WO2023008570A1 - がん治療用医薬組成物 - Google Patents

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WO2023008570A1
WO2023008570A1 PCT/JP2022/029345 JP2022029345W WO2023008570A1 WO 2023008570 A1 WO2023008570 A1 WO 2023008570A1 JP 2022029345 W JP2022029345 W JP 2022029345W WO 2023008570 A1 WO2023008570 A1 WO 2023008570A1
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cyd
folic acid
cyclodextrin
modified
pharmaceutical composition
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PCT/JP2022/029345
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French (fr)
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晋也 木村
寧 久保田
敬一 本山
大志 東
英俊 有馬
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国立大学法人佐賀大学
国立大学法人熊本大学
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions for cancer treatment and the like.
  • Cancer is the number one cause of death in Japan. Although the survival rate has improved for some cancers, there is still no adequate treatment for advanced cancer, and the development of more effective treatments is desired.
  • Cyclodextrin is a cyclic malto-oligosaccharide in which glucose is linked by ⁇ -1,4 bonds, and is a unimolecular host molecule capable of incorporating various drugs into its hydrophobic cavity.
  • CyD is widely used as a raft inhibitor because it strongly binds to cholesterol, extracts cholesterol from lipid rafts of cell membranes, and destroys the structure.
  • 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (2-Hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin: HP- ⁇ -CyD) is a hereditary lipid accumulation disease Niemann-Pick disease type C ( NPC) has been clinically applied.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2014/0877778
  • Non-Patent Document 1 Yokoo et al., PLoS One, (2015) 10 (11): e0141946.
  • cholesterol is essential for tumor cell growth and function maintenance. Therefore, it is hypothesized that HP- ⁇ -CyD itself has an antitumor effect, and the growth inhibitory effect of HP- ⁇ -CyD itself on leukemic cells has been demonstrated in vitro.
  • DDS drug delivery system
  • folic acid is 1) inexpensive, and 2) folate receptor (FR) is overexpressed in various epithelial cancer cells and low in normal cells. It is widely used as a ligand molecule because of its advantages such as selective cellular uptake, 3) lack of antigenicity, allowing repeated administration, and 4) relatively small molecular weight, so it hardly affects the intracellular dynamics of the carrier. ing.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-1204 describes folic acid-modified methylated- ⁇ -cyclodextrin (FA-M- ⁇ -CyD), which is methyl- ⁇ -cyclodextrin modified with folic acid, to selectively treat tumor cells. It is described to be used as an anticancer agent.
  • F-M- ⁇ -CyD folic acid-modified methylated- ⁇ -cyclodextrin
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-69520
  • a hydrophilic substituent e.g., polyethylene glycol group, hydroxypropyl group, etc.
  • folic acid-modified cyclodextrin having tumor accumulation ability to improve solubility. is useful as a DDS for targeting cancer.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and found that folate receptors can be highly expressed by modifying folic acid to impart tumor cell selectivity to hydroxyalkylated cyclodextrins or derivatives thereof.
  • the present inventors have found that the anticancer effect can be enhanced by enhancing the directivity to the tumor cells that are known to act as anticancer cells, thereby completing the present invention.
  • a pharmaceutical composition for cancer treatment and the like shown below are provided.
  • a cancer treatment comprising a folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxylpropyl cyclodextrin, folic acid-modified hydroxylbutyl cyclodextrin, and folic acid-modified hydroxylethyl cyclodextrin pharmaceutical composition.
  • [1-3] The pharmaceutical composition of [1-1] or [1-2] above, wherein the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or derivative thereof is folic acid-modified hydroxypropyl cyclodextrin.
  • [1-4] The pharmaceutical composition of [1-3] above, wherein the folic acid-modified hydroxypropyl cyclodextrin is folic acid-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • [1-5] The pharmaceutical composition according to any one of [1-1] to [1-4] above, which is used in combination with an ABL tyrosine kinase inhibitor.
  • [1-6] The pharmaceutical composition according to any one of [1-1] to [1-5] above, wherein the cancer is leukemia.
  • [1-7] The pharmaceutical composition according to any one of [1-1] to [1-6] above, which is an injection.
  • a composition comprising a folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxylpropyl cyclodextrin, folic acid-modified hydroxylbutyl cyclodextrin, and folic acid-modified hydroxylethyl cyclodextrin, A method of treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof.
  • the composition contains only folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • [2-3] The method according to [2-1] or [2-2] above, wherein the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or derivative thereof is folic acid-modified hydroxypropyl cyclodextrin.
  • [2-4] The method according to [2-3] above, wherein the folic acid-modified hydroxypropyl cyclodextrin is folic acid-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • [2-5] The method of any one of [2-1] to [2-4] above, wherein the composition is administered in combination with an ABL tyrosine kinase inhibitor.
  • [2-6] The method according to any one of [2-1] to [2-5] above, wherein the cancer is leukemia.
  • [2-7] The method according to any one of [2-1] to [2-6] above, wherein the composition is an injection.
  • a new pharmaceutical composition for cancer treatment is provided here.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analyzing the expression of folate receptor- ⁇ with a flow cytometer.
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the growth inhibitory effect on leukemic cell lines by MTT assay.
  • FIG. 3 shows the results of evaluating the growth inhibitory effect on low folate receptor-expressing cells A549.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the growth inhibitory effect on leukemic cell lines.
  • FIG. 10 shows the results of evaluation of cell apoptosis by Annexin V/PI staining.
  • FIG. 2 shows that FA-HP- ⁇ -CyD is taken up into cells.
  • FIG. 1 shows that FA-HP- ⁇ -CyD induces autophagosome formation.
  • FIG. 2 shows that inhibition of autophagy attenuates the cytostatic effect of FA-HP- ⁇ -CyD.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of calculation of the combined effect (combination index, CI) of FA-HP- ⁇ -CyD and imatinib or ponatinib using CalcuSyn software.
  • FIG. 4 shows that FA-HP- ⁇ -CyD prolongs survival of BCR-ABL leukemic mice.
  • 1 is a MALDI-TOF-MS spectrum of FA-HP- ⁇ -CyD (Example 1).
  • 1 H-NMR spectrum of FA-HP- ⁇ -CyD Example 1).
  • FIG. 2 shows that FA-HP- ⁇ -CyD prolongs the survival period of a mouse model of ventricular infiltration (one-time administration model).
  • FIG. 10 shows that FA-HP- ⁇ -CyD prolongs the survival period of a mouse model of ventricular invasion (two dose model).
  • the present inventors modified folic acid in order to impart tumor cell selectivity to hydroxyalkylated cyclodextrin, thereby increasing its tropism to tumor cells that highly express folate receptors, and thus increasing I thought that it might be possible to exhibit a strong anti-cancer effect.
  • the present inventors first prepared folic acid-modified HP- ⁇ -CyD (FA-HP- ⁇ -CyD), which is one of folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins (Example 1). They also found that this FA-HP- ⁇ -CyD showed equivalent anti-leukemia activity at about 1/10 the amount of unmodified HP- ⁇ -CyD (Example 3). In addition, almost no HP- ⁇ -CyD is taken up into cells without modification, but with folic acid modification, a large amount of HP- ⁇ -CyD is taken up into cells (Example 7, FIG. 6), and autophagic cell death is inhibited. It was found to be a major factor in leukemia action (Example 8, Figure 7). Furthermore, in a leukemia mouse model, administration of FA-HP- ⁇ -CyD significantly prolonged survival (Example 11 and FIG. 10).
  • Cyclodextrin is a cyclic malto-oligosaccharide in which glucose is linked by ⁇ -1,4 linkages, and is capable of incorporating various drugs into its hydrophobic cavity. It is a molecular host molecule. CyD includes, for example, ⁇ -CyD with 6 glucose residues, ⁇ -CyD with 7 glucose residues, ⁇ -CyD with 8 glucose residues, ⁇ -CyD with 9 glucose residues, and 10 glucose residues. ⁇ -CyD and derivatives thereof are known.
  • a "hydroxyalkylated cyclodextrin” is a hydroxyalkylated cyclodextrin selected from the group consisting of hydroxypropyl cyclodextrin, hydroxybutyl cyclodextrin, and hydroxyethyl cyclodextrin.
  • Hydroxyalkylated cyclodextrins are cyclodextrins (e.g., ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, etc.) in which the hydroxyl groups are randomly substituted with hydroxypropyl, hydroxybutyl, or hydroxyethyl groups.
  • hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin is a compound in which hydroxyl groups at positions 2, 3 and 6 of seven glucoses of ⁇ -cyclodextrin are randomly substituted with hydroxyalkyl groups.
  • “Folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin” is a compound in which folic acid is covalently bonded to the glucose of hydroxyalkylated cyclodextrin.
  • the site to which folic acid binds is not particularly limited, but the 2- and/or 6-positions of glucose are preferred, and the 6-position is particularly preferred.
  • the binding ratio of folic acid in the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is not particularly limited, but the cyclodextrin molecule: folic acid molecule is preferably 1:1 to 1:14, more preferably 1:1 to 1:7.
  • a preferred folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin.
  • the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxypropyl cyclodextrin, folic acid-modified hydroxybutyl cyclodextrin, and folic acid-modified hydroxyethyl cyclodextrin.
