CN113365613A - 透明质酸和表没食子儿茶素-3-o-没食子酸酯的缀合物和纳米颗粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包括由以下中的一种形成的纳米颗粒：二聚表没食子儿茶素‑3‑O‑没食子酸酯和透明质酸的缀合物；表没食子儿茶素‑3‑O‑没食子酸酯和透明质酸的缀合物；或表没食子儿茶素‑3‑O‑没食子酸酯‑封端的透明质酸缀合物；以及合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中所述活性剂被包封在所述纳米颗粒中。

Description

透明质酸和表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯的缀合物和纳 米颗粒及其用途
发明领域
本发明涉及包括透明质酸和表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯的缀合物以及活性剂的纳米颗粒组合物，以及所述缀合物和纳米颗粒组合物用于治疗急性髓性白血病的用途。
技术背景
急性髓性白血病(AML)已成为重大全球健康问题，全世界每年估计占1,000,000例新病例和147,100例死亡(Lancet.2016,388,1545–1602)。AML是一种生物学上复杂且异质性血癌，其特征是髓系的恶性细胞(髓母细胞)浸润骨髓、血液和其他组织。这样的细胞在分化途径中遭受阻塞，这导致正常血细胞和血小板被挤出。在其中分化被阻止的阶段定义AML的亚型(AML-M0至M7)。尽管诊断和治疗策略有所进展，但美国的总体5年存活率为仅25％，以及欧洲为15-20％。更严重的问题是，复发率在小于60岁的患者中仍然保持在40％之高，以及在60岁以上的患者中为10-20％(J.Kell,Leuk Res.2016,47,149-60；Betul Oran,Daniel J.Weisdorf,Haematologica 2012,97,1916–1924)。
AML的一线治疗主要涉及化疗，并分为两个阶段：(i)旨在减少白血病母细胞的数目的缓解诱导阶段，以及(ii)旨在预防疾病复发的缓解后阶段。在缓解诱导阶段期间的标准治疗主要基于阿糖胞苷(ara-C)和蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星)的联合化疗(H.Dombret,C.Gardin,Blood 2016,127,53-61)。尽管接近80％的患者实现完全缓解，但这样的化疗药物引起严重的并且有时危及生命的副作用，包括骨髓抑制、胃肠道毒性以及脑毒性，因为它们可能由于其非特异性作用方式而损害健康的组织和器官。缓解后阶段的治疗通常涉及使用阿糖胞苷的多周期高剂量化疗(有或没有放射治疗)以及干细胞移植(R.M.Stone,Semin Hematol.2001,38,17-23)。尽管干细胞移植在降低复发风险上有效，但它是复杂的，并且对于可能无法忍受这样的强化治疗的年长和/或脆弱的患者可能是致命的。
对于患有复发的AML的患者的治疗选项非常有限。供体干细胞的同种异体移植是对于早期第一次复发或第二次缓解的患者的一种治疗选项(F.R.Appelbaum,Leukemia2002,16,157-159)。三氧化二砷可以用于治疗诊断为复发性急性早幼粒细胞白血病(一种罕见的AML亚型)的患者(M.S.Tallman,Best Pract.Res.Clin.Haematol.2007,20,57-65)。吉妥珠单抗奥加米星(Gemtuzumab ozogamicin)(MylotargTM,Pfizer,Inc.)是与细胞毒素卡奇霉素(calicheamicin)缀合的单克隆抗-CD33抗体，并且最近已获得美国食品和药物管理局的批准用于治疗成人和儿科患者2岁及以上的复发性或难治性CD33阳性AML(J.Kell,Expert Rev.Anticancer Ther.2016,16,377-382)。然而，已报道在接受吉妥珠单抗奥加米星作为单一药剂或联合化疗方案的一部分的患者中的有害副作用，包括肝毒性、过敏反应和出血。因此，对于患有AML的患者，仍然存在对有效治疗方法的大量未满足的需求。
在过去的十年中，阻断某些细胞酶和受体的作用的小分子抑制剂已在AML的临床试验中得到积极测试。代表性的实例是FMS样酪氨酸激酶受体-3(FLT3)、DNA甲基转移酶(DNMT)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、含溴结构域和额外终端域家族蛋白质(bromodomain and extraterminal protein)(BET)、类端粒沉默干扰体1(disruptorof telomeric silencing 1-like)(DOT1L)、赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)以及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2(BCL-2)的抑制剂用于急性髓性白血病的治疗(C.Saygin,H.E.Carraway,J.Hematol.Oncol.2017,10,93)。其中，FLT3抑制剂，诸如米多滔林、索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)已成为患有FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)突变的AML患者的有前途的治疗剂。众所周知，FLT3-ITD突变是AML中最常见的突变，在～23％的患者中发生，并且与不良的存活率和增加的复发率相关(M.Hassanein,et al.,ClinLymphoma Myeloma Leuk.2016,16,543-549)。不幸的是，当单独使用时，FLT3抑制剂仅诱导循环中的但不诱导骨髓中的白血病母细胞的瞬时减少，表明骨髓微环境对白血病细胞的保护作用(A.Parmar,et al.,Cancer Res.2011,71,4696-4706；Z.Her,et al.,J.Hematol.Oncol.2017,10,162)。尽管可以增加FLT3抑制剂的给药频率和剂量以实现骨髓中的理想的治疗药物浓度，但由于它们在健康组织中的积累以及对其他受体酪氨酸激酶的非特异性抑制，这种过剂量可能引起严重的副作用，诸如肝毒性、白细胞减少和出血(M.I.Davis,et al.,Nat.Biotechnol.2011,29,1046-51)。
最近，已使用全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷两者对AML-M3亚型实施了治疗方案以解除对母细胞的分化阻塞(D.Nowak,et al.,Blood 2009,113,3655–3665；F.Lo-Coco,et al.,N.Engl.J.Med.2013,369,111–121)。分化疗法已将AML-M3转变为具有最佳预后的白血病亚型，其5年存活率显著提高到最高达85％。然而，用于AML的这样的分化诱导剂的可用性有限，主要是由于缺乏特异性和效力(D.Nowak,et al.,Blood 2009,113,3655–3665；K.Petrie,et al.,Curr.Opin.Hematol.2009,16,84–91)。此外，引用ATRA耐药性的研究也已开始浮出水面，强调需要考虑联合策略，诸如同时进行分化疗法和化疗以增强治疗功效(A.Tomita,et al.,Int.J.Hematol.2013,97,717–725；B.C.Shaffer,et al.,DrugResist.Updat.2012,15,62–69)。
鉴于以上，仍然存在对于展示出有效的抗白血病活性并且同时展现对正常细胞的低毒性的新化合物或材料的需要。
表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(EGCG)是绿茶儿茶素的主要组成部分，具有强的抗氧化、抗菌、抗炎和癌症预防活性。众所周知，EGCG可通过调节用于癌细胞存活、迁移和侵袭所必需的多种信号转导途径来中断肿瘤进展和转移(C.S.Yang,et al.,Nat.Rev.Cancer 2009,9,429-439；N.Khan,et al.,Cancer Res.2006,66,2500-2505)。
发明内容
出乎意料地，已经发现表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物在治疗癌症诸如急性髓性白血病中特别有用。当单独使用时，这样的缀合物能够提供对急性髓性白血病的有效治疗，对癌细胞而不是非癌细胞具有高选择性。另外，这样的缀合物能够提供用于包封活性剂的纳米颗粒组合物，其有助于将活性剂有效、靶向地递送至癌细胞。有利地，活性剂和缀合物的组合为纳米颗粒组合物提供了协同效应，从而允许使用低剂量的活性剂来有效根除癌细胞。这些潜在地减少了与使用这样的活性剂相关的副作用(如果有的话)。
现将参考以下编号的条目描述本发明的方面和实施方式。
1.一种纳米颗粒组合物，包括：
由以下中的一种形成的纳米颗粒：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置；以及
合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：
所述活性剂被包封在所述纳米颗粒中。
2.根据条目1所述的组合物，其中：
(a)所述二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物可以具有式Ia，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure BDA0003113436840000051
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元；或者
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物可以具有式Ib，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure BDA0003113436840000052
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元；或者
(c)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物可以具有式Ic：
Figure BDA0003113436840000061
，其中n表示所述透明质酸主链中的无规重复单元。
3.根据条目1或条目2所述的组合物，其中：
(a)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物具有的分子量可以为1至50kDa，诸如10至30kDa；
(b)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有的分子量可以为50至100kDa，诸如60至80kDa，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)所述二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有的分子量可以为50至100kDa，诸如60至80kDa，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合。
