向具有肿瘤蓄积能力的叶酸修饰环糊精导入亲水性的取代基(例如聚乙二醇基、羟丙基等)而提高溶解性，作为以向癌症的靶向为目标的DDS是有用的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/087778号
专利文献2：日本特开2014-1204号公报
专利文献3：日本特开2016-69520号公报
非专利文献
非专利文献1：Yokoo et al.,PLoS One,(2015)10(11):e0141946.
非专利文献2：Okamatsu et al.,Biomacromolecules,(2013)14,p.4420-4428
发明内容
发明所解决的技术问题
在所述情况下，需要新的用于癌症治疗的药物组合物等。
解决问题的技术手段
本发明人为了解决所述问题而进行反复深入研究的结果是，发现了通过修饰用于对羟烷基化环糊精或其衍生物赋予肿瘤细胞选择性的叶酸，可以提高对于高表达叶酸受体的肿瘤细胞的指向性，发挥更强的抗癌作用等，从而完成了本发明。
此处，提供如下所示的用于癌症治疗的药物组合物等。
[1-1]一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含：选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。
[1-2]根据上述[1-1]所述的药物组合物，其仅包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为有效成分。
[1-3]根据上述[1-1]或[1-2]所述的药物组合物，其中，
所述叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物为叶酸修饰羟丙基环糊精。
[1-4]根据上述[1-3]所述的药物组合物，其中，
所述叶酸修饰羟丙基环糊精为叶酸修饰羟丙基-β-环糊精。
[1-5]根据上述[1-1]～[1-4]中任一项所述的药物组合物，其与ABL酪氨酸激酶抑制剂进行组合来使用。
[1-6]根据上述[1-1]～[1-5]中任一项所述的药物组合物，其中，
所述癌症为白血病。
[1-7]根据上述[1-1]～[1-6]中任一项所述的药物组合物，其为注射剂。
[2-1]一种癌症的治疗方法，其包含：
将包含选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物的组合物给药至需要的对象。
[2-2]根据上述[2-1]所述的方法，其中，
所述组合物仅包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为有效成分。
[2-3]根据上述[2-1]或[2-2]所述的方法，其中，
所述叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物为叶酸修饰羟丙基环糊精。
[2-4]根据上述[2-3]所述的方法，其中，
所述叶酸修饰羟丙基环糊精为叶酸修饰羟丙基-β-环糊精。
[2-5]根据上述[2-1]～[2-4]中任一项所述的方法，其中，
所述组合物与ABL酪氨酸激酶抑制剂进行组合来给药。
[2-6]根据上述[2-1]～[2-5]中任一项所述的方法，其中，
所述癌症为白血病。
[2-7]根据上述[2-1]～[2-6]中任一项所述的方法，其中，
所述组合物为注射剂。
发明的效果
此处，提供一种新的用于癌症治疗的药物组合物。
附图说明
[图1]是表示叶酸受体β(folate receptor-β)的表达通过流式细胞仪(Flowcytometer)解析后的结果的图。
[图2]是表示对白血病细胞株的增殖抑制作用通过MTT实验(MTT assay)进行评价的结果的图。
[图3]是表示对叶酸受体低表达细胞A549的增殖抑制作用进行评价的结果的图。
[图4]是表示对白血病细胞株的增殖抑制作用进行评价的结果的图。
[图5]是表示细胞的凋亡通过Annexin V/PI染色进行评价的结果的图。
[图6]是表示FA-HP-β-CyD被摄取至细胞内的图。
[图7]是表示FA-HP-β-CyD诱导自噬体形成的图。
[图8]是表示通过自噬的抑制而减弱FA-HP-β-CyD的细胞增殖抑制效果的图。
[图9]是表示将FA-HP-β-CyD与伊马替尼(imatinib)或普纳替尼(ponatinib)的组合指数(combination index,CI)使用CalcuSyn软件来计算的结果的图。
[图10]是表示FA-HP-β-CyD使BCR-ABL白血病小鼠的存活时间延长的图。
[图11]是表示FA-HP-β-CyD的MALDI-TOF-MS谱图(实施例1)。
[图12]是表示FA-HP-β-CyD的1H-NMR谱图(实施例1)。
[图13]是表示FA-HP-β-CyD使脑室浸润模型小鼠的存活时间延长的图(一次给药的模型)。
[图14]是表示FA-HP-β-CyD使脑室浸润模型小鼠的存活时间延长的图(两次给药的模型)。
具体实施方式
下文中详细地进行说明。
概要
本发明人等认为通过为了对羟烷基化环糊精赋予肿瘤细胞选择性而修饰叶酸，可以提高对于高表达叶酸受体的肿瘤细胞的指向性，发挥更强的抗癌作用。
本发明人等首先制备了作为叶酸修饰羟烷基化环糊精之一的叶酸修饰H P-β-CyD(FA-HP-β-CyD)(实施例1)。并且，发现了该FA-HP-β-CyD与未修饰的HP-β-CyD相比，以约1/10量显示出等效的抗白血病作用(实施例3)。并且未修饰中HP-β-CyD几乎未被摄取至细胞内，通过叶酸修饰而HP-β-CyD大量地被摄取至细胞内(实施例7，图6)，证明了自噬细胞死亡为抗白血病作用的主要原因(实施例8，图7)。此外，在白血病小鼠模型中，确认了通过FA-HP-β-CyD给药显著地延长存活时间(实施例11和图10)。
已知成为白血病复发的原因的白血病干细胞利用自噬而获得对各种药物的抗药性。此处提供的叶酸修饰羟烷基化环糊精是反其道而行之的，关系到新的癌症治疗方法的开发。
