CN110169959B - 生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法。生长因子缓释微球包括聚乳酸‑羟基乙酸共聚物基质材料以及包封于基质材料中的重组人转化生长因子β3;微球中重组人转化生长因子β3的包封量为5ng/mg~200ng/mg;微球的缓释期为28天以上。本发明的生长因子缓释微球及组织工程软骨复合支架具有较高的缺损软骨组织再生修复效果。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域,尤其涉及一种生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法。
背景技术
软骨是人或动物体内骨骼系统的重要组成部分,软骨组织为高度特化的结缔组织,其特点是组织中缺乏血管、神经及淋巴管,细胞外基质呈致密的固态,软骨细胞被大量的细胞外基质(如胶原、纤维、蛋白、多糖等)包绕。正是由于软骨的组织学特性、生化成分的构成及软骨细胞处于低代谢和低增殖状态的特征,限制了软骨细胞的增生反应及向损伤区域的迁移,导致损伤后的软骨组织进行自我修复与再生的能力较低,难以实现自身修复及再生,并会逐步加重,导致骨关节炎,引起关节功能障碍。
基于此,本发明提供一种生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法,这为软骨损伤的治疗提供了新的技术手段。
发明内容
本发明实施例提供了一种生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法,旨在提高软骨损伤的治疗效果。
第一方面,本发明实施例提供一种生长因子缓释微球,微球包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),简称PLGA)基质材料以及包封于基质材料中的重组人转化生长因子β3(Recombinant Human Transforming Growth Factor-beta 3,简称rhTGF-β3);微球中rhTGF-β3的包封量为5ng/mg~200ng/mg;微球的缓释期为28天以上。
第二方面,本发明实施例提供一种生长因子缓释微球的制备方法,包括以下步骤:
提供浓度为1μg/mL~100μg/mL的rhTGF-β3水溶液;
提供浓度为20mg/mL~25mg/mL的PLGA油相溶液;
提供浓度为5mg/mL~10mg/mL的聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,简称PVA)水溶液;
将rhTGF-β3水溶液与PLGA油相溶液在冰浴中超声混合,得到初级乳液;
将初级乳液与PVA水溶液在20℃~25℃下搅拌混合,得到微球溶液;
将微球溶液分离处理,得到初始微球经洗涤、冷冻干燥后,得到生长因子缓释微球,微球中rhTGF-β3的包封量为5ng/mg~200ng/mg,微球的缓释期为28天以上。
第三方面,本发明实施例提供一种组织工程软骨复合支架,包括:
组织工程支架,包括沿自身高度方向依次层叠的多个支架层,相邻两个支架层中的一者包括多个沿第一方向相互间隔设置的纤维组,另一者包括多个沿第二方向相互间隔设置的纤维组,每个纤维组包括可降解高分子纤维及设置于可降解高分子纤维自身宽度方向的一侧或两侧的水凝胶纤维,水凝胶纤维沿可降解高分子纤维的长度方向延伸,第一方向与第二方向相交;
基质材料,复合于组织工程支架的水凝胶纤维中;
上述的生长因子缓释微球,复合于组织工程支架的水凝胶纤维中。
第四方面,本发明实施例提供一种组织工程软骨复合支架的制备方法,包括以下步骤:
提供包含基质材料和所述生长因子缓释微球的第一水溶液;
提供包含水凝胶的第二水溶液;
将第一水溶液和第二水溶液混合,得到生物墨水;
以生物墨水作为水凝胶纤维的原料、以可降解高分子材料作为可降解高分子纤维的原料,打印得到上述的组织工程软骨复合支架。
相对于现有技术,本发明至少具有以下有益效果:
本发明实施例提供的生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法,其中生长因子缓释微球具有rhTGF-β3控缓释放性能好的特点,能够实现长期有效的rhTGF-β3释放浓度,以及长期有效的发挥rhTGF-β3的细胞募集能力,达到提高缺损软骨组织的再生修复效果。