4.根据前述条目中任一项所述的组合物，其中，所述纳米颗粒具有的平均流体动力学直径可以为10至1,000nm，诸如90至500nm，诸如100至400nm，诸如120至350nm。
5.根据前述条目中任一项所述的组合物，其中，所述活性剂可以占所述组合物的0.1至60wt％，诸如0.3至50wt％，诸如1至47wt％(例如4.3至47wt％或0.3至5wt％)。
6.根据前述条目中任一项所述的组合物，其中，所述活性剂可以是FMS样酪氨酸激酶受体-3(FLT3)抑制剂。
7.根据条目6所述的组合物，其中，所述FLT3抑制剂可以是：
(a)I型抑制剂，任选地选自以下中的一种或多种：舒尼替尼、来妥替尼、米多滔林、克拉尼布和吉列替尼；或
(b)II型抑制剂，任选地选自以下中的一种或多种：索拉非尼、奎扎替尼和泊那替尼。
8.根据条目7的所述组合物，其中，所述FLT3抑制剂可以是：
(a)舒尼替尼；或
(b)索拉非尼。
9.根据前述条目中任一项所述的组合物，其中，所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物的纳米颗粒可以是核-壳纳米颗粒，任选地其中：
(ai)所述核-壳纳米颗粒的核主要是表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯；以及
(aii)所述核-壳纳米颗粒的壳主要是透明质酸。
10.一种制备根据条目1至9中任一项所述的组合物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(i)添加合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与以下中的一种到溶剂中：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置，
任选地搅拌，持续一段时间以提供纳米颗粒的分散体；以及
(ii)从所述纳米颗粒的分散体收集所得的纳米颗粒。
11.根据条目10所述的方法，其中：
(a)所述溶剂可以是水(例如去离子水)；和/或
(b)溶液中的所述活性剂的浓度可以为0.001至1mg mL-1，诸如0.02至0.8mg mL-1；和/或
(c)溶液中的所述缀合物的浓度可以为0.01至20mg mL-1，诸如0.1至10mg mL-1。
12.根据条目1至9中任一项所述的组合物，用于药物。
13.根据条目1至9中任一项所述的组合物用于制造用于治疗急性髓性白血病的药剂的用途。
14.根据条目1至9中任一项所述的组合物，用于治疗急性髓性白血病。
15.一种治疗急性髓性白血病的方法，包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的根据条目1至9中任一项所述的组合物。
16.式Ia或Ib的化合物：
Figure BDA0003113436840000091
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，用于制备治疗癌症的药剂的用途。
17.式Ia或Ib的化合物：
Figure BDA0003113436840000101
用于治疗癌症。
18.一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的式Ia或Ib的组合物化合物：
Figure BDA0003113436840000111
19.根据条目16、17和18分别所述的用途、化合物和方法，其中所述癌症可以是急性髓性白血病。
20.根据条目15至19中任一项所述的用途、化合物和方法，其中：
(a)所述Ia的化合物具有的分子量可以为50至120kDa，诸如80至100kDa；或者
(b)所述Ib的化合物具有的分子量可以为50至120kDa，诸如80至100kDa。
附图说明
图1描绘了本发明中使用的HA-EGCG缀合物的化学结构：(a)其中多个EGCG二聚体分子接枝到HA主链的HA-EGCG(A)；(b)其中多个EGCG分子接枝到HA主链的HA-EGCG(B)；以及(c)其中EGCG分子缀合到HA主链的终端的HA-EGCG(C)。
图2描绘了本发明的的策略的示意图：HA-EGCG缀合物(20)和小抑制剂分子(22)自组装成纳米颗粒(26)，用于通过在所合成的纳米颗粒(26)上的HA与细胞上的CD44(28)的相互作用靶向进入白血病母细胞(30)。
图3描绘了：由HA-EGCG(C)和舒尼替尼以不同浓度制备的纳米颗粒的(a)载药效率；以及(b)载药含量。结果以平均值(n＝2)报告。
图4描绘了：由HA-EGCG(C)和索拉非尼以不同浓度制备的纳米颗粒的(a)载药效率；以及(b)载药含量。结果以平均值(n＝2)报告。
图5描绘了HA-EGCG/舒尼替尼纳米颗粒(舒尼替尼-NP-1、舒尼替尼-NP-2、舒尼替尼-NP-3和舒尼替尼-NP-4)以及游离舒尼替尼对(a)MOLM-14细胞；以及(b)MV-4-11细胞的体外抗白血病活性。数据以平均值±标准偏差(n＝4)表示。
图6描绘了HA-EGCG/索拉非尼纳米颗粒(索拉非尼-NP-1、索拉非尼-NP-2、索拉非尼-NP-3和索拉非尼-NP-4)以及游离索拉非尼对(a)MOLM-14细胞；以及(b)MV-4-11细胞的体外抗白血病活性。数据以平均值±标准偏差(n＝4)表示。
图7描述了舒尼替尼-NP-1、索拉非尼-NP-1、HA-EGCG(C)缀合物和游离EGCG各自对MOLM-14和MV-4-11细胞的体外抗白血病活性，其随EGCG单元浓度的变化而变化。在该研究中，选择HA-EGCG(C)作为HA-EGCG缀合物，是因为它被用于生产舒尼替尼-NP-1和索拉非尼-NP-1。数据以平均值±标准偏差(n＝4)表示。
图8描绘了：在接受以0.4mg kg-1的索拉非尼剂量每周两次静脉内注射游离索拉非尼或索拉非尼-NP-1，持续4周的植入Leu 14的NSG小鼠的外周血中的人CD45+细胞比例随时程变化的(a)初始；以及(b)后续的合并结果。数据以人CD45+细胞相对于总细胞的平均百分比±标准偏差(对于初始结果，n＝2-5；对于后续结果，n＝3-8)表示。对于图(a)，星号表示两组之间的统计上的显著差异；*P<0.05；***P<0.0005；n.s.：不显著。对于图(b)，星号表示与对照组之间的统计上的显著差异；*P<0.05；***P<0.0005。
图9描绘了：在以0.4mg kg-1的索拉非尼剂量的游离索拉非尼或索拉非尼-NP-1的4周治疗结束时收获的植入Leu 14的NSG小鼠的脾脏和骨髓中的人CD45+细胞比例的(a)初始；以及(b)后续的合并的结果。游离索拉非尼治疗组中的一只小鼠在首次治疗后25天后死亡，将其从终点分析中排除。数据以人CD45+细胞相对于总细胞的平均百分比±标准偏差(对于初始结果，n＝1-5；对于后续结果，n＝3-8)表示。星号表示两组之间的统计上的显著差异；**P<0.005；***P<0.0005；ns：不显著。
图10描绘了接受以0.4mg kg-1的索拉非尼剂量的游离索拉非尼或索拉非尼-NP-1的4周治疗的植入Leu 14的NSG小鼠的存活概率的Kaplan-Meier图。星号表示与对照组之间的统计上的显著差异；**P<0.005；***P<0.0005。
图11描绘了HA-EGCG(A)和(B)缀合物(40)在通过HA与在细胞表面上过度表达的CD44受体结合而选择性靶向AML细胞46(即髓母细胞)中的用途的示意图。内化之后，HA-EGCG缀合物可以通过组合以下两种作用实现抗白血病活性：通过引发母细胞的细胞死亡(48)而消除(42)母细胞，或诱导细胞终末分化(44)到单核细胞(50)或粒细胞(52)。
图12描绘了AML细胞系(HL60和NB4)的CD44表达的流式细胞术谱图。
图13描绘了分别用HA-EGCG(A)和(B)缀合物(100μg/mL)、当量浓度的物理混合物(HA+EGCG)以及HA和EGCG的各个组成部分治疗持续48或72h后的(a)HL60；和(b)NB4细胞的生存力。数据以平均值±标准偏差(n＝4)表示。对比EGCG和HA+EGCG，****P<0.0001。
图14描绘了：(a)当用各种浓度的HA-EGCG(A)缀合物和(B)缀合物以及EGCG治疗持续72h时，AML细胞(HL60和NB4)和正常细胞(HEK293和HUVEC)的生存力；以及(b)当用HA-EGCG(A)和(B)缀合物(500μg/mL)治疗时，AML细胞和正常细胞的生存力。数据以平均值±标准偏差(n＝4)表示。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图15描绘了：(a)相对于未治疗的对照，分别用HA、EGCG、HA-EGCG(A)和(B)缀合物、三种完善的分化诱导剂(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、全反式维甲酸(ATRA)和抗人CD44抗体(A3D8))治疗之后，NB4细胞中CD11b、CD14和CD15表达的倍数变化；以及(b)表达三种表面抗原标记物中的每一种的细胞的百分比。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。相对于未治疗的对照，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图16描绘了：(a)相对于未治疗的对照，用HA、EGCG、HA-EGCG(A)和(B)缀合物以及三种完善的分化诱导剂(PMA、ATRA和A3D8)治疗之后，HL60细胞中CD11b、CD14和CD15表达的倍数变化；以及(b)表达三种表面抗原标记物中的每一种的细胞的百分比。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。相对于未治疗的对照，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图17描绘了未治疗的HL60细胞以及分别用HA、EGCG、HA-EGCG(A)和(B)缀合物、三种完善的分化诱导剂(PMA、ATRA和A3D8)治疗的HL60细胞的流式细胞术点图。
图18描绘了接受每周三次静脉内注射HA-EGCG(B)缀合物(50mg/kg)或PBS(对照)持续总共五周的HL60-异种移植的小鼠的红细胞计数。数据以平均值±标准偏差(n＝5)表示。
图19描绘了：接受每周三次静脉内注射HA-EGCG(B)缀合物(50mg/kg)或PBS(对照)持续总共五周的HL60-异种移植的小鼠的(a)白细胞计数；(b)体重；以及(c)存活分数；以及(d)相对于正常健康小鼠的脾脏重量在研究结束时小鼠的脾脏重量。数据以平均值±标准偏差(n＝5)表示。相对于对照，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
因此，公开了一种纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物包括：
由以下中的一种形成的纳米颗粒：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置；以及
合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：
所述活性剂被包封在所述纳米颗粒中。