叶酸修饰羟烷基化环糊精
“环糊精(cyclodextrin:CyD)”是指将葡萄糖以α-1,4键相连而成的环状麦芽寡糖，并且是能够将各种药物摄取至疏水腔内的单分子的主体分子。作为CyD，例如，已知6个葡萄糖残基的α-CyD、7个葡萄糖残基的β-CyD、8个葡萄糖残基的γ-CyD、9个葡萄糖残基的δ-CyD、10个葡萄糖残基的ε-CyD及其衍生物等。
“羟烷基化环糊精”是指选自羟丙基环糊精、羟丁基环糊精和羟乙基环糊精中的羟烷基化环糊精。羟烷基化环糊精为环糊精(例如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等)的羟基随机地被羟丙基、羟丁基或羟乙基取代而成的化合物。例如，羟烷基化-β-环糊精是指β-环糊精的7个葡萄糖的2位、3位和6位的羟基随机地被羟烷基取代而成的化合物。
“叶酸修饰羟烷基化环糊精”是指叶酸与羟烷基化环糊精的葡萄糖共价键合而成的化合物。叶酸结合的部位没有特别限定，优选为葡萄糖的2位和/或6位，特别优选为6位。叶酸修饰羟烷基化环糊精中的叶酸结合的比例没有特别限定，优选环糊精分子:叶酸分子为1:1～1:14，更优选为1:1～1:7。优选的叶酸修饰羟烷基化环糊精为叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精。
叶酸修饰羟烷基化环糊精选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精。叶酸修饰羟烷基化环糊精优选为选自叶酸修饰羟丙基-β-环糊精、叶酸修饰羟丁基-β-环糊精和叶酸修饰羟乙基-β-环糊精中的叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精。或者，叶酸修饰羟烷基化环糊精优选为叶酸修饰羟丙基环糊精。叶酸修饰羟烷基化环糊精特别优选为叶酸修饰羟丙基-β-环糊精。
叶酸修饰羟烷基化环糊精的制备方法
叶酸修饰羟烷基化环糊精可以使用公知的方法进行合成。例如，就叶酸修饰羟烷基化-α-环糊精和叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精而言，将羟烷基化-α-环糊精和羟烷基化-β-环糊精的羟基进行氨基化后，通过缩合反应使叶酸结合而合成。此外，例如，就叶酸修饰羟烷基化-γ-环糊精而言，可以通过将羟烷基化-γ-环糊精的羟基进行氨基化后，通过缩合反应使叶酸结合而合成。
叶酸修饰羟烷基化环糊精可以向叶酸的α羧基或γ羧基中的任一种导入羟烷基化环糊精。例如，在向叶酸导入羟烷基化-β-环糊精的情况下，叶酸修饰羟烷基化环糊精包含向叶酸的α羧基导入羟烷基化-β-环糊精的(α-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精)、向叶酸的γ羧基导入羟烷基化-β-环糊精的(γ-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精)或向叶酸的α羧基和γ羧基这两者导入羟烷基化-β-环糊精的(α,γ-di-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精)中的任一种。在合成向叶酸的α羧基导入羟烷基化环糊精的叶酸修饰羟烷基化环糊精的情况下，可以通过在保护叶酸的γ羧基的基础上与叶酸结合，去除保护基而合成。或者，在合成向叶酸的γ羧基导入羟烷基化环糊精的叶酸修饰羟烷基化环糊精的情况下，可以通过在保护叶酸的α羧基的基础上与叶酸结合，去除保护基而合成。
在一些方式的药物组合物中，作为叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精，包含α-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精、γ-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精、α,γ-di-叶酸修饰羟烷基化-β-环糊精中的至少一种(一种、两种或三种全部)。
叶酸修饰羟烷基化环糊精的衍生物
就叶酸修饰羟烷基化环糊精衍生物而言，包含叶酸修饰羟烷基化环糊精进一步地与其他化合物共价键合而成的化合物。进行键合的其他化合物没有特别限定，例如，可举出具有与各种受体的结合能力的化合物，具有抗肿瘤性或抗癌症性的化合物等。作为这样的化合物的具体的实例，例如，可举出转铁蛋白、上皮生长因子(EGF)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽、特异性地识别癌症细胞的抗体等。
就叶酸修饰羟烷基化环糊精衍生物而言，包含将其他化合物共价键合到叶酸修饰羟烷基化环糊精而成的化合物，不包含合而成的化合物。
药物组合物
可以将所述叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物按照常规方法进行制剂化，作为用于癌症治疗的药物组合物而使用。
此处，提供一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。
就用于癌症治疗的药物组合物而言，在组合物中，包含作为具有抗癌症活性的有效成分的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。即，在药物组合物中，不包含作为其他有效成分的增溶剂和/或稳定剂的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物，而包含作为具有抗癌症活性的有效成分的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。因此，包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为其他有效成分的增溶剂和/或稳定剂的药物组合物从所述用于癌症治疗的药物组合物中除去。