此外,组织工程软骨复合支架很好地仿生了软骨胶原取向和成分分布以及细胞生长的微环境,融合了可降解高分子纤维良好的力学性能和生物可降解性、基质材料良好的生物相容性、以及生长因子缓释微球的可控缓释性能和强大的细胞募集能力,有利于细胞的生长、迁移、增殖及再分化,从而可以很好地促进无血管区的部分或全部缺损软骨组织的再生修复,使新生软骨组织具有优良的形态、力学性能及生理功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的生长因子缓释微球的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图2为本发明实施例2的生长因子缓释微球的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图3为本发明实施例3的生长因子缓释微球的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图4为本发明实施例1至3的生长因子缓释微球体外累计释放度曲线图。
图5为Transwell迁移实验结果图像,其中A为阴性组;B为阳性组;C为空白组;D为实验组1;E为实验组2;F为实验组3。
图6为Transwell迁移实验结果统计分析图,其中A为阴性组;B为阳性组;C为空白组;D为实验组1;E为实验组2;F为实验组3。
图7为本发明实施例的组织工程软骨复合支架的结构图。
图8为本发明实施例的组织工程软骨复合支架的截面示意图。
图9为本发明实施例的组织工程软骨复合支架中支架层的示意图。
图10为本发明实施例的组织工程软骨复合支架的普通光学显微镜镜图像。
图11为本发明实施例的组织工程软骨复合支架负荷兔脂肪干细胞共聚焦显微镜图像。
图12为本发明实施例的组织工程软骨复合支架负荷小鼠巨噬RAW细胞SEM图像。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰,以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请,并非为了限定本申请。
为了简便,本文仅明确地公开了一些数值范围。然而,任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围;以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围,同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外,尽管未明确记载,但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而,每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中,需要说明的是,除非另有说明,“以上”、“以下”为包含本数,“一种或多种”中“多种”的含义是两个以上。
本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处,通过一系列实施例提供了指导,这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中,列举仅作为代表性组,不应解释为穷举。
组织工程学是综合应用工程学和生命科学的原理与技术,在体外预先构建一个有生物活性的种植体,然后植入体内,达到修复组织缺损和重建组织功能的目的。为了实现将组织工程骨应用于临床软骨缺损的治疗,本发明实施例提供一种生长因子缓释微球、组织工程软骨复合支架及制备方法。
首先说明本发明实施例第一方面提供的一种生长因子缓释微球,微球包括PLGA基质材料以及包封于基质材料中的rhTGF-β3;微球中rhTGF-β3的包封量为5ng/mg~200ng/mg;微球的缓释期为28天以上。
本发明实施例提供的生长因子缓释微球具有rhTGF-β3控缓释放性能好的特点,能够实现长期有效的rhTGF-β3释放浓度,以及长期有效的发挥rhTGF-β3的细胞募集能力,达到提高缺损软骨组织的再生修复效果。
采用PLGA对rhTGF-β3进行包封,实现rhTGF-β3的长期缓释,避免了rhTGF-β3作用时间短、易被降解和作用一过性等问题,有效防止rhTGF-β3因新陈代谢过程、生理环境变化、或与酶的作用而变性,更好地发挥rhTGF-β3的生物学作用。
本发明实施例提供的生长因子缓释微球能够应用中组织工程软骨复合支架中,达到对缺损软骨组织长期有效的再生修复效果。
在一些实施例中,生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封量为30ng/mg~200ng/mg。
进一步地,微球在第一天的缓释量为0.05%~0.5%,微球在第一天具有最大缓释速率。让rhTGF-β3以较小的速率逐渐缓释,既能达到长期的局部较小有效药物刺激浓度,又能抑制rhTGF-β3过量的潜在并发症,对于需要长时间生长和恢复的软骨缺陷来说提供良好的治疗效果,并且提高成骨质量、降低炎症反应及其他风险。
进一步地,微球在第一周的缓释量为0.1%~1%。
上述的“第一天的缓释量”及“第一周的缓释量”均是以微球的初始rhTGF-β3含量为基准计算的。
在一些实施例中,生长因子缓释微球的缓释期可以达到半年以上,如200天~600天,再例如300天~600天。
在一些实施例中,PLGA的分子量优选为1×105Da~1.1×105Da,更优选为1.02×105Da。
