CN108103067A - 具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及创伤修复材料技术领域，特别涉及一种具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。该DNA分子由编码神经生长因子的基因片段和编码YKYKY短肽的基因片段连接而成。本发明通过L‑DOPA在微碱性环境下发生化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现NGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有神经生长因子的细胞微载体、修复薄膜，神经导管等各种中枢和外周神经修复材料，以及细胞培养板和组织工程化神经修复支架。

Description

具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及创伤修复材料技术领域，特别涉及一种具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。
背景技术
神经缺损是临床上比较常见的疾病，日常生活中各种原因造成的人体创伤，很多都伴随着神经损伤。神经损伤病理过程复杂，神经再生速度缓慢，所属感觉、运动和营养作用丧失，严重影响了肢体的功能和病人的生活质量。神经生长因子(NGF,Nerve growthfactor)是具有多种活性的多肽类物质，是神经系统非常重要的生物活性分子之一。NGF广泛存在于动物体内的多种组织内，目前的基础研究表明NGF可应用于神经毒性、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年痴呆症、帕金森氏病、面神经炎以及神经损伤等神经系统疾病，对损伤的周围神经具有营养、促进再生及修复的作用，此外其对非神经细胞的生物效应也逐渐被发现，具有促进新血管形成、促进皮肤和肺的成纤维细胞的修复、调节胰腺细胞生理学等作用，基于其多方面的作用，NGF也越来越多的被应用到临床上。然而天然生长因子的不稳定性，以及体液造成的弥散性作用，很难保持其在患处作用的持续性和稳定性，降低了其在实际应用中的作用效果。因此如何提高生长因子在患处作用的稳定性和持续性近年来越来越受到关注。
通过一定方法，将神经生长因子固定于创伤修复材料的内部或表面，使其稳定长效地发挥生物活性，对于创伤修复具有深远的意义。传统的方法为物理吸附和共价结合两种方法。物理吸附是一种常用的固化蛋白，多肽及生长因子的方法，但吸附效率较低。化学方法通常指的是共价结合，往往需要多步骤的处理，比如需要通过预处理对材料表面进行活化，或者需要氧等离子、紫外等照射、亦或者添加其他化学物质等。这种改性会明显改变材料的整体性质，甚至导致材料表面变性，而且，使用化学品进行表面活化和固定化，例如N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺通常易发生水解，这会导致在聚合物上表面蛋白质或肽的聚合，从而改变材料的表面性质。
近几十年，越来越多的人开始关注天然胶粘剂的粘附机理以试图发展仿生粘合剂。发明专利WO2017101026A1是一种含贻贝粘蛋白与生长因子的组合物，在pH1.0-7.0的范围内，特别是在pH3.0-6.5的范围内，其中贻贝粘蛋白浓度是0.1-15.0mg/ml，贻贝粘蛋白与生长因子的质量比为100∶1-1∶100，再将贻贝粘蛋白与生长因子以共价键的形式交联或是通过分子间物理作用结合，交联剂或修饰剂选自氧气、臭氧、双氧水、碘及其制剂、氟、氯、高碘酸盐、高锰酸盐、硝酸盐、乙酸盐、过硫酸盐、氟化物、戊二醛、表氯醇，1，4-二羟基缩水甘油醚，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯或琥珀酰亚胺基-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯的其中之一或其组合。这种贻贝粘蛋白与生长因子的组合物可用于骨折、骨质疏松、股骨头坏死、关节炎、慢性胃炎、缺血性心脏病、血栓、肺气肿、肺供养不足、脑萎缩、老年痴呆、神经衰弱、神经性头痛。发明专利WO2017157325A1将目的蛋白与某一半衰期较长、分子量较大蛋白的基因首尾相连，由同一调控序列控制的基因表达产物即融合蛋白，所述融合蛋白与原蛋白相比不仅提高了生物活性，大大延长了半衰期，减少了患者给药次数与频率，从而缓解了患者的不良反应，并且药效得到明显提高。该发明中所述的神经生长因子融合蛋白，通式为A-B或A-L-B；其中A为神经生长因子，L为连接肽，B为IgG的Fc部分、或IgG的Fc部分的类似物、或IgG的Fc部分的片段。将该基因转入宿主细胞中进行表达，主要为哺乳动物细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。发明专利CN106148349A针对人神经生长因子的蛋白质结构以及原核和真核表达系统，通过密码子优化，获得表达重组人神经生长因子的基因，所述新的基因于大肠杆菌和酵母表达体系中均可高效表达出具有天然结构和生物活性的rhNGF，产物无需变性和复性。
海洋贻贝黏附蛋白中，含有大量的左旋3，4-二羟基苯丙氨酸(或L-多巴，L-DOPA)与赖氨酸(Lysine，K)单元。其中，L-DOPA在水溶液中能够氧化自我聚合形成薄膜，可以实现潮湿环境中对各种材料的超强附着，如金属、氧化物、合成高分子聚合物和陶瓷材料等，甚至典型的抗粘附性材料，如聚四氟乙稀(PTFE)，而赖氨酸也常用于与材料的黏附来改善材料的亲水性。