就用于癌症治疗的药物组合物而言，只要包含作为具有抗癌作用的有效成分的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物，也可以包含其他具有抗癌作用的有效成分。在一些方式中，包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为具有抗癌作用的主要的有效成分，进一步优选为仅包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为具有抗癌作用的有效成分。
用于癌症治疗的药物组合物可以为用于口服给药的组合物或用于非口服给药的组合物。
例如，作为用于口服给药的组合物，可举出固体或液体的剂型，具体而言，片剂(包含糖衣片、膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包含软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这种组合物通过本身公知的方法进行制造，含有在制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或者赋形剂。例如，作为用于片剂的载体、赋形剂，使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
作为用于非口服给药的组合物，例如，使用注射剂、栓剂、滴眼剂、点鼻剂、喷雾吸入剂、涂布剂、贴附剂等，注射剂包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂、关节内注射剂等剂型。这些注射剂按照本身公知的方法，例如，通过将所述活性成分在通常注射剂中使用的无菌的水性液或者油性液中溶解、悬浮或乳化而进行制备。作为用于注射的水性液，例如，使用包含生理盐水、葡萄糖、其他辅助药的等渗液等，可以与适当的增溶剂、例如醇(例：乙醇)、多元醇(例：丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例：聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油聚氧乙烯(50mol)加合物(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil))]等组合使用。作为油性液，例如，使用芝麻油、大豆油等，可以组合使用作为增溶剂的苯甲酸苄酯、苯甲醇等。制备的注射液通常填充至适当的安瓿中。直肠给药中使用的栓剂通过将所述活性成分与通常的栓剂用基质混合而进行制备。滴眼剂、点鼻剂、喷雾吸入剂、栓剂、涂布剂、贴附剂等也使用所述活性成分并按照本身公知的方法进行制备。
用于癌症治疗的药物组合物优选为注射剂。注射剂可以采用水溶性制剂或冷冻干燥制剂的任一方式，即水性注射剂或冷冻干燥后用时溶解型注射剂。
就一些方式的药物组合物而言，是含有叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为具有抗癌症活性的主要的有效成分，优选作为唯一的有效成分的抗癌药，并采用注射剂的方式。注射剂可以包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物以及通常用于注射剂的添加剂。即这些注射剂含有叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物以及医药上允许的添加剂，或仅包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物以及医药上允许的添加剂。这些注射剂可以采用水溶性制剂或冷冻干燥制剂的任一方式。
在药物组合物中，成为治疗的对象的癌症例如为乳腺癌、小细胞肺癌、大肠癌、恶性淋巴瘤、白血病、睾丸癌、卵巢癌、胰脏癌、肺癌、咽癌、喉癌、舌癌、牙龈癌、食道癌、胃癌、胆管癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、前列腺癌等。成为治疗的对象的癌症优选为白血病。
在药物组合物中，叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物的有效给药量可以依赖于癌的性质、疾病的程度、治疗方针、转移的程度、肿瘤的量、体重、年龄、性别、患者的(遗传)人种的背景等而适宜选择，给药量通常根据临床上观察的症状、疾病的进行的程度等要因而决定。就平均1天的给药量而言，在对人类给药的情况下，例如，是0.5g/kg～10g/kg(体重60kg的成人的情况下30g～600g)、1g/kg～10g/kg、1g/kg～5g/kg或1.2～5g/kg。给药可以以1次给药、分多次给药、通过点滴等花费时间连续地给药。在一些方式中，药物组合物通过点滴花费几小时～约10小时给药。此外，给药可以为连续的也可以为间歇给药，根据给药对象的状态而适宜选择。在一些方式中，给药为间歇给药。
组合使用
在一些方式中，药物组合物与其他活性成分组合来使用。在另一些方式中，药物组合物不与其他活性成分组合而使用。
所谓“与其他成分组合，”是指组合使用。就叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物和其他成分而言，可以为同时进行制剂化而得到的单一的制剂的方式，或者，可以为分别进行制剂化而得到的2种以上的制剂的方式。在2种以上的制剂的方式的情况下，可以向患者以同时给药的方式使用它们，或者，可以以分别给药的方式使用它们。
