KR20190050416A

KR20190050416A - miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용한 연골손상 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190050416A
Application number: KR1020170145800A
Authority: KR
Inventors: 강길선; 국연지; 전경문; 송정은
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2019-05-13

Abstract

본 발명은 miRNA-140-5p이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용한 연골손상 치료용 조성물에 관한 것으로서, 골수유래 줄기세포를 연골세포로 분화시켜, 부족한 연골세포원을 공급할 수 있는 miRNA-140-5p이 함유된 새로운 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용하여 손상된 연골의 재생과 골관절염 치료에 적용할 수 있는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 연골에서 특이적으로 발현되고 연골 세포 분화, ECM 분해 및 세포 내 분화에 관여하여 골수유래 줄기세포의 연골세포로의 분화 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골손상 치료용 주사제로써 적합하다. 또한, 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다. 또한, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

Description

miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용한 연골손상 치료용 조성물{Composition for Gellan-gum Hydrogels Containing miRNA-140-5p and Composition for treatment of Cartilage Regeneration using it}

본 발명은 miRNA-140-5p이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용한 연골손상 치료용 조성물에 관한 것으로서, 골수유래 줄기세포를 연골세포로 분화시켜, 부족한 연골세포원을 공급할 수 있는 miRNA-140-5p이 함유된 새로운 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용하여 손상된 연골의 재생과 골관절염 치료에 적용할 수 있는 연골손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

연령 관련 관절 질환인 골관절염 (Osteoarthritis, OA)은 현재 유효한 질병 치료제가 없으며, 원인 역시 완전히 밝혀지지 않았다. 골관절염을 일으키는 원인으로는 연골 세포 수의 감소와 연골 세포 외 기질 (ECM)의 분해 등이 있다고 알려져 있다. 연골을 형성하는 연골 세포는 중간엽 전구 세포로부터 유래한다. 배아 발달 동안, 중간엽 전구 세포가 증식하고, 중간엽 축합에서 응집 한 다음 연골 세포로 분화하여, 추후 뼈와 연골을 위한 연골 주형을 형성한다. 연골 세포는 연골 기질을 생성하기 위해, II 형 콜라겐 및 아그리칸(Aggrecan)과 같은 독특한 세포 외 기질 (ECM) 단백질을 분비한다.

현재 연골이 손상되었을 경우 치료 방법에는 손상된 정도에 따라 여러 가지 방법이 사용되고 있다. 대표적인 치료 방법으로는 자가 연골 세포이식술, 골수의 줄기세포를 이용한 골수 자극술, 성체줄기세포와 배아줄기세포를 이용한 연골재생 치료법, 손상된 부위에 미세 구멍을 뚫어 골수세포를 흘러나오게 하여 손상된 부위를 치료하게 하는 미세 골절술 등이 있다. [Z. Lin, C. Willers, J. Xu, and M. H Zheng, Tissue Eng., 12, 1971 (2006)]

그러나 상기에 언급한 연골 손상 치료법들은 까다로운 수술방법을 요구하고, 치료과정 중 여러 문제점이 발생한다는 단점이 있다. 따라서 이러한 여러 단점들을 개선하면서 효과적인 치료를 할 수 있는 조직 공학적 방법들이 제기되고 있다.

조직공학에서 사용되는 생체재료로써 연골재생 재료로는 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 젤란검 등이 있다. 그 중 젤란검(gellan gum, GG)은, 글루콘산, 람노오스, 그리고 포도당(1:1:2)이 규칙적으로 배열된 복합다당류로, 무취, 무색, 내열성, 그리고 내효소성 등이 우수하다. 또한, 이온 첨가 및 pH 조절 등을 통해 하이드로겔의 기계적 물성을 조절할 수 있으며, 세포 독성 또한 없어 생체 재료로 다양하게 연구되고 있다.(J. T. Oliveira, L. Martins, R. Picciochi, I. B. Malafaya, R. A. Sousa, N. M. Neves, J. F. Mano and R. L. Reis, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 93A, 852 (2010)).