传统的用于材料表面固定生长因子等生物活性蛋白的方法有通过物理吸附和共价结合两种方法。物理吸附是一种常用的固化蛋白，多肽及生长因子的方法，但吸附效率较低。化学方法通常指的是共价结合，往往需要多步骤的处理，比如需要通过预处理对材料表面进行活化，或者需要氧等离子、紫外等照射、亦或者添加其他化学物质等。这种改性会明显改变材料的整体性质，甚至导致材料表面变性，而且，使用化学品进行表面活化和固定化，例如N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺通常易发生水解，这会导致在聚合物上表面蛋白质或肽的聚合，从而改变材料的表面性质。因此，一种简单、可靠、高效的蛋白表面固定方法对于神经损伤修复材料的改性，将会有利于神经生长因子和修复材料发挥作用，促进神经损伤修复，具有良好的应用前景。通过基因重组表达或固相合成方法制备的含有材料黏附结构基团的生长因子，是目前较为先进的一种材料表面固定生长因子的方法。但是，现阶段制备的各种具有黏附基团的生长因子，绝大多数都只特异性对某些生物大分子(胶原、层黏连蛋白、透明质酸等)有黏附能力，而对于高分子材料、无机材料和金属材料等具有黏附能力的生长因子则鲜有报道，其特异性的黏附力大大限制了它们的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。本发明制备的创伤修复材料，通过黏附基团将NGF固定于包括高分子材料、无机材料和金属材料等惰性材料在内的多种材料表面，使其在保持NGF原有生物活性的基础上，具有了与多种创伤修复材料紧密结合的能力，以达到促进细胞在材料表面黏附、生长的能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种DNA分子，DNA分子由编码神经生长因子(NGF)的基因片段和编码YKYKY短肽的基因片段连接而成。
其中，YKYKY短肽的氨基酸序列为Tyr-Lys-Tyr-Lys-Tyr。
在本发明中，该DNA分子为NGF-YKYKY。
本发明通过基因重组表达技术，设计并合成在碳末端含有YKYKY短肽的NGF基因序列，该段序列由大肠杆菌诱导表达出大量NGF-YKYKY目的蛋白，我们获得该目的蛋白后，其碳末端短肽YKYKY中的酪氨酸，再通过酪氨酸羟化酶促羟化反应转化为L-DOPA的结构，从而得到在碳末端具有材料黏附基团的神经生长因子(NGF-DKDKD)。通过L-DOPA(含儿茶酚官能团)在微碱性环境下发生化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现NGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有神经生长因子的细胞微载体、修复薄膜，神经导管等各种中枢和外周神经修复材料，以及细胞培养板和组织工程化神经修复支架。
作为优选，该DNA分子的两端还包括酶切位点。
在本发明提供的具体实施例中，酶切位点为NDE1和Xhol酶切位点。
作为优选，该DNA分子的羧基端还包括终止密码子。
作为优选，该DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种蛋白质，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为上述任一DNA分子。
本发明还提供了该蛋白质的制备方法，包括：将上述任一DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白，得到蛋白质NGF-YKYKY。
在本发明提供的具体实施例中，质粒为pET15b质粒。
在本发明提供的具体实施例中，原核表达载体为BL21(DE3)型大肠杆菌。
在本发明提供的具体实施例中，表达蛋白后还包括纯化、复性的步骤。
本发明还提供了一种蛋白质，将蛋白质NGF-YKYKY的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。
作为优选，蛋白质NGF-YKYKY的YKYKY短肽中的3个L-酪氨酸替换为L-DOPA，得到NGF-DKDKD。
本发明还提供了该蛋白质的制备方法，包括：蛋白质NGF-YKYKY在酪氨酸羟化酶催化作用下得到NGF-DKDKD。
作为优选，蛋白质NGF-DKDKD的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质NGF-YKYKY混合，加入酪氨酸羟化酶，24～26℃条件下静置1.5～2.5h。
在本发明提供的具体实施例中，蛋白质NGF-DKDKD的制备方法具体为：将维生素C、PBS和蛋白质NGF-YKYKY混合，加入酪氨酸羟化酶，25℃条件下静置2h。
在本发明提供的具体实施例中，蛋白质NGF-DKDKD的制备方法具体为：将5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)，PBS(pH7.0)和100μg/mL的重组蛋白溶液(pH7.0)按照1:1:1的体积比例混合，并按照1U/μg重组蛋白的比例向混合溶液中加入酪氨酸羟化酶，25℃条件下静置反应2h。
本发明还提供了一种黏附有神经生长因子的创伤修复材料，创伤修复材料为黏附有蛋白质NGF-DKDKD的载体材料。
作为优选，载体材料为可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板或人工皮肤移植物。
在本发明提供的实施例中，载体材料为PLGA静电纺丝膜。
