CN1836034A - 生产神经元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种由未分化的间充质细胞(UMC)生产神经元的方法。本发明也公开了由该方法生产的分离的神经元、含有这种神经元的组合物、以及使用这种组合物修复损伤的或缺损的神经组织的方法。

Description

生产神经元的方法
技术领域
本发明涉及细胞组合物的生产，更特别的是涉及含有神经元的组合物。
发明背景
考虑到神经组织康复的效率低且缓慢，现迫切需要开发一种生产可移植或可植入的神经元组合物的方法。当然，在所有器官、组织或细胞移植中，避免神经元植入物的免疫排斥是至关重要的。
发明概述
本发明人发现，在血浆凝块中培养未分化的间充质细胞(UMC)的结果是在血浆凝块中神经元的生长。因此本发明公开了一种涉及在血浆凝块中培养UMC来生产神经元群的方法。本发明也提供了用这种方法生产的分离的神经元和含有包括由本发明的方法产生的神经元的分离的细胞群的组合物。在另外一个实施方案中，本发明包括将神经组织缺损或损伤修复为神经组织的方法。
更特别的是，本发明公开了生产神经元的方法。该方法包括如下连续步骤：(a)提供未分化的间充质细胞(UMC)来源；(b)提供含有约6mM到约18mM Ca2+的血浆凝块；(c)将UMC从来源加入到血浆凝块中；和(d)孵育血浆凝块。在孵育期间，血浆凝块中的UMC亚群分化为神经元，从而在血浆凝块中产生了包括神经元的细胞群。该方法可进一步涉及将细胞群从血浆凝块中分离，并且任选地在没有血清的培养基中培养被分离的细胞群。
任选地，UMC的来源可以从被给予细胞群的个体获得。UMC的来源可以是例如哺乳动物的皮肤碎片或是哺乳动物脂肪组织碎片。
此外，UMC的来源可以是含有UMC的不贴壁的衍生细胞群，不贴壁的衍生细胞是由包括如下步骤的程序生产的：(a)提供含有未分化的间充质细胞(UMC)的组织碎片以获得起始细胞；(b)从所述碎片中分离起始细胞；(c)培养起始细胞；并且(d)从所述培养物中收获不贴壁的衍生细胞群，其中所述的不贴壁的衍生细胞包括UMC。生产含有UMC的细胞群的这个程序可以进一步包括一轮或多轮衍生，包括利用从前一轮收获的不贴壁衍生细胞群作为起始细胞重复步骤(c)和(d)。一轮或多轮额外衍生作用可以是一到二十轮。含有UMC的组织可以是但不限于真皮组织、脂肪组织、结缔组织、筋膜、固有层或骨髓。该程序可进一步包括在酸性成纤维细胞生长因子存在下培养所述不贴壁的细胞。
本发明也提供了：(i)用上述方法生产的神经元；(ii)包含神经元的细胞群，该细胞群通过上述方法生产。组合物可以进一步含有药学上可接受的载体，和/或无细胞的生物可降解基质，其中细胞群的细胞被整合到基质内或基质上，和/或无细胞的生物可降解填料。在与细胞组合之前，无细胞的生物可降解基质和无细胞的生物可降解填料由任何物质或物质的组合物组成，在这里列举用于无细胞的生物可降解基质和无细胞的生物可降解填料。另外，该组合物可以基本上不含有源自培养基血清的蛋白质。
本发明的另一个方面是在哺乳动物受试者中修复损伤或缺损的神经组织的方法。该方法涉及将本发明的组合物注射入、移植或植入神经组织。神经组织可以是中枢神经系统(CNS)组织，例如脊髓组织或脑组织。神经组织也可以是外周神经系统(PNS)组织。哺乳动物受试者可以是人患者。哺乳动物受试者可具有脊髓损伤或疾病或缺损，例如阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、泰氏-萨氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、中风、面神经退化、手的外周损伤、神经纤维瘤病、纤维肌痛、脊髓空洞症、神经系统的自身免疫疾病、以及神经组织肿瘤。在该方法中，组合物的细胞群可以是自体的。
除非另外定义，这里所使用的技术和科学术语和本领域所属普通技术人员所通常理解的意思一样。尽管与这里所描述的相似或等同的方法和材料可以用来实施本发明，但合适的方法和材料在下面描述。这里所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料以它们整体的形式被引入作为参考。如果冲突，本说明书包括定义将起决定性作用。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不打算限制。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容在下面的附图和说明书中被阐述。本发明的其它公开内容、目的和益处从说明书和权利要求来看将是显而易见的。
发明详述
本发明提供了在体外从未分化间充质细胞(UMC)生产神经元的方法。这些神经元可用于治疗多种类型的神经组织缺损或损伤，例如中枢神经系统(CNS)(如脊髓或脑)组织或外周神经系统(PNS)(如感觉-躯体神经系统(如颅神经或脊神经)或植物神经系统)的组织。这样，含有用本发明的方法产生的神经元的组合物可用于治疗例如脊髓损伤、阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、泰氏-萨氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、中风，包括因中风而引起的肌肉瘫痪、面神经退化、手的外周损伤、神经纤维瘤病、纤维肌痛、脊髓空洞症、神经系统的自身免疫疾病(如多发性硬化)、以及恶性或良性神经组织肿瘤(如星形细胞瘤或成胶质细胞瘤)，例如作为外科切除这种肿瘤后的替代治疗。
UMC和源自它们的神经元与神经元受体共有至少一种主要组织相容性复合体(MHC；人HLA)单倍型。UMC供体和神经元受体优选MHC一致的。最理想的是受体和供体是纯合配对的或是同一个体。在生物成分(如组织、细胞或诸如蛋白质、核酸、糖或脂的生物分子)被移植或植入获得它们的受体或获得所述生物成分的前体的受体时，生物成分就被称为是自体的。
生产含有神经元的组合物的方法
未分化的间充质细胞
这里所使用的术语“UMC”指的是处于一个早于完全分化的如成纤维细胞的结缔组织的分化阶段的细胞。因为UMC不能分化成为每种类型的体细胞，故UMC不同于多能干细胞。除了成纤维细胞外，UMC还能分化成脂肪组织、软骨、腱、骨、肌肉细胞和神经元。尽管神经元不被认为是间充质组织，显然神经元可由UMC生产。其发生机理是不清楚的。一种可能性就是，经由特定分化途径的前体细胞(如UMC)在它们能够发育成的完全分化的细胞范围方面显然并不限于以前所想的那些；例如公知神经嵴细胞不但可以发育成神经元，而且也可以发育成例如PNS的支持细胞、色素细胞、平滑肌细胞、面部和颅的软骨和骨。或者，可能至少一些部分分化的细胞类型(如UMC)在一定的环境下(如在血浆凝块中发生的那些)能够去分化，然后沿不同的分化途径(如神经)再分化。本发明不受限于从UMC发育成神经元的任何特定机制。
本发明的方法涉及在用作基本上是UMC任何来源的神经元前体细胞来源的血浆凝块中生长神经元。UMC可以在之前没有被培养过的新鲜组织(如皮肤、脂肪组织或骨髓)中，或者用现有技术所公知的任意的各种方法例如实施例1的那些方法在体外培养和/或富集。在血浆凝块中培养的结果是：(a)选择性的生长出在UMC群中已经分化了的神经元并且具有与在血浆凝块中培养之前的UMC相同的形态；或(b)UMC亚组在生长之后分化成神经元。本发明不被任何特定作用机制所限制。
UMC可以从任意的大范围哺乳动物物种获得，如人、非人类灵长目(如猴、黑猩猩和狒狒)、牛、绵羊、马、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠或小鼠。
UMC能够通过起始培养取自受试者(如人)的活检物来体外收获和富集。如这里所述，UMC可从例如皮肤活检物或脂肪组织活检物或骨髓活检物中获得。从真皮组织分离的UMC是特别有用的，因为它们很容易获得和扩增。