마이크로 RNA (miRNA)는 전령 RNA (mRNA)의 3'-비 번역 영역에서 특정 서열에 결합하여, 유전자 발현을 조절할 수 있는 약 22 개의 뉴클레오티드를 포함하는 진화론적으로 보존된 단일 가닥의 비 암호화 RNA 분자로, 포유류 miRNA는 조직 특이적 또는 발달 단계별 발현 패턴을 나타내며 세포 분화, 종양 형성 및 면역 반응을 포함한 다양한 생물학적 과정과 관련되어있다. 이전의 연구들은 또한 OA 관절염의 비정상적인 유전자 발현 패턴에 기여할 수 있는 인간 골관절염 (Oliopoulos et al., 2008; Miyaki et al., 2009)의 miR-140 발현이 감소 된 것을 발견했다. (Iliopoulos D, Malizos KN, Oikonomou P, Tsezou A PLoS One. 3, 11, e3740, (2008))

miRNA-140-5p (이하 miRNA-140)는 연골에서 특이적으로 발현되고 연골 세포 분화, ECM 분해 및 세포 내 분화에 관여하는 것으로 나타났다. 최근 연구에 의하면 마우스와 사람의 OA에서 miRNA-140 발현에 연골 특이적 상관관계가 밝혀졌다. (Miyaki S, Sato T, Inoue A, Otsuki S, Ito Y, Yokoyama S, Genes Dev. 24, 117385 (2010)).

이와 관련된 종래 기술로서 미국특허공개 제2015-0231274호, WO 2015-174934 A9, WO 2015-034436 A1 등에서는 miRNA를 다당류와 결합하여 연골과 관련된 치료에 적용하는 기술이 제안되어 있다.

그러나 상기와 같은 다당류에 관한 기술이나 miRNA의 연골손상 치료 효과에 대한 연구는 있지만, 실질적으로 이를 연골 재생치료에 적용할 수 있는 제제는 제안되지 못하고 이론적 연구만 제안되어 있을 뿐이다.

이와 같이, 상기에 언급된 miRNA-140-5p 이용하여 연골재생 치료를 위한 실효성이 있는 제제에 관한 연구가 중요한데, 아직까지 연골손상 치료에 용이하게 적용할 수 있는 조성물에 관한 연구가 제대로 이루어지지 않고 효과적인 접근이 이루어지지 못하고 있는 실정이다.

미국특허공개 제2015-0231274호 WO 2015-174934 A9 WO 2015-034436 A1

J. T. Oliveira, L. Martins, R. Picciochi, I. B. Malafaya, R. A. Sousa, N. M. Neves, J. F. Mano and R. L. Reis, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 93A, 852 (2010) Oliopoulos et al., 2008; Miyaki et al., 2009)의 miR-140 발현이 감소 된 것을 발견했다. (Iliopoulos D, Malizos KN, Oikonomou P, Tsezou A PLoS One. 3, 11, e3740, (2008) Iliopoulos D, Malizos KN, Oikonomou P, Tsezou A PLoS One. 3, 11, e3740, (2008) Miyaki S, Sato T, Inoue A, Otsuki S, Ito Y, Yokoyama S, Genes Dev. 24, 117385 (2010)

상기와 같은 종래 기술에서 해결하지 못한 문제를 개선하기 위해, 본 발명은 수술부위를 최소화하기 위해 수술부위의 절개 없이 손상부위의 국소적인 주사만으로 연골재생 및 골관절염 치료를 위한 새로운 조성물의 개발을 해결과제로 한다.

