CN105658633A - 用于生物医药应用的聚合物-类黄酮缀合物和水凝胶 - Google Patents

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Abstract

提供了聚合物-类黄酮缀合物。根据本发明公开了类黄酮接枝聚合物缀合物和类黄酮封端聚合物缀合物。已经经由硫醇键实现类黄酮与所述聚合物的键合。本发明的方法允许以高产率制备所述缀合物，从而避免了复杂的纯化步骤。所述缀合物可以容易地自动氧化成水凝胶，所述水凝胶在其中需要更高的类黄酮稳定性的许多生物医药应用中具有用途。所述水凝胶可以潜在地用作粘性补充剂、抗粘连膜或皮肤填充物。

Description

用于生物医药应用的聚合物-类黄酮缀合物和水凝胶
技术领域
本发明大体上涉及一种聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。本发明还涉及制备所述缀合物的方法以及包含所述缀合物的水凝胶和制备所述水凝胶以及在生物医药应用中使用所述水凝胶的方法。
背景技术
类黄酮已经在体外研究中被证实具有广泛的生物活性和药理活性。实例包括抗过敏活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗微生物活性、抗细菌活性、抗真菌活性、抗病毒活性、抗癌活性、以及抗腹泻活性。在过去几十年中，例如绿茶儿茶素作为对抗冠状动脉心脏病和癌症的保护剂已经受到显著的关注(Bushman,J.L.Greenteaandcancerinhumans:areviewoftheliterature(绿茶和人类癌症：文献综述),Nutr.Cancer31:151-9；1998；以及Zaveri,N.T.Greenteaanditspolyphenoliccatechins:medicinalusesincancerandnoncancerapplications(绿茶和它的多酚类儿茶素：在癌症和非癌应用中的医药用途),LifeSci.78:2073-80；2006)。绿茶儿茶素属于类黄酮的群组。
具体地说，(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是绿茶中最丰富的儿茶素并且已经由于它的强抗氧化活性和自由基清除活性而被广泛地研究(WangY.；HoC.-T.PolyphenolicChemistryofTeaandCoffee:ACenturyofProgress(茶和咖啡的多酚类化学物质：一个世纪的进展),JAgricFoodChem57:8109-8114；2009)。
尽管有这些理想的特性，但是诸如EGCG的类黄酮的临床使用受限于它们不佳的稳定性和有限的口服生物利用率。举例来说，EGCG在生理温度和pH值下是不稳定的，并且容易分解，具有少于30分钟的半衰期。此外，EGCG的口服生物利用率不佳，这是因为它在胃液中快速水解并且在胃肠道中发生代谢降解。为了克服这些限制，许多努力一直致力于对类黄酮进行化学修饰以提高它们的稳定性、生物利用率以及生物活性。
最近，已经用各种类型的含有硫醇的化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽以及蛋白质对EGCG进行共价修饰，但是相当具有挑战性的是，以受控方式合成EGCG的复杂的硫醇缀合物。一个重要的原因是EGCG的化学不稳定性。举例来说，EGCG容易在中性溶液和碱性溶液中进行自动氧化，从而引起二聚化和分解。
此外，如果通过添加超氧化物歧化酶或通过用氮气吹扫来抑制EGCG的自动氧化，那么EGCG向(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)的差向异构倾向于增加。硫醇与EGCG的共价连接还可能被在自动氧化过程期间所产生的过氧化氢(H2O2)所妨碍。由于H2O2将游离硫醇基氧化成二硫键或次磺酸(R-SOH)，因此它可能降低参与硫醇-EGCG缀合的游离硫醇基的浓度。这在制备硫醇缀合物的反应中导致低的产率和不希望有的无反应性的二硫化物或次磺酸副产物。然后需要复杂的纯化步骤来以高的产率和纯度获得所期望的缀合物。
因此，需要找到一种以高度选择性方式用含有硫醇的化合物修饰诸如EGCG的类黄酮的有效方式。
此外，当前还没有制备稳定的聚合物-类黄酮缀合物的方式。然而，存在着产生这样的缀合物以改进类黄酮的不佳的稳定性并且使它们可用于诸如凝胶的生物医药应用中的需要。
发明内容
根据第一个方面，提供了一种聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。
有利的是，所述缀合物以稳定的方式使所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮部分连接。有可能获得具有提高的类黄酮生物利用率和生物活性的类黄酮封端聚合物和类黄酮接枝聚合物。
进一步有利的是，实现了与生物相容性和可生物降解的聚合物的缀合，这在生物医药应用中具有潜在的用途。
根据第二个方面，提供了一种用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，所述方法包括在碱性条件下经由亲核加成使所述类黄酮与所述聚合物缀合的步骤，其中所述聚合物已经被游离硫醇基修饰。
有利的是，所公开的方法允许以非常高的缀合度反应，这避免了繁琐的分离过程。可以使用所公开的方法在类黄酮结构的特定点处实现硫醇缀合。
根据第三个方面，提供了一种水凝胶，所述水凝胶包含聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物是经由硫醇接头与所述类黄酮缀合的。
有利的是，所述水凝胶可以通过使所公开的缀合物的类黄酮部分进行简单交联来制备，特别是在利用自动氧化或酶促交联反应时。所获得的水凝胶具有大于约200帕，常常甚至大于390帕的良好的储能模量。
根据第四个方面，因此公开了一种用于形成水凝胶的方法，所述方法包括在碱性条件下经由自动氧化使根据本发明的聚合物-类黄酮缀合物交联的步骤。这任选地通过添加酶和氧化剂来加速。
根据第五个方面，提供了所公开的水凝胶用于制备生物医药产品的用途。
有利的是，所述水凝胶可以用于可注射的水凝胶系统中，所述系统提供了一种有效并且便利的方式来施用多种生物活性剂和治疗剂以通过根据需要选择缀合物中的类黄酮部分和聚合物的类型来用于不同的生物医药应用。
定义
除非本文另外定义，否则本申请中所使用的科学术语和技术术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的含义。一般来说，结合本文所述的化学所使用的命名和本文所述的化学的技术是本领域公知的和常用的那些。
除非上下文另有要求或明确有相反的说明，否则在本文被叙述为单数形式的整数、步骤或要素的本发明的整数、步骤或要素明确地涵盖了所叙述的整数、步骤或要素的单数形式和复数形式这两者。
除非另外说明，否则如本文所用的下列术语具有下列含义，并且除非另外说明，否则每一个术语的定义在该术语被单独使用或用作另一个术语的组成部分时均适用(例如芳基的定义对于芳基和对于芳基烷基、烷基芳基、芳基炔基等的芳基部分来说是相同的)。
