CN104027793A - 神经生长因子缓释纳米载体的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，将神经生长因子和聚乳酸-羟基乙酸共聚物通过乳化挥发溶剂法制成球形纳米粒子。所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹的神经生长因子纳米缓释系统是核壳结构，其核是神经生长因子，外壳是均匀、致密的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，本发明解决了现有的神经生长因子在体内分布半衰期和生物活性半衰期较短、代谢快、易被酶解，在水溶液中极不稳定的问题。本发明方法操作简单、过程可控。本发明对神经生长因子的应用范围进行了二次开发，拓展了其药用范围，可利用神经生长因子纳米缓释系统的神经保护作用，将其应用于制备糖尿病合并冠心病的药物。

Description

神经生长因子缓释纳米载体的制备及应用

技术领域

本发明属于药物制备，具体涉及聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹的神经生长因子缓释系统（纳米载体）及其制备方法，以及在制备糖尿病合并冠心病药物中的应用，适合于制备改善糖尿病心脏自主神经和感觉神经功能的药物的场合。

背景技术

神经生长因子（NGF）是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经损伤后，NGF受体增加,反映在损伤修复过程中对NGF的需求。靶区NGF的水平也明显升高。目前应用于临床的是注射用鼠神经生长因子，用于促进神经损伤的恢复，例如：视神经炎、脊髓损伤、坐骨神经痛、脑萎缩、新生儿缺血缺氧性脑病、糖尿病末梢神经炎等。目前临床采用肌肉注射，一日一次，疗效确切。但由于其在体内消除半衰期较短，约为2.5小时，体内平均滞留时间为3.5小时，故造成血药浓度不稳定，不能较长时间维持有效血药浓度，治疗效果不确切，其主要副作用为注射部位局部疼痛，偶见荨麻疹。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体——乳酸（LA）和羟基乙酸（GA）随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。 不同的单体比例可以制备出不同类型的PLGA。所有的PLGA都是非定型的，其玻璃化温度在40-60 °C之间。纯的乳酸或羟基乙酸聚合物比较难溶，与之不同的是，PLGA展现了更为广泛的溶解性，它能够溶解于更多更普遍的溶剂当中，如：氯化溶剂类，四氢呋喃，丙酮或乙酸乙酯等。破坏酯键会导致PLGA的降解，降解程度随单体比不同而有差异，乙交酯比例越大越易降解。也存在特例，当两种单体比为50：50时，降解的速度会更快，差不多需要两个月。PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，同时也是人代谢途径的副产物，所以当它应用在医药和生物材料中时不会有毒副作用。通过调整单体比，进而改变PLGA的降解时间，因此可以根据药物的性质和用途调整乳酸和羟基乙酸之间的比例，制备具有特定功效的纳米制剂，所制得的纳米粒子粒径从100纳米到300纳米不等，可用于肌肉注射和静脉注射。

心血管病作为危害人类健康的“第一杀手”，已波及全球，而冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）是心血管疾病中发病率、死亡率非常高的疾病。研究显示，冠心病患者60%～80%存在血糖升高。循证医学证明，糖尿病患者80%死于冠心病，糖尿病是冠心病的高危症。早期预防和治疗糖尿病合并冠心病具有重大的意义。由于糖尿病性神经病变，患者的神经末梢受损时，痛阈升高，导致即使发生了严重的心肌缺血，疼痛也较轻微而不典型，甚至没有心绞痛症状，引起无痛性心肌梗死，这类患者因为没有明显的胸痛症状而易被误诊或延误病情而导致病情加重、死亡率增加。现有治疗方法多从降血糖、降血脂的角度出发，但治疗效果并不乐观。国外有文献，将NGF-腺病毒转染至心肌细胞，对其缺血损伤有明显的保护作用。基于上述理论基础，有待于将其应用于糖尿病合并冠心病的治疗中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，通过以下步骤实现：

（1）制备内水相、油相和外水相：内水相（W1）为NGF加入体积百分数5% 聚乙二醇（PEG）；油相（O）为PLGA溶于二氯甲烷与丙酮体积比为3:1的混合溶液，PLGA浓度为1.25%（1.25g/100ml）；外水相（W₂）为体积百分数为0.7%的聚乙烯醇（ PVA）水溶液；