본 발명자들은 과제해결을 위해 오랫동안 연구 검토한 결과, 골관절염 치료를 위한 miRNA-140-5p을 함유한 젤란검 하이드로겔을 개발하여 실용 가능한 연골 재생 효과가 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 골관절염뿐만 아니라 손상된 연골부위의 치료를 위해 연골 세포 분화, ECM 분해 및 세포 내 분화에 관여하여 연골재생효과가 있는 miRNA-140-5p를 함유한 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 인체의 관절부위에 직접 주입하여 적용할 수 있는 miRNA-140-5p를 함유한 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물을 이용한 연골재생과 골관절염 치료를 위한 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miRNA-140-5p를 함유한 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물을 포함하는 연골재생과 골관절염 치료 및 예방을 위한 조성물이 함유된 의료용 키트를 제공하는데 있다.

위와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 젤란검에 miRNA-140-5p가 함유된 하이드로겔 형태로 이루어진 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 miRNA-140-5p 함유한 세포를 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 연골손상 치료용 조성물을 유효성분으로 함유하는 주사용 관절염 치료제 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 miRNA-140-5p를 함유하는 젤란검 하이드로겔 조성물의 장점 및 효과를 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 하이드로겔 조성물은 골수유래 줄기세포의 연골세포로의 분화능력이 있는 miRNA-140-5p 효과와 더불어, 젤란검 특유의 생체에 적합한 천연고분자 재료를 선택적으로 결합하여 이용함으로써 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다. 그러므로 안전하고 우수한 상승효과를 발현하는 연골재생 및 골관절염 치료제로 사용할 수 있다.

(ii) 본 발명에서는 miRNA-140-5p를 함유한 젤란검(Gellan-gum) 하이드로겔 조성물을 간단한 제조 방법으로 제조하여 인체 주입용 주사제로 간편하게 사용 가능하도록 하는 조성물을 제공할 수 있어서 관절염 치료제로서 적용성이 매우 용이한 효과가 있다.

(iii) 본 발명에 따르면 조직공학적 주입형 하이드로겔을 제작함으로써, 수술 부위의 최소화 및 수술 시간 단축, 수술 후 신속한 치료가 가능하도록 하는 우수한 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따라 제조되는 miRNA-140-5p가 함유된 세포를 배합한 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 지지체 사진과 miRNA-140-5p가 함유된 세포를 배합하지 않은 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 지지체 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 젤란검 하이드로겔 조성물을 동결건조 시킨 후 지지체 표면의 거침도와 다공을 확인하기 위해 촬영한 SEM 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 젤란검 수용액에 miRNA-140-5p를 함유한 골수 줄기세포를 파종 후 굳힌 후 3일 뒤에 세포에 형질감염된 miRAN 효율을 Fam siRNA negative control로 확인한 사진이다.
도 4는 젤란검 하이드로겔 조성물에 각각 골수유래줄기세포, miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 날짜별(1, 3, 5, 7day)로 동결건조시킨 후 세포의 모폴로지를 확인한 사진이다.
도 5는 젤란검 하이드로겔 조성물에 각각 골수유래줄기세포, miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 날짜별(1,3,5,7day)로 세포의 증식을 분석한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 세포배양플레이트에 골수유래줄기세포와 miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 시간별(12, 24 hour)로 골수유래줄기세포와 연골세포들의 Sox9, Aggrecan, Col Ⅱ의 유전자 발현을 GAPDH로 일반화하여 정량화시킨 그래프이다.
도 7a는 본 발명에 따라 젤란검 하이드로겔 조성물에 골수유래줄기세포와 miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 젤란검 수용액과 균일하게 섞은 후 각 날짜별(1, 3day)로 골수유래줄기세포와 연골세포들의 유전자 발현을 전기영동한 후 밴드 사진이다.
7b는 전기영동결과를 GAPDH로 일반화하여 정량화시킨 그래프로서, SOX9, Aggrecan, Col Ⅱ 의 표현형에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 아직 연구가 미약한 관절염, 연골 재생을 위하여, 생체적합성이 뛰어난 젤란검과 연골 분화에 관여하는 miRNA-140-5p와 젤란검 수용액의 배합을 통해 하이드로겔 조성물로 제조하여 연골 손상 치료용 조성물로 사용하는 것에 관한 발명을 제공한다.

