CN115708882B - 一种纳米粒及其制备方法和在制备治疗心肌梗死药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米粒及其制备方法和在制备治疗心肌梗死药物中的应用，该纳米粒由在ε‑聚赖氨酸的氨基上接枝表没食子儿茶素没食子酸酯和透明质酸获得。具体地，表没食子儿茶素没食子酸酯与甲醛通过酚醛缩合醛基化后，该醛基再经还原胺化接枝到ε‑聚赖氨酸上。同时，透明质酸通过席夫碱反应接枝到ε‑聚赖氨酸的氨基上。本发明的纳米粒可以靶向心肌梗死后的M1型巨噬细胞，实现对心肌梗死病灶区域M1型巨噬细胞的靶向富集，有效减轻心梗后心肌损伤，改善心梗后心功能。另外，由于本发明的纳米粒具有大小适度且均一的粒度，使其作用于机体时代谢更稳定，吸收效率更高，富集作用更优良，解决了现有技术中药物在体内半衰期低、易分解代谢的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纳米粒及其制备方法和在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
背景技术
心脏免疫调控是近年来新兴的前沿热点研究领域。心血管疾病的发生和发展往往伴随着大量免疫细胞的浸润，这些免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等，它们通过分泌免疫细胞因子和趋化因子，影响着发病进程。
其中，巨噬细胞作为先天性免疫的重要组成部分在心血管疾病的发生发展以及心脏损伤后修复中起着不可或缺的作用。巨噬细胞对于心血管疾病的发生发展起着“双刃”作用，其自身的可塑性又为改变免疫微环境和重塑免疫进而影响疾病进程提供了可能性。
作为一类高度异质化的细胞，受不同环境条件的刺激，巨噬细胞会极化形成不同的细胞亚型，不同亚型的巨噬细胞行使不同的生理功能。以其两种经典亚型为例：巨噬细胞可极化为经典活化型(M1)及替代活化型(M2)。在Th1细胞因子IFNr或细菌脂多糖(LPS)的刺激下，巨噬细胞会表现出经典型极化(M1)。M1型巨噬细胞在机体抵御病原微生物的侵袭及抑制肿瘤的发生、发展过程中都起着不可或缺的作用。M1型巨噬细胞利用细胞吞噬来清除侵入机体内的微生物及机体内病变的肿瘤细胞，通过将抗原呈递给T淋巴细胞激活适应性免疫应答。在细胞分子水平，M1型巨噬细胞表达相应促炎症因子，如：TNFr、IL-6、IL-1b，并释放活性氮物质(RNS)及活性氧物质(ROS)来抵御外来病原微生物或肿瘤细胞的入侵。
与之相对应，在淋巴因子IL-4、IL-10和IL-13的刺激下，巨噬细胞则会向替代活化型(M2)方向极化，并表现出免疫抑制的特性。与M1型巨噬细胞相比，M2型巨噬细胞的抗原呈递能力减弱，表达细胞免疫因子促进Th2型免疫应答。因此，M2型巨噬细胞在长期组织修复，血管及淋巴管新生以及清除寄生虫感染的过程中起着积极作用。
在心梗1-3d时，心梗部位的巨噬细胞以M1促炎表型为主，可以吞噬坏死的细胞碎片并分泌各类促炎型细胞因子。在心梗后3-7d，巨噬细胞逐渐以M2修复表型为主，通过分泌修复型细胞因子介导心脏损伤修复。还有研究发现巨噬细胞谷氨酰胺代谢与巨噬细胞表型转换和功能密切相关，通过抑制Gls(谷氨酰胺酶)，可使巨噬细胞朝向M1促炎表型极化，这与巨噬细胞体内的α-酮戊二酸水平密切相关。另一项重大研究发现敲除巨噬细胞中的Glud1(谷氨酸脱氢酶1)，可增强巨噬细胞中Gs(谷氨酰胺合成酶)的活性，肌肉卫星细胞吸收巨噬细胞源的谷氨酰胺，促进了卫星细胞的增殖和分化，可修复受伤的肌肉组织。
传统药物载体在运载药物时缺乏特异性，副作用比较大，并且体内半衰期较低短，在体内易被分解代谢，疗效差。可见，开发具有巨噬细胞靶向性的药物，在心肌梗死后的治疗中具有重大前景。因此，亟需研究心脏组织稳态维持、损伤修复的病理生理机制以及心脏损伤后修复的药物。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种纳米粒及其制备方法和在制备治疗心肌梗死药物中的应用，该纳米粒能够促进心肌梗死后炎症的消退及修复心脏损伤。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案为：
一种纳米粒，由在ε-聚赖氨酸的氨基上接枝表没食子儿茶素没食子酸酯和透明质酸获得。