进一步地,PLGA中乳酸与羟基乙酸的摩尔比优选为1:1~5:1,例如2.5:1~3.5:1,再例如为3:1。
在一些实施例中,生长因子缓释微球的粒径优选为5μm~100μm,更优选为5μm~50μm。这有利于更好地实现rhTGF-β3的控缓释放。
进一步地,生长因子缓释微球的表面可以具有轻微起伏,相邻两波峰之间的间距例如为0.1μm~2.5μm,进一步为0.3μm~2μm。生长因子缓释微球微球形貌良好,有利于细胞粘附,促进细胞的生长、迁移、增殖及再分化,提高缺损软骨组织的再生修复效果。
本发明实施例第二方面提供一种生长因子缓释微球的制备方法,通过该制备方法能够制备得到上述的生长因子缓释微球。制备方法包括以下步骤:
S10,提供浓度为1μg/mL~100μg/mL的rhTGF-β3水溶液。
在步骤S10,可以是将rhTGF-β3溶于去离子水中,制备浓度为1μg/mL~100μg/mL的rhTGF-β3水溶液,作为内水相w1。
S20,提供浓度为20mg/mL~25mg/mL的PLGA油相溶液。
在步骤S20,可以是将PLGA溶于二氯甲烷(DCM)中,制备浓度为20mg/mL~25mg/mL的PLGA油相溶液,作为油相o。该种油相o能够对rhTGF-β3具有较高的包封率。
在步骤S20,PLGA的分子量优选为1×105Da~1.1×105Da,更优选为1.02×105Da。进一步地,PLGA中乳酸与羟基乙酸的摩尔比优选为1:1~5:1,例如2.5:1~3.5:1,再例如为3:1。rhTGF-β3与该些PLGA之间的作用较好,能够提高生长因子缓释微球对rhTGF-β3的包封率,并使得生长因子缓释微球具有改善的rhTGF-β3控缓释放速率,延长缓释周期,满足软骨缺损的长期再生修复需求。并且,该些PLGA的生物可降解性较好,能够为细胞附着、增殖和分化提供优良载体。
S30,提供浓度为5mg/mL~10mg/mL的PVA水溶液。
在步骤S30,将PVA溶于去离子水中,制备浓度为5mg/mL~10mg/mL的PVA水溶液,作为外水相w2。该外水相w2能够为生长因子缓释微球的形成提供优良的环境。
在步骤S30,PVA水溶液中聚乙烯醇的分子量优选为6×104Da~7×104Da,更优选为6.7×104Da。
S40,将rhTGF-β3水溶液与PLGA油相溶液在冰浴中超声混合,得到初级乳液。
在步骤S40,通过将rhTGF-β3水溶液与PLGA油相溶液在冰浴中超声混合,能够将其充分均质乳化,有利于提高PLGA对rhTGF-β3的包封率,以及提高rhTGF-β3在微球中的分散均匀性,从而提高rhTGF-β3的利用率,并改善rhTGF-β3的控缓释放效果。此外,还有效保存了rhTGF-β3的生物学活性。
在步骤S40,rhTGF-β3水溶液与PLGA油相溶液混合的体积比为1:5~1:10。
进一步地,超声混合的超声功率优选为70W~75W,超声时间优选为10s~30s。
步骤S40可以在超声细胞粉碎机中进行,如美国Qsonica Q125型超声波破碎仪,使破碎仪探头以60%振幅(超声功率为75W)震荡10s~30s,将rhTGF-β3水溶液与PLGA油相溶液超声混合,得到初级乳液。
S50,将初级乳液与PVA水溶液在20℃~25℃下搅拌混合,得到微球溶液。
在步骤S50,rhTGF-β3与PLGA自组装成微球,搅拌过程中还使得DCM挥发除去。
在步骤S50,初级乳液与PVA水溶液混合的体积比可以为1:5~1:25,例如为1:8~1:12。
进一步地,搅拌混合的速率优选为500rpm~1000rpm,时间优选为4h~12h。
S60,将微球溶液分离处理,得到初始微球经洗涤、冷冻干燥后,得到上述的生长因子缓释微球。
在步骤S60,可以采用抽滤法、离心分离法等方法将微球溶液分离处理得到初始微球。例如,将微球溶液在1500rpm~2000rpm下离心分离3min~5min。
可以采用去离子水对初始微球进行反复清洗2~4次,如3次。
可以将经洗涤后的初始微球在-4~-20℃下冷冻干燥18h~24h,得到生长因子缓释微球。
将制备得到的生长因子缓释微球于-4℃~-25℃的条件下保存备用,例如在-20℃的条件下保存备用。
采用本发明实施例的生长因子缓释微球的制备方法,对rhTGF-β3还具有较高的包封率,可以达到80%以上,进一步地90%以上,能够提高rhTGF-β3的利用率。
接下来说明本发明实施例第三方面提供的一种组织工程软骨复合支架,请参照图7至图9,组织工程软骨复合支架包括组织工程支架以及复合于组织工程支架的基质材料和上述的生长因子缓释微球。
上述组织工程支架呈多孔框架结构体,其包括沿自身高度方向依次层叠的多个支架层1,相邻两个支架层1中的一者包括多个沿第一方向(如图8中的X方向)相互间隔设置的纤维组2,另一者包括多个沿第二方向(如图8中垂直于纸面的方向)相互间隔设置的纤维组2,每个纤维组2包括可降解高分子纤维3及设置于可降解高分子纤维自身宽度方向的一侧或两侧的水凝胶纤维4,水凝胶纤维沿可降解高分子纤维的长度方向延伸,其中第一方向与第二方向相交,优选地,第一方向与第二方向垂直。