要在体外产生适用于本发明的选定的UMC，培养物可以从例如受试者完整厚度(如1-5mm，或者大于5mm，如果能得到足够组织)的齿龈、头皮、耳廓后皮肤或者腭的真皮活检标本起始。真皮位于表皮的下面，典型地具有0.5到3mm范围的厚度。真皮标本可以用例如穿刺活检程序来获取。皮肤活检物可以从位于例如耳朵后面的皮肤取得。在细胞培养起始之前，为了减少后续培养可能的污染，用抗生素和抗真菌剂反复清洗活检物。合适的“清洗培养基”可以含有组织培养基，例如象Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)、Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基(IMDM)或者其它任何适合的培养基，并具有一些或全部以下的抗生素：庆大霉素、两性霉素B(FUNGIZONE)、支原体清除剂(MRA；Dianippon Pharmaceutical Company，Japan)、原生质素(plasmocin)以及泰乐菌素(tylosin)(可以由例如Serva，Heidelberg，Germany提供)。庆大霉素可以以10到100μg/ml(例如25到75μg/ml，或者大约50μg/ml)的浓度使用。两性霉素B可以以0.5到12.5μg/ml(例如1.0到10.0μg/ml，或者大约2.5μg/ml)的浓度使用。MAR可以以0.1到1.5μg/ml(例如0.25到1.0μg/ml，或者大约0.5μg/ml)的浓度使用。原生质素可以以1到50μg/ml(例如10到40μg/ml，或者大约25μg/ml)的浓度使用。泰乐菌素可以以0.012到1.2mg/ml(例如0.06到0.6mg/ml，或者大约0.12mg/ml)的浓度使用。
如果需要，可以用无菌显微解剖来将活检物中的真皮组织与含有角化组织的表皮和含有脂肪细胞的皮下组织分开。然后用例如解剖刀或剪刀将组织精细切碎，这样活检标本就可以被分成小片。在一些实施例中，用蛋白酶(如胶原酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶)将这些组织小片消化。用200-1000 U/ml的II型胶原酶消化10分钟到24小时特别有用，尽管胶原酶的任何类型都可以使用(例如0.05％到0.1％的IV型胶原酶能够对脂肪组织的消化特别有用)。如果使用酶促消化，细胞可通过离心收集并置于组织培养瓶中。
如果组织不进行酶促消化，组织碎片可以单个地置于组织培养瓶的干燥表面上，并允许附着大约2到10分钟。可缓慢添加少量培养基，以免移动了附着的组织碎片。在被消化了的细胞的情况下，细胞可用培养基清洗以除去残留的酶，悬浮在新鲜培养基中，置于一个或多个瓶子中。在孵育约48-72小时后，可向瓶子中加入额外的培养基。当用T-25瓶起始培养时，培养基最初的量典型地为大约1.5-2.0ml。由活检标本建立细胞系需要约2到3周，在那个时候，细胞可以从起始培养器皿中移出以用于扩增。
在培养的早期，期望组织碎片仍然附着在培养器皿的底部。脱离的碎片可以重新植入新的器皿中。细胞可以根据标准技术通过对EDTA-胰蛋白酶的短暂暴露而刺激生长。这种对胰蛋白酶的暴露太短暂，不会将成纤维细胞从它们与培养器皿壁的附着释放出来。在培养物已建立并接近汇合后，可立即加工细胞样品来冷冻储存在例如液态N2中(见下文关于细胞冷冻的额外信息)。这里所使用的“贴壁”细胞是那些贴附在标准组织培养器皿的材料(如塑料)上的细胞。“不贴壁”细胞包括那些不贴附在标准组织培养器皿的材料(如塑料)上的细胞，也包括那些当空间和营养有限时从组织培养器皿表面脱离的细胞。
一旦细胞达到汇合或几乎汇合的情况时，可以看到活跃生长的UMC的不贴壁集落在上述培养基中漂浮。尽管本发明不受任何特殊作用机制限制时，由于空间和/或营养限制，起始的贴壁UMC脱离(即变成不贴壁的)是可能的。这些不贴壁UMC的集落可通过将培养基从细胞培养物中抽出并离心来收获，可以使用(如生产神经元)、冷冻并储存，也可以通过重新接种在新鲜组织培养基中扩展。当不贴壁细胞集落重新接种在新鲜组织培养器皿中时，细胞会再次贴壁到组织培养器皿的底面和/或壁上并获得鹅卵石样的形态。细胞生长过程、不贴壁细胞集落的收获和重新接种都可按照期望多次重复。它可以实施如仅仅一次或两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、12、15、17、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、500、1000次或者甚至更多次。
不贴壁UMC也可从脂肪组织(例如通过吸脂术或其它外科切除手术收获的脂肪)培养物中分离到。可将组织切成小片，可去除膜状物质，所得到的组织在能引起UMC从脂肪组织上活跃脱落的条件下置于培养物中。或者，在将膜从脂肪球上去除后，可用约0.1％到1％的胶原酶将脂肪组织分离。同样地，UMC培养物可从骨髓活组织切片起始(参见例如Marko et al.(1995)Endocrinol.136：4582-4588)。源自脂肪和骨髓的UMC的收获和重新接种过程与上述源自皮肤的UMC一样。事实上，本领域技术人员将意识到，可进行相似程序来从这里公开的任何UMC可能来源获得UMC。
本发明包括了一种源自上述培养方法的分离的UMC神经元前体细胞和含有源自上述培养方法的包括神经元细胞前体细胞的细胞群的组合物。
任何适于UMC从活检标本增殖的组织培养技术都可用来扩增细胞。适于扩增培养细胞的技术可以在例如R.I.Freshney，Ed.，AnimalCell Culture：A Practical Approach，(IRL Press，Oxford，England，1986)和R.I.Freshney，Ed.，Culture of Animal Cells：A Manual ofBasic Techniques，(Alan R.Liss & Co.，New York，1987)中找到。
细胞培养基可以是任何适于原代UMC培养物生长的培养基。培养基可以含有如上所述的抗生素、杀真菌剂和/或防止支原体生长的试剂。诸如酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)在培养基中的存在可防止UMC分化为成纤维细胞。培养基可以是无血清的，或者可以补充人或非人血清[例如自体人血清、非自体人A/B型血血清、非自体人O型血血清、马血清或者胎牛血清(FBS)]来促进细胞的生长。当培养基中包括血清时，血清典型地为约0.1％到约20％v/v的量(如大约0.5％到大约19％，大约1％到大约15％，大约5％到大约12％，或者大约10％)。特别有用的培养基包括补充了大约2 mM谷氨酰胺、大约10mg/L丙酮酸钠、大约10％(v/v)FBS以及抗生素的葡萄糖DMEM(通常叫做“完全培养基”)，其中，葡萄糖的浓度范围从大约1,000mg/L到大约4,500mg/L。UMC也能在无血清的培养基中扩增；用这种方式，UMC不会暴露于异种的或同种异体的血清蛋白质，当在含有非自体血清的培养基中扩增细胞时就不需要在无血清培养基中进行额外培养。
用于细胞培养的培养基可以补充抗生素，以防止由诸如细菌、真菌、酵母和支原体引起的细胞污染。在组织培养中，支原体污染是一个频发的并特别伤脑筋的问题。为了防止支原体污染或让其最小化，可以向培养基中加入诸如泰乐菌素这样的试剂。培养基可以进一步补充一种或多种抗生素/抗真菌药(例如庆大霉素、环丙沙星(ciprofloxacine)、丙氟沙星(alatrofloxacine)、阿齐霉素、MRA、原生质素和四环素)。泰乐菌素可以以0.006到0.6mg/ml(例如0.01到0.1mg/ml，或者大约0.06mg/ml)的浓度使用。庆大霉素可以以0.01到0.1mg/ml(例如0.03到0.08mg/ml，或者大约0.05mg/ml)的浓度使用。环丙沙星可以以0.002到0.05mg/ml(例如0.005到0.03mg/ml，或者大约0.01mg/ml)的浓度使用。丙氟沙星可以以0.2到5.0μg/ml(例如0.5到3.0μg/ml，或者大约1.0μg/ml)的浓度使用。阿齐霉素可以以0.002到0.05mg/ml(例如0.005到0.03mg/ml，或者大约0.01mg/ml)的浓度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如0.2到1.0μg/ml，或者大约0.75μg/ml)的浓度使用。原生质素可以以1到50μg/ml(例如10到40μg/ml，或者大约25μg/ml)的浓度使用。四环素可以以0.004到0.1mg/ml(例如0.008到0.05mg/ml，或者大约0.02mg/ml)的浓度使用。抗生素可以在培养的整个阶段或部分培养阶段存在。