由于心肌梗死后，梗死区域中M1型巨噬细胞特异性极化，可在其表面特异性过表达CD44受体。本发明的纳米粒可以靶向心肌梗死后的M1型巨噬细胞，抑制其Glud1表达，通过调控心肌梗死过程中巨噬细胞的谷氨酰胺代谢，促进心肌梗死后炎症的消退和损伤的修复。具体原理为：首先，纳米粒表面的透明质酸外壳可通过与CD44受体作用，对梗死区域的M1型巨噬细胞进行特异性靶向。接着，有效治疗成分表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)可通过抑制M1型巨噬细胞Glud1的表达，调控心肌梗死过程中巨噬细胞中谷氨酰胺的代谢，接着巨噬细胞分泌各类抑炎型细胞因子和修复型细胞因子，以便消退心肌梗死后出现的炎症和修复损伤组织。综上，相比于传统的小分子给药，该纳米粒具有更好的靶向富集特性，从而提高了药物的利用率，同时减轻了由于药物非特异性分布导致的毒副作用。
而且，相比于小分子的EGCG，本发明所构建的纳米粒具有更长的体内循环时间，会产生更少的药物代谢及流失，因而具有更高的药物利用率。
进一步地，本发明的纳米粒粒径约为20-200nm，PDI为0.121。由于纳米粒具有大小适度且均一的粒度，使其作用于机体时代谢更稳定，吸收效率更高，富集作用更优良，解决了现有技术中药物在体内半衰期低、易分解代谢的技术问题。
在上述的纳米粒中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯通过酚醛缩合反应接枝到ε-聚赖氨酸的氨基上。
在上述的纳米粒中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯中5，7-二羟基苯并二氢吡喃的6位或者8位与甲醛通过酚醛缩合醛基化后，该醛基再经还原胺化接枝到ε-聚赖氨酸上。
在上述的纳米粒中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯在ε-聚赖氨酸上的接枝量占纳米粒总质量的至少60％。具体地，在甲醛参与下，EGCG中5，7-二羟基苯并二氢吡喃的6位或者8位接枝到ε-聚赖氨酸上。本发明引入EGCG作为有效治疗成分构建纳米粒，所构建的纳米粒中有效成分含量高达60％以上，以便通过少量给药达到治疗的目的。而且，相比于小分子的EGCG，本发明所构建的纳米粒具有更长的体内循环时间，会产生更少的药物代谢及流失，因而具有更高的药物利用率。
在上述的纳米粒中，所述的透明质酸通过席夫碱反应接枝到ε-聚赖氨酸的氨基上。
在上述的纳米粒中，所述的透明质酸的平均分子量为10000-30000；
所述的ε-聚赖氨酸的平均分子量为1000-5000。
在上述的纳米粒中，该分子结构式如式(1)所示：
另外，式(1)可以如下形式表示：
其中，x、y、z为几种聚合单元的聚合度。
上述纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将高碘酸钠加入到透明质酸溶液中，在室温条件下反应，随后加入乙二醇，获得氧化透明质酸；
(2)将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于磷酸盐缓冲液中，加入甲醛后，向反应液中加入步骤(1)获得的氧化透明质酸，接着加入ε-聚赖氨酸，在室温条件下反应；
(3)将步骤(2)所得反应液在去离子水中透析后，冻干，制得所述的纳米粒。
本发明的制备方法中，引入EGCG作为有效治疗成分构建纳米粒，所构建的纳米粒中有效成分含量高达60％以上，可通过少量给药达到治疗的目的，具有更高的药物利用率。进一步地，相比于小分子的EGCG，通过本发明方法所制备的纳米粒具有更长的体内循环时间，避免药物代谢及流失现象的发生。
本发明的制备方法反应条件温和且反应速率适宜，使其具有良好的可控性和稳定性，确保所制备的纳米粒具有大小适度且均一的粒度，使该纳米粒作用于机体时代谢更稳定，吸收效率更高，富集作用更优良，解决了现有技术中药物在体内半衰期低、易分解代谢的技术问题。此外，本发明的制备方法具有良好的可控性以便适宜大规模生产。
在上述的纳米粒的制备方法中，步骤(1)中，所述的透明质酸、高碘酸钠和乙二醇的摩尔比为(1～10)：(120～260)：(350～500)；
步骤(2)中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯、甲醛、氧化透明质酸及ε-聚赖氨酸的摩尔比为(1～10)：(0.5～15)：(0.2～8)：(0.05～5)。
在上述的纳米粒的制备方法中，包括以下步骤：
(1)将高碘酸钠加入到透明质酸溶液中，在室温条件下搅拌5～7小时，随后加入乙二醇终止反应，经透析纯化后获得氧化透明质酸；
(2)将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于磷酸盐缓冲液中，加入甲醛经1～10分钟后，向反应液中加入步骤(1)获得的氧化透明质酸，接着快速加入ε-聚赖氨酸，在室温条件下反应2～6小时；
(3)将步骤(2)所得反应液在去离子水中透析22～26小时，冻干，获得用于治疗心肌梗死的靶向纳米粒；