作为其他活性成分，例如可举出其他抗癌剂等。作为其他抗癌剂，例如可举出ABL酪氨酸激酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、mTOR抑制剂、抗体药物、嘧啶拮抗剂(例如阿糖胞苷(CYLOCIDER)、依诺他滨(BHAC))、嘌呤拮抗剂(例如氟达拉滨(FLUDARAR)、奈拉滨(ARRANONR)、6-巯基嘌呤(L EUKERINR))、DNA甲基转移酶抑制剂(例如阿扎胞苷(VIDAZAR))、叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤(METHOTREXATER))、蒽环类药物(例如柔红霉素(DAUN OMYCINR)、伊达比星(IDARUBICINR)、多柔比星(ADRIAMYCINR)、阿柔比星(ACLACINONR))、烷化剂(例如环磷酰胺(ENDOXANR))、有丝分裂抑制剂(例如长春新碱(ONCOVINR)、长春地辛(FILDESINR))、拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷(VEPESIDR、LASTETR))、肾上腺皮质激素制剂(例如泼尼松龙(P REDNISOLONER)、地塞米松(DECADRONR、LENADEXR))、维A酸(VESANOIDR)、他米巴罗汀(AMNOLAKER)、蒽醌类抗恶性肿瘤药(例如米托蒽醌(N OVANTRONR))、代谢拮抗剂(例如羟基脲(HYDREAR))、酶类药(例如天冬酰胺酶(LEUNASER))、砷酸(TRISENOXR)、干扰素(SUMIFERONR))、免疫调节药(例如来那度胺(REVLIMIDR)、泊马度胺(POMALYSTR))等。ABL酪氨酸激酶抑制剂，例如可举出伊马替尼、普纳替尼、达沙替尼、尼洛替尼、博苏替尼等。
在一些方式中，药物组合物与ABL酪氨酸激酶抑制剂组合来使用。此时的ABL酪氨酸激酶抑制剂优选为伊马替尼、普纳替尼、达沙替尼、尼洛替尼、博苏替尼等。
其他活性成分的有效给药量可以依赖于癌的性质、疾病的程度、治疗方针、转移的程度、肿瘤的量、体重、年龄、性别、患者的(遗传)人种的背景等而适宜选择。
其他活性成分根据公知的方法，可以与药理学上允许的载体混合而成为药物，例如，片剂(包含糖衣片、薄膜包衣片)、散剂、颗粒剂、胶囊剂、(包含软胶囊)、液剂、注射剂、栓剂、缓释剂等，它们可以口服地、非口服地给药。
将药物组合物与其他活性成分组合来使用时的、叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物与其他成分的配合比可以根据给药对象、给药途径、疾病等而适宜选择。
治疗方法
此处，可以提供一种包含使用所述的药物组合物的癌症的治疗方法。癌症的治疗方法优选包含：将选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物，对需要癌症的治疗的对象进行给药。
药物组合物的具体的方式、对具体的对象的适用方法、用语的意义等如上所述。可以适宜组合其他癌症的治疗方法、癌症的治疗药来进行本治疗方法。
“对象”为人类或人类以外的生物，例如，鸟类和非人类哺乳动物(例如牛、猴、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、狗、兔子、绵羊和马)。
此外，也涉及用于制造所述的药物组合物的、选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物的使用。
试剂盒
此处，提供用于癌症治疗的试剂盒。
试剂盒中可以包含所述的药物组合物。试剂盒可以包含使用说明书等。此外，在组合使用的情况下，试剂盒的所述的药物组合物可以包含其他活性成分，或者，试剂盒可以进一步包含含有其他活性成分的另一药物组合物。
对于药物组合物等，如上所述。
需要说明的是，就本说明书中记载的全部的文献和刊行物而言，与其目的无关而根据参照内容将其整体整合到本说明书中。此外，本说明书参照作为本申请的优先权主张的基础的日本国专利申请即日本特愿2021-126032(2021年7月30日申请)的日本专利请求的范围、说明书和附图的公开内容并且进行整合。
此外，本发明的目的、特征、优点、及其创新根据本说明书的记载，对本领域技术人员是清楚的，并且本领域技术人员能够根据本说明书的记载而容易地实施本发明。就用于实施发明的最好的方式和具体的实施例等而言，表示本发明的优选的实施方式，为了例举或说明而表示，本发明不限于此。在本说明书公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种修饰，作为本领域技术人员而言是清楚的。
实施例
下文中，通过实施例对本发明进行说明，本发明不限于这些实施例。
实施例中使用的各种试剂如下所示。
试剂 购买处
叶酸(FA) 富士胶片和光纯药
N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC) 富士胶片和光纯药
N-羟基丁二酰亚胺(NHS) 东京化成工业
二甲基亚砜(DMSO) 富士胶片和光纯药
乙二胺(EDA) NACALAI TESQUE
乙腈 关东化学
HP-β-CyD 富士胶片和光纯药
三乙胺(TEA) 富士胶片和光纯药
羰基二咪唑(CDI) 东京化成工业
Spectra/Por 7透析膜 REPLIGEN公司
实施例1：叶酸修饰羟丙基-β-环糊精(FA-HP-β-CyD)的制备
FA-HP-β-CyD以如下所述的方式进行了制备。
(1)氨基化叶酸(FA)的合成
[化学式1]
首先，作为氨基化叶酸(FA)的FA-EDA通过将EDA结合至FA(导入氨基)而合成。
将FA(880mg)溶解到25mL的DMSO后，添加N,N’-二环己基碳二亚胺(N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide)(DCC，412mg)和N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxy succinimide)(NHS，230mg)，搅拌20小时。添加EDA(1mL)，进一步地搅拌24小时。用乙腈清洗(溶解、搅拌后除去上清)，进行3次，冷冻干燥，得到FA-EDA。
(2)活化HP-β-CyD的合成
[化学式2]
接下来，将HP-β-CyD用CDI进行活化而合成活化HP-β-CyD。