  • the folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is preferably folate selected from the group consisting of folate-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, folate-modified hydroxybutyl- ⁇ -cyclodextrin, and folate-modified hydroxyethyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • the folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is preferably folate-modified hydroxypropyl cyclodextrin.
  • the folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin is particularly preferably folate-modified hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • Folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrins can be synthesized using known methods. For example, folic acid-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin and folic acid-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin are prepared by amination of the hydroxyl groups of hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin and hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin followed by condensation. It can be synthesized by combining folic acid through a reaction.
  • folic acid-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin can be synthesized by aminating the hydroxyl group of hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin and then binding folic acid through a condensation reaction.
  • the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin may have the hydroxyalkylated cyclodextrin introduced into either the ⁇ -carboxyl group or the ⁇ -carboxyl group of folic acid.
  • hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin when introducing hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin into folic acid, hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin introduced into the ⁇ -carboxyl group of folic acid ( ⁇ -folic acid-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin) , or hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin introduced into the ⁇ -carboxyl group of folic acid ( ⁇ -folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin), or hydroxyalkyls on both the ⁇ - and ⁇ -carboxyl groups of folic acid Included in folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins are all those introduced with modified- ⁇ -cyclodextrins ( ⁇ , ⁇ -di-folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrins).
  • compositions of some embodiments include, as folic acid-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin , ⁇ , ⁇ -di-folate-modified hydroxyalkylated- ⁇ -cyclodextrin (one, two, or all three).
  • Folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin derivatives include folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins to which further compounds are covalently attached.
  • the other compound that binds is not particularly limited, but examples thereof include compounds that have the ability to bind to various receptors, compounds that have antitumor or anticancer properties, and the like. Specific examples of such compounds include transferrin, epidermal growth factor (EGF), arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide, antibodies that specifically recognize cancer cells, and the like.
  • Folate-modified hydroxyalkylated cyclodextrin derivatives include covalently bound other compounds to folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin, but do not include clathrates.
  • compositions The folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or its derivative can be formulated according to conventional methods and used as a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxylpropylcyclodextrin, folic acid-modified hydroxylbutylcyclodextrin, and folic acid-modified hydroxylethylcyclodextrin or a derivative thereof goods are provided.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer contains a folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof as an active ingredient having anticancer activity. That is, instead of including folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof as a solubilizer and/or stabilizer for other active ingredients in the pharmaceutical composition, folic acid itself is used as the active ingredient having anticancer activity. Including modified hydroxyalkylated cyclodextrins or derivatives thereof. Therefore, pharmaceutical compositions containing folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins or derivatives thereof as solubilizers and/or stabilizers for other active ingredients are excluded from the pharmaceutical compositions for treating cancer.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer can also contain other active ingredients with anticancer activity, as long as it contains folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof as an active ingredient with anticancer activity. In some aspects, it contains folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or a derivative thereof as the main active ingredient with anticancer activity, more preferably folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin as the active ingredient with anticancer activity or only derivatives thereof.
  • the composition for cancer treatment may be a composition for oral administration or a composition for parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). ), syrups, emulsions and suspensions.
  • Such compositions are produced by a method known per se and contain carriers, diluents or excipients commonly used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like.
  • compositions for parenteral administration include, for example, injections, suppositories, eye drops, nose drops, spray inhalants, liniments, patches, etc.
  • Injections include intravenous injections and subcutaneous injections. , intradermal injection, intramuscular injection, drip injection, intraarticular injection, and the like.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above active ingredient in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohols (e.g., ethanol), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like.
  • suitable solubilizers such as alcohols (e.g., ethanol), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like.
  • suitable solubilizers such as alcohols (e.g., ethanol), polyalcohols (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants
  • Suppositories for rectal administration are prepared by mixing the above active ingredient with a conventional suppository base. Eye drops, nose drops, spray inhalants, suppositories, ointments, patches, etc. are also prepared using the above-mentioned active ingredients according to methods known per se.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment is preferably an injection.
  • Injections can take the form of either water-soluble preparations or freeze-dried preparations, ie, water-based injections or freeze-dried ready-to-use injections.
  • compositions of some embodiments are anticancer agents containing folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins or derivatives thereof as the main active ingredient having anticancer activity, preferably as the sole active ingredient.
  • Injections can also contain additives commonly used for injections in addition to folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrins or derivatives thereof. That is, such an injection contains folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or its derivative and pharmaceutically acceptable additives, or only folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or its derivative and pharmaceutically acceptable additives. It consists of These injections can be in the form of either water-soluble preparations or freeze-dried preparations.
  • cancers to be treated include, for example, breast cancer, small cell lung cancer, colon cancer, malignant lymphoma, leukemia, testicular tumor, ovarian cancer, pancreatic cancer, lung cancer, pharyngeal cancer, and laryngeal cancer.
  • cancer tongue cancer, gingival cancer, esophageal cancer, stomach cancer, bile duct cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, and prostate cancer.
  • the cancer to be treated is preferably leukemia.
  • the effective dosage of the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or its derivative depends on the nature of cancer, degree of disease, treatment policy, degree of metastasis, tumor mass, body weight, age, sex, patient's (genetic Although the dosage can be appropriately selected depending on the racial background, etc., the dosage is generally determined based on factors such as clinically observed symptoms and the degree of progression of the disease.
  • the daily dose is, for example, 0.5 g/kg to 10 g/kg (30 g to 600 g for an adult weighing 60 kg), 1 g/kg to 10 g/kg, 1 g/kg to 5 g/kg, alternatively 1.2-5 g/kg.
  • the administration may be administered in one dose or divided into multiple doses, or may be administered continuously over time by drip infusion or the like.
  • the pharmaceutical composition is administered by infusion over several hours to about 10 hours.
  • administration may be either daily or intermittent administration, which can be appropriately selected according to the condition of the subject to be administered. In some aspects, administration is intermittent administration.
  • the pharmaceutical compositions are used in combination with other active ingredients. In some other aspects, the pharmaceutical composition is used without combination with other active ingredients.
  • the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or derivative thereof and other ingredients may be in the form of a single formulation obtained by simultaneous formulation, or may be in the form of two or more formulations obtained by formulation separately. . When in the form of two or more formulations, they may be used to be administered to the patient simultaneously or may be used to be administered separately.
  • anticancer agents include, for example, ABL tyrosine kinase inhibitors, EGFR inhibitors, VEGF inhibitors, mTOR inhibitors, antibody drugs, pyrimidine antagonists (e.g., cytarabine (kiloside R ), enocitabine (BHAC)), purine antagonists drugs (e.g. fludarabine (fludara R ), nelarabine (alanongi R ), 6-mercaptopurine (leukerin R )), DNA methyltransferase inhibitors (e.g. azacytidine (Vidaza R )), folate antagonists (e.g.
  • ABL tyrosine kinase inhibitors include, for example, ABL tyrosine kinase inhibitors, EGFR inhibitors, VEGF inhibitors, mTOR inhibitors, antibody drugs, pyrimidine antagonists (e.g., cytarabine (kiloside R ), enocita
  • methotrexate methotrexate
  • anthracyclines e.g. daunorubicin (daunomycin R ), idarubicin (idamycin R ), doxorubicin (adriacin R ), aclarubicin (acracinone R )
  • alkylating agents e.g. cyclophosphamide (endoxan R ))
  • mitotic inhibitors e.g. vincristine (Oncovin R ), vindesine (Fildesine R )
  • topoisomerase inhibitors e.g. etoposide (Vepsid R , Rustet R )
  • corticosteroids e.g.
  • prednisolone Prednisone R
  • dexamethasone Decadrone R , Renadex R
  • retinoic acid Vesanoid R
  • tamibarotene Amnolake R
  • anthraquinone antineoplastic agents e.g., mitozantrone (Novantron R )
  • antimetabolites e.g., hydroxyurea (Hydrea R )
  • enzyme drugs e.g. asparaginase (leuinase R )
  • arsenic acid Trisenox R
  • interferon Standard Iferon R
  • immunomodulators e.g.
  • ABL tyrosine kinase inhibitors include, for example, imatinib, ponatinib, dasatinib, nilotinib, bosutinib, and the like.
  • the pharmaceutical composition is for use in combination with an ABL tyrosine kinase inhibitor.
  • the ABL tyrosine kinase inhibitor at this time is preferably imatinib, ponatinib, dasatinib, nilotinib, bosutinib and the like.
  • the effective dosage of other active ingredients depends on the nature of cancer, degree of disease, treatment strategy, degree of metastasis, tumor volume, body weight, age, sex, patient's (genetic) racial background, etc. It can be selected as appropriate.
  • compositions including sugar-coated tablets and film-coated tablets, powders, granules, capsules (including soft capsules), ), liquids, injections, suppositories, sustained-release preparations, etc., which can be administered orally or parenterally.
  • pharmaceuticals such as tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), powders, granules, capsules (including soft capsules), ), liquids, injections, suppositories, sustained-release preparations, etc., which can be administered orally or parenterally.
  • the compounding ratio of the folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or its derivative and other ingredients can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, disease, and the like.
  • Methods of Treatment may also be provided herein, comprising using the aforementioned pharmaceutical compositions.