其中，步骤(1)中，所述的透明质酸、高碘酸钠和乙二醇的摩尔比为(1～10)：(150～200)：(400～450)；
(4)用磷酸盐缓冲液复溶步骤(3)得到的用于治疗心肌梗死的靶向纳米粒，获得纳米粒溶液；
步骤(2)中所述的表没食子儿茶素没食子酸酯、甲醛、氧化透明质酸及ε-聚赖氨酸的摩尔比为(1～10)：(1～10)：(0.5～5)：(0.1～1)。
本发明在室温下进行，实现反应条件温和；在制备氧化透明质酸过程中需要5～7小时，在聚合反应过程中需要反应2～6小时，使其具有良好的可控性和稳定性，确保所制备的纳米粒具有大小适度且均一的粒度。以便使该纳米粒作用于机体时代谢更稳定，吸收效率更高，富集作用更优良，解决了现有技术中药物在体内半衰期低、易分解代谢的技术问题。此外，本发明的制备方法具有良好的可控性以便适宜大规模生产。
上述的纳米粒在制备治疗心肌梗死药物中的应用。该治疗心肌梗死药物用于消退心肌梗死后心脏的炎症及修复心脏损伤。一方面，该药物通过巨噬细胞M1极化后表面过表达的CD44受体，靶向心肌梗死后的M1型巨噬细胞。另一方面，通过调控心肌梗死过程中巨噬细胞的谷氨酰胺代谢，促进心肌梗死后的炎症消退和损伤修复。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
(1)本发明的纳米粒可以靶向心肌梗死后的M1型巨噬细胞，抑制其Glud1表达，通过调控心肌梗死过程中巨噬细胞的谷氨酰胺代谢，促进心肌梗死后炎症的消退和损伤的修复。具体原理为：首先，纳米粒表面的透明质酸外壳可通过与CD44受体作用，对梗死区域的M1型巨噬细胞进行特异性靶向。接着，有效治疗成分表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)可通过抑制M1型巨噬细胞Glud1的表达，调控心肌梗死过程中巨噬细胞中谷氨酰胺的代谢，接着巨噬细胞分泌各类抑炎型细胞因子和修复型细胞因子，以便消退心肌梗死后出现的炎症和修复损伤组织。
(2)本发明的纳米粒可以靶向心肌梗死后的M1型巨噬细胞，实现对心肌梗死病灶区域M1型巨噬细胞的靶向富集，有效减轻心梗后心肌损伤，改善心梗后心功能。相比于传统的小分子给药，该纳米粒具有更好的靶向富集特性，从而使药物富集在心肌梗死病灶区域，实现高效低毒的治疗，解决了药物非特异性分布导致毒副作用的技术问题。
(3)本发明引入EGCG作为有效治疗成分构建纳米粒，所构建的纳米粒中有效成分含量高达60％以上，以便通过少量给药达到治疗的目的。而且，相比于小分子的EGCG，本发明所构建的纳米粒具有更长的体内循环时间，会产生更少的药物代谢及流失，因而具有更高的药物利用率。
(4)本发明的纳米粒粒径约为20-200nm，PDI为0.121。由于纳米粒具有大小适度且均一的粒度，使其作用于机体时代谢更稳定，吸收效率更高，富集作用更优良，解决了现有技术中药物在体内半衰期低、易分解代谢的技术问题。
(5)本发明中，酚醛缩合反应和席夫碱反应的反应条件温和且反应速率适宜，使制备方法具有良好的可控性和稳定性，确保所制备的纳米粒具有大小适度且均一的粒度，使该纳米粒作用于机体时代谢更稳定、吸收效率更高。此外，本发明的制备方法具有良好的可控性以便适宜大规模生产。
附图说明
图1为实施例1中纳米粒的粒径分布图。
图2为实施例1中纳米粒的透射电镜图。
图3为纳米粒对巨噬细胞的Glud1抑制结果图。
图4为免疫印迹试验结果对比图。
图5为动物试验中纳米粒对心肌梗死治疗的结果图。
图6为心脏纤维化对照图。
图7为心脏巨噬细胞的功能表型。
图8为动物试验中使用纳米粒对心肌梗死进行治疗后的心脏免疫荧光图。
图9为免疫荧光染色对照图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
一种纳米粒，由在ε-聚赖氨酸的氨基上接枝表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)和透明质酸获得。
具体地，在甲醛参与下，EGCG中5，7-二羟基苯并二氢吡喃的6位或者8位接枝到ε-聚赖氨酸上。其中，该表没食子儿茶素没食子酸酯在ε-聚赖氨酸上的接枝量占纳米粒总质量的至少60％。另外，透明质酸通过席夫碱反应接枝到ε-聚赖氨酸的氨基上。
该种纳米粒的制备方法中，包括以下步骤：
(1)将0.25g透明质酸溶解后，加入0.993g高碘酸钠，室温搅拌6小时后，加入6mL乙二醇终止反应，经透析纯化(MWCO＝3500)后得到氧化透明质酸。
(2)将10mg表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)溶于磷酸盐缓冲液中，加入2μL甲醛经1分钟后，向反应液中加入5mg步骤(1)获得的氧化透明质酸并快速加入1mg的ε-聚赖氨酸，在室温条件下反应4小时；