本发明还提供了该创伤修复材料的制备方法，该制备方法为：将含有蛋白质NGF-DKDKD的溶液的pH值调至8.0～9.0，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在24～26℃条件下放置6～10h；
或者将含有蛋白质NGF-YKYKY的溶液、5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)、PBS(pH7.0)、酪氨酸羟化酶和载体材料混合，24～26℃条件下静置1.5～2.5h，pH值调至8.0～9.0，在24～26℃条件下放置6～10h。
在本发明提供的实施例中，创伤修复材料的制备方法为：将含有蛋白质NGF-DKDKD的溶液的pH值调至8.5，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在25℃条件下放置8h
在本发明提供的另一实施例中，创伤修复材料的制备方法为：将含有蛋白质NGF-YKYKY的溶液、5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)、PBS(pH7.0)、酪氨酸羟化酶和载体材料混合，25℃条件下静置2h，pH值调至8.5，在25℃条件下放置8h。
作为优选，在24～26℃条件下放置6～10h后，还包括用PBS浸洗的步骤。
本发明提供了一种具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料。该DNA分子由编码神经生长因子的基因片段和编码YKYKY短肽的基因片段连接而成。本发明具有的技术效果为：
本发明通过基因重组表达技术，设计并合成在碳末端含有YKYKY短肽的NGF基因序列，该段序列由大肠杆菌诱导表达出大量NGF-YKYKY目的蛋白，我们获得该目的蛋白后，其碳末端短肽YKYKY中的酪氨酸，再通过酪氨酸羟化酶促羟化反应转化为L-DOPA的结构，从而得到在碳末端具有材料黏附基团的神经生长因子(NGF-DKDKD)。通过L-DOPA(含儿茶酚官能团)在微碱性环境下发生化学交联，在材料的表面形成聚多巴层，从而实现NGF在多种组织工程材料表面的黏附。该方法可以用于制备黏附有神经生长因子的细胞微载体、修复薄膜，神经导管等各种中枢和外周神经修复材料，以及细胞培养板和组织工程化神经修复支架。
本发明在NGF原有基因序列的羧基末端增加五个氨基酸序列即YKYKY，通过基因重组技术将NGF-YKYKY基因序列连接到pET15b质粒中，再将重组质粒转入到BL21大肠杆菌中，该获得蛋白质的方法简单，蛋白质的表达量大，纯度高，且活性良好。
本发明通过将NGF-YKYKY末端的酪氨酸羟化反应成L-DOPA的结构，从而获得具有材料黏附基团的神经生长因子(NGF-DKDKD)，这种羟化反应简单，没有副作用，不会改变材料本身的性质。
本发明这种具有粘附性基团的神经生长因子(NGF-DKDKD)，对于各种材料都有广泛的较强的粘附性，可降低体液造成的弥散性作用，保持其在患处作用的持续性和稳定性，有利于神经元再生和神经损伤修复。
附图说明
图1为经Ni柱纯化后得到的NGF-YKYKY的蛋白电泳图；
图2为PC12细胞在固定了NGF-DKDKD的PLGA静电纺丝膜上的生长情况；
图3为NGF、NGF-YKYKY、NGF-DKDKD(NGF-DOPA)对PLGA膜的黏附能力的比较。
具体实施方式
本发明公开了一种具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)能促进中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。NGF广泛分布于机体各组织器官中(包括脑)，在靶组织中的浓度与交感神经和感觉神经在靶区分支的密度和mRNA的含量有关。
左旋3，4-二羟基苯丙氨酸(或L-多巴，L-DOPA)是人和动物体内合成去甲肾上腺素和多巴胺的前体之一，是经典不可替代的抗震颤麻痹药，是具有儿茶酷轻基的神经递质多巴胺前体，常用作帕金森病的药物治疗。左旋多巴在服用后，在脑内经多巴脱羧酶脱羧作用转变为多巴胺，从而发挥多巴胺替代治疗功效。
赖氨酸(Lysine，K)是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。
酪氨酸(tyrosine；Tyr，Y)的化学名称为2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸。酪氨酸是人体的条件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸。
本发明提供的具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和创伤修复材料中所用序列、材料、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.设计并合成了如下的NGF-YKYKY基因序列，其中370-384位氨基酸为编码YKYKY短肽的基因序列，4-9位氨基酸、388-393位氨基酸分别为用于将这段序列插入到pET15b质粒载体中的NDE1和Xhol酶切位点的序列，10-369位氨基酸为编码NGF的基因序列，385-387位氨基酸为终止密码子。