본 발명은 기존의 골관절염 치료에 대한 패러다임을 바꾸어서 기존 골관절염 수술법과는 다르게 추가적인 재수술, 부작용, 수술범위를 최소화하는 방법의 치료법을 발명하고자 노력하였다. 그 결과, 생체 적합하고, 연골 세포증식이 뛰어나면서 기능유지가 효과적인 생체재료를 사용하여, 손상된 연골부위를 효과적으로 재생시킬 수 있는 주입 가능한 하이드로겔을 제조하였다.

본 발명은 바람직한 조성으로서, 근본적으로는 젤란검을 주성분으로 하고, 여기에 miRNA-140-5p을 함유한 구성을 특징으로 한다.

본 발명은 바람직한 구현예에 따르면, 젤란검에 함유되는 miRNA-140-5p는 miRNA-140-5p를 함유한 세포가 보조성분으로 혼합된 구성으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 본 발명에서 주성분으로 사용되는 젤란검은 하이드로겔로 제조할 시 높은 탄성률을 가지고, 가교 방법이나 함량에 따라 기계적 특성을 조절할 수 있다. 젤란검 하이드로겔은 온도가 특정온도 이하로 내려가면 2차 코일 헬릭스 구조를 이루어 겔화 된다. 젤란검은 낮은 독성률과 가공이 쉽게 ?문에 miRNA-140-5p을 함유한 세포와 혼합하여 하이드로겔을 제조하면, 외과적 수술을 하지 않고 인체 내 주입가능한 주사식 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, miRNA-140-5p는 연골에서 특이적으로 발현되고 연골 세포 분화, ECM 분해 및 세포 내 분화에 관여하는 것으로 나타났다. 그러므로 본 발명에 따르면, miRNA-140-5p를 함유하는 젤란검 하이드로겔을 관절염 부위에 주사하였을 경우 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예로서는, 연골 세포 분화, ECM 분해 및 세포 내 분화에 관여하는 miRNA-140-5p을 함유한 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 이러한 하이드로겔 형태의 조성물은 연골손상 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 젤란검 하이드로겔의 농도는 1-3 중량%, 더욱 좋기로는 1-2중량%인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용하는 젤란검 하이드로겔은 순수 젤란검 가루에 물, 바람직하게는 3차 증류수를 혼합하고 예컨대 CaCl₂로 가교한 하이드로겔로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔에 miRNA-140-5p에 형질 감염된 골수유래줄기세포를 첨가하여 균일하게 혼합하게 되면, miRNA-140-5p를 함유한 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, miRNA-140-5p의 농도는 세포 배양플라스크에 담긴 미디엄 7ml에 대해 10-50pmol, 더욱 바람직하게는 25-40pmol 인 것이 바람직하다. 만일, 그 함량이 너무 낮으면 첨가 효과가 없고, 너무 높으면 낭비되는 양이 많으므로 바람직하지 않다.

본 발명은 miRNA-140-5p에 형질감염된 골수유래 줄기세포를 준비하는 단계;

상기 골수유래 줄기세포의 양을 1×10 으로 한 세포 현탁액을 준비하는 단계;

상기 세포 현탁액에 200-300 μl의 미디엄을 희석하여 젤란검 수용액에 혼합하요 혼합물을 얻는 단계;

상기 혼합물을 굳혀서 miRNA-140-5p에 형질 감염된 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔를 제조하는 단계