如本文所用的术语“类黄酮”指的是一大类的植物次级代谢产物，包括而不限于典型的类黄酮(也被称作生物类黄酮)；异黄酮，衍生自3-苯基苯并吡喃-4-酮(3-苯基-1,4-苯并吡喃酮)结构；新类黄酮，衍生自4-苯基香豆素(4-苯基-1,2-苯并吡喃酮)结构；和类似的多酚类化合物以及其混合物。通常，类黄酮属于例如黄酮、黄酮醇、黄烷酮、二氢黄酮醇、黄烷、原花色素以及花色素的群组。通常，异黄酮属于例如异黄烷、异黄烷二醇(isoflavandiol)、异黃烯(isoflavene)、香豆烷(coumestan)以及紫檀烷(pterocarpan)的群组。可以被提到的一些多酚类化合物是牧豆树醇(mesquitol)和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁(phlorotannin)、单宁、茶柠檬素(theacitrin)、茶二苯并托酚酮(theadibenzotropolone)、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素(theasinensin)。
如本文所用的术语“缀合物”指的是由两种化合物结合所形成的部分或与另一个部分结合的部分。根据本发明，缀合是通过经由硫原子的共价化学键来实现的。
如本文所用的术语“酰胺”指的是形式-C(O)-NRa-烷基-的基团，其中Ra选自包括但不限于以下各项的组：氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、以及任选取代的芳基。如本文所用的术语“胺”指的是形式-NRaRb-烷基-的基团，其中Ra和Rb单独地选自包括但不限于以下各项的组：氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、以及任选取代的芳基。“酰胺”和“胺”中的-烷基-基团可以任选被取代并且优选地具有2个至10个碳原子，更优选地2个至6个碳原子，并且最优选2个碳原子。
如本文所用的术语“烷基”在它的含义内包括二价(“亚烷基”)直链或支链饱和脂族基团，所述基团具有1个至10个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个碳原子。举例来说，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。术语“烯基”在它的含义内包括二价(“亚烯基”)直链或支链不饱和脂族烃基，所述烃基具有2个至10个碳原子，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个碳原子，并且在烷基链中的任何地方具有在适用时具有E型、Z型、顺式或反式立体化学的至少一个双键。烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。如本文所用的术语“芳基”指的是具有6个至10个碳原子的芳族烃的二价(“亚芳基”)单个、多核、共轭或稠合的残基。这样的基团包括例如苯基、联苯、萘基、菲基等。芳基可以任选地被取代。术语“酯”在它的含义内包括-O-C(O)-烷基-和-c(O)-O-烷基-基团。术语“碳酸酯”在它的含义内包括-O-C(O)-O-烷基-基团。术语“醚”在它的含义内包括-O-烷基-和-烷基-O-烷基-基团。术语“氨基甲酸酯”在它的含义内包括-O-(CO)-NRa-和-O-(CO)-NRa-烷基-基团，其中Ra选自包括但不限于以下各项的组：氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、以及任选取代的芳基。术语“缩醛”在它的含义内包括-O-C(O-烷基,O-烷基)-和-O-C(O-烷基,O-烷基)-烷基-基团。
如本文所用的术语“任选取代”意指这个术语所涉及的基团可以是未取代的，或可以被独立地选自以下各项的一个或多个基团取代：烷基、烯基、炔基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基硫基、烷基羰氧基、烷基硫代、酰基硫代；含磷基团，如膦酰基和氧膦基；芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)以及-C(O)N(烷基)2。通常，这些基团具有1个至10个碳原子，如果它们含有碳原子的话。
除非另外说明，否则术语“包含(comprising)”和“包含(comprise)”以及其语法上的变化形式意图表示“开放性”或“包括性”语言，因此它们包括所述的要素，而且还容许包括另外的未陈述的要素。
如本文所用的术语“约”在制剂的组分浓度的背景下通常意指指定值+/-5％，更通常是指定值+/-4％，更通常是指定值+/-3％，更通常是指定值+/-2％，甚至更通常是指定值+/-1％，并且甚至更通常是指定值+/-0.5％。
在整个本公开中，某些实施方案可以范围的形式被公开。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所公开范围的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，对诸如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这均适用。
某些实施方案也可以被宽泛地和一般性地描述于本文中。落入一般性公开内的较窄内容和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来对实施方案的一般性地说明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。
具体实施方式
在一个方面，提供了一种聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。
根据一个优选的实施方案，所述聚合物可以选自由多糖、多核苷酸、多肽、合成聚合物以及其混合物组成的组。作为优选的多糖，可以提到的是透明质酸、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、水溶性聚蔗糖(ficoll)、胶凝糖(gellan)、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、支链淀粉、硬葡聚糖、黄原胶以及木葡聚糖。透明质酸可以作为特别优选的而被提到。作为优选的多核苷酸，可以提到的是适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)以及小发夹RNA(shRNA)。作为优选的多肽，可以提到的是蛋白质、抗体、抗体片段、适体样肽(aptide)、肽以及聚氨基酸。作为优选的合成聚合物，可以提到的是包含选自以下各项的组的单体的那些聚合物：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯以及聚氨酯。可以被进一步提到的更优选的合成聚合物包括聚丙烯酸、聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸酯-共聚-磷酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)以及其组合。聚丙烯酸可以作为最优选的而被提到。
所述聚合物可以在它的聚合物链的末端处与单个类黄酮连接(类黄酮封端聚合物)或在聚合物主链内的几个位置处连接(类黄酮接枝聚合物)。类黄酮封端聚合物的缀合度随与可用的反应位置，即还原性基团的数目有关的可用性而变。它可以广泛地变化，这取决于所使用的聚合物。类黄酮封端聚合物缀合物中所使用的聚合物可以具有不同的分子量，所述分子量优选地在约0.1kDa至1000kDa的范围，更优选地在0.1kDa至500kDa的范围，并且最优选地在0.1kDa至150kDa的范围。
类黄酮接枝聚合物的缀合度可以由羧基对半胱胺缀合物的取代度(例如被确定为聚合物的每100个重复单元的硫醇基数目)来决定。它可以广泛地变化，这取决于所使用的聚合物。通常，每100个单体单元的硫醇基数目是约1个至40个，优选地约5个至25个并且最优选地5个至22个。