CGCCATATGTCTTCCAGCCATCCTATCTTCCACCGTGGTGAATTCAGCGTATGCGATTCTGTCAGCGTTTGGGTAGGCGATAAGACTACTGCTACTGACATCAAGGGTAAAGAAGTGATGGTGCTGGGTGAGGTGAACATCAACAACTCCGTCTTCAAACAGTACTTCTTCGAAACCAAATGCCGTGACCCAAACCCGGTTGACTCCGGCTGCCGTGGTATCGATTCCAAACACTGGAATTCTTATTGCACCACGACCCACACCTTTGTTAAAGCTCTGACCATGGACGGCAAACAAGCCGCATGGCGTTTTATTCGCATTGATACCGCATGTGTTTGTGTTCTGTCTCGTAAAGCGGTACGCCGCGCGTATAAATA TAAATATTAACTCGAGCGG
将这段DNA序列插入到pET15b质粒中，再将重组质粒转入到BL21(DE3)型大肠杆菌中，构建得到用于制备NGF-YKYKY的原核表达载体。通过表达、纯化，得到NGF-YKYKY重组蛋白，蛋白电泳图见图1。
2.将5mg/mL的维生素C溶液(pH7.0)，PBS(pH7.0)和100μg/mL的NGF-YKYKY重组蛋白溶液(pH7.0)按照1:1:1的比例混合，并按照1U/μg重组蛋白的比例向混合溶液中加入酪氨酸羟化酶(Tyrosinase)，25℃条件下静置反应2h。
3.将混合溶液的pH值调至8.5，并将损伤修复材料(可吸收医用棉、创面敷料、细胞微载体、细胞培养板、人工皮肤移植物等)浸没其中，25℃条件放置8h后，用PBS(pH7.0)充分浸洗，即得到黏附有神经生长因子的损伤修复材料。
试验例1细胞培养试验
采用PLGA膜+NGF-DKDKD对PC12细胞株进行培养，试验结果见图2，可见PC12细胞在NGF-DKDKD的作用下长出突起。
试验结果表明本发明固定了NGF-DKDKD的PLGA静电纺丝膜可促进PC12细胞长出突起，有促进其分化成神经相关细胞分化的趋势。
试验例2黏附能力检测试验
检测NGF、NGF-YKYKY和NGF-DKDKD三者对于PLGA静电纺丝膜黏附能力，试验结果见图3。
试验结果表明本发明制得的NGF-DKDKD对PLGA静电纺丝膜具有较强的黏附能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 具有黏附能力的神经生长因子及其编码基因、制备方法和应用
<130> MP1800662
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgccatatgt cttccagcca tcctatcttc caccgtggtg aattcagcgt atgcgattct 60
gtcagcgttt gggtaggcga taagactact gctactgaca tcaagggtaa agaagtgatg 120
gtgctgggtg aggtgaacat caacaactcc gtcttcaaac agtacttctt cgaaaccaaa 180
tgccgtgacc caaacccggt tgactccggc tgccgtggta tcgattccaa acactggaat 240
tcttattgca ccacgaccca cacctttgtt aaagctctga ccatggacgg caaacaagcc 300
gcatggcgtt ttattcgcat tgataccgca tgtgtttgtg ttctgtctcg taaagcggta 360
cgccgcgcgt ataaatataa atattaactc gagcgg 396

Claims (10)

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子由编码神经生长因子的基因片段和编码YKYKY短肽的基因片段连接而成。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的两端还包括酶切位点。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的羧基端还包括终止密码子。
4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
5.一种蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列的结构基因的碱基序列为权利要求1至4中任一项所述DNA分子。
6.如权利要求5所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1至4中任一项所述DNA分子插入质粒，再将重组质粒转入原核表达载体中，表达蛋白。
7.一种蛋白质，其特征在于，权利要求5所述蛋白质的YKYKY短肽中的1个或几个L-酪氨酸替换为L-DOPA。
8.如权利要求7所述蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：权利要求5所述蛋白质在酪氨酸羟化酶催化作用下得到。
9.一种黏附有神经生长因子的创伤修复材料，其特征在于，所述创伤修复材料为黏附有如权利要求7所述蛋白质的载体材料。
10.如权利要求9所述创伤修复材料的制备方法，其特征在于，将含有权利要求7所述蛋白质的溶液的pH值调至8.0～9.0，得到碱性蛋白溶液；将载体材料浸入碱性蛋白溶液中，在24～26℃条件下放置6～10h；
或者将含有权利要求5所述蛋白质的溶液、酪氨酸羟化酶、维生素C溶液和载体材料混合，24～26℃条件下静置1.5～2.5h，pH值调至8.0～9.0，在24～26℃条件下放置6～10h。
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