를 포함하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물의 제조방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, miRNA-140-5p에 형질감염된 골수유래 줄기세포의 양은 1×10 의 세포 현탁액에 200-300 μl의 미디엄을 희석하여 젤란검 수용액에 혼합한 후 상온에 굳힌 형태로 하여, miRNA-140-5p에 형질 감염된 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, miRNA-140-5p를 함유하는 세포를 얻기 위해서는 골수유래줄기세포에 miRNA-140-5p를 1-2일, 보통은 하루 동안 트랜스팩션 시킨 후 예컨대, Trypsine을 이용하여 세포를 떼어 낸 후 젤란검 수용액 중량 대비 5-30, 더욱 바람직하게는 5-15%의 미디엄이 첨가된 세포현탁액에 섞는 과정을 거칠 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물에는 첨가제로서 예컨대 콜라겐 또는 성장인자인 TGF-β1, BMPs, Dexamethasone 등이 하나 이상 첨가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 하이드로겔 조성물은 예컨대 무릎 연골 손상부위에 적용하는 경우 주사제로 이용하여 곧바로 치료 주위에 주입 가능한 제형일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 투여 제형의 예로서는 miRNA-140-5p를 함유한 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 조성물이 충전된 주사용 관절염 치료제 키트로 제조될 수 있다.

그러므로 본 발명의 하이드겔 형태의 연골 손상 치료용 조성물은 그 사용이 기존에 비해 현저하게 편리한 효과가 있다.

그러므로 본 발명은 상기와 같은 miRNA-140-5p 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 연골 분화 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 매우 적합하다. 이러한 결과는 본 발명에 따라 특정 세포인 miRNA-140-5p 함유 세포와 특정 다당류인 젤란검의 선택적 결합으로 인해 나타나는 상승효과에 기인한 것으로 보인다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 사용하는 경우 기존에 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 자가 연골세포 이식술에서 생기는 방법으로 치료하던 방법에서 나타나는 여러 가지 단점을 최소화할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물은 주사에 적당한 기계적 강도를 가짐으로써 주입 가능한 주사용 관절염 치료제로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 연골 손상 부위에 주사하는 경우 예컨대, miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물은 주사제로 적용 가능하다,

따라서 본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miRNA-140-5p을 함유한 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물을 제조하기 위해서는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.

우선 알맞은 세포배양액에 배양시킨 골수유래줄기세포와 miRNA-140-5p를 줄기세포에 형질 감염시키 위한 lipofectamin과 miRNA-140-5p mimic을 준비한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 골수유래줄기세포에 miRNA-140-5p를를 형질감염 시키는 단계에서는 miRNA-140-5p이 저온으로 유지된 상태에서 사용하고, 골수유래줄기세포는 세포배양 플라스크가 60-80%채워졌을 때 miRNA-140-5p을 형질 감염시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 젤란검 수용액을 제조하고 가열하는 단계를 거친다. 바람직하게는 젤란검 파우더를 90-100℃의 온도로 가열한 증류수에 넣고 교반 하에 20-30분 가열하여 젤란검 수용액을 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 가열된 젤란검 수용액을 35-45℃로 식힌 다음 여기에 상기 miRNA-140-5p로 형질 감염된 골수유래줄기세포를 가하고 혼합하는 단계를 거칠 수 있다.

miRNA-140-5p는 저분자 물질로 세포에 형질 감염시킨 후 대체로 1일 내지 3일 경과 후에는 서서히 분해되기 때문에 젤란검 하이드로겔에서 miRNA-140-5p의 분해시간이 늦춰져 장기적인 연골분화 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물은 주사형태로 주입하는 경우 연골손상 부위에 따라 0.1~1ml의 범위 내에서 그 투여량을 조절할 수 있다. 바람직하게는 체중 60Kg 중량의 성인 기준으로 무릎관절염 환자에 대해 0.1~1ml의 범위 내에서 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 투여용 조성물은 연골 손상 정도 및 재생 정도에 따라 주 또는 월 단위로, 반복 투여가 가능하다.

본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 연골세포로로의 분화를 돕는 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다.

또한, 본 발명에 따르면 이러한 연골손상 치료용 조성물을 적용하는 경우 특별한 독성이나 부작용은 없다.