基质材料和生长因子缓释微球均复合于组织工程支架的水凝胶纤维4中。
本发明实施例提供的组织工程软骨复合支架很好地仿生了软骨胶原取向和成分分布以及细胞生长的微环境,融合了可降解高分子纤维3良好的力学性能和生物可降解性、基质材料良好的生物相容性、以及生长因子缓释微球的可控缓释性能和强大的细胞募集能力,使得复合支架具有良好的生物相容性、力学性能、可降解性能、较低的免疫原性和生长因子缓释性,并可以通过募集内源性干细胞再生修复缺损软骨组织,促进细胞的生长、迁移、增殖及再分化,从而很好地促进无血管区的部分或全部缺损软骨组织的再生修复,使新生软骨组织具有优良的形态、力学性能及生理功能。
请一并参照图10,在支架层1中,相邻纤维组2之间的间隔优选为300μm~500μm;相邻纤维组2中可降解高分子纤维3之间的间隔优选为750μm~1500μm;支架层1的高度优选为100μm~500μm。该种组织工程软骨复合支架更好地仿生了软骨组织的取向性大孔结构,以及在大孔结构内部的小孔结构,使得组织工程软骨复合支架具有较高的力学性能及生物相容性的同时,还能够让内源性干细胞更易于迁移,并在迁移过程中完成增殖和分化,实现部分软骨缺损或全部软骨缺损的再生修复,具有较高的修复效果。
进一步地,可降解高分子纤维的宽度优选为200μm~800μm;水凝胶纤维的宽度优选为200μm~800μm。
上述可降解高分子纤维的材料可以选自聚己内酯PCL、聚氨酯PU、聚乳酸PLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乳酸-聚己内酯共聚物PCLA、聚氨基酸PAA及聚乙醇酸PGA中的一种或多种。例如为PCL,其具有良好的力学性能和可生物降解性。进一步地,PCL的分子量优选为2×104Da~5×105Da,如2×104Da~1×105Da。
上述水凝胶纤维优选为甲基化程度为40%~80%的甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)纤维,进一步优选为甲基化程度为50%~70%的GelMA纤维。该种水凝胶纤维具有良好的可打印性。另外,采用该种水凝胶纤维有利于细胞的附着、迁移、增殖和分化。
上述基质材料可以选自脱细胞软骨细胞外基质、I型胶原、II型胶原、细菌纤维素、蚕丝蛋白及糖胺多糖中的一种或多种,例如为脱细胞软骨细胞外基质(dECM),dECM可来源于猪软骨、牛软骨、兔软骨、羊软骨等。可通过本领域已知的物理脱细胞的方法(例如冻融法)制备脱细胞软骨细胞外基质,之后采用化学法(例如使用质量浓度为3%的过氧化氢溶液)对脱细胞软骨细胞外基质进行处理,可以进一步脱细胞及灭菌,使得脱细胞软骨细胞外基质具有较低的免疫原性,提高软骨复合支架的生物相容性,降低受体对植入软骨复合支架的免疫排斥作用。
在一些实施例中,组织工程软骨复合支架的压缩弹性模量为100MPa~600MPa,进一步地为200MPa~500MPa。该组织工程软骨复合支架表现出较高的力学性能,完全能够满足力学支撑的需求。
本发明实施例第四方面提供一种组织工程软骨复合支架的制备方法,通过该制备方法能够制备得到上述的组织工程软骨复合支架。制备方法包括以下步骤:
S100,提供包含基质材料和上述生长因子缓释微球的第一水溶液。
在步骤S100,可以将基质材料和上述生长因子缓释微球溶于去离子水中制成第一水溶液。进一步地,第一水溶液中基质材料的浓度优选为0.01g/mL~0.05g/mL;第一水溶液中生长因子缓释微球的浓度优选为0.01g/mL~0.05g/mL。
S200,提供包含水凝胶的第二水溶液。
在步骤S200,将水凝胶如GelMA溶于去离子水中,制成水凝胶的浓度为0.1g/mL~0.2g/mL的第二水溶液。
S300,将第一水溶液和第二水溶液混合,得到具有打印性能的生物墨水。
在步骤S300,第一水溶液与第二水溶液的混合比例优选为1:1~1:2。第一水溶液与第二水溶液的混合比例在上述范围内,得到的水凝胶纤维能够更仿生细胞外基质,为细胞生长提供优良的微环境。
S400,以生物墨水作为水凝胶纤维的原料、以可降解高分子材料作为可降解高分子纤维的原料,打印得到组织工程软骨复合支架。
在步骤S400,打印可以在生物打印机中进行,如上普公司的ALPHA-IPT1型生物3D打印机,可以将生物药水和可降解高分子材料分装于打印机的两个料筒中,该两个料筒各自与一打印头连接,控制两个打印头按照预设的打印路径进行打印成型,之后经交联处理,得到组织工程软骨复合支架。
通过交联处理,能够提高组织工程软骨复合支架的力学性能。其中基质材料交联处理还能够改善基质材料的降解速率,防止其收缩变形,保证组织工程软骨复合支架的外观形态及其内部的特定微结构,有利于细胞的生长、增殖及再分化。
作为示例,步骤S400可以包括:
S410,将生物墨水加入生物打印机的与第一打印头相连的料筒中,设置保温温度为12℃~16℃。
S420,将聚己内酯加入生物打印机的与第二打印头相连的料筒中,设置保温温度为80℃~100℃。
S430,将生物打印机成型室的温度调整为3℃~5℃。
S440,第一打印头与第二打印头并行进行打印,打印产品经交联处理得到组织工程软骨复合支架。
第一打印头与第二打印头的直径范围分别为200μm~800μm,挤出速度范围可以为0.01mm/s~0.05mm/s,打印速度范围可以为5mm/s~15mm/s,层厚范围可以为0.1mm~0.5mm。
在步骤S440,可以采用本领域已知的化学方法、辐照方法及干热方法中的一种或多种对打印产品进行交联处理。
作为示例,可以采用辐照方法对打印产品进行交联处理,得到组织工程软骨复合支架。辐照方法例如是电子束辐照、紫外光辐照、γ射线辐照。辐照交联处理可以减少交联剂的使用量,或者不使用交联剂,这能够提高组织工程软骨复合支架的生物相容性。
当交联处理使用交联剂时,交联剂可以是碳二亚胺(EDAC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、LAP光交联剂、京尼平(Genipin)及戊二醛(GDA)中的一种或多种。例如,将交联剂预先加入第一水溶液中,第一水溶液中交联剂的浓度可以为100μg/mL~200μg/mL。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容,这些实施例仅仅用于阐述性说明,因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明,以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计,而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得,并且可直接使用而无需进一步处理,以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
采用w1/o/w2乳化-溶剂挥发法制备PLGA载rhTGF-β3的生长因子缓释微球,具体过程如下:将2μg的rhTGF-β3溶于200μL去离子水中,制备浓度为10μg/mL的rhTGF-β3水溶液,作为内水相w1。将分子量为10.2万Da的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷(DCM)中,制备浓度为25mg/mL的PLGA溶液,作为油相o。将分子量为6.7万Da的聚乙烯醇(PVA)溶于去离子水中,制备质量浓度为1%的PVA水溶液,作为外水相w2;将200μL内水相w1加入到2mL油相o中,冰浴中用美国Qsonica Q125型超声波破碎仪探头以60%振幅(超声功率为75w)震荡30秒形成初级乳液(w1/o);再将初级乳液(w1/o)加入20mL外水相w2中,在室温(20℃~25℃)下,以500rpm磁力搅拌12小时,挥发除去DCM,得到微球溶液;再将微球溶液以2000rpm离心3分钟后弃上清,得到初始微球用去离子水反复清洗三次,之后在-20℃冷冻干燥24小时,即得到纯净的粒径为10μm~100μm的生长因子缓释微球,于-20℃保存备用。
实施例2
与实施例1不同的是,将5μg的rhTGF-β3溶于200μL去离子水中,制备浓度为25μg/mL的rhTGF-β3水溶液,作为内水相w1。
实施例3
与实施例1不同的是,将10μg的rhTGF-β3溶于200μL去离子水中,制备浓度为50μg/mL的rhTGF-β3水溶液,作为内水相w1。
测试部分
(1)生长因子缓释微球的形态和药物分布观察
取适量实施例1-3中生长因子缓释微球置于硅片上,并经表面喷金处理,采用日本日立公司的Hitachi S-4800型扫描电子显微镜观察微球的形态特征,结果分别如图1-3所示。
图1结果表明,实施例1的生长因子缓释微球呈圆球状,形态良好,直径大小为5μm~30μm,表面较光滑,可见轻微起伏,相邻两波峰之间的间距为0.38μm~0.71μm。
图2结果表明,实施例2的生长因子缓释微球呈圆球状,形态良好,直径大小为5μm~50μm,表面较光滑,可见轻微起伏,相邻两波峰之间的间距为0.33μm~0.77μm。
图3结果表明,实施例3的生长因子缓释微球呈圆球状,形态良好,直径大小为5μm~30μm,表面较光滑,可见轻微起伏,相邻两波峰之间的间距为0.66μm~1.98μm。
本发明实施例的生长因子缓释微球微球形貌良好,有利于细胞粘附,促进细胞的生长、迁移、增殖及再分化。
(2)生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封量及包封率测定