在本文的实施方式中，单词“包括(comprising)”可以被解释为需要所提到的特征，但是不限制其他特征的存在。替代地，单词“包括(comprising)”也可以涉及其中仅旨在列出的组分/特征存在的情况(例如，单词“包括(comprising)”可以由短语“由……组成(consists of)”或“基本上由……组成(consists essentially of)”代替)。明确设想广义和狭义解释两者都可以适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包含”及其同义词可以被短语“由……组成(consisting of)”或短语“基本上由……组成(consistsessentially of)”或其同义词代替，并且反之亦然。
可以被提到的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可以通过常规方式形成，例如通过任选地在溶剂中或其中盐不溶解的介质中使适合于治疗急性髓性白血病的活性剂的化合物的游离酸或游离碱形式与一种或多种当量的适当的酸或碱反应，然后使用标准技术(例如，在真空中通过冷冻干燥或通过过滤)去除所述溶剂或所述介质。也可以通过将以盐形式的式I的化合物的抗衡离子与其他抗衡离子交换，例如使用合适的离子交换树脂来制备盐。
药学上可接受的盐的实例包括来源于矿物酸和有机酸的酸加成盐，以及来源于金属诸如钠、镁或优选地钾和钙的盐。
酸加成盐的实例包括用以下形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸以及对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如，L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如，D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如，D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如，L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸、(±)-DL-苦杏仁酸、偏磷酸、甲烷磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一烯酸以及戊酸。
盐的具体实例是来源于以下的盐：矿物酸，诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；有机酸，诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸；以及金属，诸如钠、镁，或优选地钾和钙。
如上所述，适合用于治疗急性髓性白血病的活性剂还包括所述化合物和它们的盐的任何溶剂化物。优选的溶剂化物是通过将无毒的药学上可接受的溶剂(以下被称为溶剂化溶剂)的分子掺入到本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)而形成的溶剂化物。这样的溶剂的实例包括水、醇(诸如乙醇、异丙醇和丁醇)以及二甲基亚砜。可以通过用溶剂或包含溶剂化溶剂的溶剂的混合物使本发明的化合物重结晶来制备溶剂化物。在任何给定的情况下，是否已经形成溶剂化物可以通过使用众所周知且标准的技术，诸如热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)和X射线晶体学使化合物的晶体经受分析来确定。
溶剂化物可以是化学计量或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的实例包括半水合物、一水合物和二水合物。
对于溶剂化物以及用于制造和表征它们的方法的更详细的讨论，参见Bryn etal.,Solid-State Chemistry of Drugs,Second Edition,published by SSCI,Inc ofWest Lafayette,IN,USA,1999,ISBN 0-967-06710-3。
适合用于治疗急性髓性白血病的相关活性剂的术语“前药”包括在口服或肠胃外给药之后，在体内代谢以实验上可检测的量且在预定时间内(例如在6至24小时之间的给药间隔内(即每天一至四次))形成所述化合物的任何化合物。
适合用于治疗急性髓性白血病的活性剂的前药可以通过以下制备：修饰存在于化合物上的官能团使得当这样的前药被给药到哺乳动物受试者时，该修饰在体内裂解。修饰典型地是通过合成具有前药取代基的母体化合物来实现的。适合用于治疗急性髓性白血病的活性剂的前药包括其中活性剂中的羟基、氨基、巯基、羧基或羰基基团与可在体内裂解的任何基团键合以分别再生成游离羟基、氨基、巯基、羧基或羰基基团的那些化合物。
前药的实例包括但不限于羟基官能团的酯和氨基甲酸酯、羧基官能团的酯基团、N-酰基衍生物和N-曼尼希碱。关于前药的一般信息可以例如在Bundegaard,H.“Design ofProdrugs”p.I-92,Elsevier,New York-Oxford(1985)中找到。
当在本文中使用时，术语“纳米颗粒”旨在是指具有0.1至2,000nm的平均流体动力学直径的颗粒。在本文中可以公开的本发明的更多颗粒实施方式中，纳米颗粒可以具有1至1,000nm，诸如100至400nm，诸如120至350nm的平均流体动力学直径。为了避免疑问，明确设想当在本文中引用与同一特征相关的多个数值范围时，旨在以任何顺序组合每个范围的端点以提供进一步的设想的(并隐含公开的)范围。因此，公开了关于上述相关的数值范围：
0.1至1nm、0.1至100nm、0.1至120nm、0.1至350nm、0.1至400nm、0.1至1,000nm、0.1至2,000nm；
1至100nm、1至120nm、1至350nm、1至400nm、1至1,000nm、1至2,000nm；
100至120nm、100至350nm、100至400nm、100至1,000nm、100至2,000nm；
120至350nm、120至400nm、120至1,000nm、120至2,000nm；
350至400nm、350至1,000nm、350至2,000nm；
400至1,000nm、400至2,000nm；以及
1,000至2,000nm。
本发明的缀合物可以具有任何合适的分子量。合适的分子量的实例包括1至1,500kDa，诸如2至1,000kDa，诸如25至150kDa，诸如50至100kDa，诸如60至80kDa，诸如2至50kDa，诸如10至30kDa。
当在本文中使用时，术语“二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物”是指通过将多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子中的每一个共价键合至透明质酸的聚合物主链上的合适的缀合位点(即能够与二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯形成共价键的官能团)而形成的材料。在本文中可以描述的某些实施方式中，二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物可以具有式Ia，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure BDA0003113436840000191
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元。二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物的任何合适的分子量可以用于本发明的实施方式中。例如，二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯的缀合物可以具有50至100kDa，诸如60至80kDa的分子量。
当在本文中使用时，术语“表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物”是指通过将多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子(即非二聚分子)中的每一个共价键合至透明质酸的聚合物主链上的合适的缀合位点(即能够与表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯形成共价键的官能团)而形成的材料。在本文中可以描述的某些实施方式中，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物可以具有式Ib，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure BDA0003113436840000201
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元。表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物的任何合适的分子量可以用于本发明的实施方式中。例如，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物可以具有50至100 kDa，诸如60至80 kDa的分子量。
当在本文中使用时，术语“表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物”是指通过将一种表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子(即非二聚分子)共价键合至透明质酸的末端位置而形成的材料。透明质酸的末端位置可以是糖半缩醛与附连到表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯的合适官能团之间的开环反应的结果。在本文可以描述的某些实施方式中，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物可以具有式Ic：
Figure BDA0003113436840000202
其中n表示所述透明质酸主链中的无规重复单元。表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸的缀合物的任何合适的分子量可以用于本发明的实施方式中。例如，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯封端的透明质酸的缀合物可以具有1至50 kDa，诸如10至30kDa的分子量。
在以上讨论的组合物的任一种中，活性剂(即适合用于治疗急性髓性白血病的活性剂)可以以所述组合物的任何合适的量存在。例如，活性剂可以以以下量存在：组合物的0.00001至99wt％，诸如组合物的0.1至60wt％，诸如0.3至50wt％，诸如1至47wt％(例如4.3至47wt％或0.3至5wt％)。
当在本文中使用时，术语“活性剂”和“适合用于治疗急性髓性白血病的活性剂”在本文中意指可以用于治疗急性髓性白血病的材料(除了缀合物纳米颗粒之外)。合适的活性剂的实例包括但不限于，FMS样酪氨酸激酶受体3(FLT3)抑制剂、I型FLT3抑制剂和/或II型FLT3抑制剂。I型FLT3抑制剂的实例包括但不限于舒尼替尼、来妥替尼、米多滔林、克拉尼布和吉列替尼。I型FLT3抑制剂的实例包括但不限于索拉非尼、奎扎替尼和泊那替尼。为了避免疑问，本文对活性剂的任何提及旨在也包括其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