（2）制备包裹NGF的PLGA微球：将所述内水相（W1）加入油相（O）中，100W（瓦特）冰水中超声1min制备油包水型乳液（W1/O），将(W1/O) 乳液加入含0.7% PVA的水溶液中，(W1/O) 乳液与外水相（W2）体积比为1：5；55W冰水中超声20min，得到水包油包水型复乳（W1/O/W2），将均匀的复乳倒入离心管中，51摄氏度真空旋蒸25min，以挥发溶剂；

（3）离心、冲洗、干燥、冷藏包裹NGF的PLGA微球：将步骤（2）乳液收集后，20000rpm，4°C离心20min，用蒸馏水冲洗沉淀3次洗净纳米粒表面的PVA以及游离的蛋白，然后收集纳米粒，-20℃冷冻干燥24h，冰冻干燥后，将冻干的包裹NGF的PLGA纳米微球储存于2-8℃冰箱中。

包裹的神经生长因子（NGF）为鼠源性神经生长因子（mNGF）和人工合成（rhNGF）。

包裹NGF的PLGA微球呈光滑的球形，其平均粒径为250-330nm，微球的载药量为7.76ug/mg-8ug/mg ，包封率为50%-80%。根据不同LA/GA和LA、GA分子量不同，分别得到具有不同释放特性的缓释微球。

其中PLGA选用乳酸：羟基乙酸（LA:GA）=50:50(摩尔比)。

本发明的另一个目的是提供神经生长因子缓释纳米载体在制备治疗糖尿病合并冠心病药物中的应用。为观察神经生长因子对糖尿病合并冠心病的治疗作用，本发明对糖尿病小鼠予以PLGA-NGF尾静脉注射，并采用Langendorff离体心脏灌流技术，对糖尿病小鼠的离体心脏进行缺血再灌注处理，结果发现PLGA-NGF有改善糖尿病心肌缺血后心功能的作用，并且该作用与改善糖尿病心脏的感觉神经功能有关，即改善糖尿病合并冠心病患者自主神经和感觉神经功能。所述药物由神经生长因子缓释纳米载体中有效成分神经生长因子的单一组分，与药用赋形剂制备，制剂形式包括液体制剂和固体制剂。

本发明提供的神经生长因子缓释纳米载体是一种纳米粒子，即聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹的神经生长因子缓释系统，其核是神经生长因子，外壳是均匀、致密的聚乳酸-羟基乙酸共聚物。该共聚物能有效减缓神经生长因子在体内外的降解速度，增加其稳定性和作用时间。聚乳酸-羟基乙酸是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒及良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域，与其他包裹材料相比，大大提高了NGF的包封率。NGF是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。近年来，也发现NGF对于心血管系统亦有作用，可以增进血管内皮再生、抑制血管内皮凋亡和抑制心肌细胞凋亡的作用。

本发明载体能有效减缓神经生长因子在体内外的降解速度，增加其稳定性和作用时间。载体是聚乳酸-羟基乙酸，一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域，与其他包裹材料相比，大大提高了NGF的包封率NGF是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。近年来，也发现NGF对于心血管系统亦有作用，可以增进血管内皮再生、抑制血管内皮凋亡和抑制心肌细胞凋亡的作用。

本发明（1）有效应用了聚乳酸-羟基乙酸共聚物这一组织相容性好、无毒无害的纳米材料，将其应用于医药领域，可以明显改善蛋白类药物的稳定性；（2）解决了NGF在体内外性质不稳定，消除半衰期短的问题，增加其在血液循环中维持的时间和血药浓度。（3）对NGF的药理作用进行了二次开发，拓宽了NGF的应用范围。利用其保护神经的作用，将其应用于糖尿病合并心肌缺血的治疗中，具有很好的社会及市场前景。

附图说明

图1为TEM下纳米粒子放大50000倍的形态。

图2为TEM下纳米粒子放大100000的形态。

图3为NGF-PLGA 21天体外单次释放曲线。

图4为NGF-PLGA 21天累积释放曲线。

图5为NGF-PLGA注射后不同时间点血清浓度。

图6为NGF-PLGA对糖尿病心脏缺血再灌注后心功能的影响和相应对照组比较。

图7是NGF对LVDP恢复率的影响。

图8是野生型、NGF组和糖尿病组TRPV1的表达情况。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一：PLGA-NGF制作