分别收集实施例1-3中微球溶液离心后的上清,使用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,简称ELISA)测定上清液的光密度(opticaldensity,OD)值,根据标准曲线方程分别计算上清液中rhTGF-β3的浓度及质量,再使用下列公式计算生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封量及包封率。共测定3次,结果取平均值。
包封率=(微球中rhTGF-β3的质量/rhTGF-β3的总质量)×100%
包封量=微球中rhTGF-β3的质量/微球的质量,式中包封量的单位是ng/mg,微球中rhTGF-β3的质量的单位是ng,微球的质量的单位是mg。
微球中rhTGF-β3的质量=rhTGF-β3的总质量-上清液中rhTGF-β3的质量
结果:
实施例1中,生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封率平均值为:93.6%,包封量平均值为:37.5ng/mg。
实施例2中,生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封率平均值为:94.4%,包封量平均值为:94.4ng/mg。
实施例3中,生长因子缓释微球中rhTGF-β3的包封率平均值为:98.9%,包封量平均值为:197.8ng/mg。
可见,本发明实施例的方法中,PLGA对rhTGF-β3具有很高的包封率,并具有有效的包封量,能够提高rhTGF-β3的利用率。
(3)生长因子缓释微球的控缓释放性测定
将一定质量的生长因子缓释微球加入1mL磷酸缓冲盐溶液PBS(pH为7.4)中,之后置于转速为80rpm的室温(20℃~25℃)摇床。缓释一定时间后,10000rcf离心5分钟,取上清保存,并加入等量新鲜的PBS缓冲液(pH为7.4)继续进行缓释;在缓释周期内按此方式依次取多个上清样品。使用ELISA试剂盒测定上清样品中rhTGF-β3的浓度并计算rhTGF-β3的累积释放量。每组测试3个样品,结果取平均值。
生长因子缓释微球的缓释结果参见表1和图4。
表1
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
生长因子缓释微球的加入量(mg) | 24.2 | 8.3 | 4.1 |
第一天的缓释量(%) | 0.052 | 0.088 | 0.338 |
第一周的缓释量(%) | 0.135 | 0.228 | 0.704 |
实施例1至3的缓释量均是以微球的初始rhTGF-β3含量为基准。
实施例1至3的生长因子缓释微球能够实现rhTGF-β3长期有效的控缓释放,并在第一天具有最大缓释速率,且在第一周之后基本达到稳定的缓释速率。实施例1至3的生长因子缓释微球缓释期均可达到500天以上,能够实现微球中的rhTGF-β3长期逐渐缓释,从而长期发挥rhTGF-β3的细胞募集能力,满足缺损软骨组织的长期再生修复需求。
图4示出了实施例1至3的生长因子缓释微球28天体外累计释放度曲线图,其中包括缓释时间分别为1、2、4、7、14、21、28天的累计释放度。如图4所示,不同rhTGF-β3包封量的生长因子缓释微球的缓释速度不同。rhTGF-β3包封量相对较高的微球,其释放速度也相对较高。并且,不同rhTGF-β3包封量的生长因子缓释微球均没有凸释现象。
测试结果表明,本发明实施例的生长因子缓释微球rhTGF-β3释放速度缓慢,为一种良好的控释载体,达到缓慢释放rhTGF-β3、持续不断的募集干细胞和促进干细胞的软骨分化的目的,对于需要长时间生长和恢复的软骨缺陷来说提供良好的治疗效果。
(4)生长因子缓释微球Transwell迁移实验
使用康宁公司的3422型transwell小室。
实验设置6个实验组:
1)阴性组:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有体积浓度为1%的胎牛血清FBS。DMEM/F12(50:50)低糖培养基是F12培养基(Ham’s F 12nutrient medium动物细胞培养基)与DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基以1:1结合。
2)阳性组:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有1%FBS、及10ng/mL的rhTGF-β3。
3)空白组:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有1%FBS、及10mg/mL的空白PLGA微球。
4)实验组1:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有1%FBS、及5mg/mL实施例3的生长因子缓释微球,生长因子缓释微球的含量满足rhTGF-β3因子的含量约为1000ng/mL培养基。