支原体污染可通过用一种例如可以从bioMerieux(MarcyI′Etiole，France)获得或可在室内制备的支原体琼脂平板的系统通过琼脂培养方法或者PCR来分析。美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)在市场上出售PCR“支原体检测试剂盒”。含有泰乐菌素(0.06 mg/ml)、庆大霉素(0.1mg/ml)、环丙沙星(0.01mg/ml)、丙氟沙星(1.0μg/ml)、阿齐霉素(0.01mg/ml)和四环素(0.02mg/ml)的培养基对防止支原体污染特别有用。另一种对防止支原体污染有用的试剂是4-氧-喹啉-3-羧酸(OQCA)衍生物，它可以由例如ICNPharmaceuticals，Inc(Costa Mesa，CA)提供的“支原体清除药剂”而从商业上获得。这种试剂典型地以0.1到2.5mg/ml(例如0.2到2.0mg/ml，或0.5mg/ml)的浓度使用。在成纤维细胞培养起始后的前两个星期可以存在抗生素混合物或其它试剂。在培养合适的时间(例如两周)后，含有抗生素的培养基典型地被不含抗生素的培养基所替换。一旦培养物中存在足够的细胞时，就能够检测它们的支原体、细菌和真菌污染。只有不含有可检测到污染的细胞才能在本发明的方法中使用。
在血浆凝块中培养UMC来产生神经元
用于本发明的方法的血浆凝块可以用现有技术中公知的任何方法来生产。血浆的制备可以通过，例如，向刚由合适的哺乳动物受试者取得的血液中加入柠檬酸钠或肝素，然后将血液的血浆部分经离心从细胞成分中分离出来。血浆可以以液态或者比如冻干的形式获得。如果血浆是以冻干的形式获得的，那么在使用之前通过添加去离子水或者比如组织培养基来重配。血浆可以从被给予神经元的个体(受体)获得，也就是说它可以是自体的。或者，血浆可以从与受体同样的物种的一个或多个个体获得，比如，它可以是从许多(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或者更多)的人志愿者制备的血浆样品集合。另外，血浆可以从任何哺乳动物物种，例如人、非人灵长类动物、牛、绵羊、马、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠或小鼠的一个或多个个体的成体、婴儿的血液或者胎儿血液中分离出来。从这些物种获得的血浆可与来自同样物种或另一物种的UMC一起使用。
凝块可通过在一个适当的器皿(如塑料组织培养皿)中将血浆和Ca2+离子源(如CaCl2)或凝血酶混合而形成。即使使用了除添加Ca2+离子外的其它诱导凝结的方法，由UMC生产神经元仍然需要在血浆凝块中有相对高浓度的Ca2+离子。因此优选通过添加Ca2+离子来诱导凝结。如果要使用一些其它的方法，必须在细胞被添加到凝块之前就通过将凝块在含有Ca2+离子的溶液或培养基中孵育而将Ca2+离子引入到凝块中。Ca2+离子在凝块中的浓度可以是大约4mM到大约18mM，例如大约6mM到大约17mM；大约8mM到大约16mM；或大约8mM到大约15mM。
凝结可以在室温下进行，或者在例如37℃下进行可以更快。在凝块形成后，添加足够的组织培养基到含有凝块的器皿中，以防止凝块变干。因此凝块可以被培养基完全覆盖或者培养基和凝块的上表面水平线基本上一样高。
组织培养基可以是任何适于神经元生长的培养基。一种这样的培养基是“FGF-DMEM”，它含有补充了大约2mM谷氨酰胺、大约10mg/L丙酮酸钠、大约2.5％(v/v)FBS(或者这里所公开的任何人血清)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF；大约5ng/ml)、肝素(大约5μg/ml)和抗生素的DMEM(通常叫做“完全培养基”)，葡萄糖的浓度范围从大约1,000mg/L到大约4,500mg/L。另一种有用的培养基是“N培养基”，它含有补充了大约2mM谷氨酰胺、B27补充物(Gibco；以大约1∶50的比例添加到Neuralbasal培养基中)、表皮生长因子(EGF；终浓度大约20ng/ml)、R3长形胰岛素样生长因子(R3 IGF；终浓度大约25ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；终浓度大约10ng/ml)和白血病抑制因子(LIF；终浓度大约10ng/ml)的Neuralbasal培养基(Gibco，Carlsbad，CA)。如果期望，可利用N-2补充物(Gibco)来代替B27补充物。美国专利No.6,736,238(它的公开内容以整体的形式被引入这里做为参考)描述了各种适于神经元体外生长的培养基。
用于生长神经元的培养基可以补充一个或多个生长因子，例如酸性成纤维细胞生长因子(FGF；aFGF)、碱性FGF(bFGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、长形胰岛素样生长因子(R3 IGF)、表皮生长因子(EGF)、长形EGF、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、转化生长因子(TGF)家族成员(例如TGFβ)、骨形成蛋白(BMP)家族成员(例如BMP 2-8的任何一种)、FGF-7、FGF-9、睫状神经营养因子(CNTF)、脑来源的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-5(NT-5)、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)或者LIF。可以理解的是，具有全长野生型生长因子活性至少50％的任何上述生长因子的片段或变体(例如具有缺失、添加或取代的那些)也可用于那些可使用全长野生型生长因子的本发明的任何目的。同样有用的还有那些显示出可增强生长因子的神经元生长促进活性的化合物；这样的化合物在美国专利6,172,086中已被描述过，其公开内容在这里被整体引入当作参考。此外，神经元生长所需要的或可以增强神经元生长的氨基酸例如L-肉毒碱、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺和L-半胱氨酸可以添加到培养基中来生长神经元。其它添加剂包括甲状腺激素、维生素E、乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶、亚油酸、皮质酮、乙酸视黄酯、孕酮和腐胺。
将UMC、含有UMC的细胞群、或其碎片、或者含有UMC的被切碎的组织放到血浆凝块的表面。细胞、被切碎的组织或组织碎片可被添加到血浆凝块上面的培养基，并通过重力的作用使其沉降到血浆凝块的表面上。或者，培养基的水平面可以调整到和血浆凝块的上表面一致或者比血浆凝块上表面稍低。然后可将UMC或组织碎片放到血浆凝块表面并且孵育足够长的时间(例如在37℃)以使细胞或组织碎片贴壁在凝块表面。一旦发生贴壁，就可以加入额外的培养基使其完全覆盖血浆凝块。很重要的一点是不管什么时候在组织培养器皿中都要有足够的培养基以防止血浆凝块变干。可以理解的是，与其将细胞、被切碎的组织或组织碎片接触血浆凝块的表面，还不如将细胞、被切碎的组织或组织碎片包埋入血浆凝块中。这样它们就能在形成之后被插入，或者在凝块形成之前将它们加入血浆中来制造凝块。
在将细胞、被切碎的组织或组织碎片放到凝块中后，培养器皿在标准组织培养条件下例如在大约37℃(如35℃、36℃、或37℃)、在含有大约5％到大约10％CO2(例如大约5％到大约6.5％CO2)的空气中以及大约85％到大约98％湿度下进行孵育。细胞的生长和形态可以通过在其上方的显微镜来监控。神经元很容易被本领域技术人员辨认出来，其特征在于存在轴突和/或许多树突。自然地，培养基改变和细胞传代的频率取决于处于培养中的细胞的分裂速度。这个因素会根据例如所使用的培养基、UMC的种类以及是否在培养中使用生长增强因子而改变。本领域技术人员将能够为那些感兴趣的培养物建立可使用的条件。