(3)将步骤(2)所得反应液在去离子水中透析(MWCO＝3500)24小时并冻干，制得用于治疗心肌梗死的靶向纳米粒；
(4)称取10mg步骤(3)所制得靶向纳米粒溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，制得纳米粒溶液。
其中，透明质酸的平均分子量为20000；ε-聚赖氨酸的平均分子量为3000。
所制得靶向纳米粒的粒径图及透射电镜图见图1和图2，由图可知此纳米的粒度均一，其粒径约为72.53nm，PDI为0.121。其中EGCG负载率为62.5％。
应用例1
纳米粒对巨噬细胞的Glud抑制作用：
在巨噬细胞中加入LPS(脂多糖)使其激活成为M1促炎表型后，分成两组，分别加入实施例1制得的纳米粒溶液和自由药物(具体为EGCG)，共培养24小时，提取细胞蛋白，检测细胞中Glud1的表达情况。
由图3-4中免疫印迹试验结果图可知，与传统药物相比，实施例1制备的纳米粒能够抑制Glud1的表达。
应用例2
动物试验验证纳米粒对动心肌梗死的治疗效果：
首先，建立心肌梗死小鼠模型，其后将小鼠分为三组，分别注射等体积的纳米粒、自由药物(具体为EGCG)及生理盐水。其中，药物使用剂量为10mg/kg，每日注射1次。接着，连续给药14天后，做小动物心脏彩超来检测小鼠心功能。随后，在小鼠安乐死后解剖分离出心脏组织，做冰冻切片并进行Masson染色检测心脏纤维化情况和免疫荧光染色检测心脏巨噬细胞的功能表型，结果见图5-9。
由图5、图6和图7可知，与自由药物相比，纳米粒对心肌梗死具有更强的治疗效果，表现在使用纳米粒治疗的小鼠的心脏射血分数(EF)显著高于对照组(图5-6)，梗死面积也显著减少，并且梗死边界区纤维化程度也有所减轻(图7)。以往研究表明CD68可作为巨噬细胞普遍标志物，而CD86则可作为巨噬细胞M1促炎亚群的标志物，图8-9中免疫荧光染色结果表明应用纳米粒治疗的小鼠心肌梗死部位M1促炎表型巨噬细胞比例更低，提示其心脏炎症消退更快。
Claims (6)
1.一种纳米粒，其特征在于，由在ε-聚赖氨酸的氨基上接枝表没食子儿茶素没食子酸酯和透明质酸获得；
所述的表没食子儿茶素没食子酸酯通过酚醛缩合反应接枝到ε-聚赖氨酸的氨基上；
所述的表没食子儿茶素没食子酸酯中5，7-二羟基苯并二氢吡喃的6位或者8位与甲醛通过酚醛缩合醛基化后，该醛基再经还原胺化接枝到ε-聚赖氨酸上；
所述的纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将高碘酸钠加入到透明质酸溶液中，在室温条件下反应，随后加入乙二醇，获得氧化透明质酸；
（2）将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于磷酸盐缓冲液中，加入甲醛后，向反应液中加入步骤（1）获得的氧化透明质酸，接着加入ε-聚赖氨酸，在室温条件下反应；
（3）将步骤（2）所得反应液在去离子水中透析后，冻干，制得所述的纳米粒；
所述的表没食子儿茶素没食子酸酯、氧化透明质酸及ε-聚赖氨酸的摩尔比为（1~10）：（0.2~8）：（0.05~5）。
2.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯在ε-聚赖氨酸上的接枝量占纳米粒总质量的至少60%。
3.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述的透明质酸通过席夫碱反应接枝到ε-聚赖氨酸的氨基上。
4.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述的透明质酸的平均分子量为10000-30000；
所述的ε-聚赖氨酸的平均分子量为1000-5000。
5.如权利要求1所述的纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的透明质酸、高碘酸钠和乙二醇的摩尔比为（1~10）：（120~260）：（350~500）；
步骤（2）中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯、甲醛、氧化透明质酸及ε-聚赖氨酸的摩尔比为（1~10）：（0.5~15）：（0.2~8）：（0.05~5）。
6.如权利要求1~4中任意一项所述的纳米粒在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
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