类黄酮接枝聚合物缀合物中所使用的聚合物可以具有不同的分子量，所述分子量优选地在约1kDa至1000kDa的范围，更优选地在1kDa至500kDa的范围并且最优选地在1kDa至150kDa的范围。
根据一个优选的实施方案，所述聚合物或类黄酮可以进一步与治疗剂结合或与治疗剂缀合。
所述治疗剂可以选自由小分子药物和纳米药物组成的组，其中所述纳米药物本身可以选自由聚合物胶束、脂质体以及树枝状聚合物组成的组。
根据一个优选的实施方案，所述类黄酮可以选自由黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素以及其混合物组成的组。具体来说，黄烷可以作为类黄酮而被提到，所述类黄酮选自黄烷，所述黄烷选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、(+)-表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇(fisetinidol)、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇和刺槐亭醇、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁、单宁、茶柠檬素、茶二苯并托酚酮、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素以及其混合物。如果没有具体提到，那么本发明在它的范围内包括本文所公开的化合物的所有异构体形式，包括所有的非对映异构体、外消旋体以及对映体。因此，如果没有另外具体提到，那么在每种情况下在适当时，类黄酮应当被理解成包括例如所述化合物的E型、Z型、顺式、反式、(R)型、(S)型、(L)型、(D)型、(+)型和/或(-)型形式。
硫醇接头意指经由通过使硫醇基反应所引入的硫原子的共价键。
根据一个优选的实施方案，所述硫醇接头可以衍生自与所述聚合物结合的硫醇部分，其中所述硫醇部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰胺基、酰胺基酯、氨基甲酸酯以及缩醛基。这个部分使聚合物与桥联硫原子连接。具有硫醇基的酰胺和胺对于制备缀合物来说是特别优选的。最优选地，所述硫醇部分是氨基乙基硫醇基(半胱胺衍生的)。
根据本发明，经由硫醇基的透明质酸(HA)-EGCG缀合物是特别优选的。特别是，这种方法允许使聚合物高效地连接在EGCG的B环的C2'位处。根据所述优选的实施方案，可以制备两种类型的EGCG透明质酸(HA)缀合物：EGCG封端HA和EGCG接枝HA。HA是大量存在于结缔组织的细胞外基质中的一种天然的多糖。它在细胞增殖、形态发生、炎症以及伤口修复中起重要作用。HA是生物相容性的和可生物降解的。HA在这个实施方案中被选为主链聚合物以与EGCG连接。所述缀合可以是EGCG封端的或EGCG接枝的。所述缀合物因此可以是选自由以下各项组成的组的透明质酸-EGCG缀合物：
式(I)；以及
式(II)
其中：
每一个n独立地是0至15,000的整数；并且每一个m独立地是1至15,000的整数。
优选地，n是0至1,000的整数。优选地，m是1至1,000的整数。更优选地，n是0至300的整数。更优选地，m是1至300的整数。
特别优选的是具有0.01％至100％的缀合度的式(I)或式(II)的透明质酸(HA)-EGCG缀合物。
根据第二个方面，提供了一种用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，所述方法包括在碱性条件下经由亲核加成使所述类黄酮与所述聚合物缀合的步骤，其中所述聚合物已经被游离硫醇基修饰。
所述方法包括使被引入到聚合物中的硫醇基与类黄酮进行亲核反应。在碱性条件下进行所述反应。这意味着pH值不低于pH7.0。所述亲核反应可以在高pH值下进行，但是优选的pH值是pH7.0至pH10.0，这是因为这提高了与类黄酮中所选择的基团(例如EGCG中的没食子酰基)反应的特异性。
优选地，在具有7.0至9.0的pH值的弱碱性条件下进行反应。约7.2至8.2的pH值是最优选的。优选地，使用缓冲液，如磷酸盐缓冲液来严格控制反应。
可以在各种温度进行所述反应，但是20℃至30℃的环境温度是优选的。最优选的是约25℃。溶剂的选择可以改变。优选的是，在水性溶剂中，任选地在与诸如DMSO的有机溶剂的混合物中进行反应。优选地以1小时至36小时，更优选地2小时至24小时的反应时间进行缀合步骤。3小时至6小时的反应时间是最优选的。
根据所述方法的一个优选的实施方案，将清除剂添加到所述过程中。所述清除剂可以选自由丙酮酸钠和超氧化物歧化酶组成的组。有利的是，所述清除剂能够有效地清除引起副反应的不希望有的H2O2。清除剂，特别是丙酮酸钠可以优选地以0.1mM至100mM，更优选地1mM至25mM的浓度来使用。
在所述反应中，相对于带有硫醇基的聚合物，类黄酮优选地以过量来使用。所述过量可以是2倍至200倍，优选地40倍至100倍。
根据本发明，将所述聚合物用硫醇基修饰以与类黄酮连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述方法进一步包括以下步骤：
(a)在还原剂存在下使含有硫醇或二硫化物的化合物与所述聚合物连接；以及
(b)使任何所形成的二硫化物在二硫键处裂解，从而形成所述带有末端硫醇基的聚合物。
这种方法例如适合于制备类黄酮封端聚合物缀合物。以高纯度和高产率(超过90％)获得所述缀合物。所述方法是易于进行以及按比例放大的。它是一种不需要复杂纯化的非酶促方法。
所述含有硫醇或二硫化物的化合物可以是例如氨基烷基硫醇衍生物，如半胱胺盐酸盐和胱胺二盐酸盐。
根据一个优选的实施方案，所述连接步骤(a)可以是还原胺化。
作为用于步骤(a)的合适的还原剂，可以提到的是氰基硼氢化钠、硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、氢化铝锂。特别优选的是氰基硼氢化钠。
优选地在碱性条件下进行连接步骤(a)。这意味着pH值不低于pH7.0。优选地，在具有7.5至9.0，优选地7.5至8.9的pH值的碱性条件下进行反应。约8.5的pH值是最优选的。优选地，使用缓冲液，如硼酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液来严格控制反应。
可以在各种温度进行步骤(a)的反应，但是30℃至45℃的高温是优选的。最优选的是约37℃。溶剂的选择可以改变。优选的是，在水性溶剂中进行反应。
在所述反应中，含有硫醇或二硫化物的化合物可以与相应还原反应中的还原剂约等摩尔量使用。然而，所述还原剂也可以过量使用。通常，步骤(a)中的反应时间可以在广泛的范围变化，但是可以优选的是，具有几天，优选地1天至7天，最优选4天至6天的长反应时间。
在裂解步骤(b)中，可以使用可以裂解二硫键的合适的还原剂。这样的还原剂包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)。对于裂解步骤，可以使用与方法步骤(a)中相同的溶剂和pH值。反应时间优选地是2小时至48小时，更优选地是12小时至36小时以实现完全裂解。在还原反应中，相对于带有二硫化物基团的聚合物，所述还原剂优选地以过量来使用。在裂解之后，可以利用通过在氮气氛下以给定的截留分子量(例如约1,000Da至5,000Da)透析进行的纯化并且将所获得的产物冻干以进一步用于制备根据本发明的最终缀合物的反应中。可以获得大于90％的硫醇末端修饰，如通过埃尔曼测定(Ellman'sassay)所确定。
还可以通过其它方式将所述聚合物用硫醇基修饰以与类黄酮连接。根据本发明的另一个优选的实施方案，用于制备缀合物的方法然后进一步包括在偶联剂存在下使含有硫醇或二硫化物的化合物与所述聚合物偶联的步骤。