神经元可以通过将凝块切成小碎片并将碎片包埋入新鲜血浆凝块或放置在新鲜血浆凝块的表面来传代。神经元和UMC从凝块碎片迁移到新的凝块中进一步培养。神经元比UMC先被移入新凝块，这个因素提供了一种在凝块中富集神经元的方法。因此，例如在培养一种将含有神经元和UMC的凝块碎片包埋入其中或贴壁到其表面的新凝块后，可将凝块碎片除去或者将新凝块切成小碎片并又将其包埋入第三个新凝块中，所述培养进行足够长的时间以允许相对大数量的神经元迁移入新凝块内部、但对于充足数量的UMC迁移入新凝块内部来说时间还不够长。这样的程序可以按照期望的频率进行重复，就是说直到获得含有期望比例的神经元的细胞群为止。
或者，凝块中的细胞可以通过溶解凝块(见下文)并从被溶解的凝块收集细胞来传代。然后以与上述用于培养物起始的基本上同样的方式来将这些细胞加入到新凝块的表面。
细胞可以通过在培养物中添加诸如胰蛋白酶、链激酶或血纤维蛋白溶酶原的这些酶，并在室温或37℃下孵育它们而从血浆凝块中收获到。
在从凝块中收获细胞后，将它们在无血清/血浆的培养基中进一步培养至少额外的4小时(例如过夜或大约18小时)。将细胞放在无血清的培养基中孵育可以将源自添加到培养基中的血清(如FBS)的蛋白质基本去除，如果这些蛋白质存在于注入患者的组合物中，可能引起不期望的免疫反应。无血清的培养基可以含有例如补充了约2mM谷氨酰胺、有或没有约110mg/L的丙酮酸钠的葡萄糖DMEM，其中葡萄糖的浓度范围从大约1,000mg/L到大约4,500mg/L。葡萄糖浓度在大约4,500mg/L时特别有用。无血清培养基也可以含有一种或多种如上文所描述的那些抗生素。
任何细胞群(例如UMC、含有UMC的细胞、神经元或含有神经元的细胞)可被冷冻并储存在任何适于冷冻这种细胞类型的培养基(例如任何通过商业手段可得到的冷冻培养基)中，储存在例如大约-80℃的冷藏柜或液态N2中。不必在冷冻之前将细胞从血浆凝块中收获；含有这种细胞的凝块可在冷冻培养基中冷冻。一种由大约70％(v/v)培养基、大约20％(v/v)FBS和大约10％(v/v)二甲亚砜(DMSO)组成的培养基特别适用于冷冻这里所公开的任何细胞类型。FBS可以被例如含有5％右旋糖的Krebs Ringer代替。DMSO也能被例如甘油代替。解冻的细胞可以用来起始用于制备额外的供以后用于同一个受试者的悬浮液的第二次培养，这样可以避免要获得第二个标本的不便。
神经元和含有神经元的组合物
本发明也提供了一种用上述血浆凝块方法由UMC产生的分离的神经元以及一种含有包括许多通过该方法由UMC产生的神经元的细胞群的组合物。在这些细胞群中，神经元优选细胞群的至少5％(例如至少：5％；7％；9％；10％；12％；15％；18％；20％；25％；30％；35％；40％；45％；50％；55％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％或100％)。这些细胞群中的其它细胞可以是但不限于以下细胞类型的一种或多种：UMC、成纤维细胞、角化细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、黑素细胞、皮肤朗氏细胞或内皮细胞。在一个实施方案中，组合物基本上没有成纤维细胞、角化细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、黑素细胞、皮肤朗氏细胞和内皮细胞；它们也可以基本上没有UMC。
在一个实施方案中，神经元和组合物基本上没有源自异种或同种异体培养基血清的蛋白质。这里所使用的“基本上没有源自异种或同种异体培养基血清的蛋白质”的细胞是指那些细胞周围的液体含有少于0.1％(例如少于0.05％、少于0.01％、少于0.005％或少于0.001％)包含在预先培养细胞的组织培养基中的异种或同种异体血清的细胞。类似地，一种“基本上没有源自异种或同种异体培养基血清的蛋白质”的组合物是指那些组合物内的细胞周围的液体含有少于0.1％(例如少于0.05％、少于0.01％、少于0.005％或少于0.001％)包含在预先培养细胞的组织培养基中的异种的或同种异体的血清。
要获得基本上没有源自同种异体或异种培养基血清的蛋白质的细胞，培养细胞可以在不含有同种异体或异种血清的培养基中扩增，即在不含有血清或含有自体血清的培养基中。或者，细胞可以首先在含有同种异体或异种血清(例如0.1％到20％血清)的培养基中培养，然后在不含血清的培养基中培养。这样，源自可能的免疫原性血清的蛋白质在细胞悬浮液中的存在可通过这些方法避免。
药学上可以接受的载体，例如生理盐水、赋形剂或者稳定剂可以在细胞被给予患者之前加入到这些细胞中。短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物，它们在所使用的浓度下不会对细胞有害，是生理相容的，当给予人体时典型地不会产生过敏或类似的不利反应，例如胃不适、头晕等等。各种药学上可接受的载体、赋形剂或者稳定剂在现有技术中是公知的[Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thEdition，Osol，A.Ed.1980]。可接受的载体、赋形剂或者稳定剂包括：  诸如磷酸、柠檬酸和其它无毒有机酸的缓冲液；诸如抗坏血酸的抗氧化剂；小分子量(少于10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白类的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水聚合物；诸如甘氨酸、  谷氨酰胺、  天冬酰胺、  精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；诸如EDTA的螯合剂；诸如甘露醇或山梨糖醇的糖醇；盐形成平衡离子，如钠离子；和/或诸如Tween、Pluronics或PEG的非离子型表面活性剂。
或者，如果细胞没有被立即给药，它们可以在收获之后于4℃在冰上孵育达24-48小时。对于这样的孵育来说，细胞可以悬浮在具有适当摩尔渗透压浓度并检测了热原和内毒素水平的生理溶液中。这种溶液典型地不含有酚红pH指示剂，并且任何优选的血清是患者的血清(即自体血清)而不是胎牛血清(FBS)或其它异种血清(例如马血清和山羊血清)。细胞可以在例如含有5％右旋糖、不含酚红的DMEM的Krebs-Ringer溶液或任何其它生理溶液中悬浮。可将细胞抽出并在孵育培养基中给予受试者。细胞所悬浮的盐水或孵育培养基的体积典型地与诸如要被注入的细胞量和由于组织恶化或缺损引起的损害程度这些因素有关。
生物可降解的无细胞基质
含有本发明的神经元的组合物也能够包含生物可降解的无细胞基质成分。无细胞基质成分通常充当一个结构的角色。比如，可以被填入组织的缺损、孔、间隙或空腔中，并提供一种环境，在这种环境中被注入或被植入的细胞能够粘附在基质或周围组织上，生长并由于新组织的生长而产生结构因子或其它因子(例如趋化因子)。在许多情况下，基质的间隙填充作用是暂时的，并仅仅持续到被植入的细胞和/或宿主细胞迁移到这个区域并形成新组织。优选无细胞基质是生物可降解的。基质优选固态或半固态的物质，并在生理条件下是不溶的。这种组合物适于注入或植入受试者体内以修复已经退化了的组织。这里所使用的术语“生物可降解的”是指一种生物上没有害处、并且能通过自然效应物(例如天气、土壤细菌、植物或动物)被化学降解或分解的组合物。本发明可以使用的基质的例子包括但不限于：含有自体和非自体蛋白质的无细胞基质和含有生物可降解的聚合物的无细胞基质。