尽管上文所述的缀合物材料的纳米颗粒可以采取任何纳米颗粒形式，但它们可以在本文所述的特定实施方式中被讨论为核壳纳米颗粒。在本文中可以被提到的特定实例中，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物可以以核-壳纳米颗粒提供。当缀合物提供核-壳纳米颗粒结构时，核-壳纳米颗粒的核部分可以主要是表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，并且核-壳纳米颗粒的壳可以主要是(缀合物的)透明质酸。换句话说，缀合物可以自组装以在核-壳纳米颗粒的核部分中提供表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯，与形成壳部分的透明质酸。可以理解，由于这种核-壳纳米颗粒通过自组装形成，在核和/或壳中可能保留一定量的其他材料。因此，当在本文中使用时，术语“主要地”旨在意指核或壳中的大部分(即大于50％)的材料是主要材料。即，核可以由缀合物材料的表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯部分的55至100wt％，诸如60至99wt％，诸如70至95wt％，诸如80至90wt％形成。类似地，壳可以由缀合物材料的透明质酸部分的55至100wt％，诸如60至99wt％，诸如70至95wt％，诸如80至90wt％形成。
在本发明的进一步的方面，提供了制备根据如上所述的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)添加合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与以下中的一种到溶剂中：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置，
任选地搅拌，持续一段时间以提供纳米颗粒的分散体；以及
(ii)从所述纳米颗粒的分散体收集所得的纳米颗粒。
在上述方法中，可以使用任何合适的溶剂。可以被提到的特定溶剂是水(例如去离子水)，但是该溶剂也可以是极性有机溶剂。可以在本发明的实施方式中使用的合适的极性有机溶剂的实例包括但不限于丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜和1,4-二噁烷。可以理解，这些极性有机溶剂中的一种或多种可以单独使用或与水组合使用。例如，溶剂可以是体积比为10％比90％水:有机溶剂的水与一种或多种有机溶剂的混合物。在实施例中描述了这样的混合溶剂体系的具体实例。
可以使用在溶液中的任何合适浓度的活性剂。例如，溶液中活性剂的浓度可以为0.001至1mg mL-1，诸如0.02至0.8mg mL-1。可以使用在溶液中的任何合适浓度的活性剂。例如，溶液中的缀合物的浓度可以为0.01至20mg mL-1，诸如0.1至10mg mL-1。这些浓度是指在上述方法的步骤(i)中达到的浓度。
上文提及的搅拌可以通过任何合适的方式进行。诸如定轨振荡器、机械搅拌器等。
可以使用任何合适的时间段。例如，时间段可以是1秒至5天，诸如5秒至3天。应当理解，如果使用搅拌，则搅拌可以基本上对应于提供纳米颗粒的分散体的时间段。在本文提到的某些实施方式中，搅拌可以是方法的重要部分，并且其中上文提及的混合物进行搅拌的时间段可以是1秒至5天，诸如5秒至3天。
在本文公开的方法中使用的透明质酸可以具有任何合适的分子量。例如，透明质酸的分子量可以为1至1,000kDa，诸如2至1,000kDa，诸如50至100kDa。
除非本文另有说明，否则提及聚合物材料的重量是指它们的数均分子量。
可以理解，以上公开的组合物可以用于药品，以及因此在本发明的进一步的方面，公开了如上所述的组合物，用于药物。
本发明的进一步方面涉及：
(bi)如上公开的组合物用于制造用于治疗急性髓性白血病的药剂中的用途；
(bii)如上公开的组合物，用于治疗急性髓性白血病；以及
(biii)治疗急性髓性白血病的方法，该方法包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的如上公开的组合物。
还注意到，用于制造上述组合物的纳米颗粒部分(即缀合物)的材料也可以具有抗急性髓性白血病的活性。因此，上述组合物可以通过用于治疗急性髓性白血病的活性剂和所使用的缀合物的组合显示协同效应(如以下实施例3和4所示出的)。鉴于此，本文所述的纳米颗粒组合物的使用通过以下提供了急性髓性白血病的有效治疗(即靶向MOLM-14和MV-4-11癌细胞)：(a)使用表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物将活性剂靶向递送至癌细胞；以及(b)活性剂和缀合物的组合在杀死癌细胞中的协同效应。有利地，这允许使用低剂量的活性剂和/或缀合物进行治疗，这从而减少对正常细胞的副作用(如果有的话)。
因此，除了上述组合物之外，在本发明的进一步的方面公开了：
(ci)式Ia或Ib化合物：
Figure BDA0003113436840000241
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药用于制备治疗癌症的药剂的用途；
(cii)式Ia或Ib的化合物：
Figure BDA0003113436840000251
用于治疗癌症；以及
(ciii)治疗癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的式Ia或Ib的组合物化合物：
Figure BDA0003113436840000261
本文公开的化合物可以具有任何合适的分子量，诸如1至1,500kDa，诸如2至1,000kDa、诸如25至150kDa、诸如20至120kDa、诸如80至100kDa。
可以理解，缀合物材料可以更一般地用于癌症的治疗，但是在急性髓性白血病的治疗中可以特别有用。
关于包括缀合物材料的组合物，描述的仅用于癌症的缀合物材料与上文所述的缀合物在化学上相同，以及因此，上文所述的缀合物材料的物理性质的提及也可以适用于上文所述的材料。例如，缀合物材料的分子量可以与上文讨论的相同。为了避免疑问，描述的关于直接用于治疗癌症的缀合物材料可以通过已知的任何合适的方式来配制，并且不需要以前文所述的纳米颗粒形式提供，尽管如此应当理解，上文直接描述的缀合物材料可以以这种方式配制。
单独的缀合物能够提供对急性髓性白血病的有效治疗，对癌细胞而不是非癌细胞具有高选择性。具体而言，如实施例5中所示出的，这样的缀合物显示出比对正常细胞(即HEK293和HUVEC)的毒性更高的对癌细胞(即HL60和NB4细胞系)的毒性。明显地，这样的缀合物能够在癌细胞中诱导终末分化，因此抑制癌症进展并延长癌症患者的存活期。
现将通过参考以下非限制性实施例来描述本发明的另外方面和实施方式。
实施例
材料
表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG，最低90％，TEAVIGOTM)购自DMSNutritional Products Ltd.(巴塞尔(Basel)，瑞士(Switzerland))。透明质酸由JNC公司(东京，日本)善意捐赠或购自Lifecore Biomedical(明尼苏达州(Minnesota)，美国)。苹果酸舒尼替尼是BioVision(米尔皮塔斯(Milpitas)，美国)的产品。甲苯磺酸索拉非尼获自AbMole BioScience(休斯敦(Houston)，美国)。Amicon Ultra-15离心过滤器购自MerckMillipore Corporation(达姆施塔特(Darmstadt)，德国)。按照制造商的方案使用CellTiter-Glo细胞生存力测定试剂(Promega公司，美国)。胱胺二盐酸盐获自MerckMillipore公司(达姆施塔特，德国)。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)购自Tokyo Chemical Industry(东京，日本)。2,2-二乙氧基乙胺(DA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、全反式维甲酸(ATRA)、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和抗人CD44抗体(克隆：A3D8)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯(St.Louis)，美国)。小鼠抗人抗体CD44(Bu52)、同型对照抗体和异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的二抗获取自Bio-Rad实验室(赫拉克勒斯(Hercules)，美国)。荧光标记的小鼠抗人抗体(FITC-缀合的CD11b(ICRF-44)、Cy7-缀合的CD14(HCD14)和Cy5-缀合的CD15(SSEA-1))获自Biolegend(圣地亚哥(San Diego)，美国)。
统计分析
两组之间的统计分析是通过不成对的学生t检验确定的，而多组之间的统计差异则使用单向方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验(Tukey post-hoc test)来检验，其中P值小于0.05被认为具有统计显著性。使用Kaplan-Meier估计器进行存活分析，以及随后使用对数秩检验来计算P值。
通用合成1-HA-EGCG(A)缀合物
HA-EGCG(A)缀合物可以通过如下文所讨论的通用合成1a或1b来合成。两种合成方法都将产生类似的HA-EGCG(A)缀合物，并且此处可以使用任何合适的分子量的HA聚合物(例如1kDa至1000kDa、76kDa或90kDa)。
通用合成1a
HA-EGCG(A)缀合物通过在US 8,753,687 B2中报道的两步法合成。一般地，HA-EGCG(A)缀合物通过两步反应来合成，其中首先将2,2-二乙氧基乙胺(DA)缀合至HA，随后将缀合物偶联至EGCG。HA-EGCG(A)的化学结构如图1a中所示。
在典型反应的第一步骤中，使用标准碳二亚胺偶联方法(具有一些修改)合成了HA-DA缀合物(F.Lee,et al.,Soft Matter 2008,4,880–887)。将HA(5g，12.5mmol的COOH)溶解在500mL的蒸馏水中。然后添加DA(2.38g，17.8mmol)，随后添加NHS(1.16g，10.0mmol)和EDC(2.40g，12.5mmol)以引发缀合反应。反应期间，通过添加1M NaOH将混合物的pH保持在4.7。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将pH增加至7.0。将溶液依次针对100mM氯化钠溶液渗析2天，针对25％乙醇渗析1天，以及针对去离子水渗析1天(截留Mw：1000Da)。将纯化的溶液冻干以获得HA-DA缀合物(约84％产率)。
在第二步骤中，首先将HA-DA缀合物(1g)溶解在57mL的去离子水中。随后，添加溶解在13mL的DMSO中的EGCG溶液(相对于DA单元为20当量的摩尔浓度)。将反应混合物在室温下在酸性条件下搅拌24h。之后，将混合物在氮气气氛下针对水渗析(截留Mw：3500Da)3天。将纯化的溶液冻干以获得HA-EGCG缀合物(约87％产率)。通过使用Hitachi U-2810光谱仪检测HA-EGCG缀合物在274nm处的吸光度来确定取代度(即，HA中每100个二糖单元中的EGCG二聚体的数目)。HA-EGCG(A)缀合物的取代度确定为1.5。