将500μg NGF 加入250μl硼酸盐缓冲溶液中（0.05M），称取0.5mg FITC加入250μl蛋白体系中，混合均匀，直到FITC完全溶解。室温下避光反应1小时后上纯化柱纯化，1000g离心30-45秒，收集经纯化后的蛋白，4度避光冷藏。内水相（W₁），200μl经FITC标记后NGF加入5% PEG；油相（O），25mg PLGA溶于2毫升二氯甲烷与丙酮体积比为3:1的混合溶液中，将蛋白溶液加入到PLGA溶液中，100W冰水中超声1min制备油包水型乳液（W₁/O）。将(W₁/O) 乳液加入10ml含0.7% PVA的水溶液中，55W冰水中超声20min，得到水包油包水型复乳（W₁/O/W₂）。将均匀的复乳倒入离心管中，51摄氏度真空旋蒸25min，以挥发溶剂。将乳液收集后，20000rpm，4°C离心20min，用蒸馏水冲洗沉淀3次洗净纳米粒表面的PVA以及游离的蛋白，然后收集纳米粒。在-20℃冷冻干燥24h后，将冻干NGF-PLGA保存于2-8℃冰箱里。

实施例二：PLGA-NGF 表面形态观察

称取PLGA-NGF纳米粒子冻干粉1mg，加入到1ml蒸馏水中搅拌均匀形成白色乳液，吸取少量乳液滴在铜网上，再滴加2%磷钨酸溶液负染，自然晾干。然后在透射电子显微镜（TEM）下观察粒子的表面形态。参见图1。

实施例三：纳米粒子平均粒径及粒径分布的测定

称取PLGA-NGF纳米粒子冻干粉少许，用蒸馏水稀释至目视稍显浑浊的浓度，在室温下（20摄氏度）用激光纳米粒度分析仪（S90 Malvern，英国）测量粒子的平均粒径和粒径分布，取14个循环，取三个独立样本，每个样本测三次重复。

实施例四：PLGA-NGF 体外释放试验

称取1mg PLGA-NGF纳米粒子冻干粉，置于15ml 离心管中，加入10ml PH 7.4 的磷酸盐缓冲液（phoshate-buffered saline，PBS）缓冲液中，37°C，速度100rpm的条件下进行21天的释放试验。在第4h、8h、12h、24h、之后隔天取样一次，一直取样到第21天，取三个独立的样本。

取样方法：离心（12000rpm， 4°C），取上清液，并在离心管中加入等量的新鲜PBS缓冲液。采用NGF E_max ^? ImmunoAssay Syatem ELISA试剂盒来检测上清液中NGF的含量，记录了21天内的单次释放量和累积释放量。

21天的体外释放结果参见图2，可以看到，经过21天的释放，大约83.9%的NGF被释放出来，有着明显的缓释效果，在最初的2天内，NGF有一个突释的过程，两天内释放全部的大约60%，其原因主要是部分NGF存在于纳米粒子的外层或者吸附在纳米粒子表面，所以在PLGA初期降解的过程中，当外壳崩解时，位于纳米粒子表面和表层内的NGF会被迅速释放出来，且NGF的水溶性强，溶解速度快；2天之后渐趋稳定，至14天，每天释放的药物在2%-5%这是因为随着释放时间的增长，PLGA的骨架开始逐步降解，位于粒子内部的药物缓慢被释放出来，到第15天后释药量有明显的下降，据文献报道，NGF在37°C情况下14天后会迅速变性失活，导致检测到的NGF的量明显减少。由此可见，纳米粒子的药效持续时间最长不超过14天。见图3和图4。

实施例五：PLGA-NGF体内释放试验

1.实验动物和材料

雄性6周龄ICR小鼠，体重20-25g；NGF购买自R&D;PLGA-NGF剂量计算

PLGA-NGF的包封率为7.76ug/mg；PLGA, LA: GA 50:50（摩尔比）购自lakeshore biomaterial，美国.

2.NGF血药浓度测定

ICR小鼠35只，随机分为7 组，6组为实验组，1组为对照组，每组5 只.。实验组小鼠尾静脉注射NGF-PLGA（包封率为7.76ug/mg），NGF注射剂量为100ug/kg，给药体积为0.1ml；对照组小鼠注射同样剂量的PBS缓冲液。实验各组小鼠给药后分别于不同时间点（6h、12h、24h、2d、3d和5d）右心室取血0.6ml，收集于1ml离心管中，室温静置10min后，4℃离心分离血清，取心肌组织匀浆处理。将收集到血清样品和心肌匀浆上清液存放于-80℃。样品收集完全后，应用ELISA法，确定NGF 血药浓度和心肌浓度。