许多含有非自体蛋白质的生物可降解的无细胞基质可以使用到这里所提供的组合物中。生物可降解的无细胞基质的例子包括：含有任何类型胶原(例如牛、猪、人或生物工程胶原)、或者任何类型的与例如戊二醛交联的带有糖胺聚糖(GAG)的胶原的基质。基质包含的胶原包括但不限于：可吸收的胶原海绵、胶原膜和骨松质。有用的胶原类型包括例如：牛胶原(例如ZYDERM和ZYPLAST，可以从McGhan Medical Corporation，Santa Barbara，CA那里购买到)、猪胶原、人尸体胶原(例如FASCIANTM(Fascia Biosystems，LLC，BeverlyHills，CA)、CYMETRATM(LifeCell Corp.，Branchburg，NJ)、或DERMALOGENTM(以前由Collagenesis Corp.生产)、生物工程胶原(例如FORTAPERMTM，可以从Organogenesis，Inc.，Canton，MA那里获得)和自体人胶原(AUTOLOGEN，见下文)。FASCIANTM可以特别有用。这种产物可以以5种不同颗粒大小的形式获得，任何一种都可以使用到这里所描述的组合物和方法当中。尺寸为0.25mm的颗粒可以特别有用。另外一种适用于这种基质的生物聚合物是纤维蛋白。为本发明的目的感兴趣的就是用来由UMC生产神经元的血浆凝块类型(见上文)。事实上，在某些实施方案中，没有必要将神经元从用来生产它们的血浆凝块中提取出来。任选地可以被切成适当的大小和形状的凝块能被直接植入或直接移植到损伤的或缺损的神经组织中去。
可吸收的胶原海绵可以从例如Sulzer Calcitek，Inc.(Carlsbad，CA)购买到。这些以COLLATAPE、COLLACOTE和COLLAPLUG的名字销售的胶原海绵填料由从牛深屈肌(Achilles)腱提取的交联胶原和GAG制成。这些产物是柔软的、易曲折的、不易碎的和无热源的。大于90％的胶原海绵典型地由开孔组成。
生物可降解的无细胞基质可以含有形成例如薄膜的胶原(例如牛或猪I型胶原)。一种这样的膜由Sulzer Calcitek生产，并作为BIOMENDTM销售。另一种这样的膜基质由Geistlich Sohne AG(Wolhusen，Switzerland)作为BIO-GIDE销售，它由猪I型和III型胶原制成。BIO-GIDE有一个双分子层结构，一个表面是多孔的并允许细胞向内生长，第二个表面是致密的，防止纤维组织向内生长。
其它含有胶原的合适基质包括由NeuCell，Inc.(Campbell，CA)生产的COLLAGRAFT，和由Wright Medical Technology(Arlington，TN)出售的OSTEOSET硫酸钙α-半水化物小球。
生物可降解的无细胞基质也能用形成颗粒或块的骨松质制成。这些材料由动物(例如人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪或者山羊)骨组成，其中基本所有的有机物质(例如蛋白质、脂、核酸、碳水化合物和如维生素和非蛋白质激素的小有机分子)都被去除。这种类型的基质在这里被称为“无机基质”。一种作为BIO-OSS松质颗粒和BIO-OSS块出售的这样的基质由Geistlich Sohne AG生产。这个公司也生产一种块型基质(BIO-OSS胶原)，其含有无机骨、另外大约含有10重量％的胶原纤维。
其它有用的生物可降解的无细胞基质可以含有明胶、羊肠线、脱矿质的骨、无机骨、珊瑚或羟磷灰石或这些物质的混合物。由脱矿质的人骨制成的基质例如形成小块并由GenSci RegenerationLaboratories，Inc.(Toronto，Ontario，Canada)作为DYNAGRAFT出售，由Tutogen Medical，Inc.(Clifton，NJ)作为TUTOPLAST出售或者由Osteotech，Inc.(Eatontown，NJ)作为GRAFTON脱矿质的骨基质出售。脱矿质的骨可以和例如胶原组合生产出海绵状、块状或膜状的基质。生物可降解的基质可以含有诸如粘多糖或透明质酸的糖胺聚糖。
特别适用于本发明目的的是形成杆状的生物聚合物(例如这里公开的各种类型的胶原或纤维蛋白)凝胶。在这些杆中的生物聚合物原纤维依靠磁场定向为纵向(轴向)。这种含有神经元并任选含有其它细胞(如施旺细胞)的杆可以用来桥接例如外周神经的切断的末梢之间的间隙。杆内纵向排列的原纤维用来引导跨越切断的神经末梢之间的间隙的神经生长，从而促进原有神经连接的再生。这些生物聚合物杆和制造它们的方法在美国专利No.6,057,137中更为详细地记载，其公开内容整体引入这里作为参考。
此外，由一个或多个单体制成的合成聚合物可以用来制造在这里有用的生物可降解的无细胞基质。这种合成聚合物包括例如聚(羟基乙酸)、聚(乳酸)和聚(羟基乙酸)-聚(乳酸)。合成聚合物也能与上面所提到的任何物质组合形成基质。形成单一基质的不同聚合物可以在分开的隔室或层上。例如，W.L.Gore & Associates，Inc.(Flagstaff，AZ)生产一种多孔的生物可降解的无细胞基质(GORE RESOLUT XT再生材料)。这种基质由合成的生物可降解的乙交酯和碳酸亚丙酯共聚物纤维组成，细胞可以迁移入这种基质中，基质附着到封闭的由合成的生物可降解的乙交酯和丙交酯共聚物组成的组成的不允许细胞向外生长的膜上。其它适合的生物可降解的基质的例子可以在例如美国专利No.5,885,829中找到。
为本发明的目的而感兴趣的是诸如聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩和这些聚合物的衍生物的导电生物聚合物。这种衍生物的例子包括3-取代的聚苯胺、聚吡咯和聚噻吩，例如烷基取代的衍生物。基质可以由这些聚合物来构建或者这些聚合物能被包被到这里所公开的任何其它生物可降解的无细胞基质材料上。这种基质对本发明的有用性源自电荷增强神经突延伸和神经再生的发现。这些基质的神经生长增强性质可通过体内或体外应用得到进一步增强，其通过对在放置到受试者体内之前附着了神经元的基质施加电压或电流。这些导电聚合物和它们的用途在美国专利No.6,095,148中被更为详细的记载，其公开内容整体引入这里作为参考。
细胞附着到生物可降解的无细胞基质上的能力可通过用一个或多个本领域公知的附着分子包被基质来增强。这些分子包括天然分子(例如像昆布氨酸和纤连蛋白这样的细胞外基质因子)和合成分子(例如含有纤连蛋白和/或昆布氨酸结合位点的肽)。有用试剂的例子是但不限于基膜成分、明胶、阿拉伯树胶、I-XII型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖以及它们的混合物。其它合适的附着分子包括简单的糖类、复杂的糖类、脱唾液酸糖蛋白、外源凝集素、生长因子、低密度脂蛋白、肝素、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、凝血酶、玻连蛋白以及纤维蛋白原。合成分子包括利用传统的方法掺入一个或多个诸如氨基酸序列RGD(SEQ ID NO：1；来自纤连蛋白)、LIGRKKT(SEQ ID NO：2；来自纤连蛋白)和YIGSR(SEQ ID NO：3；来自层粘连蛋白)的结合位点制得的肽。附着分子的用途和将其连接到生物可降解的无细胞基质上的方法在美国专利No.6,095,148中记载。
在选择了生物可降解的无细胞基质后，可将浓缩的细胞悬浮液(例如含有上述由UMC生产的神经元的悬浮液)均匀地分布到基质表面上。浓缩悬浮液典型地是为了避免超过基质吸收液态悬浮液的容量而使用的。例如，用于GORE RESOLUT XT基质的细胞悬浮液通常具有大约94μl到125μl的体积，每平方厘米的基质含有大约2.0×106到大约4.0×106个细胞。细胞可在未进一步添加培养基时附着到基质上。细胞可与基质在例如大约37℃下孵育大约1-2小时。在孵育后大约60分钟，细胞典型地附着并均匀分布到整个基质材料上。此时，含有加载了细胞的基质的培养容器可以补充额外的培养基，细胞可在基质中培养大约3-4天。因为细胞是被高密度地添加到基质以充分填满基质内部空间的，所以在这3-4天的培养期间很少或没有增殖发生。事实上，明显的细胞增殖在这个期间典型地是不期望的，因为分裂细胞可以分泌能降解或部分降解基质的酶(例如胶原酶)。