这种方法例如适用于制备类黄酮接枝聚合物缀合物。所述含有硫醇或二硫化物的化合物可以是例如氨基烷基硫醇衍生物，如半胱胺盐酸盐和胱胺二盐酸盐。
所述偶联剂可以是脱水剂以将羧酸朝向酰胺或酯的形成来活化。它可以例如选自由以下各项组成的组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基二环己基碳二亚胺(DCC)盐酸盐、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑、二亚胺代己二酸二甲酯、N-羟基丁二酰亚胺、氯甲酸对硝基苯酯以及1-(对甲苯磺酰基)咪唑。作为优选的偶联剂而被特别提到的还有2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉(DMTMM)。为了提高这种活性酯的稳定性，可以另外使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或N-羟基磺基丁二酰亚胺(磺基-NHS)。
优选地在水溶液中进行偶联步骤并且将pH值控制在酸性范围，例如约pH4.0至pH6.5的酸性范围。优选地，使用氮气氛进行反应。
可以在各种温度进行偶联步骤，但是20℃至30℃的环境温度是优选的。最优选的是约25℃。
在所述反应中，所述偶联剂可以与偶联反应中聚合物的COOH含量约等摩尔量使用。也可以约等摩尔量使用NHS或磺基-NHS。通常，偶联步骤中的反应时间可以在广泛的范围变化，但是可能优选的是，具有几天，优选地1天至2天的长反应时间。
由于反应产物可能含有二硫桥，因此可以使用裂解步骤。所述裂解步骤可以与对于将聚合物用硫醇基修饰的其它方法所述的裂解步骤(b)相同或基本上相同。纯化也可以是类似的。
根据本发明的第三个方面，提供了一种水凝胶，所述水凝胶包含聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物是经由硫醇接头与所述类黄酮缀合的。
具有0.01％至100％，优选地2％至40％，更优选地以下值中的任一个的缀合度的式(II)的聚合物-类黄酮缀合物在所述水凝胶中可以是合适的并且被具体提到：2％、5％、7.5％、10％、20％、30％以及40％。
根据本发明的第四个方面，公开了一种用于形成根据本发明的水凝胶的优选的方法，所述方法包括使聚合物-类黄酮缀合物在碱性条件下经由自动氧化而交联的步骤。
聚合物-类黄酮缀合物是如上所述的根据本发明的聚合物-类黄酮缀合物。
所述用于形成水凝胶的方法优选地在碱性条件下进行。这意味着pH值不低于pH7.0。优选地，在具有7.0至8.0，优选地约7.4的pH值的碱性条件下进行反应。优选地，使用缓冲液，如磷酸盐缓冲液来严格控制反应。可以在各种温度进行偶联步骤，但是30℃至40℃的高温是优选的。最优选的是约35℃至39℃。可以根据需要调整反应时间以获得合适的水凝胶。合适的反应时间可以是2分钟至45小时，优选地10分钟至24小时。
根据所述方法的另一个实施方案，形成水凝胶的自动氧化可以进一步通过以下步骤来支持，所述步骤包括在氧化剂存在下添加酶。这加速了氧化以形成水凝胶。
所述酶可以是过氧化物酶。这样的过氧化物酶可以优选地选自由以下各项组成的组：辣根过氧化物酶、人类髓过氧化物酶、乳过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、前列腺素H合酶、大豆过氧化物酶、氯化血红素、血红素以及微过氧化物酶-11。所述氧化剂可以例如是过氧化物，如特别优选的过氧化氢。过氧化物和氧化剂的浓度不是关键的并且可以在已知的范围内选择。所述酶可以例如以几个单位/毫升，优选地0.1单位/毫升至10单位/毫升，更优选地0.1单位/毫升至2单位/毫升的量使用。所述氧化剂可以毫摩尔浓度水平使用，优选地约0mM至50mM，更优选地0.5mM至10mM，0.5mM至3mM是最优选的。
合适的水凝胶可以通过简单地改变酶浓度或所用的氧化剂的量来调整。
根据本发明的第五个方面，提供了所公开的水凝胶用于制备生物医药产品的用途。可以被提到的这样的生物医药产品包括粘性补充剂、抗粘连膜或真皮填充物。
附图说明
附图图示了所公开的实施方案并且用来阐明所公开的实施方案的原理。然而，应当了解的是，所述附图仅被设计用于图示的目的，而不用作对本发明的限制条件的限定。
图1示出了EGCG封端HA的合成方案。通过还原胺化以及二硫键的后续裂解将HA分子的还原端用硫醇基修饰。在碱性pH值下使所得的硫醇末端修饰的HA与EGCG缀合。
图2示出了以0.5mg/mL的浓度溶解在蒸馏水中的HA和EGCG封端HA的UV-可见光谱。
图3示出了EGCG和EGCG封端HA的HPLC色谱图。上箭头和下箭头分别指示了EGCG和EGCG封端HA的峰。
图4示出了EGCG封端HA随反应时间而变的缀合度。
图5示出了具有8kDa分子量的EGCG封端HA的1HNMR谱。
图6示出了EGCG接枝HA的合成方案。通过与胱胺分子缀合以及二硫键的后续裂解将HA中的羧基用硫醇基修饰。在碱性pH值下使所得的硫醇官能化的HA与EGCG缀合。
图7示出了以0.25mg/mL的浓度溶解在蒸馏水中的EGCG接枝HA的UV-可见光谱。
图8示出了具有90kDa分子量的EGCG接枝HA的1HNMR谱。
图9示出了HA-EGCG水凝胶随H2O2浓度而变的储能模量和凝胶点。HRP的浓度被固定在0.16单位/毫升。
图10示出了用不同的HRP浓度制备的HA-EGCG水凝胶的储能模量和凝胶点。H2O2的浓度被固定在0.91mmol/L。
图11示出了在125单位/毫升的透明质酸酶存在下HA-EGCG水凝胶和HA-酪胺水凝胶的归一化的重量变化的时间过程。这两种水凝胶具有相同的储能模量(1kPa)。HA-EGCG水凝胶是用0.16单位/毫升的HRP和1.14mmol/L的H2O2形成的。
附图详细说明
图1示出了EGCG封端HA的合成方案，其中单个EGCG分子连接在HA的末端位置处。已知的是，大部分多糖(例如HA、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉)只含有一个具有环状半缩醛基的还原端。对于EGCG封端HA的合成，首先通过还原胺化将HA分子的天然还原端用胱胺修饰。随后，通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)使胱胺中的二硫键裂解以在HA的末端处产生游离硫醇基。通过埃尔曼测定所确定的硫醇化度高于98％。然后在pH7.4将硫醇末端修饰的HA与过量的EGCG一起孵育。如图中所示，HA可以在弱碱性pH值下特异性地与EGCG的B环缀合。应当指出的是，所述缀合反应是在丙酮酸钠存在下进行的。可以简单地通过在氮气氛下针对蒸馏水进行透析来纯化所产生的EGCG封端HA。
图2示出了EGCG封端HA在274nm处具有EGCG的特征性UV吸收峰。对于EGCG封端HA没有在425nm处观测到UV吸收谱带，这表示不存在EGCG二聚体和其它氧化产物。通过反相高效液相色谱(HPLC)进一步确认EGCG的成功缀合。
图3示出了EGCG封端HA被展示以比EGCG短的保留时间被洗脱出。值得注意的是，没有在HPLC色谱图中检测到EGCG二聚体。
图4示出了随着反应时间从2小时增加到6小时，缀合度从20％增加到100％。缀合度不取决于HA的分子量。根据这些结果，在这种情况下，最佳的反应时间被确定为约4小时。