  • a folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin or derivative thereof selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxylpropyl cyclodextrin, folic acid-modified hydroxylbutyl cyclodextrin, and folic acid-modified hydroxylethyl cyclodextrin is used to treat cancer.
  • a method of treating cancer comprising administering to a subject suffering from cancer.
  • This treatment method may be performed by appropriately combining other cancer treatment methods and cancer treatment drugs.
  • a "subject” is a human or non-human organism, such as avian and non-human mammals (e.g., cows, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, rabbits, sheep, and horses). be.
  • avian and non-human mammals e.g., cows, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, rabbits, sheep, and horses.
  • folic acid-modified hydroxyalkylated cyclodextrin selected from the group consisting of folic acid-modified hydroxylpropyl cyclodextrin, folic acid-modified hydroxylbutyl cyclodextrin, and folic acid-modified hydroxylethyl cyclodextrin, or its It also relates to the use of derivatives.
  • Kits Cancer treatment kits are provided herein.
  • the kit can include the pharmaceutical compositions described above.
  • Kits can include instructions and the like.
  • the aforementioned pharmaceutical composition of the kit may contain other active ingredients, or the kit may further contain another pharmaceutical composition containing other active ingredients.
  • the pharmaceutical composition and the like are as described above.
  • FA-HP- ⁇ -CyD Folate-Modified Hydroxypropyl- ⁇ -Cyclodextrin
  • FA-EDA which is aminated folic acid (FA)
  • FA aminated folic acid
  • DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide
  • NHS N-Hydroxysuccinimide
  • HP- ⁇ -CyD was then activated with CDI to synthesize activated HP- ⁇ -CyD.
  • CDI basic catalyst triethylamine
  • FA-EDA was then reacted with CDI-activated HP- ⁇ -CyD to obtain FA-HP- ⁇ -CyD.
  • the entire amount of FA-EDA prepared in step (2) was added to the CDI-activated HP- ⁇ -CyD solution prepared in step (1) above, and the mixture was stirred for 24 hours.
  • Confirmation of preparation was performed by MALDI-TOF-MS and 1 H-NMR. The results of MALDI-TOF-MS are shown in FIG. 11, and the results of 1 H-NMR are shown in FIG.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used in the examples below includes ⁇ -FA-HP- ⁇ -CyD, ⁇ -FA-HP- ⁇ -CyD, and ⁇ , ⁇ -di-FA-HP- ⁇ -CyD is included.
  • Example 2 Expression of folate receptor- ⁇ Hepatic cell lines, lung cancer cell lines (A549), and leukemia cell lines (BV173, K562, Ba/F3 p190, and Ba/F3 p210) Expression of folate receptor ⁇ in cells was analyzed with a flow cytometer as follows. PE anti- FOLR1 antibody (Bio Legend), APC anti-human Folate Receptor ⁇ (FR- ⁇ ) antibody (Bio Legend) and APC anti-mouse Folate Receptor ⁇ ( FR- ⁇ ) antibody (Bio Legend) was added and incubated for 20 minutes in the dark. Cells were harvested by washing twice with 1 mL of PBS (pH 7.4), filtered through nylon mesh, and analyzed using a FACSVerse flow cytometer system (BD Biosciences).
  • FIG. 1 shows that leukemia cell lines (BV173, K562, Ba/F3 p190, and Ba/F3 p210) highly express folate receptor ⁇ .
  • Example 3 Cytostatic Effect on Leukemia Cell Lines Anti-proliferative effects on leukemic cell lines were evaluated by modified dimethyl-thiazole-diphenyl-tetrazolium (MTT assay) as follows.
  • hepatic cell lines and leukemic cell lines were used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1.
  • Cell viability was assessed using the trypan blue dye exclusion method.
  • Cell proliferation was assessed using the MTT assay Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan).
  • FIG. 2 shows that cell proliferation of leukemia cell lines (K562, BV173 and Ba/F3 p190) is dose-dependently suppressed.
  • FA-HP- ⁇ -CyD and HP- ⁇ -CyD were assayed, and IC 50 was determined.
  • Table 1 shows the results. From Table 1, the IC50 of FA-HP- ⁇ -CyD against leukemia cell lines (K562, BV173, Ba/F3 p190, Ba/F3 p210, MYL-R, K562-IMR and KBM5-STI) It can be seen that it is about 1/5 to about 1/20 for -CyD. Thus, FA-HP- ⁇ -CyD is about 5 to about 20 times more potent than HP- ⁇ -CyD. Thus, FA-HP- ⁇ -CyD is found to have stronger cytotoxic activity than HP- ⁇ -CyD.
  • FIG. 4D Although the cell line is KB cells, which is different from this example, folate-modified CyD (TRITC - Fol- C 1 - ⁇ -CyD) showed a 2- to 3-fold increase in intracellular uptake. In general, it is assumed that cytotoxicity increases in correlation with intracellular concentration. was assumed.
  • Example 4 Growth inhibitory effect on folate receptor low-expressing cells The growth inhibitory effect on folate receptor low-expressing cells A549 was evaluated as follows.
  • a human non-small cell lung cancer cell line (A549) was used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1.
  • Cell proliferation was performed by seeding leukemia cell lines in flat-bottom 96-well plates (Greiner Labortechnik, Hamburg, Germany) at 2 ⁇ 10 4 cells per well in 100 ⁇ l of DMEM medium (Sigma-Aldrich, USA) at various concentrations ( 0 mM (control: CT), 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM) of FA-HP- ⁇ -CyD and HP- ⁇ -CyD were exposed and incubated for 72 hours. It was then evaluated using the dimethyl-thiazole-diphenyl-tetrazolium (MTT) assay (Nacalai Tesque, Japan). Data represent the mean ⁇ standard deviation (SD) of three independent experiments.
  • MTT dimethyl-thiazole-diphenyl-tetrazolium
  • Example 5 Cytoproliferative effect on leukemic cell lines in the presence of folic acid (FA) The cytostatic effect on leukemic cell lines in the presence of folic acid (FA) was evaluated by MTT assay as follows.
  • leukemic cell lines K562 and BV173 were used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1. 2 ⁇ 10 4 cells were seeded in 100 ⁇ L medium per well in flat-bottom 96-well plates (Greiner Labortechnik, Hamburg, Germany) and FA-HP- ⁇ -CyD in the absence and presence of FA (2 mM). (5 mM) and HP- ⁇ -CyD (5 mM) in medium for 2 hours at 37°C. It was then evaluated using a modified dimethyl-thiazole-diphenyl-tetrazolium (MTT) assay, Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Data represent the mean ⁇ standard deviation (SD) of three independent experiments. The results are shown in FIG.
  • CT computed tomography
  • Example 6 Cellular Apoptosis Apoptosis of cells exposed to FA-HP- ⁇ -CyD was assessed by Annexin V/propidium iodide (PI) staining as follows.
  • leukemic cell lines K562 and BV173 were used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1. Apoptosis assays were performed by staining cells with propidium iodide (PI) and annexin V (BD Biosciences). Cells were cultured in 6-well plates at a cell density of 4 ⁇ 10 5 cells/well, and various concentrations (0 mM (control: CT), 0.5 mM, 1 mM and 1.5 mM) of FA-HP- ⁇ -CyD were added. Both were incubated for 48 hours.
  • PI propidium iodide
  • annexin V BD Biosciences
  • Example 7 Intracellular Uptake The intracellular uptake of FA-HP- ⁇ -CyD was evaluated as follows.
  • a leukemic cell line (BV173) was used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1. 10 mg of HP- ⁇ -CyD or FA-HP- ⁇ -CyD and 1 mg of TRITC were dissolved in 400 ⁇ L of dimethylsulfoxide (DMSO) and stirred for 24 hours, after which the solution was slowly poured into acetone. A precipitate was obtained and dissolved with water. It was lyophilized to prepare TRITC-HP- ⁇ -CyD and TRITC-FA-HP- ⁇ -CyD.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • TRITC-FA-M- ⁇ -CyD TRITC-HP- ⁇ -CyD
  • FA-HP- ⁇ - CyD HP- ⁇ CyD
  • ZEISS LSM880 confocal microscope was used for cell observation. Fluorescence image analysis software Imaris (ZEISS) was used for the analysis.
  • a control group was cultured at the same time as other exposure groups without drug exposure. The cell localization was stained with DAPI, the cell membrane was stained with PlasMen Bright Green, and the intracellular uptake of TRITC-FA-HP- ⁇ -CyD was evaluated with a confocal microscope.
  • Example 8 Induction of Autophagosome Formation The induction of autophagosome formation of FA-HP- ⁇ -CyD was assessed as follows.
  • leukemic cell lines K562 and BV173 were used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1. Cells were cultured in 6-well plates at a cell density of 4 ⁇ 10 5 cells/well, treated with 1 mM or 5 mM HP- ⁇ -CyD or FA-HP- ⁇ -CyD for 2 hours, and incubated. Then, Cyto-ID (registered trademark) autophagy detection kit (Enzo Life Sciences, USA) was used, and cells were observed under a fluorescence microscope AxioImager. M2 + ApoTome. 2 (ZEISS) was used.
  • Example 9 Effect of Autophagy Inhibition on Cytostatic Effect
  • leukemic cell lines K562 and BV173 were used.
  • FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1.