有细胞附着的基质典型地用例如盐水或者没有血清和酚红的培养基清洗(比如最少清洗3次，每次10分钟)以基本除去在给予患者时可能引起免疫反应的免疫原性蛋白质(例如如果在基质接种步骤使用了含有非自体血清的培养基的源自培养基血清的蛋白质)。每次清洗可以使用新鲜PBS。然后可将基质在使用之前在新鲜PBS或无血清培养基中孵育(例如2小时长的孵育)。在孵育之后，可将含有细胞的基质置于组织恶化或缺损的区域。
对于胶原海绵基质(例如COLLACOTE)，在大约1.5ml生长培养基中的大约1.5×106到2.0×106个细胞(或根据需要而更多)可以接种到2cm×4cm的薄(大约2.5到3.0mm的厚度)海绵上。然后可将海绵在未进一步添加额外培养基时在37℃下孵育大约1-2小时，使基本所有的细胞都充分贴壁到基质材料上。在细胞贴壁后，可将额外的培养基添加到基质和细胞组合物，然后可将它们在37℃下孵育3-4天，每天换培养基。如果含有非自体血清的培养基被用于细胞接种步骤，可将组合物从含有这种血清的培养基中移出，并用PBS反复清洗(例如3次或更多)。在每次添加PBS后，基质可以在弃去PBS之前孵育10-20分钟。在最后一次清洗之后，组合物可以立即给予受试者，或者转移到装有生理溶液(例如Kreb′s Ringer溶液)的运输小瓶中，并在大约4℃下孵育达大约24-48小时。
对于膜基质(例如BIOMENDTM)，在大约100μl培养基中的大约1.5×106到2×106个细胞(或者多于所需要的量)可以接种到15mm×20mm的薄(大约0.5到1.0mm的厚度)膜上。然后可将膜在未进一步添加额外培养基时在37℃下孵育大约30-60分钟，使基本所有的细胞都充分贴壁到基质材料上。在细胞贴壁后，可将额外的培养基添加到基质和细胞组合物上，然后可将它们在37℃下孵育2-3天，每天换培养基。细胞典型地是以高密度(见上文)添加到基质，以使得它能充分填充细胞可达到的基质内的空间。清洗组合物象上文对海绵基质的记载一样，可以立即使用或孵育。
在诸如上述无机基质(例如BIO-OSS块)或者脱矿质的骨基质(例如DYNAGRAFTTM基质)的块状基质的情况下，在大约100到150μl生长培养基中的大约1.5×106到2.0×106个细胞(或者根据需要而更多)可以接种到1cm×1cm×2cm的基质材料立方块中。细胞典型地被缓慢接种到块状基质的一个面上。一旦培养基和细胞都被吸收进块内后，可以用同样的方式在块的另外一个面上接种。可以重复这个程序，直到这个块的所有面都接种并且这个块被培养基完全饱和。应该小心避免添加过量的培养基从而引起培养基和细胞从块中渗漏。然后可将组合物在未进一步添加额外培养基时在37℃下孵育大约60-120分钟，使基本所有细胞充分贴壁到基质材料上。在细胞贴壁后，可将额外的培养基添加到基质和细胞组合物，然后可将其在37℃下孵育2-3天，每天更换培养基。细胞典型地是以高密度(见上文)添加到基质，以使得它能充分填充细胞可达到的基质内的空间，并和上述结果一样。清洗组合物象上文对海绵基质的记载一样，可以立即使用或孵育。
含有本发明的神经元和小颗粒生物可降解的基质(例如FASCIANTM、CYMETRATM或DERMALOGENTM)的组合物可以通过在用金属锁连接的两个注射器之间来回传递来混合成分而进行制备。例如FASCIANTM典型地可以以80mg/注射器提供在注射器(例如3cc注射器)中。FASCIANTM颗粒可以在使用之前直接在注射器中清洗，吸取少量(例如1.5ml)清洗缓冲液(例如等渗盐水或含有右旋糖的Kreb′s Ringers溶液)放入注射器中，通过金属锁将第一个注射器和第二个注射器连接，在这两个注射器之间来回传递颗粒和清洗溶液数次。要将颗粒从清洗液中分离，可将混合物转移到一个无菌管中，并使FASCIANTM颗粒沉淀。可将溶液去除(例如轻轻倒出或吸出)，当期望时可反复进行清洗程序，其通过将颗粒吸取到一个新注射器中(例如通过18规格或20规格的针头)。
当颗粒被适当清洗后，可以用与清洗相同的程序将其与细胞混合。细胞(例如1.5×106到2×106个细胞)可悬浮在溶液(例如1.5 ml含有5％右旋糖的  Kreb′s Ringers溶液)中，并吸收到注射器中。含有这些细胞的注射器可以通过金属锁与含有填充颗粒的注射器连接，这两种成分可以通过在注射器之间来回传递进行混合。然后可将混合物转移到一个T-25组织培养瓶或组织培养皿或管中，这样细胞就能附着到填料颗粒上。或者当附着发生的时候，混合物仍然在注射器内，尽管这可能对细胞更有害。混合物可以孵育过夜，然后转移到容器(例如小瓶或管)中交给医师或者转移到注射器给予患者。要交给医师的容器在运输过程中可以保持在冰上。当使用这种小颗粒的无细胞生物可降解基质时，含有细胞的颗粒悬浮液任选地进行注射而不是将其植入到组织退化或缺损的区域。
可以理解的是，本发明的组合物除含有细胞和药学上可接受的载体和/或生物可降解的无细胞基质(见下文)、和/或生物可降解无细胞填料(见下文)外，还可含有任何一种或多种上文所列出的神经元生长因子。
本发明也提供了制造含有本发明神经元和基质成分的组合物的方法。这些方法典型地涉及提供包括大量神经元的细胞群，提供生物可降解的无细胞基质，将生物可降解的无细胞基质与细胞群一起孵育，这样细胞就能整合到基质上或基质内，从而形成一种可用于修复损伤的或缺损的神经组织的组合物。
生物可降解的无细胞填料材料
本发明组合物可含有本发明的神经元，同时含有一种或多种生物可降解的无细胞可注射填料材料(即填充剂)。组合物适于注射到受试者体内以修复退化的组织。填料材料通常充当结构功能。比如，它可以填充组织内的缺损、孔、间隙或空腔，并提供一个被注射的细胞可以贴壁到周围组织上并且由于新组织的生长而生长并产生结构因子和其它因子(例如趋化因子)的环境。在许多情况下，填料的间隙填充功能只是暂时的，只持续到被植入的和/或宿主细胞迁移入这个区域并形成新组织为止。填料优选是生物可降解的。填料典型地是以粘性溶液或悬浮液的形式提供或使用。填料可以与包括本发明神经元的细胞群组合。
生物可降解的无细胞可注射填料的许多类型都可以用于本发明的组合物。填料可以由包括从受试者获得的任何胶原类型的自体蛋白质组成。这种组合物的一个例子就是以前由Collagenesis Corp.(Beverly，MA)生产的Autologen。Autologen是来自受试者的自体真皮胶原纤维的分散体，所以在与诸如UMC和任选的成纤维细胞一起再次给予受试者时不会引起甚至最小限度的免疫反应。为了获得Autologen，从受试者获得组织(例如真皮、胎盘或者脐带)样品并交给Collagenesis Corp.，在那里样品被加工成为富含胶原的分散体。大约1.5平方英寸的真皮组织可以生产1立方厘米(cc)的Autologen。Autologen的浓度可以根据受试者体内矫正缺损或增大组织的所需的量进行调节。在分散体中Autologen的浓度可以是例如至少大约25mg/L(例如至少大约30mg/L，至少大约40mg/L，至少大约50mg/L或至少大约100mg/L)。
无细胞可注射填料材料也可以含有非自体蛋白质，包括任何类型的胶原。许多胶原产品可以商业得到，用于本发明的组合物。人胶原产品也可以商业得到。商业可得到的胶原的例子包括但不限于牛胶原，例如诸如Zyderm和Zyplast的重构牛胶原产品，其含有与戊二醛交联并悬浮在含有0.3％利多卡因的磷酸盐缓冲生理盐水中的重构牛胶原纤维。这些产品是由Santa Barbara，CA的McGhan MedicalCorporation生产的。猪胶原产品也可以商业得到。在本发明中有用的胶原可以从合适的物种的组织中分离，或者它们可以被制成重组蛋白质。重组蛋白质可以含有与天然存在蛋白质一样的氨基酸序列，或者它们可以具有含有改善蛋白质功能的氨基酸替换、缺失或插入的氨基酸序列。
有用的填料材料的其它例子包括但不限于：溶解的明胶、聚乙醇酸(例如溶解的聚乙醇酸或聚乙醇酸颗粒)或羊肠线缝合物。一种特定的明胶基质植入物是例如以Fibril的商标出售。该填料含有等量的(1)分散在0.9％(按体积计算)氯化钠溶液中的猪明胶粉末和o-氨基己酸的混合物、和(2)来自患者的一份血浆。其它有用的作为填料的物质包括：透明质、透明质酸、restalyn和parleane。