图5示出了通过1HNMR光谱法对EGCG封端HA的结构进行的评价。1HNMR谱显示A环(在δ＝6.1-6.3处的H-6和H-8)、C环(在δ＝5.60-5.85处的H-2和H-3)以及D环(在δ＝6.95处的H-2”和H-6”)的质子信号。由于源自A环、C环以及D环的质子信号类似于未修饰的EGCG的那些质子信号，因此可以设想的是，这些结构没有参与缀合反应。相反，在缀合反应之后，B环的质子信号显然发生变化。EGCG封端HA在δ＝6.7ppm处仅展示出B环的一个质子的单峰信号，而不是EGCG的两个质子的单峰信号。这一结果可以被解释为一个质子(H-2')经由硫醇末端修饰的HA在B环的C2'位处的连接而消失。此外，H-6'原子的质子信号(δ＝6.7)与未修饰的EGCG的质子信号相比表现出0.2ppm的向低场方向的位移。综上所述，这些结果证实只有一个HA分子以位点特异性方式连接在EGCG的B环的C2'位处。
根据本发明，合成基于上文所述的位点特异性缀合方法的另一种类型的HA-EGCG缀合物以证实本发明构思。
图6示出了EGCG接枝HA的合成方案，所述EGCG接枝HA由与HA主链连接的多个EGCG分子组成。首先，使用三嗪介导的反应使胱胺分子与HA的羧基偶联。随后，通过TCEP将胱胺中的二硫键裂解以产生游离硫醇基。所得的HA-半胱胺缀合物通常具有8.4的取代度(每100个重复二糖单元的硫醇基数目)。然后在pH7.4将HA-半胱胺缀合物与过量的EGCG一起孵育以允许EGCG与硫醇基缀合。值得注意的是，添加丙酮酸钠以防止H2O2介导的游离硫醇基氧化。还添加少量的DMSO以提高EGCG的溶解度。在25℃孵育24小时之后，使混合物的pH值达到6以停止缀合反应。简单地通过在氮气氛下针对蒸馏水进行透析来纯化所产生的EGCG接枝HA。
值得注意的是，HA-半胱胺缀合物中的取代度是通过改变偶联剂(DMTMM)与HA中的羧基的摩尔比来控制的。举例来说，随着DMTMM与羧基的摩尔比从0.5:1升高到1.5:1，取代度从2.8增加到8.4。使用具有5.7和8.4的取代度的HA-半胱胺缀合物分别引起具有5.8和11的取代度的EGCG接枝HA产生。这一结果表明有可能简单地通过使用具有不同取代度的HA-半胱胺缀合物来调整EGCG缀合的程度。此外，可以通过受控方式使用DMTMM将聚丙烯酸用半胱胺部分进行修饰。举例来说，随着DMTMM与羧基的摩尔比从0.04:1升高到0.15:1，取代度从0.3增加到1.4。使用具有1.0和1.4的取代度的聚丙烯酸-半胱胺缀合物分别引起具有0.035和0.07的取代度的EGCG接枝聚丙烯酸产生。
图7示出了所获得的EGCG接枝HA在274nm处显示出UV吸收峰，这表示EGCG的成功缀合。没有产生EGCG二聚体和其它氧化产物，如由在425nm处不存在UV吸收谱带所证实。
图8示出了EGCG接枝HA的1HNMR谱。A环(在δ＝6.1-6.3处的H-6和H-8)、C环(在δ＝5.60-5.85处的H-2和H-3)以及D环(在δ＝6.98处的H-2”和H-6”)的质子信号类似于未修饰的EGCG的那些，这表明在缀合反应期间这些部分没有发生任何变化。重要的是，B环的质子信号与未修饰的EGCG的那些(δ＝6.5)相比显著地移位到δ＝6.7ppm。此外，B环信号的NMR峰被显示为具有D环信号的峰下面积的一半，这表明在缀合反应后一个质子(H-2')从B环消失。因此，上述结果揭示了HA-半胱胺缀合物的位点特异性连接仅在EGCG的B环的C2'位处发生。
所得的EGCG接枝HA易溶于水溶液中并且可以用于经由EGCG部分的交联而形成水凝胶。根据本发明，可以通过自动氧化或酶促交联反应而产生HA-EGCG水凝胶。为了经由自动氧化形成HA-EGCG水凝胶，将2重量％的HA-EGCG溶液在37℃和pH7.4孵育。自动氧化介导的HA-EGCG水凝胶的形成缓慢进行；胶凝时间是约2小时。
根据本发明，已发现HA-EGCG水凝胶的形成可以通过使用HRP进行酶促交联反应来加速。
图9示出了在以0.16单位/毫升的浓度添加HRP时，胶凝时间从2小时显著缩短到2分钟。这一结果证实HRP通过催化EGCG氧化加速了EGCG二聚体的形成。
图9示出了在各种H2O2浓度下HA-EGCG水凝胶的储能模量的研究结果。储能模量随着H2O2浓度递增而逐渐增加。举例来说，随着H2O2浓度从0.68mM增加到1.14mM，储能模量从366Pa增加到924Pa。值得注意的是，水凝胶的凝胶点在约2分钟时保持不变。这一结果表明HA-EGCG水凝胶的储能模量可以在不影响它们的胶凝速率的情况下受到控制。
图10示出了随着HRP浓度递增，胶凝速率变得更快。用0.15单位/毫升的HRP形成的水凝胶的凝胶点是4.1分钟，而用0.16单位/毫升的HRP形成的水凝胶的凝胶点是1.6分钟。尽管胶凝速率是不同的，但是所形成的水凝胶具有相似的储能模量。这些结果证实可以通过简单地改变HRP浓度来调整HA-EGCG水凝胶的胶凝速率。
图11示出了对HA-EGCG水凝胶在125单位/毫升的透明质酸酶存在下的降解曲线的研究结果。为了比较，制备具有相同储能模量(1kPa)的HA-酪胺水凝胶。在人体内，透明质酸酶存在于许多器官中，如肝脏、脾脏以及肾脏。透明质酸酶使得HA主链中的糖苷键裂解。如所预期，透明质酸酶在6小时内使HA-酪胺水凝胶快速降解。相比之下，HA-EGCG水凝胶在5天内仅表现出少量水平的降解(约9％)。EGCG部分引起了对透明质酸酶活性的抑制。这些结果表明与常规的HA水凝胶相比，HA-EGCG水凝胶将表现出在一段较长的时间内延长的体内停留。因此可以预期的是，具有可控制的胶凝速率和机械强度的HA-EGCG水凝胶可以作为可注射的支架用于组织工程和生物活性剂的控制释放。
实施例
将通过参考具体实施例来进一步更详细地描述本发明的合成/制备实施例和非限制性实施例，所述具体实施例不应当以任何方式被视为限制本发明的范围。
材料：HA(Mw＝8kDa和17kDa)购自生命核心生物医药公司(LifecoreBiomedical)(明尼苏达州的查斯卡(Chaska,MN))。HA(Mw＝90kDa)由JNC公司(JNCCorporation)(日本东京(Tokyo,Japan))友情提供。(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG，>95％纯度)是从栗田工业株式会社(KuritaWaterIndustries)(日本东京)获得的。聚丙烯酸(PAA，Mw＝100kDa)、胱胺二盐酸盐、半胱胺盐酸盐、四硼酸钠、氯化钠(NaCl)、氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉(DMTMM)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(埃尔曼试剂)、以及L-半胱氨酸购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国的明尼苏达州(Minnesota,USA))。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)购自东京化成工业株式会社(TokyoChemicalIndustry)(日本东京)。丙酮酸钠(100mM溶液)是从英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州的卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))获得的。辣根过氧化物酶(HRP，190单位/毫克)购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries)(日本的大阪(Osaka,Japan))。过氧化氢(H2O2)是从兰开斯特公司(Lancaster)获得的。所有的其它化学品均是分析级的。
合成实施例1：
EGCG封端HA的合成