通用合成1b
替代地，HA-EGCG(A)缀合物也可以通过在F.Lee,et al.,Polym Chem.2015,6,462-4472中报道的两步法合成。简而言之，可以首先合成乙胺桥接的EGCG二聚体，随后将二聚体偶联至HA以得到所需的缀合物。
在第一步骤中，使EGCG与2,2-二乙氧基乙胺(DA)反应以形成乙胺桥接的EGCG二聚体。简而言之，在搅拌的同时，将145μL的DA(1mmol)添加至1.2mL的冷的甲磺酸(MSA):THF(1:5,v/v)中。然后将混合物添加至溶解于包含1.7μL的MSA的3.8mL的THF的EGCG(2.29g，5mmol)中，并在黑暗中在室温下搅拌过夜。未反应的EGCG通过以下去除：用乙酸乙酯的多次萃取循环，直到检测不到游离的EGCG。通过在274nm处的吸光度确定纯化的乙胺-桥接的EGCG二聚体的浓度，并发现其为84mg/mL(产率＝88％)。
在第二步骤中，通过碳二亚胺-介导的偶联反应将乙胺-桥接的EGCG二聚体缀合至HA。简而言之，将HA(250mg，0.62mmol)溶解于包含2.5mL的DMF的19.8mL的0.4M MES缓冲液(pH 5.2)中。依次添加NHS(89mg，0.78mmol)、乙胺-桥接的EGCG二聚体(0.205mmol，于2.7mL的水中)和EDC(150mg，0.78mmol)，并将混合物的pH值调节至4.7。将反应混合物用N2剧烈吹扫10min，然后在N2下孵育过夜。HA-EGCG缀合物然后通过在NaCl存在下的三个乙醇沉淀循环来纯化。随后，将沉淀物重新溶解在150mL的水中，并在冻干前在N2气氛下用水渗析过夜。最终产率为74.4％。通过使用Hitachi U-2810光谱仪检测HA-EGCG缀合物在274nm处的吸光度来确定取代度。HA-EGCG(A)缀合物的取代度确定为0.96。
通用合成2-HA-EGCG(B)缀合物
HA-EGCG(B)缀合物是以先前在C.Liu,et al.,Biomacromolecules 2017,18,3143–3155和US 2016/0213787 A1中建立的两步程序合成的。HA-EGCG(B)的化学结构如图1b中所示。可以理解，此处可以使用任何合适的分子量的HA聚合物(例如1kDa至1000kDa、76kDa或90kDa)。
首先通过用硫醇基团改性HA主链中的羧基基团来合成硫醇化HA衍生物。通常，将1g的HA(2.5mmol的COOH)溶解在100mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中。随后，添加溶解在10mL的PBS中的DMTMM(1.037g，3.75mmol)和胱胺二盐酸盐(844.5mg，3.75mmol)，并将反应混合物在25℃下搅拌24h。将得到的溶液依次针对0.1M NaCl溶液渗析2天，针对25％乙醇渗析1天，以及针对去离子水渗析2天(截留Mw：3500Da)。将纯化的溶液冻干以获得硫醇化HA衍生物。
在第二步骤中，通过在适度碱性条件下将EGCG缀合至硫醇化HA衍生物来合成HA-EGCG缀合物。在氮气吹扫的条件下，将硫醇化HA衍生物(0.5g)溶解在70mL的PBS(pH 7.4)中。将该溶液逐滴添加到包含过量EGCG的30ml的PBS溶液中。通过添加1M NaOH将混合物的pH调节至7.4，并在调节至pH 6之前，在25℃下搅拌3h。在氮气氛下，将最终混合物针对25％乙醇渗析1天，以及针对去离子水渗析2天(截留Mw：3500Da)。将纯化的溶液冻干以获得HA-EGCG缀合物(约95％产率)。通过使用Hitachi U-2810光谱仪检测HA-EGCG缀合物在274nm处的吸光度来确定取代度(即，HA中每100个二糖单元中的EGCG的数目)。HA-EGCG(B)缀合物的取代度确定为6.0。
通用合成3-HA-EGCG(C)缀合物
HA-EGCG(C)缀合物是以先前在K.H.Bae,et al.,Biomaterials 2017,148,41-53和US 2016/0213787 A1中建立的程序合成的。HA-EGCG(C)的化学结构如图1c中所示。可以理解，此处可以使用任何合适的分子量的HA聚合物(例如1kDa至1000kDa或20kDa)。HA-EGCG(C)缀合物的取代度确定为0.98。
实施例1.制备包含小分子抑制剂的HA-EGCG纳米颗粒
使用具有FLT3抑制剂的HA-EGCG缀合物(A)-(C)中的一种来合成本发明的HA-EGCG纳米颗粒。分别选择舒尼替尼和索拉非尼作为代表性I型和II型FLT3抑制剂，来制备这些纳米颗粒。舒尼替尼是当受体处于活性构象时通过结合至它的胞内ATP-结合位点来阻断FLT3信号转导的I型抑制剂，而索拉非尼是当受体被灭活时结合至仅可接近的ATP-结合位点附近的疏水区域的II型抑制剂(M.Larrosa-Garcia,M.R.Baer,Mol.Cancer Ther.2017,16,991-1001)。
与仅能够杀死带有FLT3-ITD突变的AML细胞的II型抑制剂不同，I型抑制剂可以用于治疗具有FLT3-ITD突变的AML细胞以及具有FLT3酪氨酸激酶结构域(TKD)突变的那些，其见于～7％的AML患者中，尽管具有与FLT3-ITD突变相比的更有利的预后(M.Hassanein,etal.,Clin.Lymphoma Myeloma Leuk.2016,16,543-549)。
图2示出了由HA-EGCG缀合物(20)和小抑制剂分子(22)通过自组装和离心过滤(24)形成自组装纳米颗粒(26)的本发明的示意图。纳米颗粒(26)然后用于通过在所合成的纳米颗粒(26)上的HA与细胞上的CD44(28)的相互作用而靶向进入白血病母细胞(30)。
通常，通过将HA-EGCG溶液与甲苯磺酸索拉非尼/苹果酸舒尼替尼溶液混合以诱导纳米颗粒的自组装，来制备包括HA-EGCG缀合物和索拉非尼/舒尼替尼的纳米颗粒。采用离心过滤技术来取回自组装的纳米颗粒，同时从混合物中去除未负载的聚合物、药物分子以及残留溶剂。
制备包含舒尼替尼的HA-EGCG(A)纳米颗粒
所合成的HA-EGCG(A)缀合物(来自通用合成1b，HA的Mw＝76kDa)用于制备本发明的纳米颗粒。应当理解，由具有其他合适的分子量的HA制备的HA-EGCG(A)缀合物也可以用于该制备中。
为了制备纳米颗粒，在搅拌下将苹果酸舒尼替尼的溶液(在去离子水中)逐滴添加至HA-EGCG(A)的溶液(在去离子水中)中，以得到对于每种化合物0.2mg min-1的最终浓度。然后将混合物在黑暗的地方在25℃下孵育1天，无需任何搅拌。将混合物转移至AmiconUltra-15离心过滤器(截留Mw为100kDa)中，通过在25℃下以2,000×g离心5min来纯化纳米颗粒。将纯化的纳米颗粒重新悬浮于1mL的去离子水中，并在4℃下保存直至使用。
制备包含舒尼替尼的HA-EGCG(B)纳米颗粒
所合成的HA-EGCG(B)缀合物(来自通用合成2，HA的Mw＝76kDa)用于制备本发明的纳米颗粒。在这种情况下使用的HA-EGCG(B)的取代度(定义为HA中每100个重复二糖单元中的取代基的数目)确定为6.6。应当理解，由具有其他合适的分子量的HA制备的HA-EGCG(B)缀合物也可以用于该制备中。
为了生产纳米颗粒，在搅拌下将苹果酸舒尼替尼的溶液(在去离子水中)逐滴添加至HA-EGCG(B)的溶液(在去离子水中)中，以得到对于每种化合物0.2mg min-1的最终浓度。然后将混合物在黑暗的地方在25℃下孵育1天，无需任何搅拌。将混合物转移至AmiconUltra-15离心过滤器(截留Mw为100kDa)中，通过在25℃下以2,000×g离心5min来纯化纳米颗粒。将纯化的纳米颗粒重新悬浮于1mL的去离子水中，并在4℃下保存直至使用。
制备包含舒尼替尼的HA-EGCG(C)纳米颗粒
所合成的HA-EGCG(C)缀合物(来自通用合成3，HA的Mw＝20kDa)用于制备本发明的纳米颗粒。应当理解，由具有其他合适的分子量的HA制备的HA-EGCG(C)缀合物也可以用于该制备中。
通过在去离子水中以各种浓度混合HA-EGCG(C)和苹果酸舒尼替尼来制备HA-EGCG(C)纳米颗粒。通常，将HA-EGCG(C)与苹果酸舒尼替尼溶液涡旋混合5sec，以得到对于HA-EGCG(C)和苹果酸舒尼替尼分别为2-8mg mL-1和0.1-0.6mg mL-1的最终浓度。然后将混合物在黑暗的地方在定轨振荡器上以50rpm在37℃下孵育3天。将混合物转移至Amicon Ultra-15离心过滤器(截留Mw为50kDa)中，通过在25℃下以2,000×g离心5min来纯化纳米颗粒。然后通过分散在去离子水中并离心三次来进一步纯化所获得的纳米颗粒。然后将纯化的纳米颗粒重新悬浮于1.5mL的去离子水中，并在4℃下保存直至使用。
制备包含索拉非尼的HA-EGCG(C)纳米颗粒
所合成的HA-EGCG(C)缀合物(来自通用合成3，HA的Mw＝20kDa)用于制备本发明的纳米颗粒。应当理解，由具有其他合适的分子量的HA制备的HA-EGCG(C)缀合物也可以用于该制备中。
通过在水-溶剂混合物中以各种浓度混合HA-EGCG(C)和甲苯磺酸索拉非尼来制备HA-EGCG(C)纳米颗粒。由于甲苯磺酸索拉非尼的水溶性差，因此将其溶解于乙腈:甲醇混合物(1:1,v/v)中。通常，将HA-EGCG(C)(在去离子水中)与甲苯磺酸索拉非尼溶液涡旋混合持续5sec，以得到对于HA-EGCG(C)和甲苯磺酸索拉非尼分别为2-8mg mL-1和0.04-0.4mg mL-1的最终浓度。然后将混合物在黑暗的地方在定轨振荡器上以50rpm在37℃下孵育2天。将混合物转移至Amicon Ultra-15离心过滤器(截留Mw为50kDa)中，通过在25℃下以2,000×g离心5min来取回纳米颗粒。然后通过分散在去离子水中并离心三次来进一步纯化所获得的纳米颗粒。将纯化的纳米颗粒重新悬浮于1.5mL的去离子水中，并在4℃下保存直至使用。
实施例2.包含舒尼替尼或索拉非尼的HA-EGCG纳米颗粒的表征
通过动态光散射来表征实施例1的所制备的HA-EGCG纳米颗粒，以确定颗粒的流体动力学大小。另外，确定了纳米颗粒的载药效率和载药含量。
实验
动态光散射
使用Nano ZS zetasizer(Malvern Instruments,UK)通过动态光散射检测了纳米颗粒的流体动力学直径。所有测量在37℃下一式三份进行。
载药效率和载药含量
为了检测舒尼替尼在纳米颗粒中的负载，将每个样品在25％乙醇-水溶液中稀释50倍，并在Hitachi U-2810分光光度计上测量431nm处的吸光度。使用各种浓度的苹果酸舒尼替尼(1-10μg mL-1)建立校准曲线。
根据先前的报告(具有一些修改)通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)确定纳米颗粒中负载的索拉非尼的数量(L.Li,et al.,J.Chromatogr.B 2010,878,3033–3038)。简而言之，将100μL的每个样品与500μL的乙腈和甲醇的1:1(v/v)混合物混合，以及然后在轻轻摇动下孵育1h，以从纳米颗粒中萃取索拉非尼。在4℃下以10,000g离心8min之后，使用配备有Discovery HS C18色谱柱(5μm，4.6mm i.d.×250mm，Supelco)的Waters 2695分离模块分析上清液中的索拉非尼的量。样品在25℃下用乙腈-水混合物(65:35,v/v)以1mL min-1的流速洗脱。索拉非尼的洗脱在265nm处进行监测，并使用Empower 3色谱数据软件(Waters集团(Waters Corporation)，美国)进行分析。使用一系列甲苯磺酸索拉非尼溶液(0.4–50μgmL-1)建立校准曲线。还测量了冷冻干燥的纳米颗粒的重量。通过以下公式计算载药含量和载药效率：