  • CT in FIG. 8 is evaluated as follows. That is, 2 ⁇ 10 5 cells were seeded in 100 ⁇ L of RPMI1640 medium per well in a flat-bottomed 96-well plate and cultured for 2 hours + 24 hours, the same as the exposed group, without exposure to drugs or autophagy inhibitors. and This CT was compared with the exposed group. A significant difference was tested as follows. That is, the data were analyzed using a two-sided Student's t-test without a control table. A value of P ⁇ 0.05 was considered significant.
  • Example 10 Combination of FA-HP- ⁇ -CyD and ABL Tyrosine Kinase Inhibitor The effect of combination of FA-HP- ⁇ -CyD and ABL tyrosine kinase inhibitor was evaluated as follows. In this example, leukemic cell lines (K562 and BV173) were used. FA-HP- ⁇ -CyD used was synthesized in Example 1.
  • IC 50 values for ABL tyrosine kinase inhibitors (imanitib and ponatinib) were obtained using the non-linear regression program CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).
  • Anti-leukemic activity of FA-HP- ⁇ -CyD in combination with TKIs was assayed in a single 96-well plate after IC 50 values for each drug were obtained.
  • Both K562 and BV173 cells were treated with 5 concentrations of both compounds (imanitib and ponatinib) (0.25x, 0.5x, 0.75x, 1.0x, or 2.0x the IC50 ). ).
  • the FA-HP- ⁇ -CyD synthesized in Example 1 was used.
  • EGFP+Ba/F3 BCR-ABLWT cells (1 ⁇ 10 6 cells) were transplanted into 6-week-old nude mice.
  • Example 12 Therapeutic effect of folic acid-modified HP- ⁇ -CyD on leukemic central nervous system invasion
  • Central nerve infiltration of leukemic cells is one of the complications that greatly affect the prognosis of leukemia patients. Even now, when prevention of central nervous system infiltration has become commonplace, central nervous system infiltration is still a major problem. reported as 15%.
  • Treatment methods include intrathecal administration of anticancer drugs, and intensive chemotherapy with large doses of anticancer drugs that easily migrate to the central nervous system, such as cytarabine and mesoterexate.
  • systemic administration is likely to cause damage to organs other than the central nervous system, and intrathecal administration may cause neurotoxicity and, in some cases, cytopenia.
  • model mice were prepared to verify the effects of HP- ⁇ -CyD and FA-HP- ⁇ -CyD on leukemia central nerve invasion.
  • the FA-HP- ⁇ -CyD synthesized in Example 1 was used.
  • the dose is the dose of HP- ⁇ -CyD for hereditary lipid storage disease Niemann-Pick disease type C (NPC) model mice (Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 452. https: http://doi.org/10.3390/ijms22010452), HP- ⁇ -CyD was set at 30 mg/kg and FA-HP- ⁇ -CyD at 3 mg/kg.
  • NPC Niemann-Pick disease type C
  • the intracerebroventricular drug concentrations at the time of drug administration were 7.78 mM for HP- ⁇ -CyD and 0.79 mM for FA-HP- ⁇ -CyD.
  • the FA-HP- ⁇ -CyD group showed longer survival than the Vehicle group and the HP- ⁇ -CyD group.
  • the HP- ⁇ -CyD group was compared with the model in which the vehicle (PBS administration), HP- ⁇ -CyD, and FA-HP- ⁇ -CyD were administered once (Fig. 13).
  • the FA-HP- ⁇ -CyD group survival was prolonged by 1 day.

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Abstract

ここでは、葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む、がん治療用医薬組成物が提供される。これにより、新たながん治療用医薬組成物などが提供される。

Description

がん治療用医薬組成物
　本発明は、がん治療用医薬組成物などに関する。
　がんは、わが国における死亡原因第１位の疾患である。一部のがんでは生存率は改善しているものの、進行がんでは未だ十分な治療法がなく、より有効な治療法の開発が望まれている。
　シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ＣｙＤ）は、グルコースがα－１，４結合で連なった環状マルトオリゴ糖であり、その疎水空洞内に種々の薬物を取り込むことが可能な単分子的ホスト分子である。また、ＣｙＤは、コレステロールと強固に結合し、細胞膜の脂質ラフトからコレステロールを引き抜き、その構造を破壊することからラフト阻害剤として広く用いられている。例えば、細胞内コレステロールに対する作用に着目し、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ＨＰ－β－ＣｙＤ）が、遺伝性の脂質蓄積病Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ｃ型（ＮＰＣ）に臨床応用されている。
　特許文献１（国際公開第２０１４／０８７７７８号）および非特許文献１（Ｙｏｋｏｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，(２０１５)１０（１１）：ｅ０１４１９４６．）では、コレステロールは腫瘍細胞の増殖や機能維持に必須であることからＨＰ－β－ＣｙＤ自体が抗腫瘍作用を持つのではないかと仮説を立て、ＨＰ－β－ＣｙＤ自体の白血病細胞に対する増殖抑制作用をｉｎ　ｖｉｔｒｏで証明している。
　ここで、がん細胞に対して殺細胞効果が高い抗がん剤に加えて、特に抗がん剤を標的部位に選択的かつ効率よくデリバリーさせる薬物送達システム（Ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）の構築が期待されている。ＤＤＳとは、薬物の体内動態を制御し薬物治療の最適化を目指すものであり、薬物放出挙動の制御、薬物の吸収促進、薬物の標的組織へのターゲティングなどに分類される。キャリアにターゲティング能を付与させる方法として、抗体、糖鎖、葉酸、トランスフェリンなどのリガンド修飾が知られている。
　なかでも葉酸は、１）安価である、２）葉酸レセプター（Ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＦＲ）は、各種上皮がん細胞で過剰発現し、正常細胞では発現が低いため、ＦＲ介在性エンドサイトーシスによりがん細胞選択的に取り込まれる、３）抗原性がないため反復投与が可能である、４）分子量が比較的小さいことからキャリアの細胞内動態に影響を与えにくい、などの利点からリガンド分子として汎用されている。
　特許文献２（特開２０１４－１２０４号公報）には、メチル－β－シクロデキストリンに葉酸を修飾した、葉酸修飾メチル化－β－シクロデキストリン（ＦＡ－Ｍ－β－ＣｙＤ）を腫瘍細胞選択的抗がん剤として用いることが記載されている。
　また、特許文献３（特開２０１６－６９５２０号公報）には、腫瘍集積能力を有する葉酸修飾シクロデキストリンに親水的な置換基（例えば、ポリエチレングリコール基、ヒドロキシプロピル基など）を導入して溶解性を高めたものが、がんへのターゲティングを目的としたＤＤＳとして有用であることが記載されている。
国際公開第２０１４／０８７７７８号 特開２０１４－１２０４号公報 特開２０１６－６９５２０号公報
Ｙｏｋｏｏ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，(２０１５)１０（１１）：ｅ０１４１９４６． Ｏｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（２０１３）１４，ｐ．４４２０－４４２８
　上記状況において、新たながん治療用医薬組成物などが求められていた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体に腫瘍細胞選択性を付与させるための葉酸を修飾することで、葉酸レセプターを高発現している腫瘍細胞に対しての指向性を高め、より強力な抗がん作用を発揮できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　ここでは、以下に示す、がん治療用医薬組成物などが提供される。
［１－１］　葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む、がん治療用医薬組成物。
［１－２］　有効成分として、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体のみを含む、上記［１－１］に記載の医薬組成物。
［１－３］　前記葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体が、葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである、上記［１－１］または［１－２］に記載の医薬組成物。
［１－４］　前記葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンが、葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンである、上記［１－３］に記載の医薬組成物。
［１－５］　ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いられる、上記［１－１］～［１－４］のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［１－６］　前記がんが、白血病である、上記［１－１］～［１－５］のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［１－７］　注射剤である、上記［１－１］～［１－６］のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［２－１］　葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんの治療方法。
［２－２］　前記組成物が有効成分として、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体のみを含む、上記［２－１］に記載の方法。
［２－３］　前記葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体が、葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである、上記［２－１］または［２－２］に記載の方法。
［２－４］　前記葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンが、葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンである、上記［２－３］に記載の方法。
［２－５］　前記組成物が、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載の方法。
［２－６］　前記がんが、白血病である、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載の方法。
［２－７］　前記組成物が注射剤である、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載の方法。
　ここでは、新たながん治療用医薬組成物が提供される。