PLGA-NGF体内5天释放结果如图5所示：可以看到，PLGA-NGF可以持续缓慢释放5天，前24h释放较快，大部分NGF已释放，2d-5d，血清NGF浓度已接近血清正常水平。单次注射PLGA-NGF在心肌组织的代谢结果如图6所示：PLGA-NGF可以持续缓慢释放5天，前24h释放较快，大部分NGF已释放，2d-5d，心肌NGF浓度已接近心肌正常水平。根据以前的文献报道，未包装的¹²⁵I-NGF体内释放情况是：按剂量25 ug/kg静注，测得消除相半衰期（t1/2（β））为3.65h。

实施例六：PLGA-NGF对糖尿病心脏缺血再灌注的心功能的影响

1.实验动物和材料：雄性12周龄 C57小鼠，体重20-25g；Langendorff离体心脏灌流装置购自南京美易科技有限公司。

2.实验步骤

应用STZ腹腔注射制造糖尿病小鼠模型，造模成功后高脂饮食8周后，给予PLGA-NGF尾静脉注射，100ug/kg，给药体积为0.5ml，每日一次，共5天。对于注射后的糖尿病小鼠，迅速摘下心脏，于4℃K-H液中洗去心腔内的血液后，将其主动脉残端挂于Langendorff装置上。剪开左心耳，将充满水的球囊通过左心耳插入左心室，球囊另一端与压力换能器相接，压力换能器另一端连接在生物信息采集器上。离体心脏用含95%氧气和5%二氧化碳混合气体预饱和的K-H液灌流，稳定期15min，停灌期40min和复灌期40min。观察稳定期和复灌期心功能指标：LVSP、LVDP、CF和±dp/dt。并与未进行PLGA-NGF治疗的糖尿病小鼠离体心脏灌流情况相比较。分别取注射了PLGA-NGF治疗的糖尿病小鼠和未治疗的糖尿病小鼠的心肌组织，提取蛋白做western blot，以推测是否PLGA-NGF治疗糖尿病合并心肌缺血与改善感觉神经受体TRPV1的功能有关。

3.实验结果

参见附图7，给予PLGA-NGF治疗的糖尿病小鼠，离体心脏缺血复灌后，心功能损伤程度明显弱于对照组，分析可能心肌组织改善神经功能有关。见附图8，给予PLGA-NGF治疗的糖尿病小鼠，其心肌组织TRPV1表达量较为治疗糖尿病小鼠有所上升。

Claims (5)

1. 一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）制备内水相、油相和外水相：内水相W1为NGF加入体积百分数为5% 的聚乙二醇；油相O为PLGA溶于二氯甲烷与丙酮体积比为3:1的混合溶液，聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA浓度为1.25%；外水相W₂为体积百分数为0.7%的聚乙烯醇水溶液；

（2）制备包裹NGF的PLGA微球：将所述内水相W1加入油相O中，100W冰水中超声1min制备油包水型乳液W1/O，将W1/O乳液加入含0.7% 聚乙烯醇的水溶液中，W1/O乳液与外水相W2体积比为1：5；55W冰水中超声20min，得到水包油包水型复乳W1/O/W2，将均匀的复乳倒入离心管中，51摄氏度真空旋蒸25min，以挥发溶剂；

（3）离心、冲洗、干燥、冷藏包裹神经生长因子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球：将步骤（2）乳液收集后，20000rpm，4°C离心20min，用蒸馏水冲洗沉淀3次洗净纳米粒表面的聚乙烯醇以及游离的蛋白，然后收集纳米粒，-20℃冷冻干燥24h，冰冻干燥后，将冻干的包裹神经生长因子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球储存于2-8℃冰箱中。

2.根据权利要求1所述的一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，其特征在于，包裹的神经生长因子为鼠源性神经生长因子mNGF和人工合成rhNGF。

3.根据权利要求1所述的一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，其特征在于，包裹神经生长因子的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球呈光滑的球形，其平均粒径为250-330nm，微球的载药量为7.76ug/mg-8ug/mg ，包封率为50%-80%。

4.根据权利要求1所述的一种神经生长因子缓释纳米载体的制备方法，其特征在于，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物选用乳酸：羟基乙酸的摩尔比为50:50。

5.根据权利要求1所述方法制备的一种神经生长因子缓释纳米载体在制备治疗糖尿病合并冠心病药物中的应用。