KR100684940B1

KR100684940B1 - 피브린／ｈａ를 함유하는 혼합 지지체를 이용한 중간엽줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR100684940B1
Application number: KR1020050097124A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박소라; 박상혁
Original assignee: (주)필미아젠
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2007-02-20

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자인 피브린/HA을 함유하는 혼합지지체에 고정하여 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 고가의 성장인자를 사용하지 않고도 효율적으로 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 연골질환 치료용 조성물은 뛰어난 생체 적합성 및 생분해성을 가져 외과적 처치 시에 유용하다.

피브린, 히알루론산, 중간엽 줄기세포, 연골세포

Description

피브린／ＨＡ를 함유하는 혼합 지지체를 이용한 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법{Method for Differentiating Mesenchymal Stem Cell to Chondrocyte Using Fibrin/HA Containing Scaffold}

도 1은 본 발명에 따른 삼차원 지지체 및 비교 지지체들의 배양기간에 따른 외양의 변화를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 삼차원 지지체 및 비교 지지체들의 4주 배양 후 연골세포의 분화정도를 사프라닌 염색을 통하여 확인한 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 삼차원 지지체에 TGF-β가 미치는 영향을 사프라닌 염색으로 확인한 것이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자인 피브린/HA 혼합지지체에 고정하여 배양하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 방법으로는 연골세포를 이용하는 방법과 중간엽 줄기세포를 이용하는 방법에 대한 연구가 진행 중이다. 연골세포를 이용한 연골조직의 제작은 이미 생체 내 실험을 거친 방법들이 많이 보고되고 있으나, 중간엽 줄기세포를 이용하여 연골세포로의 분화를 유도하는 방법은 아직까지 명확히 제시되지 못하고 있다. 조직공학에서 줄기세포를 이용하여 연골을 제작하기 위해서는 조직공학의 3요소인 지지체, 세포 및 성장인자를 적절하게 응용하여 그 조건을 설정해야 하며, 이 중 지지체는 합성고분자 지지체와 천연고분자 지지체로 나뉘어 진다. 합성고분자들은 일반적으로 천연고분자에 비해 생체 적합성과 생분해성에 불리한 면이 많기 때문에, 천연고분자를 이용한 실험이 많이 행하여지고 있다.

생분해성 천연 고분자 중 피브린(fibrin)은 피브리노겐(fibrinogen)에 트롬빈(thrombin)을 처리함으로서 고형화되어 생성되는 생분해성 천연 고분자로서, 지지체로 사용할 경우, 생체 적합성, 생분해성, 연골 하골과의 접합성 등이 우수하다는 것이 보고되면서 여러 가지 용도로 사용되어지고 있다. 이러한 피브린은 연골재생에 있어서도 연골세포의 표현형을 유지시키면서 세포외 기질 분비에 효과적인 환경을 제공하여 연골조직 형성에 도움을 주고 결손 부위와의 결합이 용이한 장점이 있다. 그러나, 이상적인 지지체로서 사용되기 위해서는 물리적인 견고함을 가져야 한다는 문제를 안고 있으며분해되는 속도가 빨라 세포의 분화 환경을 완벽히 지 원해 주지 못한다는 단점을 지니고 있다.

HA(hyaluronate)는 글루쿠로닉 산/N-아세틸글루코사민 디사카라이드 단위가 연속하여, 비황화 글루코사미노글리칸을 이루는 생체고분자로서, 지지체로 사용할 경우 연골세포의 이동과 증식을 증가시키고, 연골조직의 분해를 유도하는 싸이토카인인 IL-1β의 활성을 억제시키는 작용을 하여, 세포외 기질형성에 효과적이라고 보고되고 있다. 그러나 HA는 자연 상태에서는 완벽한 생체 적합성을 지니지만 지지체로 사용시 화학적 작용을 거치면서 생체 내에 이식되었을 때 생체 적합성이 떨어지게 된다는 문제점이 있다.

따라서, 피브린에 HA를 첨가하면 피브린의 구조를 안정화시킬 수 있고, 조직이 상처를 입었을 때 회복과정에서 가장 먼저 농도가 높아지면서 회복 기전에 중요하게 작용하는 물질이 피브린과 HA라는 점을 볼 때 이 두 물질을 혼합물질이 이상적인 천연 고분자 물질로서 세포지지체로 사용될 수 있는 가능성을 가지고 있다고 판단된다.

현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다. 펠렛배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이라는 것이 보편적으로 알려져 있으며, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다. 그러나 원심분리를 통한 응집만으로 줄기세포의 충분한 연골화 분화를 조건을 제공하지 못하므로, 주로 TGF-β와 같은 성장인자를 첨가하여 연골세포로의 분화(연골화)를 유 도하고 있다.

또한, 알지네이트를 이용하여 연골화를 유도하는 방법은 세포를 알지네이트 비드에 인캡슐레이션(encapsulation)시켜 세포주위에 생리적으로 적합한 환경을 제공하고, 쉽게 다룰 수 있을 정도의 기계적 강도를 제공하여 이식에 효과적인 방법으로 인식되고 있다. 그러나 실험실에서의 알지네이트 배양을 통한 줄기세포 분화를 유도할 때에는 성장인자를 첨가하지 않으면 연골화가 충분히 이루어지지 않고 생체 내 실험에서도 만족할만한 결과가 아직까지 보고되고 있지 않다.