葉酸レセプターβ（ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－β）の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 白血病細胞株への増殖抑制作用をＭＴＴアッセイで評価した結果を示す図である。 葉酸受容体低発現細胞Ａ５４９に対する増殖抑制作用を評価した結果を示す図である。 白血病細胞株への増殖抑制作用を評価した結果を示す図である。 細胞のアポトーシスをＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＰＩ染色で評価した結果を示す図である。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが細胞内に取り込まれることを示した図である。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤがオートファゴソーム形成を誘導することを示した図である。 オートファジーの阻害によりＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞増殖抑制効果が減弱することを示した図である。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとｉｍａｔｉｎｉｂまたはｐｏｎａｔｉｎｉｂとの併用効果（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ，ＣＩ）をＣａｌｃｕＳｙｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した結果を示した図である。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤがＢＣＲ－ＡＢＬ白血病マウスの生存期間を延長させることを示した図である。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルである（実施例１）。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである（実施例１）。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが脳室浸潤モデルマウスの生存期間を延長させることを示した図である（一回投与したモデル）。 ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが脳室浸潤モデルマウスの生存期間を延長させることを示した図である（二回投与したモデル）。
　以下、詳細に説明する。
　概略
　本発明者らは、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンに腫瘍細胞選択性を付与させるために、葉酸を修飾することで、葉酸レセプターを高発現している腫瘍細胞に対しての指向性を高め、より強力な抗がん作用を発揮できるのではないかと考えた。
　本発明者らは、先ず、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンの一つである、葉酸修飾ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ）を調製した（実施例１）。そして、このＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが、無修飾のＨＰ－β－ＣｙＤと比較して、約１／１０量で同等の抗白血病作用を示すことを見出した（実施例３）。しかも無修飾ではＨＰ－β－ＣｙＤは殆ど細胞内に取り込まれないが、葉酸修飾によってＨＰ－β－ＣｙＤが細胞内に大量に取り込まれ（実施例７、図６）、オートファジー細胞死が抗白血病作用の主たる要因であることが明らかとなった（実施例８、図７）。さらに、白血病マウスモデルで、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ投与により有意に生存期間延長が認められた（実施例１１および図１０）。
　白血病再発の原因となる白血病幹細胞はオートファジーを利用して様々な薬剤への抵抗性を獲得していることが知られている。ここで提供される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、それを逆手にとったものであり、新規のがん治療法の開発につながるものである。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン
　「シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ＣｙＤ）」は、グルコースがα－１，４結合で連なった環状マルトオリゴ糖であり、その疎水空洞内に種々の薬物を取り込むことが可能な単分子的ホスト分子である。ＣｙＤとしては、例えば、グルコース残基６個のα－ＣｙＤ、グルコース残基７個のβ－ＣｙＤ、グルコース残基８個のγ－ＣｙＤ、グルコース残基９個のδ－ＣｙＤ、グルコース残基１０個のε－ＣｙＤ、およびそれらの誘導体などが知られている。
　「ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン」は、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、ヒドロキシブチルシクロデキストリン、およびヒドロキシエチルシクロデキストリンからなる群より選択されるヒドロキシアルキル化シクロデキストリンである。ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、シクロデキストリン（例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリンなど）の水酸基が、ランダムに、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基またはヒドロキシエチル基に置換された化合物である。例えば、ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンとは、β－シクロデキストリンの７個のグルコースの２位、３位および６位の水酸基がランダムにヒドロキシアルキル基に置換された化合物である。
　「葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン」とは、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンのグルコースに葉酸が共有結合された化合物である。葉酸が結合する部位は特に限定されないが、グルコースの２位および／または６位が好ましく、６位が特に好ましい。葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン中の葉酸が結合する割合は、特に限定されないが、シクロデキストリン分子：葉酸分子で、１：１～１：１４が好ましく、１：１～１：７がより好ましい。好ましい葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンである。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシエチルシクロデキストリンからなる群より選択されるものである。葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、好ましくは、葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシブチル－β－シクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンである。あるいは、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、好ましくは、葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである。葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、特に好ましくは、葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンである。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンの調製方法
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、公知の方法を用いて合成することができる。例えば、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－α－シクロデキストリンおよび葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンは、ヒドロキシアルキル化－α－シクロデキストリンおよびヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンの水酸基をアミノ化後、縮合反応により葉酸を結合させることにより合成できる。また、例えば、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－γ－シクロデキストリンは、ヒドロキシアルキル化－γ－シクロデキストリンの水酸基をアミノ化後、縮合反応により葉酸を結合させることにより合成できる。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンは、葉酸のαカルボキシル基またはγカルボキシル基のいずれにヒドロキシアルキル化シクロデキストリンが導入されていてもよい。例えば、葉酸にヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンを導入する場合は、葉酸のαカルボキシル基にヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンを導入したもの（α－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリン）、あるいは葉酸のγカルボキシル基にヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンを導入したもの（γ－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリン）、あるいは葉酸のαカルボキシル基とγカルボキシル基の両方にヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンを導入したもの（α，γ－ｄｉ－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリン）のいずれも、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンに含まれる。葉酸のαカルボキシル基にヒドロキシアルキル化シクロデキストリンを導入した葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンを合成する場合は、葉酸のγカルボキシル基を保護した上で葉酸と結合させ、保護基を外すことにより合成できる。あるいは、葉酸のγカルボキシル基にヒドロキシアルキル化シクロデキストリンを導入した葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンを合成する場合は、葉酸のαカルボキシル基を保護した上で葉酸と結合させ、保護基を外すことにより合成できる。
　いくつかの態様の医薬組成物には、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンとして、α－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンと、γ－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンと、α，γ－ｄｉ－葉酸修飾ヒドロキシアルキル化－β－シクロデキストリンの少なくとも１つ（１つ、２つ、あるいは３つ全て）が含まれる。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンの誘導体
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン誘導体には、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンに、さらに他の化合物を共有結合したものが含まれる。結合する他の化合物は、特に限定はされないが、例えば、各種レセプターへの結合能を有する化合物、抗腫瘍性または抗がん性を有する化合物などを挙げることができる。そのような化合物の具体的な例として、例えば、トランスフェリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、がん細胞を特異的に認識する抗体などをあげることができる。
　葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン誘導体には、他の化合物を葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンに共有結合したものは含まれるが、包接したものは含まれない。
　医薬組成物
　上述の葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を常套手段に従って、製剤化し、がん治療用医薬組成物として用いることができる。
　ここでは、葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む、がん治療用医薬組成物が提供される。
　がん治療用医薬組成物は、組成物中に、抗がん活性を有する有効成分として葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む。すなわち、医薬組成物中に、他の有効成分の可溶化剤および／または安定化剤として葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含むのではなく、抗がん活性を有する有効成分そのものとして葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む。このため、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を他の有効成分の可溶化剤および／または安定化剤として含む医薬組成物は前記がん治療用医薬組成物から除かれる。
　癌治療用医薬組成物は、抗がん作用を有する有効成分として葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む限り、他の抗がん作用を有する有効成分を含むこともできる。いくつかの態様では、抗がん作用を有する主要な有効成分として葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含み、さらに好ましくは、抗がん作用を有する有効成分として葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体のみを含む。
　がん治療用組成物は、経口投与のための組成物でもよく、あるいは非経口投与のための組成物でもよい。