本发明也提供了制备含有本发明神经元和生物可降解的无细胞填料的组合物的方法。这些方法典型地涉及提供一种包括本发明的基本上没有免疫原性蛋白质(例如源自培养基血清的蛋白质)的神经元的细胞群，提供一种或多种生物可降解的无细胞填料材料，并将填料和细胞群组合。
使用本发明的神经元的方法
本发明的神经元和组合物可在体外和体内使用。神经元以及含有神经元的组合物的体外用途包括它们用作体外筛选或测试感兴趣的用于例如神经元生长促进活性或神经毒性活性的化合物的靶的用途。它们也可用于体外和体内的基础神经生物学研究。
神经元特别适用于治疗任何种类的神经系统疾病(见上文)。神经元可经注射、植入或移植给药。它们可在例如去除肿瘤切除部位的肿瘤手术期间植入。这样，例如，在药学可接受的载体和/或生物可降解的无细胞填料(见上文)中的含有本发明的神经元的组合物(见上文)可以被注入到感兴趣的CNS区域(例如脑室或脊髓)。或者，附着到和/或掺入生物可降解的无细胞基质(见上文)中的神经元可以被植入或移植到损伤的或缺陷的CNS组织(脑或脊髓)或者外周神经。
给药可以是单次或多次。因此，它们可以进行一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、17、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、700、1000或者更多次。在进行多次给药时，给药可间隔任何适当的时间，例如30秒、一分钟、两分钟、三分钟、四分钟、五分钟、1 0分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、两小时、三小时、四小时、五小时、八小时、12小时、1 8小时、24小时、两天、三天、四天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、八个月、十个月、一年、18个月、两年、三年、四年、五年、六年、八年、十年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年或者甚至更长的时间间隔。
一种或多种生长因子也可以给予本发明的神经元受体。这些因子包括上文列举的任意因子。可以理解的是，相关生长因子可能直接作用来促进植入或移植的神经元的生长或者可能通过作用在其它细胞上来间接帮助组织修复，例如通过增强血管生成。生长因子可以跟含有神经元的组合物成分一样给予受试者。或者，它们可以分开给药并且或者同时或者在不同时间给药。此外，它们可以在细胞组合物同一部位或者不同部位进行给药。它们可以全身或局部给药，例如口服、经皮、经直肠、经阴道、鼻内、胃内、气管内或肺内或静脉内皮下、肌内或者腹膜内注射给药。给药频率与细胞组合物的一样(见上文)。
生长因子可以生长因子本身的形式给药。或者，它可以通过结合到或包裹入作为生长因子储池或仓库的固体基质上而被传递。固体基质可以是一个物体或者多个物体(成形为例如颗粒或线)。生长因子从固体基质逐渐释放到其环境中。在固体基质是珠的形式时，珠通常是具有约0.005-2.0mm直径的近似球形。在固体基质是线状时，线通常具有0.01-1.0mm的直径。这些线在形成凝胶前可被折叠成网状或者切成小片(约5-10mm)。在含神经元的组合物还含有生物可降解的无细胞基质时，可以理解的是，如果需要，基质还可以作为固体基质起减缓生长因子释放的作用。能够制造成固体基质的物质包括胶原、明胶、乙烯-乙酸乙烯酯、聚交酯/羟基乙酸共聚物、纤维蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维素、胶乳、多羟基乙基甲基丙烯酸酯、尼龙、涤纶、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、羊肠线、棉花、亚麻、聚酯以及丝绸。
固体基质可以将肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合到它上面，作为促进肝素结合的生长因子(例如bFGF、VEGF或PDGF)结合到它上面的手段。这种固体基质的一个例子是主要由琼脂糖与结合到其上的肝素组成的珠。固体基质可以是各种物理形状，例如珠、不规则颗粒、片或者线。当生长因子包裹到固体基质中时，生长因子随着时间而逐步释放，例如由于作用在固体基质上的酶。
将一种或多种生长因子送递给受试者的另一种手段是通过给予受试者用一种或多种含有编码一种或多种生长因子的核酸序列的表达载体转染或转化的重组细胞。这些细胞可以是神经元本身或者其它细胞类型，例如成纤维细胞、UMC、角化细胞、内皮细胞或淋巴样细胞。适用于神经元的组织相容性需求(见上文)同样适用于用来送递生长因子的重组细胞；这些细胞优选源自受体，即它们是自体的。
既然本发明的神经元是源自UMC的，那么可以理解的是，这里描述的所有UMC(例如由实施例1中所述方法生产的那些)都可用于治疗同样的列举在这里作为用本发明神经元可治疗的神经系统疾病。此外，UMC可以是这里所述的任何组合物的成分。
下面的实施例用来举例说明但并不限制本发明。
实施例
实施例1-自体UMC和成纤维细胞的分离
按如下方法从得自正常健康人志愿者的皮肤活检物起始培养来体外收获和富集细胞以得到UMC。约10到200mm3的活检物从耳廓后区域获得，成纤维细胞组织培养如上所述使用含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的DMEM进行起始。在贴壁成纤维细胞传代两次或三次达到完全汇合后，观察到了不贴壁的活跃生长细胞的集落。这个过程能够通过在较少血清中起始培养以及通过5ng/ml的aFGF的存在而缩短，或者通过在直接来自组织的血浆凝块中生长细胞(见实施例2)，其中加入300mM的CaCl2达到15mM的终浓度。每个集落包括2到约80个的细胞，其具有鹅卵石样形态并活跃分裂。通过吸出含有漂浮集落的培养基并离心该培养基来收集集落。将离心沉淀的细胞转移到新的组织培养皿中，其通过直接接种在含有aFGF和肝素的新鲜培养基(含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％热灭活的FBS、5ng/mL的重组人aFGF和5pg/mL肝素的DMEM)中而实现。将细胞悬液加入到新鲜组织培养瓶中，在37℃孵育。每周给细胞加料两次，并在达到汇合时(通常在一到两周内)进行传代或分化性胰蛋白酶消化。在起始培养约3-6周内观察到了鹅卵石样的细胞集落。分离集落并在新鲜组织培养器皿中培养使细胞变成了贴壁的。
不贴壁细胞集落也从人脂肪组织如下分离到了。将组织切成小片并去除所有可见的膜。将组织置于DMEM培养基中，其中含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％热灭活的FBS、1到10ng/mL的重组人aFGF和5pg/mL肝素。在这些条件下，鹅卵石样的细胞从脂肪组织活跃脱落，并继续长期生长。将脂肪组织小片清洗并置于新鲜组织培养器皿中。在大约2周之内，将UMC经IV型胶原酶37℃处理大约5-15分钟而从组织中分离。来自脂肪组织的新细胞在培养中保持活跃生长超过一年，直到培养终止。一旦培养物充分生长，就观察到了不贴壁细胞的簇集。当这些细胞重新接种在新鲜组织培养瓶中时，观察到了同样类型的细胞活跃生长。
在存在aFGF时，来自皮肤和脂肪组织培养物的细胞在外观上是形态相似的并具有鹅卵石样形态。然而，当从培养基中去除aFGF时，大多数的细胞完全分化成了贴壁的成纤维细胞。鹅卵石样的不贴壁细胞也在由骨髓起始的培养物中观察到了，其利用由Marko等人描述的方法(见上文)。因此，看起来至少从由真皮建立的成纤维细胞培养物或者从脂肪组织或骨髓的培养物收获的不贴壁上皮样细胞确实是UMC。
实施例2-UMC分化为神经元
在初步实验中，发现由牛血浆制备的凝块在支持细胞生长方面与由胎牛血浆制成的那些凝块一样有效。比培养基中通常存在的浓度(即约2mM)更高浓度的Ca2+的存在对于血浆凝块UMC培养物中神经元的生长是必需的。血浆凝块中神经元的分化、生长和迁移都被发现依赖于用于凝块生产的Ca2+(以CaCl2的形式)的浓度。发现CaCl2的最优浓度是大约8mM到大约15mM。