특히, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, miRNA-140-5p를 함유한 세포를 배합한 젤란검 구성물은 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해되어 몸에 흡수되기 때문에 다른 재료보다 생체 적합한 장점을 가진다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 자세히 설명하겠는바, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 : 무릎 연골세포 채취 및 배양

연골세포는 6주된 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼(Hanil laboratory animal center, Wanju, Korea)의 무릎 연골에서 분리하여 채취하였다. 채취한 무릎 연골은 바로 인산완충용액(PBS, pH 7.4, Gibco, NY, USA)으로 3번 이상 세척한 후, 1 ㎟이하의 크기로 잘게 썰고, PBS에 넣은 후 12000 rpm에서 3분간 원심분리 시킨다. 잘게 썬 연골을 0.25 wt%의 콜라게네이즈 A형(Roche, Applied Science, Germany)용액으로 24시간 동안 인큐베이터(37 ℃ 5 % CO₂)에서 조직을 용해시켰다.

용해가 완료된 조직을 재 원심분리하여 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM, Gibco)과 F-12 영양배지 혼합액(Ham's F-12, Gibco), 10 % 우태아혈청(FBS, Gibco) 및 1 % 항생제(100 units/mL 페니실린과 100 ㎍/mL 스트랩토마이신)와 200 mM L-글루타민(Gibco), 50 ㎍/mL 아스코르빈산(Sigma), 15 mM HEPES buffer 1 M(Gibco)로 혼합된 배양액을 사용하여 세포배양 플라스크에 분주하고 37 ℃ 5 % CO₂ 조건하에 배양하였다.

제조예 2 : 골수유래줄기세포 분리 및 배양

골수유래줄기세포는 6주된 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼(Hanil laboratory animal center, Wanju, Korea)의 다리뼈에서 분리하여 추출하였다. 추출한 골수유래줄기세포는 바로 인산완충용액(PBS, pH 7.4, Gibco, NY, USA)으로 3번 이상 세척하였다. 그리고 90 ㎛의 나일론 매쉬로 거른 다음 원심분리하여 alpha-minimum essential culture medium (α-MEM) (Lonza, Walkersville, MD, USA) 과 20 % 우태아혈청(FBS, Gibco) 및 1 % 항생제(100 units/mL 페니실린으로 혼합된 배양액을 사용하여 세포배양 플라스크에 분주하고 37 ℃ 5 % CO₂ 조건하에 배양하였다. 5일 이 지난 후 세포배양 플라스크에 떠다니는 부유물을 세척해 준 후 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

실시예 1: miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔의 제조

골수유래줄기배양 플라스크에 세포가 40-70%차면 세포에 Lipofectamin과 miRNA-140-5p을 1:1비율로 섞은 후 세포배양 플라스크디쉬에 담긴 미디엄의 10%정도로 뿌려준 후 24시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에 배양한다. 24시간 후 Trypsine을 사용하여 세포를 떼어내고, 대조군으로 연골세포 배양플라스크에서 Trypsine을 사용하여 세포를 떼어낸다.

90℃로 가열된 증류수(80ml)에 1wt% 젤란검(Sigma)(0.8g)을 넣고 교반시키며 20분간 가열한다. 젤란검 파우더가 완전히 녹으면 0.03% 염화칼슘(0.03g)을 넣고 10분간 용해시킨다. 젤란검 수용액을 37-40℃까지 낮춘후 떼어놓은 세포들에 미디엄을 300μl를 넣어준 후 젤란검 수용액과 골수 중간엽 세포, miRNA-140-5p로 형질 감염된 세포, 연골 세포를 각각 젤란검 수용액과 섞은 후 페트리 디쉬에 붓고 상온에서 굳힌다. 굳은 겔을 바이옥시 펀지를 이용해 지름 6mm, 두께 3mm로 자른다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 제조방법에 따라 제조된 젤란검 하이드로겔의 지지체 사진이다.

도 1에서는 상기와 같이 제조된 miRNA-140-5p가 함유된 세포를 배합한 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 지지체 사진과 miRNA-140-5p가 함유된 세포를 배합하지 않은 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 지지체를 비교하여 보여주고 있다.