　例えば、経口投与のための組成物としては、固体、または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧吸入剤、塗布剤、貼付剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤、などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記活性成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。点眼剤、点鼻剤、噴霧吸入剤、坐剤、塗布剤、貼付剤等も、上記活性成分を用いて自体公知の方法に従って調製される。
　がん治療用医薬組成物は、好ましくは、注射剤である。注射剤は、水溶性製剤または凍結乾燥製剤のいずれの形態をとることができ、すなわち、水性注射剤、または凍結乾燥した用時溶解型注射剤である。
　いくつかの態様の医薬組成物は、抗がん活性を有する主要な有効成分として、好ましくは唯一の有効成分として、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含有する抗がん剤であって、注射剤の形態をとる。注射剤は、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体に加えて注射剤に通常用いられる添加剤を含むこともできる。すなわち、かかる注射剤は、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体および医薬上許容される添加剤を含むものであるか、あるいは葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体および医薬上許容される添加剤のみからなるものである。これらの注射剤は、水溶性製剤または凍結乾燥製剤のいずれの形態をとることもできる。
　医薬組成物において、治療の対象となるがんは、例えば、乳がん、小細胞肺がん、大腸がん、悪性リンパ腫、白血病、精巣腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、歯肉がん、食道がん、胃がん、胆管がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、前立腺がんなどである。治療の対象となるがんは、好ましくは、白血病である。
　医薬組成物において、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体の有効投与量は、癌の性質、病気の程度、治療方針、転移の程度、腫瘍の量、体重、年齢、性別、患者の（遺伝的）人種的背景などに依存して適宜選択できるが、投与量は、一般に、臨床上観察される症状、病気の進行の度合い等の要因に基づいて決定される。１日あたりの投与量は、ヒトに投与する場合は、例えば、０．５ｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇ（体重６０ｋｇの成人では、３０ｇ～６００ｇ）、１ｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ～５ｇ／ｋｇ、あるいは１．２～５ｇ／ｋｇである。投与は、１回で投与しても複数回に分けて投与してもよく、また、点滴等により時間をかけて連続的に投与してもよい。いくつかの態様では、医薬組成物は、点滴により数時間～約１０時間をかけて投与する。また、投与は、連日であっても間歇投与であってもよく、投与対象の状態に応じて適宜選択できる。いくつかの態様では、投与は、間歇投与である。
　併用
　いくつかの態様では、医薬組成物は、他の活性成分と組み合わせて用いられる。別のいくつかの態様では、医薬組成物は、他の活性成分と組み合わせることなく用いられる。
　「他の成分と組み合わせて」とは、併用することである。葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体と他の成分は、同時に製剤化して得られる単一の製剤の形態でもよいし、あるいは、別々に製剤化して得られる２種以上の製剤の形態でもよい。２種以上の製剤の形態の場合、それらを、患者に、同時に投与するように用いてもよいし、あるいは、別々に投与するように用いてもよい。
　他の活性成分としては、例えば、他の抗癌剤などが挙げられる。他の抗癌剤としては、例えば、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体医薬品、ピリミジン拮抗薬（例えば、シタラビン（キロサイドＲ）、エノシタビン（ＢＨＡＣ））、プリン拮抗薬（例えば、フルダラビン（フルダラＲ）、ネララビン（アラノンジーＲ）、６－メルカプトプリン（ロイケリンＲ））、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤（例えば、アザシチヂン（ビダーザＲ））、葉酸拮抗薬（例えば、メソトレキサート（メソトレキセートＲ））、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシンＲ）、イダルビシン（イダマイシンＲ）、ドキソルビシン（アドリアシンＲ）、アクラルビシン（アクラシノンＲ））、アルキル化剤（例えば、サイクロフォスファミド（エンドキサンＲ））、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン（オンコビンＲ）、ビンデシン（フィルデシンＲ））、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、エトポシド（ベプシドＲ、ラステットＲ））、副腎皮質ホルモン製剤（例えば、プレドニソロン（プレドニンＲ）、デキサメサゾン（デカドロンＲ、レナデックスＲ））、レチノイン酸（ベサノイドＲ）、タミバロテン（アムノレイクＲ）、アントラキノン系抗悪性腫瘍剤（例えば、ミトザントロン（ノバントロンＲ））、代謝拮抗剤（例えば、ハイドロキシウレア（ハイドレアＲ））、酵素薬（例えば、アスパラギナーゼ（ロイナーゼＲ））、亜砒酸（トリセノックスＲ）、インターフェロン（スミフェロンＲ））、免疫調節薬（例えば、レナリドマイド（レブリミドＲ）、ポマリドミド（ポマリストＲ））などが挙げられる。ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ、ポナチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブなどが挙げられる。
　いくつかの態様では、医薬組成物は、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いられるものである。このときのＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、イマチニブ、ポナチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブなどである。
　他の活性成分の有効投与量は、癌の性質、病気の程度、治療方針、転移の程度、腫瘍の量、体重、年齢、性別、患者の（遺伝的）人種的背景などに依存して適宜選択できる。
　他の活性成分は、公知の方法に従って、薬理学的に許容される担体と混合して医薬、例えば、錠剤(糖衣錠、フイルムコーティング錠を含む)、散剤、顆粒剤、カプセル剤、(ソフトカプセルを含む)、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤などとすることができ、それらは、経口的、又は非経口的に投与することができる。
　医薬組成物を他の活性成分と組み合わせて用いるときの、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体と他の成分の配合比は、投与対象、投与ルート、疾患などにより適宜選択することができる。
　治療方法
　ここでは、前述の医薬組成物を用いることを含む、がんの治療方法も提供され得る。好ましくは、葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、がんの治療方法である。
　医薬組成物の具体的な態様、具体的な対象への適用方法、用語の意義等は、前述のとおりである。他のがんの治療方法やがんの治療薬を適宜組み合せて本治療方法を行ってもよい。
　「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
　また、前述の医薬組成物を製造するための、葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体の使用にも関する。
　キット
　ここでは、がん治療用キットが提供される。
　キットには、前述の医薬組成物を含めることができる。キットは、取り扱い説明書等を含めることができる。また、併用の場合には、キットの前述の医薬組成物に他の活性成分が含まれていてもよいし、あるいは、キットに、他の活性成分を含む別の医薬組成物をさらに含めるようしてもよい。
　医薬組成物などについては、前記で説明したとおりである。
　なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願２０２１－１２６０３２（２０２１年７月３０日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を参照して組み込むものとする。
　また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
 
　実施例で用いた各試薬は次の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例１：葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ）の調製
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを、以下の通り調製した。
（１）アミノ化葉酸（ＦＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　先ず、アミノ化葉酸（ＦＡ）であるＦＡ－ＥＤＡをＦＡにＥＤＡを結合すること（アミノ基を導入すること）で合成した。
　ＦＡ（８８０ｍｇ）を２５ｍＬのＤＭＳＯへ溶解後、Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ，４１２ｍｇ）とＮ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ，２３０ｍｇ）を加え、２０時間撹拌した。ＥＤＡ（１ｍＬ）を添加し、さらに２４時間撹拌した。アセトニトリルで洗浄（溶解、撹拌したのちに上清除去）を３回行い、凍結乾燥し、ＦＡ－ＥＤＡを得た。
（２）活性化ＨＰ－β－ＣｙＤの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　次に、ＨＰ－β－ＣｙＤをＣＤＩで活性化して活性化ＨＰ－β－ＣｙＤを合成した。
　ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳ　５．５，１．５ｇ）を２０ｍＬのＤＭＳＯへ溶解後、塩基性触媒であるＴｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＴＥＡ，１００μＬ）およびＣＤＩ（１．６２ｇ）を加え、窒素置換後、１６時間撹拌し、活性化ＨＰ－β－ＣｙＤを得た。
（３）ＦＡ－ＥＤＡとＣＤＩ活性化ＨＰ－β－ＣｙＤの反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　次に、ＦＡ－ＥＤＡとＣＤＩ活性化ＨＰ－β－ＣｙＤを反応させて、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを得た。
　上記（１）の工程で調製したＣＤＩ活性化ＨＰ－β－ＣｙＤ溶液に、上記（２）の工程で調製したＦＡ－ＥＤＡを全量加え、２４時間撹拌した。０．１ｍＭアンモニア水で１週間透析後（ＭＷＣＯ　１，０００）、凍結乾燥した。乾燥後、イオン交換樹脂（ダイヤイオンＰＫ２１２）カラムで分取し、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを得た。
　調製の確認は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳおよび１Ｈ－ＮＭＲで行った。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図１１に示し、１Ｈ－ＮＭＲの結果を図１２に示す。
　図１１のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果において、ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＤＳ　５．５）単独よりも高分子量側に２つのブロードなピークが認められた。分子量２，０００付近の大きなピークは、１つのＨＰ－β－ＣｙＤにＦＡが複数個結合したＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤであると考えられる。また、分子量３，５００付近のピークは、１つのＦＡに２つのＨＰ－β－ＣｙＤが結合したｄｉ－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤであると考えられる。以上の結果より、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの調製が確認できた。
　以下の実施例で用いた「ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ」には、α－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ、γ－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ、およびα，γ－ｄｉ－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが含まれる。
　置換度は（葉酸分子数／ＣｙＤ分子数）で表される。１Ｈ－ＮＭＲの結果において、ＦＡおよびＨＰ－β－ＣｙＤ由来のピークが観察された。また、そのピーク面積より算出したＦＡの平均置換度は２．０８であった。
　葉酸置換度＝（ＦＡの積分値／プロトン数）／（ＣｙＤのプロトン数／ＨＰ置換度／プロトン数）＝（０．５２／１）／（４．１１／５．５／３）＝２．０８
実施例２：葉酸レセプターβ（ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－β）の発現
　肝細胞株、肺癌細胞株（Ａ５４９）、および白血病細胞株（ＢＶ１７３、Ｋ５６２、Ｂａ／Ｆ３　ｐ１９０、およびＢａ／Ｆ３　ｐ２１０）の各細胞株における葉酸レセプターβの発現を、以下の通り、フローサイトメーターで解析した。　各細胞株２×１０６個の細胞混濁液に、ＰＥ　ａｎｔｉ－ＦＯＬＲ１抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β（ＦＲ－β）抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ）およびＡＰＣ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｆｏｌａｔｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　β（ＦＲ－β）抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ）を添加して２０分暗所でインキュベートした。１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄して細胞を収集し、ナイロンメッシュで濾過し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターシステム（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