首先根据先前的报道在略作改动的情况下将HA(8kDa和17kDa)在还原端处用硫醇基修饰(Lee,H.；Lee,K.；Kim,I.K.；Park,T.G.Synthesis,characterization,andinvivodiagnosticapplicationsofhyaluronicacidimmobilizedgoldnanoprobes(透明质酸固定的金纳米探针的合成、表征以及体内诊断应用),Biomaterials29:4709-4718；2008)。通常，将HA(8kDa，500mg)和胱胺二盐酸盐(1.2g，10.6mmol)溶解在30mL的含有0.4MNaCl的0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)中。将反应混合物在25℃搅拌2小时。向这一溶液中缓慢地添加溶解在20mL0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)中的NaBH3CN(628mg，10mmol)。在搅拌同时将混合物在37℃孵育5天。然后，添加15mL的0.5MTCEP溶液(pH7)并且在25℃搅拌2小时以产生游离硫醇基。将所得混合物转移到具有1,000Da的截留分子量的透析管中。在氮气氛下将所述管针对0.1MNaCl溶液透析2天，针对25％乙醇透析1天，并且针对蒸馏水透析2天。将纯化的溶液冻干以获得硫醇末端修饰的HA。在冻干后，将最终产物在暗处保持在-20℃。通过埃尔曼测定，使用L-半胱氨酸作为标准测定HA中游离硫醇基的量(Ellman,G.L.,Acolorimetricmethodfordetermininglowconcentrationsofmercaptans(用于测定低硫醇浓度的比色法),ArchBiochemBiophys.74:443-50；1958)。HA的硫醇末端修饰的效率高于98％，如通过埃尔曼测定所确定。产率：93％。
对于缀合反应，将EGCG(440mg，0.96mmol)溶解在60mL的含有2mM丙酮酸钠的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)中。将硫醇末端修饰的HA(100mg，0.012mmol)溶解在10mL的含有2mM丙酮酸钠的PBS溶液中。然后，将所述溶液逐滴添加到经过搅拌的EGCG溶液中。将混合物在25℃搅拌4小时。将所得溶液转移到具有2,000Da的截留分子量的透析管中。将所述管针对经过氮气吹扫的蒸馏水进行充分透析。将纯化的溶液冻干以获得EGCG封端HA。通过1HNMR光谱法确认产物的结构。产率：93％。1HNMR(D2O):δ2.1(s,来自HA的-C＝OCH3),2.9-3.0(d,C环的H-4),3.3-4.0(m,HA的质子),4.45和4.55(d,HA端基质子),5.60-5.85(s,C环的H-2和H-3),6.1-6.3(s,A环的H-6和H-8),6.7(s,B环的H-6'),6.95(s,D环的H-2”和H-6”)。
合成实施例2：
EGCG接枝HA的合成：
通过将HA主链中的羧基用硫醇基修饰来合成具有不同的硫醇化度的硫醇化HA衍生物。通常，将1gHA(90kDa，2.5mmol-COOH)溶解在100mLPBS溶液(pH7.4)中。向这一溶液中添加1.037g(3.75mmol)DMTMM。然后添加溶解在10mLPBS溶液(pH7.4)中的胱胺二盐酸盐(844.5mg，3.75mmol)以引发缀合反应。将反应混合物在25℃搅拌24小时。然后，添加15mL的0.5MTCEP溶液(pH7)并且在25℃搅拌1小时以产生游离硫醇基。将溶液转移到具有3,500Da的截留分子量的透析管中。依次将所述管针对0.1MNaCl溶液透析2天，针对25％乙醇透析1天，并且针对蒸馏水透析2天。在氮气氛下进行所有透析。将纯化的溶液冻干以获得HA-半胱胺缀合物(0.87g)。取代度(DS)被定义为HA中每100个重复二糖单元的取代基数目。通过埃尔曼测定确定DS是8.4。
将干燥的HA-半胱胺缀合物(0.5g，105μmol-SH)溶解在70mLPBS溶液(pH7.4)中。向这一溶液中添加2.5mL的0.5MTCEP溶液(pH7)。在氮气氛下将EGCG(1.547g，3.375mmol)溶解在预混合的溶剂(23mL的0.1MPBS溶液(pH7.4)、5mL的DMSO、以及2mL的100mM丙酮酸钠)中。然后将此溶液加入至缀合物中，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。溶液。将反应混合物在25℃搅拌24小时。然后，通过添加10％乙酸使混合物的pH值达到6，之后将溶液转移到具有3,500Da的截留分子量的透析管中。在氮气氛下将所述管针对蒸馏水透析5天。将纯化的溶液冻干以获得EGCG接枝HA(0.48g)。通过测量EGCG在274nm的吸光度来确定DS。DS是11。通过1HNMR光谱法确认产物的结构。1HNMR(D2O):δ2.0(s,来自HA的-C＝OCH3),3.3-4.0(m,HA的质子),4.51和4.54(d,HA端基质子),5.60-5.85(s,C环的H-2和H-3),6.1-6.3(s,A环的H-6和H-8),6.7(s,B环的H-6'),6.98(s,D环的H-2”和H-6”)。
合成实施例3：
EGCG接枝PAA的合成
通过将PAA主链中的羧基用硫醇基修饰来合成具有不同的硫醇化度的硫醇化PAA衍生物。通常，将10gPAA(90kDa，138.8mmol-COOH)溶解在250mL的去离子水中。通过添加10MNaOH溶液使溶液的pH值达到5。向这一溶液中添加5.8g(21mmol)DMTMM。然后添加半胱胺二盐酸盐(2389mg，21mmol)以引发缀合反应。将反应混合物在25℃搅拌24小时。将溶液转移到具有3,500Da的截留分子量的透析管中。在氮气氛下将所述管针对0.1MNaCl溶液透析1天。然后，添加溶解在5mL水(pH5)中的TCEP(3g，10.5mmol)并且在25℃反应1小时以产生游离硫醇基。然后，将溶液转移到具有3,500Da的截留分子量的透析管中。依次将所述管针对0.1MNaCl溶液透析2天，针对25％乙醇透析1天，并且针对蒸馏水透析2天。在氮气氛下进行所有透析。将纯化的溶液冻干以获得PAA-半胱胺缀合物(8.7g)。取代度(DS)被定义为PAA中每100个重复单元的取代基数目。通过埃尔曼测定确定DS是1.4。
将干燥的PAA-半胱胺缀合物(0.5g，100μmol-SH)溶解在70mLPBS溶液(pH7.4)中。向这一溶液中添加1.5mL的0.5MTCEP溶液(pH7)。在氮气氛下将EGCG(1.547g，3.375mmol)溶解在预混合的溶剂(23mL的0.1MPBS溶液(pH7.4)、5mL的DMSO、以及2mL的100mM丙酮酸钠)中。然后将这一溶液添加到经过搅拌的PAA-半胱胺缀合物溶液中。通过添加10MNaOH溶液使混合物的pH值达到7.4。将反应混合物在25℃搅拌24小时。然后，通过添加10％乙酸使混合物的pH值达到6，之后将溶液转移到具有3,500Da的截留分子量的透析管中。在氮气氛下将所述管针对蒸馏水透析5天。将纯化的溶液冻干以获得EGCG接枝PAA(0.48g)。通过测量EGCG在274nm的吸光度来确定DS。DS是0.07。
合成实施例4：
HA-EGCG缀合物的表征
在HitachiU-2810分光光度计上测量HA-EGCG缀合物的UV-可见光谱。通过测量EGCG在274nm的吸光度来确定EGCG缀合的程度。使用装备有SpiritTMC18有机柱(5μm，4.6mm×250mm内径，AAPPTec公司)的Waters2695分离模块进行反相高效液相色谱(HPLC)。将EGCG和HA-EGCG缀合物以1mg/mL的浓度溶解在去离子水中。将样品用含1％乙酸的水和含1％乙酸的乙腈(6:4，v/v)的溶剂混合物以1.0毫升/分钟的流速在25℃洗脱。在280nm监测洗脱曲线。