Figure BDA0003113436840000341
Figure BDA0003113436840000342
结果与讨论
首先检测了包括HA-EGCG(C)和舒尼替尼的纳米颗粒的载药能力。据观察，可以通过改变制剂中使用的HA-EGCG(C)和舒尼替尼的浓度来调节纳米颗粒的载药效率(图3a)和载药含量(图3b)。
一般地，提高HA-EGCG(C)的浓度导致增加的负载效率伴随着药物含量的减少，这表明在更高浓度的HA-EGCG(C)下，发生EGCG与舒尼替尼之间的更大的相互作用。当HA-EGCG(C)和舒尼替尼的浓度分别为6和0.4mg mL-1时，舒尼替尼的负载效率显著提高至最高达超过99％。如表1中所示，还进行了动态光散射实验以检测纳米颗粒的流体动力学直径。
表1.选择用于体外研究的HA-EGCG/舒尼替尼纳米颗粒的特征
Figure BDA0003113436840000343
Figure BDA0003113436840000351
*表示强度加权平均直径。
根据载药能力和粒度，两种组合物被选择用于体外抗白血病活性研究(在实施例3中)并命名为舒尼替尼-NP-1和舒尼替尼-NP-2(表1)。另外，以类似方式筛选HA-EGCG(B)/舒尼替尼和HA-EGCG(A)/舒尼替尼纳米颗粒，分别命名为舒尼替尼-NP-3和舒尼替尼-NP-4。明显地，所有HA-EGCG/舒尼替尼纳米颗粒均在95-180nm的大小范围内生产。它们的纳米尺寸对于通过增强渗透和滞留(EPR)效应(由于淋巴引流受损，纳米材料倾向于穿过渗漏的肿瘤血管并在肿瘤中长期停留的现象)实现长循环和优先的肿瘤外渗是理想的(H.Maeda,etal.,Adv Drug Deliv.Rev.2013,65,71-79)。
还观察到，舒尼替尼-NP-3和舒尼替尼-NP-4的舒尼替尼负载含量(35.9-46.9wt％)显著高于舒尼替尼-NP-1和舒尼替尼-NP-2(4.4-8.9wt％)，以及其他先前报道的基于聚(乙二醇)-聚(乳酸-co-乙醇酸)(PEG–PLGA)胶束的纳米制剂的负载含量(0.8-5.1wt％)(M.Huo,et al.,J.Control Release 2017,245,81-94)。这可能是由于舒尼替尼与EGCG部分之间的氢键合、疏水和π-π堆积相互作用，这有助于将舒尼替尼有效地掺入基于HA-EGCG的纳米颗粒中。此外，据推测沿HA主链具有多个EGCG部分的HA-EGCG缀合物比每条HA链具有单个EGCG分子的那些可能更有效地与舒尼替尼结合，得到更有效的舒尼替尼的包封。
对于HA-EGCG(C)/索拉非尼缀合物，观察到HA-EGCG(C)和索拉非尼的浓度对纳米颗粒的载药效率(图4a)和载药含量(图4b)有显著影响。与负载舒尼替尼的纳米颗粒类似，负载索拉非尼的纳米颗粒的载药效率随着EGCG-封端的HA的浓度的升高而逐渐增加，伴随药物含量的下降。当HA-EGCG和索拉非尼的浓度分别为8和0.4mg mL-1时，索拉非尼的负载效率提高至最高达74％。富含EGCG的核的存在可能有助于索拉非尼在纳米颗粒中的有效包封。还通过动态光散射检测了纳米颗粒的流体动力学直径。在用于制备纳米颗粒的条件下将未改性的HA与索拉非尼混合之后，未观察到颗粒结构，这表明EGCG部分的存在在纳米颗粒的自组装中起着重要的作用。
根据载药能力和粒度，三种组合物被选择用于体外抗白血病活性研究(在实施例3中)的，并命名为索拉非尼-NP-1至索拉非尼-NP-3(表2)。其中，索拉非尼-NP-1具有最小的粒度和最低的索拉非尼负载能力。明显地，所有索拉非尼-NP组合物均得到透明溶液，没有任何沉淀，而以相同浓度悬浮在水中的游离索拉非尼则严重絮凝并最终沉淀。这提供了索拉非尼分子被稳定包封在索拉非尼-NP的内部的间接证据。索拉非尼-NP组合物的优异的分散稳定性将对其临床应用有益。
表2.选择用于体外研究的HA-EGCG/索拉非尼纳米颗粒的特征
Figure BDA0003113436840000361
*表示强度加权平均直径。
^表示数目加权平均直径。
实施例3.所制备的包含舒尼替尼或索拉非尼的HA-EGCG纳米颗粒的体外抗白血病活性
在MOLM-14和MV-4-11细胞上评估了选择的包含舒尼替尼或索拉非尼的HA-EGCG纳米颗粒(在实施例2中)的体外抗白血病活性。
实验
将MOLM-14和MV-4-11细胞(ATCC，美国)保持在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(v/v)青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。将接种在白壁96孔板上的细胞(1×104细胞/孔)在包含不同浓度的舒尼替尼或索拉非尼-负载的纳米颗粒和各自的游离药物的100μL的10％FBS-补充的培养基中孵育。在游离索拉非尼的情况下，在二甲亚砜(DMSO)中制备甲苯磺酸索拉非尼的储备溶液，以及然后用RPMI 1640培养基稀释至1％的最终DMSO浓度；DMSO的这种浓度对白血病细胞生长没有可检测的影响。治疗3天之后，将100μL的CellTiter-Glo测定试剂添加到板的每个孔中。在25℃下孵育10min之后，使用TecanInfinite 200酶标仪(Tecan集团(Tecan Group)，瑞士)测量细胞的发光。结果以分析的细胞相对于未治疗的对照的发光信号的百分比表示。为了检测HA-EGCG与FLT抑制剂之间的协同作用，使用CompuSyn软件(ComboSyn公司(ComboSyn Inc.)，美国)基于中值效应方程计算了联合指数(CI)值。
结果与讨论
在两种不同的FLT3-突变的AML细胞系：MOLM-14细胞(图5a)和MV-4-11细胞(图5b)上评估舒尼替尼-NP组合物的体外抗白血病活性。细胞用舒尼替尼-NP或当量浓度的游离舒尼替尼治疗3天，并通过测量作为活细胞指标的ATP含量的CellTiter-Glo测定法分析它们的生存力。在本研究中发现的有效性顺序为：舒尼替尼-NP-1>舒尼替尼-NP-2>游离舒尼替尼>舒尼替尼-NP-3>舒尼替尼-NP-4。这是出乎意料的结果，因为一般地已知具有较高的药物含量的纳米颗粒展现出比具有较低药物含量的那些纳米颗粒更好的治疗活性。
另外，还注意到有效性的顺序与舒尼替尼负载含量的顺序成负相关(舒尼替尼-NP-4(46.9±0.47wt％)>舒尼替尼-NP-3(35.9±0.57wt％)>舒尼替尼-NP-2(8.89±0.19wt％)>舒尼替尼-NP-1(4.36±0.09wt％)；表1)。此外，似乎粒度对舒尼替尼-NP组合物的体外抗白血病活性没有不显著的影响。例如，尽管舒尼替尼-NP-2具有的粒度(164.8nm)比舒尼替尼-NP-4(142.3nm)大，但舒尼替尼-NP-2示出比舒尼替尼-NP-4更强的抗白血病活性。考虑到具有最强抗白血病活性的舒尼替尼-NP-1具有最高的HA-EGCG含量(ca.95.64wt％)(尽管最低的舒尼替尼(ca.4.36wt％))，因此合理地推断，具有较高HA-EGCG含量的舒尼替尼-NP组合物倾向于比具有较低HA-EGCG含量的那些更有效地根除白血病母细胞。这些发现还意指以最佳比例共同递送HA-EGCG和舒尼替尼将驱动协同抗白血病作用的增强。
还在MOLM-14细胞(图6a)和MV-4-11细胞(图6b)上评估了索拉非尼-NP和游离索拉非尼的体外抗白血病活性。所有索拉非尼-NP组合物在杀死白血病细胞方面比当量浓度的游离索拉非尼更有效。例如，所有200nM的索拉非尼-NP组合物的治疗根除超过99％的MOLM-14细胞，而相同剂量的游离索拉非尼则仅导致细胞生存力适度降低(～14％)。在该研究中发现的有效性的顺序为：索拉非尼-NP-1>索拉非尼-NP-2>索拉非尼-NP-3>游离索拉非尼。索拉非尼-NP-1的最强抗白血病活性可能归因于它的最小粒度(这有利于细胞内摄取)以及最高的HA-EGCG含量。
接下来，将舒尼替尼-NP-1和索拉非尼-NP-1的体外抗白血病活性与HA-EGCG(C)缀合物和游离EGCG进行了比较。在该研究中，选择HA-EGCG(C)是因为该缀合物用于生产舒尼替尼-NP-1和索拉非尼-NP-1。对于MOLM-14细胞(图7a)和MV-4-11细胞(图7b)两者，当以当量EGCG单元浓度比较时，舒尼替尼-NP-1和索拉非尼-NP-1比HA-EGCG缀合物以及游离EGCG诱导白血病细胞的更有效的根除。这表明HA-EGCG和FLT3抑制剂对白血病细胞生长的协同效应。
另外，进行中值效应图分析以研究HA-EGCG和FLT3抑制剂对MOLM-14和MV-4-11细胞存活的协同效应。选择舒尼替尼-NP-1和索拉非尼-NP-1进行这种分析是因为发现它们在测试的纳米颗粒组合物中是最有效的。基于中值效应方程计算各种有效剂量(ED50、ED75、ED90和ED95)下的联合指数(CI)值(表3)。索拉非尼-NP-1的所有CI值均小于0.1，表示HA-EGCG(C)与索拉非尼之间非常强的协同作用。该结果证明HA-EGCG(C)和索拉非尼的协同抗白血病效应是所观察到的索拉非尼-NP-1优于游离索拉非尼的优越效力的原因。明显地，索拉非尼-NP-1具有明显小于舒尼替尼-NP-1的CI值，这表明HA-EGCG(C)和索拉非尼的组合的抗白血病效应远强于具有舒尼替尼的HA-EGCG(C)。选择索拉非尼-NP-1进行动物研究(在实施例4中)是因为它的显著的协同抗白血病活性。
表3.HA-EGCG和FLT3抑制剂对AML细胞系的存活的联合效应的联合指数(CI)值
Figure BDA0003113436840000391
*EDχ定义为引起AML细胞存活的χ％抑制所需的药物剂量。
Figure BDA0003113436840000392
由基于以下标准的ED50下的CI值确定。非常强的协同作用：CI<0.1；强的协同作用：0.1-0.3；协同作用：0.3-0.7；适度的协同作用：0.7-0.85；轻微的协同作用：0.85-0.90；接近相加：0.90-1.10。
实施例4.选择的包含索拉非尼的HA-EGCG纳米颗粒的体内抗白血病活性
为了证明本发明的纳米颗粒的体内抗白血病活性，在临床前患者来源的AML异种移植小鼠模型上进一步评估了包含索拉非尼的HA-EGCG(C)纳米颗粒(表示为索拉非尼-NP-1)。
实验
所有动物实验均按照由新加坡生物资源中心的IACUC批准的方案进行。基于先前的报告建立临床前患者来源的液体异种移植小鼠模型(Z.Her,et al.,J.Hematol.Oncol.2017,10,162)。简而言之，对NOD-scid Il2rg-/-(NSG)新生幼崽进行1Gy亚致死性辐照，并植入了命名为Leu 14的患者来源的AML细胞。当外周血中人CD45+细胞的比例达到约10-15％时，将小鼠随机分为3组。第一组接受了静脉内注射包含索拉非尼-NP-1的等渗右旋糖溶液，索拉非尼剂量为0.4mg kg-1，每周两次，持续4周。为了比较，另一组小鼠接受了静脉内注射当量剂量的在盐水-DMSO混合物(95:5，v/v)中制备的游离索拉非尼溶液。据报道，DMSO的这种浓度不对小鼠造成明显的毒性(C.Carlo-Stella,et al.,PLoS One2013,8,e61603)。最后一组未接受任何治疗，并用作对照。在选定的时间点，使用LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)通过流式细胞术分析检测外周血、脾脏和骨髓中人CD45+细胞的比例。