　その結果を図１に示す。図１から、白血病細胞株（ＢＶ１７３、Ｋ５６２、Ｂａ／Ｆ３　ｐ１９０、およびＢａ／Ｆ３　ｐ２１０）は、葉酸レセプターβを高発現することがわかる。
実施例３：白血病細胞株に対する細胞増殖抑制作用
　白血病細胞株への増殖抑制作用を、以下の通り、改変ジメチル－チアゾール－ジフェニル－テトラゾリウム（ＭＴＴアッセイ）で評価した。
　本実施例では、肝細胞株、および白血病細胞株（Ｋ５６２、ＢＶ１７３、Ｂａ／Ｆ３　ｐ１９０、Ｂａ／Ｆ３　ｐ２１０、ＭＹＬ－Ｒ、Ｋ５６２－ＩＭＲおよびＫＢＭ５－ＳＴＩ）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　細胞生存率は、トリパンブルー色素排除法を使用して評価した。細胞増殖は、ＭＴＴアッセイであるＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を使用して評価した。平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ハンブルグ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で２×１０４個の各細胞を播種し、さまざまな濃度（０ｍＭ（コントロール：ＣＴ）、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ）のＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＨＰ－β－ＣｙＤに暴露して７２時間インキュベートした。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表している。
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを用いてアッセイした結果を、下記表および図２に示す。図２から、白血病細胞株（Ｋ５６２、ＢＶ１７３およびＢａ／Ｆ３　ｐ１９０）の細胞増殖が、用量依存的に抑制されていることがわかる。
　さらに、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＨＰ－β－ＣｙＤを用いてアッセイしＩＣ５０を求めた結果を表１に示す。表１から、白血病細胞株（Ｋ５６２、ＢＶ１７３、Ｂａ／Ｆ３　ｐ１９０、Ｂａ／Ｆ３　ｐ２１０、ＭＹＬ－Ｒ、Ｋ５６２－ＩＭＲおよびＫＢＭ５－ＳＴＩ）に対するＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤのＩＣ５０は、ＨＰ－β－ＣｙＤに対して約１／５～約１／２０であることがわかる。すなわち、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較して約５倍～約２０倍強力である。このように、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、ＨＰ－β－ＣｙＤより強力な細胞障害活性を持つことがわかる。
　ＨＰ－β－ＣｙＤに葉酸を修飾しただけでは、ＨＰ－β－ＣｙＤと比較してＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞障害活性は約２倍～約３倍にしかならかないと予想されるところ、実際には上記の通り約５倍～約２０倍強力であり、このことは従来の技術常識からは予測できないことである。
　ここで、非特許文献２（Ｏｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（２０１３）１４，ｐ．４４２０－４４２８）のＦｉｇ．４Ｄにあるように、細胞株は本実施例とは異なるＫＢ細胞であるが、未修飾体（ＴＲＩＴＣ－ＮＨ２－Ｃ１－β－ＣｙＤ）と比較して、葉酸修飾ＣｙＤ（ＴＲＩＴＣ－Ｆｏｌ－Ｃ１－β－ＣｙＤ）は２～３倍程度の細胞内取り込みであった。一般的に細胞内の濃度に相関して細胞障害性は高まることが推測されるため、本実施例で用いた細胞でも葉酸修飾による細胞障害性は２～３倍程度増強されるにとどまると従来は想定されていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例４：葉酸受容体低発現細胞に対する増殖抑制作用
　葉酸受容体低発現細胞Ａ５４９に対する増殖抑制作用を、以下の通り、評価した。
　本実施例では、ヒト非小細胞肺癌細胞株（Ａ５４９）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　細胞増殖は、白血病細胞株を平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ハンブルグ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌのＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で２×１０４個の細胞を播種し、さまざまな濃度（０ｍＭ（コントロール：ＣＴ）、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ）のＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＨＰ－β－ＣｙＤを暴露して７２時間インキュベートした。次に、ジメチル－チアゾール－ジフェニル－テトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ、日本）を使用して評価した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表している。
　その結果を図３に示す。葉酸受容体低発現細胞Ａ５４９に対してＨＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは強い細胞障害活性を示すものの、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは抗腫瘍活性を示さない。このことから、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、葉酸受容体を強く発現している細胞への選択性を有することが分かる。
実施例５：葉酸（ＦＡ）存在下での白血病細胞株に対する細胞増殖抑制作用
 
　葉酸（ＦＡ）存在下での白血病細胞株に対する細胞増殖抑制作用を、以下の通り、ＭＴＴアッセイで評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ハンブルグ、ドイツ）にウェルあたり１００μＬの培地で２×１０４個の各細胞を播種し、ＦＡ（２ｍＭ）の非存在下および存在下でＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（５ｍＭ）とＨＰ－β－ＣｙＤ（５ｍＭ）を含む培地とともに３７℃で２時間インキュベートした。次に、改変ジメチル－チアゾール－ジフェニル－テトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイであるＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を使用して評価した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表している。
　その結果を図４に示す。
　ここで、図４中の「ＣＴ」、「ｏｎｌｙ　ＦＡ」は、それぞれ、次のように評価したものである。すなわち、平底９６ウェルプレートにウェルあたり１００μＬの培地で２×１０４個の各細胞を播種し、３７℃で２時間インキュベートしたものを「ＣＴ」とし、ＦＡのみを暴露して３７℃で２時間インキュベートしたものを「ｏｎｌｙ　ＦＡ」として評価した。
　有意差は次の通り検定した。検証薬剤（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　ｗｉｔｈ　ＦＡ、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＦＡ）の２標本ｔ検定を行った。２標本の比較において、ｐ＜０．０５であり、有意差はあるといえる。
　図４に示されているように、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）においては、ＦＡ存在下でのＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　ｗｉｔｈ　ＦＡ）の抗腫瘍活性は、ＦＡ非添加系（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ＦＡ）と比較して有意に低下した。この結果は、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの抗腫瘍活性は葉酸受容体を介することを示すものである。
実施例６：細胞のアポトーシス
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを暴露した細胞のアポトーシスを、以下の通り、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　アポトーシスアッセイは、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）およびアネキシンＶ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色することによって実行した。細胞を６ウェルプレートで４×１０５個／ｗｅｌｌの細胞密度で培養し、さまざまな濃度（０ｍＭ（コントロール：ＣＴ）、０．５ｍＭ、１ｍＭおよび１．５ｍＭ）のＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤをともに４８時間インキュベートした。次に、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびアネキシンＶ－ＡＰＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターシステム（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表している。
　その結果を図５Ａ～Ｃに示す。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）に対して濃度依存的にアポトーシスを誘導することが分かる。
実施例７：細胞内への取り込み
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞内への取り込みを、以下の通り、評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（ＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　１０ｍｇのＨＰ－β－ＣｙＤまたはＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤと１ｍｇのＴＲＩＴＣを４００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２４時間撹拌した後、溶液を徐々にアセトンに注いだ。沈殿物を得て、水で溶解した。それを凍結乾燥し、ＴＲＩＴＣ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＴＲＩＴＣ－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを調製した。
　次に、細胞を６ウェルプレートでウェルあたり４×１０ｅ５個の細胞密度で培養し、さまざまな濃度のＴＲＩＴＣ－ＦＡ－Ｍ－β－ＣｙＤ，ＴＲＩＴＣ－ＨＰ－β－ＣｙＤ，ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ，ＨＰ－βＣｙＤをともにインキュベートした。細胞観察にはＺＥＩＳＳ　ＬＳＭ８８０の共焦点顕微鏡を使用した。解析には、蛍光画像解析ソフトウェアＩｍａｒｉｓ（ＺＥＩＳＳ）を使用した。
　薬剤を暴露せずに、他の暴露群と同時に培養したものをＣｏｎｔｒｏｌとした。細胞局在をＤＡＰＩで、細胞膜をＰｌａｓＭｅｎ　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｇｒｅｅｎで染色し、ＴＲＩＴＣ－ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤが細胞内に取り込まれていることを共焦点顕微鏡で評価した。
　その結果を図６に示す。一般にＣｙＤは親水性かつ分子量が約１０００と大きいことから、細胞内に取り込まれがたいことが知られている。実際、ＴＲＩＴＣを付加した実験により葉酸無修飾のＨＰ－β－ＣｙＤは細胞内に取り込まれていない。しかしながら、ＴＲＩＴＣを付加した実験によりＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは細胞内に取り込まれることがわかった。
実施例８：オートファゴソーム形成の誘導
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤのオートファゴソーム形成の誘導を、以下の通り、評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　細胞を６ウェルプレートで４×１０５個／ｗｅｌｌの細胞密度で培養し、１ｍＭまたは５ｍＭのＨＰ－β－ＣｙＤまたはＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤで２時間処理し、細胞をインキュベートした。その後、Ｃｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を使用し、細胞観察には蛍光顕微鏡ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ．Ｍ２＋ＡｐｏＴｏｍｅ．２（ＺＥＩＳＳ）を使用した。
　その結果を図７に示す。オートファゴソーム膜タンパク質ＬＣ３Ｂは、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤで細胞をインキュベートしたときに、濃度依存的に増加することがわかる。尚、図７中のＤＩＣは、微分干渉顕微鏡でのイメージである。このことから、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、無修飾のＣｙＤ類とは異なり、細胞内に取り込まれることで抗腫瘍活性を示すことがわかる。
実施例９：オートファジー阻害の細胞増殖抑制効果に対する影響