5)实验组2:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有1%FBS、及0.5mg/mL实施例3的生长因子缓释微球,生长因子缓释微球的含量满足rhTGF-β3因子的含量约为100ng/mL培养基。
6)实验组3:DMEM/F12(50:50)低糖培养基,其中含有1%FBS、及0.05mg/mL实施例3的生长因子缓释微球,生长因子缓释微球的含量满足rhTGF-β3因子的含量约为10ng/mL培养基。
具体操作步骤按说明书进行。每组样品重复3次,结果取平均值。结果如图5和6所示。
图5和图6的结果表明,本发明实施例的生长因子缓释微球具有显著的促进家兔滑膜干细胞迁移的功能,更有效地发挥了rhTGF-β3的强大细胞募集能力,能够提高缺损软骨组织的再生修复效果。
实施例4
取自兔软骨的dECM源先采用冻融法处理,之后使用质量浓度为3%的过氧化氢溶液进行处理,得到脱细胞软骨细胞外基质;将脱细胞软骨细胞外基质、实施例1的生长因子缓释微球及LAP光交联剂溶于去离子水中,制成脱细胞软骨细胞外基质和生长因子缓释微球的浓度均为0.03g/mL的第一水溶液,第一水溶液中交联剂的浓度为100μg/mL;将GelMA水凝胶溶于去离子水中,制成GelMA水凝胶的浓度为0.2g/mL的第二水溶液,其中GelMA水凝胶的甲基化程度约60%;将第一水溶液和第二水溶液按照体积比为1:1混合,得到具有打印性能的生物墨水。
采用上普公司的ALPHA-IPT1型生物3D打印机,将生物墨水加入生物打印机的与第一打印头相连的料筒中,设置保温温度为16℃;将聚己内酯颗粒加入生物打印机的与第二打印头相连的料筒中,设置保温温度为100℃;将生物打印机成型室的温度调整为5℃;按照图8和图9的结构,第一打印头与第二打印头按预设打印路径并行进行打印,打印产品经紫外光交联处理,得到组织工程软骨复合支架。
实施例5
与实施例4不同的是,生长因子缓释微球为实施例2的生长因子缓释微球。
实施例6
与实施例4不同的是,生长因子缓释微球为实施例3的生长因子缓释微球。
测试部分
(1)组织工程软骨复合支架的形态观察
实施例4中组织工程软骨复合支架的大体观如图7所示,镜下观如图10所示。图7结果表明:组织工程软骨复合支架为20mm×20mm×2mm的长方体框架结构,PCL纤维呈白色,水凝胶纤维呈透明状,孔隙中有小气泡。图10结果表明:组织工程软骨复合支架的PCL纤维的宽度约为700μm,纤维组之间的平均孔隙为500μm,水凝胶纤维的宽度约500μm。
(2)组织工程软骨复合支架的力学测定
使用美国安捷伦U9820A Nano Indenter G200型纳米力学测试系统测定实施例4-6的组织工程软骨复合支架的压缩弹性模量。
实施例4-6的测试结果示于下面的表2。
表2
实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
压缩弹性模量/MPa | 400 | 400 | 500 |
结果表明:本发明实施例的组织工程软骨复合支架的压缩弹性模量可以达到400MPa~500MPa,比正常软骨的压缩弹性模量要高,能够提供较好的力学支撑。
(3)组织工程软骨复合支架细胞相容性共聚焦显微镜观察
将实施例4制备的无菌组织工程软骨复合支架与新西兰家兔第二代脂肪间充质干细胞共培养7天后,用活/死细胞染色试剂盒染色,用荧光共聚焦显微镜拍照,评估组织工程软骨复合支架的生物相容性。结果如图11所示。
在图11中,以封闭曲线标出的细胞为死细胞,剩余的是活细胞,细胞存活率可达95%左右。图11结果表明,细胞在组织工程软骨复合支架生长状态良好,细胞存活率高,说明了本发明实施例的组织工程软骨复合支架具有良好的生物相容性,有利于细胞生存、增殖及再分化。
(4)组织工程软骨复合支架细胞相容性扫描电子显微镜观察
将实施例4制备的无菌组织工程软骨复合支架与小鼠RAW细胞共培养3天后,用2.5%戊二醛固定等预处理后,在扫描电子显微镜下观察,评估组织工程软骨复合支架的生物相容性。结果如图12所示。
图12结果表明:小鼠RAW细胞在组织工程软骨复合支架生长状态良好,细胞形态多样,分泌大量细胞外基质,细胞之间相互接触,说明了本发明实施例的组织工程软骨复合支架具有良好的生物相容性,有利于细胞生存、增殖及再分化。
以上结果表明,本发明实施例提供的组织工程软骨复合支架,具有多孔结构、且生物相容性好、力学强度高,适用于软骨缺损的移植,能够很好地促进无血管区的缺损软骨组织的再生修复,提高再生修复效果。
以上所述,仅为本申请的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到各种等效的修改或替换,这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此,本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种组织工程软骨复合支架,其特征在于,包括:
组织工程支架,包括沿自身高度方向依次层叠的多个支架层,相邻两个所述支架层中的一者包括多个沿第一方向相互间隔设置的纤维组,另一者包括多个沿第二方向相互间隔设置的纤维组,每个所述纤维组包括可降解高分子纤维及设置于所述可降解高分子纤维自身宽度方向的一侧或两侧的水凝胶纤维,所述水凝胶纤维沿所述可降解高分子纤维的长度方向延伸,所述第一方向与所述第二方向相交;
所述支架层中,相邻所述纤维组之间的间隔为300μm~500μm,相邻所述纤维组中所述可降解高分子纤维之间的间隔为750μm~1500μm,所述支架层的高度为100μm~500μm;
基质材料,复合于所述组织工程支架的所述水凝胶纤维中;
生长因子缓释微球,复合于所述组织工程支架的所述水凝胶纤维中,所述生长因子缓释微球包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物基质材料以及包封于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物基质材料中的重组人转化生长因子β3;
所述生长因子缓释微球中重组人转化生长因子β3的包封量为5ng/mg~200ng/mg;
所述生长因子缓释微球的缓释期为28天以上;
所述生长因子缓释微球的粒径为5μm~100μm;
所述生长因子缓释微球的表面具有轻微起伏,相邻两波峰之间的间距为0.3μm~2μm;
所述生长因子缓释微球在第一天具有最大缓释速率,且在第一周之后达到稳定的缓释速率;
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为1.02×105Da,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为1:1~5:1,所述可降解高分子纤维为分子量为2×104Da~5×105Da的聚己内酯纤维,所述水凝胶纤维为甲基化程度为40%~80%的甲基丙烯酸化水凝胶纤维,所述基质材料为脱细胞软骨细胞外基质;所述支架层中,所述可降解高分子纤维的宽度为200μm~800μm,所述水凝胶纤维的宽度为200μm~800μm;所述组织工程软骨复合支架的压缩弹性模量为400MPa~500MPa。
2.根据权利要求1所述的组织工程软骨复合支架,其特征在于,所述生长因子缓释微球在第一天的缓释量为0.05%~0.5%。
3.根据权利要求2所述的组织工程软骨复合支架,其特征在于,所述生长因子缓释微球在第一周的缓释量为0.1%~1%。
4.根据权利要求1所述的组织工程软骨复合支架,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为3:1。
5.根据权利要求1所述的组织工程软骨复合支架,其特征在于,所述生长因子缓释微球的粒径为5μm~50μm。
6.权利要求1至5任一项所述组织工程软骨复合支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
提供包含基质材料和权利要求1-5任一所述组织工程软骨复合支架中的所述生长因子缓释微球的第一水溶液;
提供包含水凝胶的第二水溶液;
将所述第一水溶液和所述第二水溶液混合,得到生物墨水;
以所述生物墨水作为所述水凝胶纤维的原料、以可降解高分子材料作为所述可降解高分子纤维的原料,打印得到所述组织工程软骨复合支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述第一水溶液中所述基质材料的浓度为0.01g/mL~0.05g/mL,所述第一水溶液中所述生长因子缓释微球的浓度为0.01g/mL~0.05g/mL;
所述第二水溶液中所述水凝胶的浓度为0.1g/mL~0.2g/mL;
所述第一水溶液与所述第二水溶液混合的体积比为1:1~1:2。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述以所述生物墨水作为所述水凝胶纤维的原料、以可降解高分子材料作为所述可降解高分子纤维的原料,打印得到所述组织工程软骨复合支架的步骤包括:
将生物墨水加入生物打印机的与第一打印头相连的料筒中,设置保温温度为12℃~16℃;
将聚己内酯加入生物打印机的与第二打印头相连的料筒中,设置保温温度为80℃~100℃;
将生物打印机成型室的温度调整为3℃~5℃;
所述第一打印头与所述第二打印头并行进行打印,打印产品经交联处理得到所述组织工程软骨复合支架。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述第一水溶液中还含有交联剂,所述第一水溶液中所述交联剂的浓度为100μg/mL~200μg/mL。
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Title |
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