结果与讨论
虽然当与未治疗的对照比较时，索拉非尼-NP-1治疗诱导外周血中AML细胞增殖的显著延迟(P<0.05)，但从游离索拉非尼治疗的组中仅观察到AML进展的轻微推迟(图8a和b分别代表初始和后续结果)。索拉非尼-NP-1的增强的全身功效可能归因于其体外观察到的强的抗白血病活性和AML细胞通过HA-CD44相互作用的有效内化。在4周的终点，用相同剂量的游离索拉非尼治疗的那些小鼠相比，用索拉非尼-NP-1治疗的小鼠具有实质上更低的在脾脏和骨髓中的AML细胞的比例(图9a和b分别代表初始和后续结果)。该结果表明，与游离索拉非尼制剂相比，索拉非尼-NP-1能够将索拉非尼更靶向地递送至脾脏和骨髓，导致更明显地抑制这些器官中的AML细胞增殖。索拉非尼-NP-1在骨髓和脾脏中增加的积累将有益于AML治疗，因为负责AML复发的白血病干细胞主要位于该器官中(D.S.Krause,et al.,Nat.Med.2006,12,1175-80)。在治疗的过程期间，未观察到接受NP-1的小鼠索拉非尼-的体重减轻或死亡，未显示脱靶毒性的迹象。
Kaplan-Meier分析显示，与游离索拉非尼制剂相比，索拉非尼-NP-1治疗更有效地改善了植入Leu 14的NSG小鼠的存活(图10)。虽然几乎所有用索拉非尼-NP-1治疗的小鼠都可以在治疗期期间(0-24天)存活，但是用游离索拉非尼治疗的那些小鼠在12-14天内开始死亡，可能是由于快速的AML进展。考虑到索拉非尼-NP-1治疗在第24天停止，因此有可能通过继续给药索拉非尼-NP-1来进一步延长生存期。总的来说，以上结果证明了在患者来源的AML模型中，索拉非尼-NP-1优于游离索拉非尼制剂的治疗功效。
实施例5.HA-EGCG(A)和(B)缀合物的体外抗白血病活性
HA-EGCG(A)和(B)(根据通用合成1a和通用合成2合成的，HA的Mw＝90kDa)的治疗效果通过它们在诱导分化和靶向杀死AML细胞方面的体外功效进行评估。两种不同亚型的AML细胞系HL60(AML-M2)和NB4(AML-M3)用于评估这些HA-EGCG缀合物的治疗潜力。
图11示出了使用HA-EGCG(A)和(B)缀合物(40)通过HA与在细胞表面上过度表达的CD44受体结合而选择性靶向AML细胞46(即髓母细胞)的策略的示意图。内化之后，HA-EGCG缀合物(40)可以通过组合以下两种作用实现抗白血病活性：通过引发母细胞的细胞死亡(48)而消除(42)母细胞，或诱导细胞终末分化(44)到单核细胞(50)或粒细胞(52)。
实验
细胞系
人AML细胞系HL60、人胚胎肾细胞系HEK293和原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)(ATCC)。人AML细胞系NB4是由新加坡癌症科学研究所善意捐赠的。所有AML细胞均在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中培养，并以2×105至1×106个细胞/mL的密度保持。HEK293细胞在补充有10％FBS的DMEM培养基中培养，而HUVEC细胞则保持在补充有内皮细胞生长培养基SingleQuotsTM补充剂和生长因子的EBMTM-2内皮细胞生长基础培养基中。将所有细胞保持在37℃的具有5％CO2的潮湿培养箱中。
AML细胞中CD44表达的定量评估
为了检测CD44表达水平，将5×105个AML细胞悬浮在包含0.2％(v/v)牛血清白蛋白BSA的PBS(pH 7.4)中，并与抗人CD44抗体或同型对照抗体(2μg/mL)在4℃下一起孵育20min(S.Ghaffari,et al.,Leukemia 1996,10,1773–1781)。然后将细胞用包含0.2％(v/v)BSA的冰冷的PBS洗涤三次，以及然后用FITC-标记的二抗染色持续再20min。随后，再次洗涤细胞并使用荧光激活的细胞分选仪BD LSR II(BD Biosciences，加利福尼亚州(CA))通过流式细胞术分析。
体外细胞生存力测定
将所有细胞(HL60、NB4、HEK293和HUVEC细胞)以1×104个细胞/100mL/孔接种在96孔板中。将所有AML细胞孵育2h，同时在治疗之前允许HEK293细胞和HUVEC细胞粘附过夜。随后，将细胞用各种浓度的EGCG和HA-EGCG缀合物治疗，并孵育指定的持续时间。药物治疗之后，用CellTiter-GloTM发光细胞生存力测定试剂盒(Promega,Madison,WI)按照制造商的说明来评估细胞生存力。使用Tecan Infinite酶标仪(Tecan集团，瑞士)测量来自每个孔的发光。最终细胞生存力值以源自治疗的细胞相对于未治疗的细胞的发光强度的百分比表示。所有测量均一式三份进行。
AML细胞的分化的定量评估
将AML细胞以在1mL中的1×105个细胞/孔接种在24孔板中，并在37℃下用5％CO2孵育2h。然后用500μg/mL的HA-EGCG(A)、250μg/mL的HA-EGCG(B)以及当量浓度的仅HA和EGCG(38μM)治疗细胞。ATRA(1mM)、PMA(100ng/mL)和A3D8(0.6μg/mL)被包括作为阳性对照。三天的孵育之后，收获细胞并通过评估细胞表面抗原表达检测分化的迹象。为了标记细胞表面抗原，将细胞悬浮在包含0.2％(v/v)BSA的PBS(pH 7.4)中，然后在4℃用小鼠抗人FITC-缀合的CD11b、Cy7-缀合的CD14以及Cy5-缀合的CD15抗体(各自2μg/mL)孵育30min。小鼠IgG1同型抗体用作对照。之后，将细胞用包含0.2％(v/v)BSA的PBS洗涤三次，并使用荧光激活细胞分选仪BD LSR II(BD Biosciences，加利福尼亚州)通过流式细胞术确定抗体结合的水平。每次测量都包括获取至少1×104个细胞，并且当在枚举门中收集到充足数目的事件(>100)时，分析被视为提供信息的。为了定量表达抗原的细胞的百分比，如果细胞落入预设为包括＜2％的未治疗的对照细胞的门控区域内，则将这些细胞定义为对抗原呈阳性。
结果与讨论
首先，通过流式细胞术评估在HL60细胞和NB4细胞两者中的CD44表达，这证实了在两种AML细胞中升高的CD44的表达水平(图12和表4)。
表4.不同亚型的两种AML细胞系中的表达CD44的细胞的百分比。
细胞系 AML亚型 表达CD44的细胞(％)
HL60 M2 95.3
NB4 M3 100
然后通过分别用HA-EGCG(100μg/mL)、HA、EGCG以及当量的HA或EGCG浓度的HA和EGCG混合物的混合物孵育来评估这些细胞的生存力。在HL60细胞中，据观察HA-EGCG(B)在两种AML细胞的五个测试组中均展示出最高的毒性(图13a)，导致在48h时细胞生存力下降至25.2±1.1％，并且在72h时进一步减少到7.3±0.3％。与分别用EGCG以及HA和EGCG的混合物治疗相比，对于HA-EGCG(A)的治疗未观察到毒性的明显增加。另一方面，在48h时，HA-EGCG(A)和HA-EGCG(B)治疗两者对NB4细胞的毒性明显高于EGCG、HA以及HA和EGCG的混合物，分别达到17.9±1.9％和4.9±0.5％的细胞生存力(图13b)。对于HA-EGCG(A)，随着72h的更长的孵育时间，将NB4的细胞生存力降低到3.9±0.4％。在两种细胞类型中，仅EGCG以及HA和EGCG混合物治疗导致相似的毒性，而仅HA对细胞生存力具有有限的影响。与仅EGCG以及HA和EGCG混合物相比，HA-EGCG缀合物的更大的毒性将可能归因于EGCG与HA的偶联促进了这些AML细胞的CD44靶向。
为了评估HA-EGCG的AML靶向特异性，评估了HA-EGCG(A)和(B)对两种正常细胞类型-人胚肾细胞(HEK293)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性。观察到HA-EGCG(A)和(B)两者以及仅EGCG的浓度增加导致72h之后的所有细胞类型的生存力随之下降(图14a)。有趣的是，HA-EGCG(B)在两种AML细胞中均展示出比EGCG更大的毒性，其中对于HL60，EGCG当量浓度范围为15-38μM，以及对于NB4，范围为1.5-76μM。相比之下，EGCG在正常细胞中展示出比HA-EGCG(B)更大的毒性，对于HEK293，EGCG等效浓度为76μM，以及对于HUVEC，范围为15-76μM(图14a)。类似地，与正常HEK293细胞和HUVEC细胞相比，HA-EGCG(A)对NB4细胞显示更高的毒性。此外，固定浓度为500μg/mL的HA-EGCG(A)和(B)使AML细胞的细胞生存力大大降低多于94％。相比之下，用HA-EGCG(A)和(B)治疗之后，分别有90.8±4.4％和91.5±3.5％的HEK293细胞以及62.5±0.6％和56.5±0.8％的HUVEC细胞仍然是活的(图14b)。总的来说，这些结果证明HA-EGCG的毒性对AML细胞具有选择性。
为了评估HA-EGCG诱导AML细胞的终末分化的能力，检测了在用HA-EGCG缀合物孵育72h之后在NB4细胞和HL60细胞中的三种细胞表面抗原CD11b(常见的髓性标记物)、CD14(单核细胞)以及CD15(粒细胞)的表达。三种先前报道的分化诱导剂(ATRA，佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和抗人CD44抗体(克隆：A3D8))也用作阳性对照(T.R.Breitman,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1980,77,2936–40；P.E.Newburger,et al.,CancerRes.1981,41,1861–1865；R.S.Charrad,et al.,Nat.Med.1999,5,669–676；R.S.Charrad,et al.,Blood,2002,99,290–299)。
在NB4细胞中，据观察阳性对照ATRA在三种抗原表达水平和表达抗原的细胞的比例上增加最大。三天之后，HA-EGCG治疗显著地增加了所有三种抗原的表达水平(分别地，对于HA-EGCG(A)，CD11b：1.2倍、CD14：1.1倍以及CD15：1.2倍；对于HA-EGCG(B)，CD11b：1.2倍、CD14：1.1倍以及CD15：1.4倍)(图15a)。此外，表达CD11b、CD14以及CD15的细胞百分比随着HA-EGCG(A)(CD11b：4.8％、CD14：2.8％以及CD15：3.8％)和HA-EGCG(B)(CD11b：5.8％、CD14：3.0％以及CD15：4.9％)治疗也显示出明显增加(图15b)。在仅EGCG中也观察到了类似的效果，但在仅HA中未观察到类似的效果，这表明EGCG主要负责诱导分化。明显地，HA-EGCG缀合物在促进所有三种分化标记物表达方面优于其他阳性对照、PMA以及A3D8。在三种抗原中，与CD14相比，HA-EGCG更大程度地增加了CD11b和CD15表达，表明HA-EGCG还支持将NB4细胞优先分化为粒细胞谱系。
在HL60细胞中，据观察HA-EGCG(B)治疗导致CD11b和CD14的表达水平明显增加(CD11b：1.3倍以及CD14：2.0倍)(图16a)以及表达CD11b(18.6％)和CD14(9.5％)的HL60细胞的百分比的增加(图16b)。还注意到表达CD15的HL60细胞的百分比显著降低。HA-EGCG(A)治疗未导致分化标记物的表达的任何增强。与NB4细胞相似，与HA-EGCG相比，仅EGCG也显示出类似的趋势，证实了EGCG在诱导分化中的主要作用。