　オートファジー阻害の細胞増殖抑制効果に対する影響を、以下の通り、評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ハンブルグ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で２×１０５個の各細胞を播種し、５ｍＭ ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤと１５ｍＭ ＨＰ－β－ＣｙＤで３７℃、２時間処理した。次にオートファジー阻害剤であるクロロキン（２０μＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社）、バフィロマイシンＡ１（１ｎＭ）（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）またはＬＹ２９４００２（５０μＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社）で２４時間前処理した。その後、細胞増殖を、改変ジメチル－チアゾール－ジフェニル－テトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイであるＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）を使用して評価した。データは、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表している。
　その結果を図８に示す。
　ここで、図８中の「ＣＴ」は、次のように評価したものである。すなわち、平底９６ウェルプレートにウェルあたり１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５個の各細胞を播種し、薬剤、オートファジー阻害剤を暴露せず、暴露群と同じ２時間＋２４時間培養したものをＣＴとした。このＣＴと暴露群を比較した。
　有意差は次の通り検定した。すなわち、データの解析には対照表のない両側のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いて分析した。Ｐ＜０．０５の値を有意差ありとした。
　オートファジー阻害剤の添加により、葉酸修飾ＣｙＤ（ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ）の細胞増殖抑制能は低下するが（図８Ａおよび図８Ｂ）、無修飾ＣｙＤ（ＨＰ－β－ＣｙＤ）ではその影響を受けない（図８Ｃおよび図８Ｄ）。このことから、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの細胞障害活性の機序としてアポトーシス誘導以外に、オートファジーが強く関わることが分かる。
実施例１０：ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤の併用
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤の併用の効果を、以下の通り、評価した。
　本実施例では、白血病細胞株（Ｋ５６２およびＢＶ１７３）を用いた。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（ｉｍａｎｉｔｉｂおよびｐｏｎａｔｉｎｉｂ）のＩＣ５０値は、非線形回帰プログラムＣａｌｃｕＳｙｎ（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ、英国）を使用して得た。
　各薬剤のＩＣ５０値が得られた後、ＴＫＩと組み合わせたＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの抗白血病活性を単一の９６ウェルプレートでアッセイした。Ｋ５６２細胞とＢＶ１７３細胞の両方を、両方の化合物（ｉｍａｎｉｔｉｂおよびｐｏｎａｔｉｎｉｂ）の５つの濃度（ＩＣ５０の０．２５倍、０．５倍、０．７５倍、１．０倍、または２．０倍）で処理した。併用効果と比較するために、細胞を単剤として各化合物（ｉｍａｎｉｔｉｂおよびｐｏｎａｔｉｎｉｂ）で処理した。影響を受ける画分（Ｆａ；０．２５のＦａは２５％の生細胞を示す）および組み合わせ指数（ＣＩ）は、ＣａｌｃｕＳｙｎ（Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使用して計算した。この方法は、さまざまな用量と効果レベルでの相乗作用（ＣＩ＜１）と拮抗作用（ＣＩ＞１）の定量化を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表わす。
　その結果を図９に示す。Ｋ５６２細胞については、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとｉｍａｎｉｔｉｂまたはｐｏｎａｔｉｎｉｂとの組み合わせでは、Ｆａ値の増加にともないＣＩ値が減少することが確認された（ＣＩ＜１）。ＢＶ１７３細胞についても、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとｉｍａｎｉｔｉｂとの組み合わせでは、Ｆａ値の増加にともないＣＩ値が減少し（ＣＩ＜１）、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤとｐｏｎａｔｉｎｉｂとの組み合わせでは、低Ｆａ値の域ではＣＩ＜１となることが確認された。このことから、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは慢性骨髄性白血病の治療薬、ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤との併用により相乗作用を示すことが分かる。
実施例１１：ＢＣＲ－ＡＢＬ白血病マウスの生存期間延長
　ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤによるＢＣＲ－ＡＢＬ白血病マウスの生存期間延長の効果を、以下の通り、評価した。
　本実施例では、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　ＥＧＦＰ＋Ｂａ／Ｆ３　ＢＣＲ－ＡＢＬＷＴ細胞（１×１０６個）を６週齢のヌードマウスに移植した。移植の３日後、２００μＬのビヒクル（ｎ＝１０）、１５０ｍＭ（２０８６．５ｍｇ／ｋｇ）ＨＰ－β－ＣｙＤ（ｎ＝１０）、１５ｍＭ（２４９ｍｇ／ｋｇ）ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ（ｎ＝１０）、または６．６μＭ（２００ｍｇ／ｋｇ）ｉｍａｔｉｎｉｂ（ｎ＝１０）を１日２回、２０日間腹腔内注射した。生存期間は毎日監視した。生存データを、ログランクのノンパラメトリック検定を使用して分析し、カプランマイヤー生存曲線として示した。
　有意差は次の通り検定した。すなわち、データの解析には対照表のない両側のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いて分析した。Ｐ＜０．０５の値を有意差ありとした。
　その結果を図１０に示す。ＢＣＲ－ＡＢＬ白血病モデルマウスにおいて、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤはＨＰ－β－ＣｙＤの１／１０量で同等の生存期間延長をもたらすことが分かる。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは腫瘍細胞に指向性があるためＨＰ－β－ＣｙＤの約５倍～約２０倍の殺細胞効果を有している（実施例３）。この結果、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいても、少量で、生存期間が有意に延長したと考えられる。
実施例１２：白血病中枢神経浸潤に対する葉酸修飾ＨＰ－β－ＣｙＤの治療効果
［目的］
　白血病細胞の中枢神経浸潤は白血病患者の予後に大きく関わる合併症の一つである。中枢神経浸潤の予防が一般化された現在においても、依然として中枢神経浸潤は大きな問題であり、急性リンパ性白血病の再発のうち中枢神経浸潤を伴うものは小児では３０～４０％、成人では１～１５％と報告されている。治療法としては、抗がん剤の髄腔内投与や、シタラビンやメソテレキセートなどの中枢神経に移行しやすい抗がん剤の大量投与による強化化学療法が行われている。特に全身投与は中枢神経系以外でも臓器障害をきたしやすく、髄腔内投与は神経毒性の他、時に血球減少などもきたすことがある。何より、これらは３０～４０年ほど前より行われており、白血病中枢神経浸潤に対する治療法には一向に進歩がない。
　今回、ＨＰ－β－ＣｙＤ、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤの白血病中枢神経浸潤に対する効果についてモデルマウスを作製し検証した。
［実験方法］
脳室浸潤モデルマウス
　ＢＲＪマウス（雌）を麻酔（塩酸メデトミジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ミタゾラム（４ｍｇ／ｋｇ）、酒石酸ブトルファノール（５ｍｇ／ｋｇ）三種混合麻酔を腹腔内（ＩＰ）で１００ｕＬ投与する）下で、ハミルトンシリンジＬＴ型針先形状ｐｓｔ－３、２５ゲージを用いて正確に３ｍｍの深さまでＢＶ１７３細胞（白血病細胞）を注入するように設計されたポリエチレンストッパーチューブを備えたマイクロシリンジを、矢状縫合によって定義される中心線の右側１ｍｍの点で右冠状縫合を通して髄腔内移植した。
投与量の決定
　本実施例では、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤは、実施例１で合成したものを用いた。
　投与量は、遺伝性の脂質蓄積病Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ｃ型（ＮＰＣ）モデルマウスに対してのＨＰ－β－ＣｙＤの投与量（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０２１，２２，４５２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｉｊｍｓ２２０１０４５２）を参考に、ＨＰ－β－ＣｙＤ　３０ｍｇ／ｋｇ、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　３ｍｇ／ｋｇとした。
　また、下記表に示したマウスの脳脊髄液量を基に薬剤投与時の脳室内薬剤濃度は、ＨＰ－β－ＣｙＤ　７．７８ｍＭ、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　０．７９ｍＭとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［結果］
　その結果を、図１３に示す。白血病細胞（ＢＶ１７３）脳室移植後、２週目で、ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ投与）（ｎ＝８）、ＨＰ－β－ＣｙＤ　３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）を一回投与した。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ群はＶｅｈｉｃｌｅ群やＨＰ－β－ＣｙＤ群と比較して生存延長を認めた。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してＨＰ－β－ＣｙＤではＰ＝０．０７４６であり、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤではＰ＝０．０１１１であった。
　また、別の結果を、図１４に示す。白血病細胞（ＢＶ１７３）脳室移植後、１週目で一回、２週目で一回、ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ投与）（ｎ＝８）、ＨＰ－β－ＣｙＤ　３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ　３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）を合計二回投与した。ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ群はＶｅｈｉｃｌｅ群やＨＰ－β－ＣｙＤ群と比較して生存延長を認めた。ここで、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してＨＰ－β－ＣｙＤではＰ＝０．１８２であり、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤではＰ＝０．０４７２であった。脳室移植後、２週目で、ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ投与）、ＨＰ－β－ＣｙＤ、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤを一回投与（図１３）したモデルと比較して、ＨＰ－β－ＣｙＤ群においては生存延長は認められなかったが、ＦＡ－ＨＰ－β－ＣｙＤ群では１日生存延長された。
　ここで、有意差は次の通り検定した。すなわち、データの解析には対照表のない両側のＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いて分析した。Ｐ＜０．０５の値を有意差ありとした。
［考察］
　目的でも述べたように、白血病の中枢神経浸潤は患者の予後に大きく影響する合併症であり、予防を行ってもある一定の割合で発生する。その治療法も長年変わらず、進歩がない。また、髄腔内投与、全身化学療法ともに有害事象をきたし、何度も繰り返し頻回に行えるものではない。その点、シクロデキストリンは抗がん剤投与でみられる血球減少をきたす可能性は低く、Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ病Ｃ型患児へのＨＰ－β－ＣｙＤ髄室内投与が長期に可能であることからも、より少量で有効性の高い葉酸修飾ＨＰ－β－ＣｙＤが白血病中枢神経浸潤に対して有望な薬剤であることを明確に示すものである。

Claims (7)

  1. 　葉酸修飾ヒドロキシルプロピルシクロデキストリン、葉酸修飾ヒドロキシルブチルシクロデキストリン、および葉酸修飾ヒドロキシルエチルシクロデキストリンからなる群より選択される葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体を含む、がん治療用医薬組成物。
  2. 　有効成分として、葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体のみを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記葉酸修飾ヒドロキシアルキル化シクロデキストリンまたはその誘導体が、葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記葉酸修飾ヒドロキシプロピルシクロデキストリンが、葉酸修飾ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンである、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いられる、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 　前記がんが、白血病である、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　注射剤である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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