HP-β-CyD(DS 5.5，1.5g)溶解到20mL的DMSO后，添加作为碱性催化剂的三乙胺(Triethylamine)(TEA，100μL)和CDI(1.62g)，氮气置换后，搅拌16小时，得到活化HP-β-CyD。
(3)FA-EDA与CDI活化HP-β-CyD的反应
[化学式3]
接下来，使FA-EDA与CDI活化HP-β-CyD反应，得到FA-HP-β-CyD。
向通过所述(1)的工序制备的CDI活化HP-β-CyD溶液中，添加全部的通过所述(2)的工序制备的FA-EDA，搅拌24小时。用0.1mM氨水透析1周后(M WCO 1000)，进行冷冻干燥。干燥后，用离子交换树脂(DIAION PK212)柱进行分离，得到FA-HP-β-CyD。
制备的确认通过MALDI-TOF-MS和1H-NMR进行。MALDI-TOF-MS的结果由图11表示，1H-NMR的结果由图12表示。
在图11的MALDI-TOF-MS的结果中，与单独HP-β-CyD(DS 5.5)相比，在高分子量侧确认了两个宽峰。分子量2000附近的强峰认为是在一个HP-β-CyD上结合了多个FA而成的FA-HP-β-CyD。此外，分子量3500附近的峰认为是在一个FA上结合了两个HP-β-CyD而成的di-FA-HP-β-CyD。根据以上的结果，可以确认FA-HP-β-CyD的制备。
在以下的实施例中使用的“FA-HP-β-CyD”中，包含α-FA-HP-β-CyD、γ-F A-HP-β-CyD和α,γ-di-FA-HP-β-CyD。
取代度由(叶酸分子数/CyD分子数)表示。在1H-NMR的结果中，观察到FA和HP-β-CyD来源的峰。此外，根据其峰面积计算的FA的平均取代度为2.08。
叶酸取代度＝(FA的积分值/质子数)/(CyD的质子数/HP取代度/质子数)＝(0.52/1)/(4.11/5.5/3)＝2.08
实施例2：叶酸受体β(folate receptor-β)的表达
在肝细胞株、肺癌细胞株(A549)和白血病细胞株(BV173、K562、Ba/F3p190和Ba/F3p210)的各种细胞株中的叶酸受体β的表达，如下所述，通过流式细胞仪(Flowcytometer)解析。在各种细胞株2×106个细胞混浊液中，添加PE anti-FOLR1抗体(Bio Legend)、APCanti-human Folate Receptorβ(FR-β)抗体(Bio Legend)和APC anti-mouse FolateReceptorβ(FR-β)抗体(Bio Lege nd)并在暗处孵化20分钟。用1mL的PBS(pH7.4)清洗2次后收集细胞，用尼龙网过滤，使用FACSVerse流式细胞仪(Flowcytometer)系统(BDBiosciences)进行分析。
其结果由图1表示。由图1可知白血病细胞株(BV173、K562、Ba/F3 p190和Ba/F3p210)高表达叶酸受体β。
实施例3：对白血病细胞株的细胞增殖抑制作用
对白血病细胞株的增殖抑制作用，如下所述，通过改良二甲基-噻唑-二苯基-四氮唑(MTT实验)进行评价。
本实施例中，使用了肝细胞株和白血病细胞株(K562、BV173、Ba/F3 p190、Ba/F3p210、MYL-R、K562-IMR和KBM5-STI)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
细胞存活率使用台盼蓝染料排除法进行评价。细胞增殖使用作为MTT实验的CellCounting Kit-8(Dojindo，日本)进行评价。在平底96孔板(Greiner Labortechnik，汉堡，德国)中用每个孔100μl的RPMI1640培养基(Sigma-Ald rich，美国)接种2×104个各种细胞，暴露于各个浓度(0mM(对照：CT)、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM)的FA-HP-β-CyD和HP-β-CyD并孵化72小时。数据由3次的独立实验的平均±标准差(SD)表示。
使用FA-HP-β-CyD进行实验的结果由下文中的表和图2表示。由图2可知白血病细胞株(K562、BV173和Ba/F3 p190)的细胞增殖以用量依赖性方式被抑制。
此外，使用FA-HP-β-CyD和HP-β-CyD进行实验而求出IC50的结果由表1表示。从表1可知对于白血病细胞株(K562、BV173、Ba/F3 p190、Ba/F3p210、MYL-R、K562-IMR和KBM5-STI)的FA-HP-β-CyD的IC50相对于HP-β-CyD为约1/5～约1/20。即，FA-HP-β-CyD与HP-β-CyD相比为约5倍～约20倍的强效。因此，可知FA-HP-β-CyD与HP-β-CyD相比具有更强的细胞损害活性。
在只对HP-β-CyD修饰叶酸的情况下，预测与HP-β-CyD相比FA-HP-β-CyD的细胞损害活性只有约2倍～约3倍，而实际上如上所述是约5倍～约20倍的强效，该结果根据以往的技术常识是无法预测的。
此处，如非专利文献2(Okamatsu et al.,Biomacromolecules,(2013)14,p.4420-4428)的Fig.4D中所示，细胞株是与本实施例不同的KB细胞，与未修饰体(TRITC-NH2-C1-β-CyD)相比，叶酸修饰CyD(TRITC-Fol-C1-β-CyD)为2～3倍左右的细胞内摄取。通常而言推测与细胞内的浓度相关且细胞损害性升高，因此以往认为即使在本实施例中使用的细胞的情况下，基于叶酸修饰的细胞损害性最多增强2～3倍左右。
表1
实施例4：对于叶酸受体低表达细胞的增殖抑制作用
对于叶酸受体低表达细胞A549的增殖抑制作用以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，使用了人类非小细胞肺癌细胞株(A549)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