对HA-EGCG(A)和(B)治疗的HL60细胞的进一步分析揭示，在流式细胞术点状图(图17)的第2象限(Q2)中CD11b/CD14双阳性细胞群的明显出现，其在用所有阳性对照-ATRA、PMA和A3D8治疗的HL60细胞中不存在。有趣的是，与NB4细胞向CD11b/CD15双阳性粒细胞谱系的分化诱导不同，该结果支持HA-EGCG在使HL60细胞能够向单核细胞谱系分化中的有效性。总的来说，这些结果提供了HA-EGCG缀合物在NB4细胞和HL60细胞两者中的分化诱导能力的明确证据。
实施例6.HA-EGCG(B)缀合物的体内抗白血病活性
在人AML HL60细胞的异种移植小鼠模型上进一步评估了HA-EGCG(B)缀合物(根据通用合成2合成的，HA的Mw＝90kDa)的体内抗白血病功效。
实验
所有动物实验均按照由新加坡生物资源中心的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。使用先前开发的基于非肥胖糖尿病(NOD)/LtSz-重症联合免疫缺陷(SCID)IL2Rγnull(NSG)小鼠的AML异种移植模型评估抗白血病功效(A.Agliano,et al.,Int.J.Cancer 2008,123,2222–2227；E.Saland,et al.,Blood Cancer J.2015,5,e297)。在通过尾静脉注射接种2x 106个HL60细胞之前，NSG小鼠(6-8周龄)以来自光子辐射源的2.5Gy(60cGy/min)的亚致死剂量辐照24h。然后每周三次静脉内注射(200μL)的无菌PBS作为对照或HA-EGCG(B)溶液(50mg/kg)持续总共五周对小鼠进行治疗。为了获得造血细胞计数，在指定时间点通过眶后出血收集外周血。在涂有肝素的试管中收集三十微升的血液，随后使用血液计数器(HEMAVETTM 950FS，Erba Diagnostic，FL)进行分析。在研究结束时，将动物处死，并且收集脾脏并称重。每两周对小鼠的疾病症状(邋遢的皮毛、肿瘤样肿块、虚弱和活动能力降低)进行监测，并对所有显示出任何痛苦迹象的动物实施安乐死。
结果与讨论
将两百万个HL60细胞静脉内注射到亚致死剂量(2.5Gy)辐照的小鼠中，然后通过每隔一天尾静脉注射用50mg/kg HA-EGCG(B)或PBS治疗。注射后一个月每周一次评估血细胞计数，并且还监测小鼠的存活。在注射后第49天，虽然对照和HA-EGCG(B)组两者中的红细胞计数均保持在约10x106个/μL(图18)，但对照小鼠的白细胞计数从5.0x106个/μL急剧增加到8.7x106个/μL(图19a)。在HA-EGCG(B)治疗的小鼠中，白细胞计数明显降低(4.8x106个/μL)，表明HA-EGCG(B)延迟了白血病的发作。这得到了以下的支持：与对照相比第49天小鼠体重增加延迟，可能是由于癌性肿块的生长(图19b)。另外，HA-EGCG(B)治疗延长了白血病小鼠的存活(P<0.01)(图19c)并且抑制了脾脏重量的急剧增加(白血病细胞移植的常见特征)(173％，相比之下对照组为317％)(图19d)(A.Agliano,et al.,Int.J.Cancer 2008,123,2222–2227；M.A.Papiez,et al.,Food Chem.Toxicol.2010,48,3391–3397)。综上所述，这些结果证明了HA-EGCG(B)在体内抑制AML进展中的功效。

Claims (20)

1.一种纳米颗粒组合物，包括：
由以下中的一种形成的纳米颗粒：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置；以及
合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：
所述活性剂被包封在所述纳米颗粒中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中：
(a)所述二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有式Ia，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure FDA0003113436830000021
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元；或者
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有式Ib，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合：
Figure FDA0003113436830000022
其中每个n和m表示所述透明质酸主链中的无规重复单元；或者
(c)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物具有式Ic：
Figure FDA0003113436830000031
其中n表示所述透明质酸主链中的无规重复单元。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中：
(a)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物具有的分子量为1至50kDa，诸如10至30kDa；
(b)所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有的分子量为50至100kDa，诸如60至80kDa，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)所述二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物具有的分子量为50至100kDa，诸如60至80kDa，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述纳米颗粒具有的平均流体动力学直径为10至1,000nm，诸如90至500nm，诸如100至400nm，诸如120至350nm。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述活性剂占所述组合物的0.1至60wt％，诸如0.3至50wt％，诸如1至47wt％(例如4.3至47wt％或0.3至5wt％)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述活性剂是FMS样酪氨酸激酶受体-3(FLT3)抑制剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述FLT3抑制剂是：
(a)I型抑制剂，任选地选自以下中的一种或多种：舒尼替尼、来妥替尼、米多滔林、克拉尼布和吉列替尼；或
(b)II型抑制剂，任选地选自以下中的一种或多种：索拉非尼、奎扎替尼和泊那替尼。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述FLT3抑制剂是：
(a)舒尼替尼；或
(b)索拉非尼。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物的纳米颗粒是核-壳纳米颗粒，任选地其中：
(ai)所述核-壳纳米颗粒的核主要是表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯；以及
(aii)所述核-壳纳米颗粒的壳主要是透明质酸。
10.一种制备根据权利要求1至9中任一项所述的组合物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(i)添加合适用于治疗急性髓性白血病的活性剂或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与以下中的一种到溶剂中：
(a)二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个二聚表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；
(b)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯和透明质酸的缀合物，其中所述透明质酸在其聚合物主链中具有多个缀合位点，其中多个表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子各自与透明质酸的所述聚合物主链中的所述多个缀合位点之一缀合；或
(c)表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯-封端的透明质酸缀合物，其中表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯分子共价键合至所述透明质酸的末端位置，
任选地搅拌，持续一段时间以提供纳米颗粒的分散体；以及
(ii)从所述纳米颗粒的分散体收集所得的纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的方法，其中：
(a)所述溶剂是水(例如去离子水)；和/或
(b)溶液中的所述活性剂的浓度为0.001至1mg mL-1，诸如0.02至0.8mg mL-1；和/或
(c)溶液中的所述缀合物的浓度为0.01至20mg mL-1，诸如0.1至10mg mL-1。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，用于药物。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物用于制造用于治疗急性髓性白血病的药剂的用途。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，用于治疗急性髓性白血病。
15.一种治疗急性髓性白血病的方法，包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的组合物。
16.式Ia或Ib的化合物：
Figure FDA0003113436830000061
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，用于制备治疗癌症的药剂的用途。
17.式Ia或Ib的化合物：
Figure FDA0003113436830000071
用于治疗癌症。
18.一种治疗癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的受试者提供药学上有效量的式Ia或Ib的组合物化合物：
Figure FDA0003113436830000081
19.根据权利要求16、17和18分别所述的用途、化合物和方法，其中所述癌症是急性髓性白血病。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的用途、化合物和方法，其中：
(a)所述Ia的化合物具有的分子量为50至120kDa，诸如80至100kDa；或者
(b)所述Ib的化合物具有的分子量为50至120kDa，诸如80至100kDa。
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