실험예 1: 지지체의 모폴로지 확인

제작된 1 wt% 젤란검 하이드로겔의 다공 및 지지체의 표면 거침도를 확인하기 위해 SEM 관찰을 실시하였다. 먼저 하이드로겔을 동결건조 시킨 후 스펀지 상태에서 모폴로지를 확인한 결과, 지지체의 다공 크기는 125-201μm였다. 각 지지체에 대한 SEM 관찰 사진은 도 2에 나타내었다.

도 2에서는 상기에 따라 제조된 젤란검 하이드로겔 조성물을 동결건조 시킨 후 지지체 표면의 거침도와 다공을 확인할 수 있다.

실험예 2: miRNA-140-5p의 세포 주입 효율 확인

토끼의 골수유래줄기세포의 miRNA-140-5p 형질감염의 효율을 확인하기 위해 Fam siRNA negative control을 이용해 miRNA-140-5p이 함유된 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔의 제조방법과 같이 토끼의 골수유래줄기세포에 siRNA를 형질감염시킨 후 Confocal microscopy로 효율을 확인하였다. 초록색의 부분은 세포에 주입된 siRNA가 형광으로 나타난 것을 확인하였고, 파란색은 DAPI염색한 토끼 골수유래 줄기세포의 핵이다.

도 3은 본 발명에 따라 제조된 젤란검 수용액에 토끼 골수유래 줄기세포에 miRNA-140-5p를 주입한 후 세포에 주입된 miRNA-140-5p의 효율을 확인한 실험결과이다.

여기서는 상기 제조된 젤란검 수용액에 miRNA-140-5p를 함유한 골수 줄기세포를 파종 후 굳힌 후 3일 뒤에 세포에 형질감염된 miRAN 효율을 Fam siRNA negative control로 확인한 사진을 도시하고 있다.

실험예 3: 세포의 모폴로지 확인

제작된 하이드로겔 지지체를 동결건조 시킨 후 SEM을 이용해 지지체 표면 다공을 관찰하였다. 토끼 골수 골수유래 줄기세포와 연골세포를 채취한 후 지지체에서 3, 7, 14일 동안 배양하고, 2.5 % 글루타알데하이드를 이용해 고정한 후, 연골세포의 모폴로지를 확인하였다. 골수유래 줄기세포군, miRNA-140-5p가 함유된 골수유래 줄기세포군, 연골세포군에서 세포의 증식은 큰 차이가 없는 것을 확인 할 수 있었으며, 세포외 기질은 세가지 군 모두 형성된 것을 확인하였다.

도 4는 본 발명에 따라 제조된 젤란검 수용액과 토끼 연골세포를 섞은 후 각각 3, 7, 14일 뒤에 SEM을 통해 확인한 사진이다.

도 4에서는 젤란검 하이드로겔 조성물에 각각 골수유래줄기세포, miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 날짜별(1, 3, 5, 7day)로 동결건조 시킨 후에 대한 세포의 모폴로지를 확인할 수 있다.

실험예 4: 세포의 증식률 평가

하이드로겔 지지체에서 골수유래 줄기세포, miRNA-140-5p가 함유된 골수유래 줄기세포, 연골세포의 증식률을 알아보고자 MTT(디메틸치아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 분석법을 시행한 결과, 시간이 지날수록 증식률이 큰 차이 없음을 확인 할 수 있었다.

도 5는 본 발명에 따라 제조된 젤란검 하이드로겔 지지체에 파종된 골수유래 줄기세포, miRNA-140-5p가 함유된 골수유래 줄기세포, 연골세포의 증식률을 확인한 그래프이다.

도 5에서는 상기 제조한 젤란검 하이드로겔 조성물에 각각 골수유래줄기세포, miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 날짜별(1,3,5,7day)로 세포의 증식을확인할 수 있다.