就细胞增殖而言，将白血病细胞株在平底96孔板(Greiner Labortechnik，汉堡，德国)中用每个孔100μl的DMEM培养基(Sigma-Aldrich，美国)接种2×104个细胞，暴露于各个浓度(0mM(对照：CT)、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM)的FA-HP-β-CyD和HP-β-CyD并孵化72小时。接下来，使用二甲基-噻唑-二苯基-四氮唑(MTT)实验((NACALAI TESQUE，日本)进行评价。数据由3次的独立实验的平均±标准差(SD)表示。
其结果由图3表示。对于叶酸受体低表达细胞A549，HA-HP-β-CyD显示出较强的细胞胞损害活性，而FA-HP-β-CyD不显示抗肿瘤活性。由此可知，FA-HP-β-CyD具有对强表达叶酸受体的细胞的选择性。
实施例5：在叶酸(FA)存在下的对白血病细胞株的细胞增殖抑制作用
在叶酸(FA)存在下的对白血病细胞株的细胞增殖抑制作用，如下所述，通过MTT实验进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(K562和BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
在平底96孔板(Greiner Labortechnik，汉堡，德国)中用每个孔100μL的培养基接种2×104个各种细胞，在不存在FA(2mM)的情况下和存在FA(2mM)的情况下与包含FA-HP-β-CyD(5mM)和HP-β-CyD(5mM)的培养基一起在37℃下孵化2小时。接下来，使用作为改良二甲基-噻唑-二苯基-四氮唑(MTT)实验的Cell Counting Kit-8(Dojindo，日本)进行评价。数据由3次的独立实验的平均±标准差(SD)表示。
其结果由图4表示。
此处，图4中的“CT、”“only FA”分别以以下方式进行评价。即，将在平底96孔板中用每个孔100μL的培养基接种2×104个各种细胞，并在37℃下孵化2小时的作为“CT，”将仅暴露FA并在37℃下孵化2小时的作为“only FA”而进行评价。
显著性差异以以下的方式进行检验。将验证药物(FA-HP-β-CyD with FA，FA-HP-β-CyD without FA)的2个样本进行t检验。在2个样本的比较中，p<0.05，可以说有显著性差异。
如图4所示，在白血病细胞株(K562和BV173)中，在FA存在下的FA-HP-β-CyD(FA-HP-β-CyD with FA)的抗肿瘤活性与不添加FA类(FA-HP-β-CyD without FA)相比显著地降低。该结果表示FA-HP-β-CyD的抗肿瘤活性由叶酸受体介导。
实施例6：细胞的凋亡
暴露FA-HP-β-CyD的细胞的凋亡，如下所述，通过Annexin V/碘化丙啶(PI)染色进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(K562和BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
凋亡实验通过碘化丙啶(Propidium iodide)(PI)和Annexin V(BD Biosciences)来染色细胞而进行。将细胞在6孔板中以4×105个/well的细胞密度进行培养，将各个浓度(0mM(对照：CT)，0.5mM、1mM和1.5mM)的FA-HP-β-CyD同时孵化48小时。接下来，将细胞通过碘化丙啶(PI)和Annexin V-APC(BD Biosciences)进行染色，使用FACSVerse流式细胞仪(Flowcytometer)系统(BD Biosciences)进行分析。数据由3次的独立实验的平均±SD表示。
其结果由图5A～C表示。可知FA-HP-β-CyD对白血病细胞株(K562和B V173)诱导浓度依赖性的凋亡。
实施例7：向细胞内的摄取
FA-HP-β-CyD的向细胞内的摄取以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
将10mg的HP-β-CyD或FA-HP-β-CyD和1mg的TRITC溶解到400μL的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌24小时后，将溶液缓慢倒入丙酮中。得到沉淀物，并用水溶解。将其冷冻干燥，制备TRITC-HP-β-CyD和TRITC-FA-HP-β-CyD。
接下来，将细胞在6孔板中以每个孔4×10e5个细胞密度进行培养，将各个浓度的TRITC-FA-M-β-CyD、TRITC-HP-β-CyD、FA-HP-β-CyD、HP-βCyD同时孵化。ZEISS LSM880的共聚焦显微镜用于细胞观察。荧光图像解析软件Imaris(ZEISS)用于解析。
将在不暴露药物的情况下与其他暴露组同时培养的作为Control(对照组)。用DAPI染色细胞定位，用PlasMen Bright Green染色细胞膜，用共聚焦显微镜对TRITC-FA-HP-β-CyD被摄取至细胞内进行评价。
其结果由图6表示。已知通常CyD为亲水性且分子量较大约为1000，因此很难被摄取至细胞内。实际上，由添加TRITC的实验表明叶酸未修饰的HP-β-CyD没有被摄取至细胞内。然而，由添加TRITC的实验可知FA-HP-β-CyD被摄取至细胞内。
实施例8：自噬体形成的诱导
将FA-HP-β-CyD的自噬体形成的诱导以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(K562和BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
将细胞在6孔板中以4×105个/well的细胞密度进行培养，用1mM或5mM的HP-β-CyD或FA-HP-β-CyD处理2小时，并孵化细胞。然后，使用Cyto-ID(注册商标)自噬检测试剂盒(Enzo Life Sciences，美国)，使用荧光显微镜AxioImager.M2+ApoTome.2(ZEISS)进行细胞观察。