3차원 배양에 주로 사용되는 TGF-β(transforming growth factor-β)는 생체 내에서 뼈와 연골의 발달에 있어서, 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있으며 마우스, 인간 및 토끼의 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데에 효과적이라는 실험결과들이 많이 보고 되어있다.

이에, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 3차원 배양에 있어서, 효과적인 연골세포의 분화 촉진방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 피브린과 HA의 혼합물을 중간엽 줄기세포의 조직공학적 지지체 또는 세포전달체로 사용하였을 때, 종래 연골세포 분화를 위해 첨가되었던 TGF-β를 첨가하지 않아도 연골세포로의 분화가 촉진된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 피브린/HA 지지체를 이용하여 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 지지체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브린 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl₂, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 지지체를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직 또는 골수 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 트롬빈 첨가 시에 분해저해제를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합용액에 CaCl₂, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 또는 골절인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 여러 생화학적 및 기계적 특성을 강화시킬 수 있는 다양한 방법을 사용하여 개질될 수 있다.

본 발명에서는 단백질 계열인 피브린과 다당류 계열인 HA를 사용하여 단백질 계열의 지지체에 세포가 접종되었을 경우 세포외 기질과 빠른 시기에 접합하여 세포외 주위 반응을 감지하고 여러 종류의 자극을 수용할 수 있는 장점과 다당류 계열의 지지체가 세포 접종시 세포의 주위 환경과의 독립적인 공간을 제공하여 세포외기질을 분비할 수 있는 장점을 동시에 가질 수 있도록 혼합 3차원 배양 환경을 제공하였다.

또한, 피브린이 세포 및 조직 친화성을 보유하면서 세포분화 유도체로서의 유용하게 사용될 때의 농도와 피브린에 HA를 혼합하여 피브린의 물성과 중간엽 줄기세포의 연골화 분화에 도움을 주는 조건을 결정하였는데 중간엽 줄기세포를 피브린/HA 혼합지지체에 혼합하여 연골화 분화를 유도하는데 있어 피브린/HA 지지체가 다른 배양 방법에 사용되는 지지체보다 세포분화 지지체로서 우수함을 증명하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한된는 것으로 해석되지 않는 다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 사용하였으나, 배아 유래 줄기세포, 근육, 지방, 신경조직 등 성체조직에서 유래되는 줄기세포 등의 다른 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있는 것은 당해분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 분리 및 배양

중간엽 줄기 세포는 체중 250g의 어린 뉴질랜드산 흰토끼(중앙실험동물센터, 한국)의 경골과 대퇴골로부터 10 mL용량의 주사기를 사용하여 얻어진 골수천자액을 분리한 후 5% 아세트산에 현탁시킨 다음, 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 적혈구가 제거된 세포를 수득하였다.

상기 중간엽 줄기세포를 10% NCS(new-born calf serum)가 첨가된 α-MEM(α-Minimum essential meidium eagle alpha modification: Sigma, USA)에 현탁시키고, 1.5x10⁷ cells/mL의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂에서 배양기에서 2주간 배양하였다.

실시예 2. 피브린/HA 혼합 지지체의 준비

동결건조 되어있는 피브리노겐 분말 (목암연구소, 녹십자, 한국)을 α-MEM에 녹여서 9mg/mL 및 18mg/mL의 피브리노겐 용액을 제조하였다. HA는 분자량 3000kD의 HA(LGCI, 한국)를 2.5mg/ml의 농도로 PBS로 희석하여 사용하였다. 트롬빈 (thrombin) (목암연구소, 녹십자, 한국), 피브린 분해저해제(fibrinolysis inhibition factor, DI101, DI102)(듀플로젠, 한국)는 분배하여 -20℃에 보관하고 사용 직전에 꺼내서 사용하였다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포가 고정된 지지체의 제조 및 배양

단층 배양한 중간엽 줄기세포를 PBS로 2~3회 수세하고 트립신-EDTA (Gibco-BRL, ,USA)를 처리하여 세포를 수득한 후 하기의 3가지 방법을 사용하여 3차원배양을 수행하였다.

(1) 알지네이트 배양

밀리셀 삽입 배양접시(millicell insert plate)를 12 well 배양접시에 넣고 2% 알지네이트 용액 300㎕를 밀리셀 삽입 배양접시에 분주하였다. 상기 12 well의 안쪽으로 천천히 102mM CaCl₂ 1ml을 첨가하고, 5분간 방치하여 알지네이트 층(alginate layer)을 제조하였다.

(2) 펠렛 배양

5x10⁵개의 중간엽 줄기세포를 15ml 튜브에 옮겨 담고 α-MEM 배지 1ml을 첨가한 후, 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리한 펠렛을 1일간 정치배양한 후 펠렛 지지체로 사용하였다.