以下是代表性实验的说明。
冻干的牛血浆(Sigma Aldrich Co.，St.Louis，MO；Cat.No.P-4639)用适当体积的不含肝素的组织培养基例如DMEM或Neurobasal培养基(见上文)进行重构。将适当体积的CaCl2储液(例如300mM)加入到一系列塑料组织培养皿(一组具有30mm的直径，另一组具有60mm的直径)中，以使加入血浆后的终浓度是15mM。将血浆加入到培养皿中(1ml到30mm培养皿，2ml到60mm培养皿)，将其涡旋以混合CaCl2和血浆。薄的凝块(高度小于1mm)通过加入0.5到0.75ml血浆到30mm培养皿中以及1.0到大约1.25ml血浆到60mm培养皿中而制得；如上所述，将适当体积的CaCl2溶液加入到培养皿中达到终浓度为15mM。
然后将培养皿在室温或37℃孵育直到血浆凝结。在37℃凝结需要大约2-3小时，这比在室温快。将大约2ml组织培养基加入到30mm组织培养皿中，5ml加入到60mm组织培养皿中。组织培养基是“N培养基”(见上文)。然后将培养皿储存在37℃、10％CO2空气的组织培养箱中，直到准备使用。如实施例1所述制备的少量(每个凝块大约5个细胞到大约105个细胞)真皮来源的UMC加入到每个培养皿中，允许细胞沉降在每个凝块上。培养皿中的组织培养基每3-4天更换；去除用过的培养基后，加入1.5ml到30mm组织培养皿中，加入3ml到60mm组织培养皿中。凝块中细胞的生长延续了大约一年，这是用显微镜观察到的。
血浆凝块中的UMC亚群在起始培养2-3天后观察到了向神经元的分化。在大多数培养物中，具有唯一轴突的小细胞是首先出现神经元形态的细胞。在以后阶段，具有树突状外观的细胞在培养基中是可见的。大多数UMC来源的神经元在凝块的上部生长，保持UMC形态的细胞靠近凝块底部。
当凝块中的细胞达到较高的密度时，将一片或多片血浆凝块转移到新鲜制备的血浆凝块上。细胞在18-24小时中从被转移的片移动到新凝块中。神经元是迁移入新凝块的第一种细胞。含有细胞的血浆凝块用标准的含DMSO的冷冻培养基贮存在液态N2中(见上文)。
如果将薄的(垂直尺寸小于1mm)的血浆凝块用于神经元的长出，细胞可以通过用标准技术进行的胰蛋白酶处理而从凝块中收获。1U/ml浓度的血纤维蛋白溶酶原(Sigma；Catalog No.P-9156)用于从较厚的血浆(垂直尺寸大约3mm到大约4mm)回收神经元。需要三次处理来从凝块释放神经元。由前两次处理所释放的细胞几乎全部(如果不是全部)是UMC和其它污染细胞。看起来通过增加血纤维蛋白溶酶原的浓度，由一次或者可能两次处理来释放神经元是可能的。
通过在凝块周围的培养基中包括B27(或者N-2)培养补充物混合物(Gibco，Carlsbad，CA)来增加凝块中神经元的产生。在培养基中使用aFGF作为唯一的生长因子也观察到了人神经元的生长增强。然而，在用从大鼠皮肤制备的UMC进行的平行实验中，需要生长因子的组合(bFGF、长形EGF、LIF和R3长形IGF)；除了aFGF之外的这些生长因子在人细胞培养基中的存在进一步增加了神经元的生长。
不用实施例1记载的方法生产的UMC，而是用皮肤和脂肪组织的小片(例如尺寸各自为大约0.5到大约5mm的近似立方体的碎片)在血浆凝块中产生神经元也是可能的。这两种组织在分开的实验中测试。组织碎片直接置于凝块表面上。培养皿中的培养基水平面要足够高以防止变干，但也要足够低以防止组织碎片漂浮并允许它们附着到血浆凝块表面。在这些培养物中，通过使用带有低血清浓度(即不高于2.5％)并包含人aFGF(5ng/ml)的培养基来防止成纤维细胞的过度生长。碱性FGF(bFGF)也可以加入到培养基中。起始这些培养5-7天期间，在组织碎片紧邻的凝块中观察到了神经元的生长。组织(皮肤或脂肪)碎片可从原始血浆凝块中移出并用于接种新的血浆凝块。从脂肪组织回收的神经元在形态上不同于从皮肤回收的神经元。那些从皮肤产生的是小的树突细胞，而那些从脂肪产生的是大的少突细胞。
在重新接种进血浆凝块后，源自人和大鼠骨髓的UMC(以前也称为前脂肪细胞)就在血浆凝块中产生出神经元。这些UMC/前脂肪细胞记载于共同未决的美国专利申请Serial No.10/330,584中，其公开内容整体引入这里作为参考。考虑到从皮肤和脂肪碎片生长神经元的能力(见上文)，很可能从骨髓细胞或骨髓碎片生长它们同样是可行的，象对皮肤和脂肪碎片所进行的一样将骨髓细胞或骨髓碎片置于血浆凝块表面。
一旦神经元由上述血浆凝块方法产生，它们就可以从凝块中分离并在标准液体培养条件下生长。
本发明的许多实施方式已经被记载。然而，能够理解的是，可以进行不脱离本发明精神和范围的各种修改。相应地，其它实施方式是在下面权利要求的范围之内的。

Claims (26)

1.生产神经元的方法，该方法包括如下连续步骤：
(a)提供未分化的间充质细胞(UMC)来源；
(b)提供含有约6mM到约18mM Ca2+的血浆凝块；
(c)将UMC从来源加入到血浆凝块中；并且
(d)孵育血浆凝块，
其中，在孵育期间，血浆凝块中的UMC亚群分化为神经元，从而在血浆凝块中产生了包括神经元的细胞群。
2.权利要求1的方法，其中UMC来源是哺乳动物皮肤碎片。
3.权利要求1的方法，其中UMC来源是哺乳动物脂肪组织碎片。
4.权利要求1的方法，其中UMC来源是含有UMC的不贴壁的衍生细胞群，不贴壁的衍生细胞通过如下过程生产，包括：
(a)提供含有未分化的间充质细胞(UMC)的组织的碎片以获得起始细胞；
(b)从所述碎片中分离起始细胞；
(c)培养起始细胞；并且
(d)从所述培养物中收获不贴壁的衍生细胞群，其中所述的不贴壁的衍生细胞包括UMC。
5.权利要求4的方法，该过程进一步包括一轮或多轮衍生，包括利用从前一轮收获的不贴壁的衍生细胞作为起始细胞重复步骤(c)和(d)。
6.权利要求5的方法，其中一轮或多轮额外的衍生包括一个到二十轮。
7.权利要求4的方法，其中所述的含有UMC的组织选自：真皮组织、脂肪组织、结缔组织、筋膜、固有层以及骨髓。
8.权利要求4的方法，进一步包括在酸性成纤维细胞生长因子存在下培养所述不贴壁的细胞。
9.权利要求1的方法，进一步包括从血浆凝块中分离细胞群。
10.权利要求9的方法，进一步包括在无血清培养基中培养所分离的细胞群。
11.权利要求1的方法，其中UMC来源是从给予了该细胞群的个体中获得的。
12.由权利要求1的方法生产的神经元。
13.含有包括了神经元的细胞群的组合物，其中细胞群是由权利要求1的方法生产的。
14.权利要求13的组合物，进一步包括药学可接受的载体。
15.权利要求13的组合物，进一步包括无细胞的生物可降解基质，其中细胞群的细胞被整合到基质内或基质上。
16.权利要求13的组合物，进一步包括无细胞的生物可降解填料。
17.权利要求13的组合物，其中组合物基本上没有来自培养基血清的蛋白质。
18.修复哺乳动物受试者中损伤的或缺损的神经组织的方法，该方法包括将权利要求13的组合物注射入、移植或者植入到神经组织中。
19.权利要求18的方法，其中神经组织是中枢神经系统(CNS)组织。
20.权利要求19的方法，其中CNS组织是脊髓组织。
21.权利要求21的方法，其中CNS组织是脑组织。
22.权利要求18的方法，其中神经组织是外周神经系统(PNS)组织。
23.权利要求18的方法，其中哺乳动物受试者是人患者。
24.权利要求18的方法，其中哺乳动物受试者具有脊髓损伤。
25.权利要求18的方法，其中哺乳动物受试者患有选自下组的疾病或缺损：阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、泰氏-萨氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、中风、面神经退化、手的外周损伤、神经纤维瘤病、纤维肌痛、脊髓空洞症、神经系统的自身免疫疾病、以及神经组织肿瘤。
26.权利要求20的方法，其中组合物的细胞群是自体的。
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