실험예 5: 세포배양 플라스크에서 유전자 발현 분석

골수유래 줄기세포, miRNA-140-5p가 함유된 골수유래 줄기세포, 연골세포를 배양 12시간 24시간 뒤 유전자 표현형을 비교하였다. 어그리칸과 제 II형 콜라겐과 같은 ECM-연관 유전자 발현결과에 따르면miRNA-140-5p이 함유된 골수유래 줄기세포에서 발현이 가장 높게 된 것을 확인하였다.

도 6는 본 발명에 따라 세포배양 플라스크에 토끼 골수유래 줄기세포, miRNA-140-5p이 함유된 골수유래 줄기세포, 연골세포의 연골 관련 마커 유전자 발현도를 전기영동으로로 확인 한 후 분석한 그래프이다.

도 6에서는 세포배양플레이트에 골수유래줄기세포와 miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 파종 후 시간별(12, 24 hour)로 골수유래줄기세포와 연골세포들의 Sox9, Aggrecan, Col Ⅱ의 유전자 발현을 GAPDH로 일반화하여 정량화시킨 결과를 보여주고 있다.

실험예 6: 젤란검 하이드로겔 내에서 유전자 발현 분석

젤란검과 miRNA-140-5p가 배합된 하이드로겔에서 연골세포의 유전자 발현도를 비교하였을 때, 연골 유전자와 관련있는 Col Ⅱ, Sox9, Aggrecan, 표현형이 miRNA-140-5p로 형질감염된 젤란검 하이드로겔에서 가장 높게 나왔다. 이에 따라, miRNA-140-5p는 연골세포 분화에 긍정적인 역할을 하는 것으로 확인되었다.

이러한 확인 자료로서 도 7a는 Col Ⅱ, Sox9, Aggrecan의 표현형에 대한 전기영동을 통해 확인한 밴드 사진이다.

도 7b는 전기영동 밴드사진을 그래프화 한 것이다.

도 7a에서는 상기 제조된 젤란검 하이드로겔 조성물에 골수유래줄기세포와 miRNA-140-5p를 함유한 골수유래줄기세포, 연골세포를 젤란검 수용액과 균일하게 섞은 후 각 날짜별(1, 3day)로 골수유래줄기세포와 연골세포들의 유전자 발현을 전기영동한 후 밴드 사진을 보여주고 있다.

또한, 도 7b는 전기영동결과를 GAPDH로 일반화하여 정량화시킨 그래프로서, SOX9, Aggrecan, Col Ⅱ 의 표현형에 대한 결과를 보여주고 있다.

Claims

젤란검에 miRNA-140-5p가 함유된 하이드로겔 형태로 이루어진, miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, miRNA-140-5p는 miRNA-140-5p를 함유한 세포가 보조성분으로 혼합 형태인 것을 특징으로 하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, miRNA-140-5p는 miRNA-140-5p에 형질감염된 골수유래 줄기세포의 형태로 함유된 것을 특징으로 하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, 젤란검 하이드로겔의 농도는 1 ~ 3 중량%인 것을 특징으로 하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
청구항 1에 있어서, miRNA-140-5p의 농도는 세포 배양플라스크에 담긴 미디엄 7ml에 대해 10-50pmol인 것을 특징으로 하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
miRNA-140-5p에 형질감염된 골수유래 줄기세포를 준비하는 단계;
상기 골수유래 줄기세포의 양을 1×10 으로 한 세포 현탁액을 준비하는 단계;
상기 세포 현탁액에 200-300 μl의 미디엄을 희석하여 젤란검 수용액에 혼합하요 혼합물을 얻는 단계;
상기 혼합물을 굳혀서 miRNA-140-5p에 형질 감염된 세포가 배합된 젤란검 하이드로겔를 제조하는 단계
를 포함하는 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물의 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 miRNA-140-5p가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 포함하는 연골손상 치료용 조성물.
청구항 7에 있어서, 주사제 형태인 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
청구항 7에 따른 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제.
청구항 7에 따른 연골손상 치료용 조성물을 유효성분으로 함유하는 주사용 관절염 치료제 키트.