合成实施例5：
经由自动氧化形成HA-EGCG水凝胶
通过在25℃将缀合物以22.5mg/mL的浓度溶解在蒸馏水中来制备HA-EGCG缀合物(90kDa)的原液。通常，将4mL原液用0.5mL的90mMPBS溶液(最终离子强度：0.16M，pH7.4)稀释以得到20mg/mL的最终HA-EGCG浓度。为了通过自动氧化形成HA-EGCG水凝胶，在37℃孵育270μL的HA-EGCG溶液(20mg/mL)。通过小瓶倾斜法确定胶凝时间。在翻转容纳水凝胶的小瓶后一分钟内没能观测到明显的流动运动时被视为凝胶状态。
合成实施例6：
通过HRP介导的交联反应形成HA-EGCG水凝胶
如上文所述在PBS溶液(最终离子强度：0.16M，pH7.4)中制备HA-EGCG溶液(20mg/mL)。为了产生水凝胶，将270μL的HA-EGCG溶液与3μL的具有不同浓度的HRP溶液混合(最终HRP浓度：0.15单位/毫升和0.16单位/毫升)。随后，以在0.68mM至1.14mM范围的最终浓度添加3μL的H2O2溶液，并且通过平缓涡旋混合均匀混合。在37℃继续进行胶凝。通过小瓶倾斜法确定胶凝时间。在翻转容纳水凝胶的小瓶后一分钟内没能观测到明显的流动运动时被视为凝胶状态。
HA-EGCG水凝胶的流变学表征：对于流变学表征，将270μL的HA-EGCG溶液(20mg/mL)与3μL的具有不同浓度的HRP溶液混合(最终HRP浓度：0.15单位/毫升和0.16单位/毫升)。随后，以在0.68mM至1.14mM范围的最终浓度添加3μL的H2O2溶液。立即将混合物涡旋混合并且将其中210μL施加到HAKKERheoscope1流变仪(德国的卡尔斯鲁厄(Karlsruhe,Germany))的底板上。在37℃，以动态振荡模式，用1％的恒定变形和1Hz的频率，使用3.5cm直径和0.949°锥角的锥板几何形状进行流变学测量。随时间的变化监测储能模量(G')和损耗模量(G”)的演变。进行测量直到G'达到平台为止。将G'和G"发生交叉的时间记录为凝胶点。
HA-EGCG水凝胶和HA-酪胺水凝胶的酶促降解：对于降解分析，将270μL的HA-EGCG溶液(20mg/mL)与3μL的HRP和H2O2溶液中的每一种混合。用于形成HA-EGCG水凝胶的HRP和H2O2的最终浓度分别是0.16单位/毫升和1.14mM。立即将混合物涡旋混合，并且将其中210μL注射到被夹在一起而具有1.5mm间距的两个平行的玻璃板之间。在37℃在轨道振荡器上以50rpm使胶凝进行2小时。为了比较，根据先前所报道的方法制备具有1kPa的储能模量的HA-酪胺水凝胶(Lee,F.；Chung,J.E.；Kurisawa,M.Aninjectableenzymaticallycrosslinkedhyaluronicacid-tyraminehydrogelsystemwithindependenttuningofmechanicalstrengthandgelationrate(具有机械强度和胶凝速率的独立调整的可注射的酶促交联的透明质酸-酪胺水凝胶系统),SoftMatter4,880-887；2008)。将HA-EGCG水凝胶和HA-酪胺水凝胶浸泡在20mL的含有125单位/毫升的牛睾丸透明质酸酶的PBS溶液(pH7.4)中，然后在37℃在振荡孵育箱中孵育。在所示的时间点，将水凝胶从溶液中取出并且称出。根据以下方程式由水凝胶的初始重量以及在降解后的剩余重量确定归一化的凝胶重量：归一化的凝胶重量＝Wt/W0，其中W0是水凝胶的初始重量并且Wt是水凝胶在降解后的剩余重量。
应用
所公开的类黄酮-聚合物缀合物提高了类黄酮的生物利用率和稳定性。
有利的是，它们可以用于使得类黄酮可用于需要更长的分子寿命以使它在生物医药应用中具有有效性的应用中。
更有利的是，可以容易地由所述类黄酮-聚合物缀合物形成水凝胶。这些水凝胶可以具有生物医药应用。
这些应用领域包括制备用于组织覆盖物的非粘性膜以及可注射的凝胶。可以被提到的典型的应用是粘性补充剂或真皮填充物。
进一步有利的是，所述凝胶可以根据用于制备它们的本发明的方法和所述缀合物而变化。因此，本发明开拓了其中需要不同特征的一类新的应用。
将显而易见的是，本发明的各种其它改动方案和改进方案对于本领域技术人员在阅读了上述公开内容之后将是显而易见的，而不脱离本发明的精神和范围，并且所有这些改动方案和改进方案意图落入所附权利要求书的范围内。

Claims (41)

1.一种聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。
2.根据权利要求1所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物选自由多糖、多核苷酸、多肽、合成聚合物以及其混合物组成的组。
3.根据权利要求2所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述多糖选自由以下各项组成的组：透明质酸、葡聚糖、纤维素、直链淀粉、淀粉、明胶、藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、环糊精、硫酸葡聚糖、水溶性聚蔗糖、胶凝糖、瓜尔胶、果胶、聚蔗糖、支链淀粉、硬葡聚糖、黄原胶以及木葡聚糖。
4.根据权利要求2所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述多核苷酸选自由以下各项组成的组：适体、DNA、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、肽核酸(PNA)以及小发夹RNA(shRNA)。
5.根据权利要求2所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述多肽选自由以下各项组成的组：蛋白质、抗体、抗体片段、适体样肽、肽以及聚氨基酸。
6.根据权利要求2所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述合成聚合物包含选自由以下各项组成的组的单体：烯烃、醚、羧酸、亚胺、酰胺、胺、酐、碳酸酯、酯、原酸酯以及聚氨酯。
7.根据权利要求6所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述合成聚合物选自由以下各项组成的组：聚丙烯酸、聚(丙烯酰胺)、聚(烯丙胺)、聚酐、聚(β-氨基酯)、聚(丁二酸丁二醇酯)、聚己内酯、聚碳酸酯、聚二烷酮、聚乙烯亚胺、聚(甘油)、聚乙醇酸、聚(3-羟基丙酸)、聚(N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乳酸、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(原酸酯)、聚(2-唑啉)、聚(癸二酸)、聚(对苯二甲酸酯-共聚-磷酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)以及其组合。
8.根据权利要求2所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物选自聚丙烯酸或透明质酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述类黄酮选自由黄酮、异黄酮、黄烷、原花色素和花色素以及其混合物组成的组。