其结果由图7表示。自噬体膜蛋白质LC3B在用FA-HP-β-CyD孵化细胞时，浓度依赖性地增加。需要说明的是，图7中的DIC是在微分干涉显微镜中的图像。由此可知，FA-HP-β-CyD与未修饰的CyD类不同，被摄取至细胞内，因此显示出抗肿瘤活性。
实施例9：对于自噬抑制的细胞增殖抑制效果的影响
对于自噬抑制的细胞增殖抑制效果的影响以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(K562和BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
在平底96孔板(Greiner Labortechnik，汉堡，德国)中用每个孔100μl的RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich，美国)接种2×105个各种细胞，用5mM FA-HP-β-CyD和15mM HP-β-CyD在37℃下，处理2小时。接下来用作为自噬抑制剂的氯喹(20μM)(富士胶片和光纯药株式会社)、巴弗洛霉素A1(1nM)(Funakoshi)或LY294002(50μM)(富士胶片和光纯药株式会社)预处理24小时。然后，对细胞增殖使用作为改良二甲基-噻唑-二苯基-四氮唑(MTT)实验的Cell Counting Kit-8(Dojindo，日本)进行评价。数据由3次的独立实验的平均±标准差(SD)表示。
其结果由图8表示。
此处，图8中的“CT”以以下方式进行评价。即，在平底96孔板中用每个孔100μL的RPMI1640培养基接种2×105个各种细胞，将在不暴露药物、自噬抑制剂的情况下，与其他暴露组同时培养2小时+24小时的作为CT。该CT与暴露组进行比较。
显著性差异以以下的方式进行检验。即，数据的解析中使用不在对照表的双侧的Student’s t-test进行分析。P<0.05的值设为有显著性差异。
通过自噬抑制剂的添加，叶酸修饰CyD(FA-HP-β-CyD)的细胞增殖抑制能力降低(图8A和图8B)，而未修饰CyD(HP-β-CyD)不受其影响(图8C和图8D)。由此可知，作为FA-HP-β-CyD的细胞损害活性的机制，除了凋亡诱导以外，自噬也较强地与此相关。
实施例10：FA-HP-β-CyD和ABL酪氨酸激酶抑制剂的组合使用
FA-HP-β-CyD和ABL酪氨酸激酶抑制剂的组合使用的效果以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，使用了白血病细胞株(K562和BV173)。FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
ABL酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(伊马替尼(imanitib)和普纳替尼(ponatinib))的IC50值使用非线形回归程序CalcuSyn(Biosoft，剑桥，英国)而得到。
得到各种药物的IC50值之后，与TKI组合的FA-HP-β-CyD的抗白血病活性在单一的96孔板中进行实验。将K562细胞和BV173细胞这两者通过两种化合物(伊马替尼(imanitib)和普纳替尼(ponatinib))的5个浓度(IC50的0.25倍、0.5倍、0.75倍、1.0倍或2.0倍)进行处理。为了与组合使用效果进行比较，对细胞以作为单一药物的各个化合物(伊马替尼(imanitib)和普纳替尼(ponatinib))进行处理。受影响的部分(Fa；0.25的Fa表示25％的活细胞)和组合指数(CI)使用CalcuSyn(Biosoft)进行计算。该方法表示各种用量与效果水平的协同作用(CI<1)和拮抗作用(CI>1)的定量化。数据由3次的独立实验的平均±SD表示。
其结果由图9表示。确认了对于K562细胞，FA-HP-β-CyD与伊马替尼(imanitib)或普纳替尼(ponatinib)的组合中，CI值随Fa值的增加而减少(CI<1)。对于BV173细胞，确认了FA-HP-β-CyD与伊马替尼(imanitib)的组合中，CI值随Fa值的增加而减少(CI<1)，FA-HP-β-CyD与普纳替尼(ponatinib)的组合中，低Fa值的区域中为CI<1。由此可知，FA-HP-β-CyD通过与慢性骨髓性白血病的治疗药、ABL酪氨酸激酶抑制剂的组合使用而显示出协同作用。
实施例11：BCR-ABL白血病小鼠的存活时间延长
基于FA-HP-β-CyD的BCR-ABL白血病小鼠的存活时间延长的效果以如下所述的方式进行评价。
本实施例中，FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
将EGFP+Ba/F3 BCR-ABLWT细胞(1×106个)移植到6周龄的裸鼠上。移植的3天后，以1天2次，连续20天腹腔内注射200μL的载体(n＝10)、150mM(2086.5mg/kg)HP-β-CyD(n＝10)、15mM(249mg/kg)FA-HP-β-CyD(n＝10)或6.6μM(200mg/kg)伊马替尼(imatinib)(n＝10)。每天监视存活时间。存活数据使用对数秩非参数检验进行分析，设为Kaplan-Meier存活曲线来表示。
显著性差异以以下的方式进行检验。即，数据的解析中使用不在对照表的双侧的Student’s t-test进行分析。P<0.05的值设为有显著性差异。
其结果由图10表示。在BCR-ABL白血病模型小鼠中，FA-HP-β-CyD以HP-β-CyD的1/10量而带来等效存活时间延长。在In vitro中，FA-HP-β-CyD对肿瘤细胞有指向性因此具有HP-β-CyD的约5倍～约20倍的杀细胞效果(实施例3)。该结果，认为在in vivo中，以少量而显著地延长存活时间。