(3)피브린/HA 혼합지지체

상기 수득한 세포를 배양기에서 10분간 배양한 후 회수하여 피브리노겐/HA 용액 (피브리노겐(9mg/mL):HA(2.5mg/mL)=10:1에 5x10⁶cells/ml의 농도로 중간엽 줄기세포를 혼합한 후, factor VIII을 4.4-8.8 U/ml 농도로 혼합하였다.

CaCl₂와 트롬빈 혼합용액(CaCl₂: 5~6mg/ml, 트롬빈: 2~4mg/ml; Sigma, USA) 20㎕을 배양접시의 well에 분주하고, 상기 피브리노겐/HA 용액과 세포의 혼합액을 1 clot에 200~250㎕ 부피로 첨가하여, 실온에서 5~10분간 방치하여 반고체의 fibrin/HA 지지체들을 만들었다.

상기 세가지 방법으로 만들어진 알지네이트 층 및 피브린/HA 혼합지지체를 24 well 배양접시에 각 well 당 하나의 지지체를 넣고, defined media[DMEM (high glucose; Sigma , USA), insulin 6.25μg/mL, selenious acid 6.25μg/mL, transferin 6.25μg/mL, bovine serum albumin 1.25mg/mL 및 pyruvate 100ug/mL, ascobibate 2-phosphate 50μg/mL, dexamethazone 100nM, proline 40μg/mL]에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하면서 매일 1차례 배지를 교환을 해주었으며, 펠렛 배양은 15ml 튜브에서 같은 조건으로 배양하였다.

이때, 성장인자인 TGF-β의 영향을 살펴보기 위하여, TGF-β (10ng/mL)처리군과 비처리군(대조군)으로 나누어 배양하였다.

실시예 4. 연골세포로 분화 유도된 지지체의 외양관찰

피브린/HA 혼합지지체, 알지네이트 층 및 펠렛 배양의 배양 중 크기 변화를 살펴보면 배양 4주 후까지 알지네이트 층에서는 크기 변화가 전혀 나타나지 않았으며, 피브린/HA 혼합지지체에서는 1주 후에 초기 크기의 70% 정도로 줄어들었으나 이후에는 크기 변화가 나타나지 않았다. 그러나, 펠렛배양에서는 4주후에 크기가 증가하였다 (도 1).

TGF-β 처리의 영향을 살펴보면, 알지네이트 층과 피브린/HA 혼합지지체에서는 TGF-β 처리군과 비처리군의 크기 차이가 없었으며, 펠렛 배양의 경우는 TGF-β를 처리한 군에서 크기가 더욱 증가하였다.

실시예 4. 연골세포로 분화 유도된 지지체의 조직학적 특성

상기 3가지 지지체를 배양한지 4주 후의 회수한 조직을 10% 포르말린 용액에 24시간 고정시키고, 에탄올 농도를 점차 증가시키는 탈수과정을 거친 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 상기 파라핀 블록을 4μm 두께로 잘라서 표본을 제작하고, 헤마토실린 에오신(hematoxylin, eosin) 염색으로 세포의 모양을 관찰하였다.

연골화 정도를 측정하기 위하여는, 사프라닌(safranin)-O염색을 실시하여 GAG(glycosaminoglycan)을 포함하고 있는 연골화 세포외 기질을 현미경(eclipse e600, nikon)을 사용하여 관찰하였다.

조직학적 결과를 사프라닌-O, 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통해 살펴보 면 알지네이트 층 배양 및 펠렛 배양에서는 TGF-β를 처리한 군에서만 분화된 연골세포의 성질을 나타내고 있음을 확인할 수 있었으나, 피브린/HA 혼합지지체 배양에서는 TGF-β를 처리하지 않은 그룹에서도 연골세포 분화가 잘 일어나고 있음을 확인할 수 있었다 (도 2).

피브린/HA 혼합지지체에서의 연골세포 분화는 배양 1주 후부터 관찰되었으며, 배양시간이 경과함에 따라 연골화 분화가 잘 이루어지고 있었다 (도 3). 또한, TGF-β를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 연골화 정도의 차이가 관찰되지 않았으나, TGF-β가 첨가된 군에서는 조직의 바깥쪽으로 연골화 분화가 잘 유도된 반면, 미첨가된 군에서는 세포의 ECM(extracelluar matrix) 전체에서 고르게 분화가 이루진 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 피브린/HA 지지체를 이용하여 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 지지 체를 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.본 발명에 따르면, 고가의 성장인자를 사용하지 않고도 효율적으로 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 연골질환 치료용 조성물은 뛰어난 생체 적합성 및 생분해성을 가져 외과적 처치 시에 유용하다.

Claims

다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법:

(a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 하이알유로네이트(HA) 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/하이알유로네이트(HA) 용액을 혼합하는 단계;

(b) 상기 혼합용액에 CaCl₂, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/하이알유로네이트(HA) 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 하이알유로네이트(HA)의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 트롬빈 첨가 시에 분해저해제를 첨가하는 것을 특징 으로 하는 방법.
(a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 하이알유로네이트(HA) 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/하이알유로네이트(HA) 용액을 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합용액에 CaCl₂, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/하이알유로네이트(HA) 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/하이알유로네이트(HA) 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 또는 골절인 것을 특징으로 하는 조성물.