10.根据权利要求9所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述黄烷选自由以下各项组成的组：(-)-表儿茶素、(+)-表儿茶素、(-)-儿茶素、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素没食子酸酯、(+)-表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、非瑟酮醇、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、牧豆树醇(mesquitol)和刺槐亭醇(Robinetinidol)、鞣花单宁、没食子单宁、乌龙茶氨酸、褐藻单宁、单宁、茶柠檬素(theacitrin)、茶二苯并托酚酮(theanaphthoquinone)、茶黄素、茶萘醌、茶红素、聚酯型儿茶素以及其混合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述硫醇接头进一步衍生自与所述聚合物结合的硫醇部分，其中所述硫醇部分选自由以下各项组成的组：酰胺、胺、烷基、烯基、芳基、酯、碳酸酯、醚、酰胺基、酰胺基酯、氨基甲酸酯以及缩醛基。
12.根据权利要求11所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述酰胺、胺或烷基具有1个至10个碳原子。
13.根据权利要求11所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述烯基具有2个至10个碳原子。
14.根据权利要求11所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述芳基具有6个至10个碳原子。
15.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物或类黄酮进一步与治疗剂结合或缀合，或含有治疗剂。
16.根据权利要求15所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述治疗剂选自由小分子药物和纳米药物组成的组。
17.根据权利要求15所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述纳米药物选自由聚合物胶束、脂质体以及树枝状聚合物组成的组。
18.根据权利要求1所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物-类黄酮缀合物是透明质酸-EGCG缀合物，所述透明质酸-EGCG缀合物选自由以下各项组成的组：
式(I)；和
式(II)
其中：
每一个n独立地是0至15,000的整数，包括端值在内；并且每一个m独立地是1至15,000的整数，包括端值在内。
19.根据权利要求18所述的聚合物-类黄酮缀合物，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为所述式(I)或式(II)的缀合物，并且具有0.01％至100％的缀合度。
20.一种用于形成聚合物-类黄酮缀合物的方法，所述方法包括在碱性条件下经由亲核加成使所述类黄酮与所述聚合物缀合的步骤，其中所述聚合物已经被游离硫醇基修饰。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
a)在还原剂存在下使含有硫醇或二硫化物的化合物与所述聚合物连接；以及
b)使所述含有二硫化物的化合物在二硫键处裂解，从而形成带有末端硫醇基的所述聚合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述还原剂选自由以下各项组成的组：氰基硼氢化钠、硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠以及氢化铝锂。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中以1小时至24小时的反应时间进行所述缀合步骤。
24.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括在偶联剂存在下使含有硫醇或二硫化物的化合物与所述聚合物偶联的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述偶联剂选自由以下各项组成的组：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、1-乙基-3-(3-二甲基二环己基碳二亚胺(DCC)盐酸盐、二异丙基碳二亚胺(DIC)、羰基二咪唑、二亚胺代己二酸二甲酯、N-羟基丁二酰亚胺、氯甲酸对硝基苯酯以及1-(对甲苯磺酰基)咪唑。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述偶联剂选自2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉(DMTMM)。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述亲核加成中添加清除剂的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述清除剂选自由丙酮酸钠和超氧化物歧化酶组成的组。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述亲核加成中的所述碱性条件是在约7.0至10.0的pH值范围内。
30.一种从聚合物-类黄酮缀合物获得的水凝胶，其中所述聚合物经由硫醇接头与所述类黄酮缀合。
31.根据权利要求30所述的水凝胶，其中所述聚合物-类黄酮缀合物为所述式(II)的聚合物-类黄酮缀合物，并且具有0.01％至100％的缀合度。
32.一种用于形成水凝胶的方法，所述方法包括在碱性条件下经由自动氧化使根据权利要求1至19中任一项所述的聚合物-类黄酮缀合物交联的步骤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述交联步骤进一步包括在氧化剂存在下添加酶的步骤。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述酶是过氧化物酶。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述过氧化物酶选自由以下各项组成的组：辣根过氧化物酶、人类髓过氧化物酶、乳过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、前列腺素H合酶、大豆过氧化物酶、氯化血红素、血红素以及微过氧化物酶-11。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述氧化剂是过氧化物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述过氧化物是过氧化氢。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中以约2分钟至45小时的反应时间进行所述交联步骤。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中在选自约35℃至39℃范围的温度进行所述交联步骤。
40.根据权利要求30或31所述的水凝胶用于制备生物医药产品的用途。
41.根据权利要求40所述的水凝胶的用途，其中所述生物医药产品是粘性补充剂、抗粘连膜或皮肤填充物。
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