实施例12：对于白血病中枢神经浸润的叶酸修饰HP-β-CyD的治疗效果
[目的]
白血病细胞的中枢神经浸润是较大关系到白血病患者的预后的并发症之一。即使在中枢神经浸润的预防已经司空见惯的现在，中枢神经浸润依然是较大的问题，报告了急性淋巴白血病的复发时伴有中枢神经浸润的儿童有30～40％，成人有1～15％。作为治疗法，进行了抗癌药的髓腔内给药、通过阿糖胞苷、甲氨蝶呤等容易转移到中枢神经的抗癌药的大量给药的强化化学疗法。特别是全身给药在中枢神经系统以外也容易造成内脏器官损害，髓腔内给药除神经毒性之外，有时也会造成血细胞减少等。最重要的是，这些都是从30～40年前开始进行的，对于白血病中枢神经浸润的治疗法完全没有进步。
此次，关于HP-β-CyD、FA-HP-β-CyD对白血病中枢神经浸润的效果，制备模型小鼠并进行了验证。
[实验方法]
脑室浸润模型小鼠
将BRJ小鼠(雌)在麻醉(盐酸美托咪定(0.75mg/kg)、咪达唑仑(4mg/kg)、酒石酸布托啡诺(5mg/kg)三种混合麻醉以腹腔内(IP)给药100uL)的情况下，将具备以使得用LT型针尖形状pst-3、25外径的HAMILTON注射器将BV173细胞(白血病细胞)精确地注射到3mm的深度的方式涉及的设计的聚乙烯塞管的微型注射器，在由矢状缝合定义的中心线的右侧1mm处通过右冠状缝合而进行髓腔内移植。
给药量的决定
本实施例中，FA-HP-β-CyD使用了通过实施例1合成的化合物。
给药量参考对于遗传性的脂质积蓄病尼曼匹克病C型(NPC)模型小鼠的HP-β-CyD的给药量(Int.J.Mol.Sci.2021，22，452.https：//doi.org/10.3390/ijms22010452)，设为HP-β-CyD 30mg/kg、FA-HP-β-CyD 3mg/kg。
此外，以下述表中表示的小鼠的脑脊髓液量为基础的药物给药时的脑室内药物浓度为HP-β-CyD 7.78mM、FA-HP-β-CyD 0.79mM。
表2.4.1.4.1动物种类间的中枢神经系统参数和姿势的比较a
TPP1：三肽基肽酶1
a小鼠和猴：Herculano-Houzel，2009,Front Hum Neurosci、狗(公司内部数据)和人类：Dekaban,1978,Ann Neurol)Giedd，JN，Snell，JW，Lange，N，Rajapakse，JCet.al.Quantitative magnetic resonance imaging of human brain development：ages4-18.Cereb Cortex 6[4]，551-560.1996.
[结果]
其结果由图13表示。白血病细胞(BV173)脑室移植后，第2周，一次给药载体(vehicle)(PBS给药)(n＝8)、HP-β-CyD 30mg/kg(n＝8)、FA-HP-β-CyD 3mg/kg(n＝8)。证明了FA-HP-β-CyD组与载体组、HP-β-CyD组相比存活延长。此处，与载体组相比HP-β-CyD是P＝0.0746，FA-HP-β-CyD是P＝0.0111。
此外，另一结果由图14表示。白血病细胞(BV173)脑室移植后，第1周一次，第2周一次，合计两次给药载体(PBS给药)(n＝8)、HP-β-CyD 30mg/kg(n＝8)、FA-HP-β-CyD 3mg/kg(n＝8)。证明了FA-HP-β-CyD组与载体组、HP-β-CyD组相比存活延长。此处，与载体组相比HP-β-CyD为P＝0.182，FA-HP-β-CyD为P＝0.0472。未发现脑室移植后，与第2周一次给药载体(PBS给药)、HP-β-CyD、FA-HP-β-CyD(图13)的模型相比，在HP-β-CyD组中存活延长，而在FA-HP-β-CyD组中存活延长1天。
此处，显著性差异以以下的方式进行检验。即，数据的解析中使用不在对照表的双侧的Student’s t-test进行分析。P＜0.05的值设为有显著性差异。
[考察]
如目的所述，白血病的中枢神经浸润是对患者的预后有较大影响的并发症，即使进行预防也会以一定的比例产生。该治疗法长年未改变，没有进步。此外，髓腔内给药、全身化学疗法造成不良事件，并且不能重复或多次进行。在这方面，本发明明确显示出环糊精造成由抗癌药给药引起的血细胞减少的可能性较低，对尼曼匹克病C型患儿的HP-β-CyD髓室内给药可以长期进行，以更少量而较高有效性的叶酸修饰HP-β-CyD对于白血病中枢神经浸润是有前途的药物。

Claims (7)

1.一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含：
选自叶酸修饰羟丙基环糊精、叶酸修饰羟丁基环糊精和叶酸修饰羟乙基环糊精中的叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其仅包含叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物作为有效成分。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，
所述叶酸修饰羟烷基化环糊精或其衍生物为叶酸修饰羟丙基环糊精。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，
所述叶酸修饰羟丙基环糊精为叶酸修饰羟丙基-β-环糊精。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的药物组合物，其与ABL酪氨酸激酶抑制剂进行组合来使用。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的药物组合物，其中，
所述癌症为白血病。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的药物组合物，其为注射剂。
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