CN107224571A

CN107224571A - 一种具有坐骨神经保护功能的plga复合微球

Info

Publication number: CN107224571A
Application number: CN201610165630.3A
Authority: CN
Inventors: 张巍; 王军松; 张卓; 康晓琪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2017-10-03

Abstract

本发明公开了一种具有坐骨神经保护功能的复合PLGA微球及其制备方法。通过将具有神经保护作用，但不同作用机制的神经生长因子(NGF)与促红细胞生成素(EPO)蛋白包裹于PLGA微球，制备同时具有NGF与EPO缓释能力的NGF/PLGA/PLGA复合微球。基于NGF、EPO在神经保护中的不同作用机制，同时释放的NGF、EPO蛋白将在坐骨神经损伤后发挥协同保护作用。坐骨神经损伤大鼠模型中实验表明，本发明提供的NGF/EPO/PLGA复合微球较以往报道的单一NGF/PLGA微球及EPO/PLGA微球均具有显著提高的神经保护作用。

Description

一种具有坐骨神经保护功能的PLGA复合微球

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种具有坐骨神经保护功能的PLGA复合微球及其制备方法。

发明背景

外周神经损伤是临床上常见的疾病类型，然而其修复一直是临床医生面临的棘手问题。研究表明，一些细胞因子在神经修复工具有重要作用，典型的代表如神经生长因子(NGF)与促红细胞生成素(EPO)。在以往的研究中，相关研究人员分别在坐骨损伤动物模型中探讨了NGF与EPO的神经保护作用，并发现均具有显著的粗神经功能恢复作用。然而，直接以水溶液形式注射的细胞因子，在体内作用时间非常短暂，难以达到有效的神经保护作用，而长时间的定期注射在实践中又较为繁琐。基于此，控制细胞因子的体内长时间释放成为研究人员关注的。

聚乳酸羟基乳酸(PLGA)是临床批准应用的医用高分子材料，由于其较好的生物相容性与可降解性，在药物控释领域受到众多研究人员的青睐。在以往的研究中，不同的研究团队分别尝试了利用PLGA材料用于细胞因子或化学药物的体内递送，且在坐骨神经损伤动物模型的试验表明，基于生物材料的药物缓释策略能够达到显著的神经保护作用。尽管如此，由于神经损伤后导致的病理环境是较为复杂的，单一的药物或者神经保护因子在神经损伤后的保护作用是较为局限的。近年来的基础研究发现，尽管NGF与EPO均具有神经保护作用，但其神经保护作用的机制却具有显著差异。NGF的神经保护机制涉及到促进感觉与运动神经元再生、STAT3通路调控、促进轴突生长等；EPO的神经保护机制涉及到生长相关蛋白43的上调、RhoA/ROCK通路调控、抑制神经细胞凋亡等等。NGF与EPO在神经保护中的不同作用提示我们，两者在坐骨神经损伤保护中可能发现协同作用。因此，发展一种具有同时NGF与EPO的药物制剂，有望获得双重神经保护作用，从而提高神经保护效果，具有重要意义。然而，相关产品与研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于制备一种同时携带NGF与EPO的PLGA药物缓释微球，从而赋予其双重神经保护作用，以提高对坐骨神经损伤的保护效果。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有坐骨神经双重保护功能的PLGA微球，包括以下步骤；

(1)将EPO与NGF共溶于水，混合均匀；

(2)0.5mL EPO/NGF水溶液加入到4mL10％的PLGA溶液中，超声乳化分钟，制备初乳液；

(3)将初乳液倒入外水相中，初乳液与外水相比例1∶10；

(4)利用匀质机在10000rpm速率下均质1min；

(5)室温固化5小时，并在100rpm转速下缓慢搅拌使溶剂挥发；

(6)200g离心5min收集微球，并使用去离子水洗3次；

(7)收集的微球冻干备用。

步骤(1)中所述的EPO与NGF水溶液，溶液浓度不是本发明的关键，但较高的浓度能够提高所制备PLGA微球的药物携带量；

步骤(3)中所述的外水相，为含2％聚乙烯醇(PVA)、3％NaCl水溶液。

本发明的有益效果是，通过将NGF与EPO同时包裹于PLGA微球，以获得具有同时缓释NGF与EPO两种神经保护因子的药物制剂，从而达到增强的神经损伤保护效果。相对于以往的神经保护药物缓释方法而言，本发明制备的PLGA微球携带了在神经机制上具有显著不同的两种因子，他们在共同缓释过程中将发挥协同作用，从而增强作用效果。

附图说明

图1 PLGA载药微球的电镜观察；(a)NGF/PLGA微球；(b)EPO/PLGA微球；(c)NGF/EPO/PLGA复合微球。

图2 NGF/PLGA微球、EPO/PLGA微球以及NGF/EPO/PLGA复合微球中细胞因子体外释放曲线。

图3坐骨神经损伤大鼠接受不同处理后的神经恢复状况观察；A，接受PBS注射实验组；B，接受对照PLGA微球注射实验组；C，接受NGF/PLGA微球注射实验组；D，接受EPO/PLGA微球注射实验组；E，接受NGF/EPO/PLGA复合微球注射实验组。

具体实施方式

下面通过以下实施例对本发明作进一步详细描述，以便本领域的技术人员进一步理解本发明，但不对本发明构成任何限制。

实施例1：PLGA载药微球制备与表征

(1)PLGA载药微球制备

1)NGF微球：将5000IUNGF溶于0.5mL水中，再将药物的水溶液于4mL油相(10％PLGA溶液，溶剂二氯甲烷)混合，超声乳化1min后，倒入40mL外水相中(2％PVA与3％NaCl混合溶液)，再用均质机10000rpm速率下均质1min后，室温固化5h，超纯水洗涤3次(200g离心3min)，冷冻干燥后，得到最终的微球；

2)EPO微球：将5000IU EPO溶于0.5mL水中，随后与4mL油相(10％PLGA溶液，溶剂二氯甲烷)混合，超声乳化1min后，倒入40mL外水相中(2％PVA与3％NaCl混合溶液)，再用均质机10000rpm速率下均质1min后，室温固化5h，超纯水洗涤3次(200g离心3min)，冷冻干燥后，得到最终的微球；

3)NGF和EPO缓和微球：将5000IU EPO与NGF共融于0.5mL水中，混合均匀后，再将药物的水溶液与4mL油相(10％PLGA溶液，溶剂二氯甲烷)混合，超声乳化1min后，倒入40mL外水相中(2％PVA与3％NaCl混合溶液)，再用均质机10000rpm速率下均质1min后，室温固化5h，超纯水洗涤3次(200g离心3min)，冷冻干燥后，得到最终的微球。

(2)PLGA载药微球形态观察

用导电胶粘取少许微球后，将其贴与样品台上，120mA喷金30s后，用电镜观察表面形貌。如附图1所示，所制备的微球形态规则，表面光滑，大小相对较为均一。激光粒度仪中测定不同微球的直径分别为：NGF/PLGA微球19.72±6.41μm，EPO/PLGA微球17.86±7.56μm，NGF/EPO/PLGA复合微球22.14±4.98μm。

(3)PLGA载药微球体外药物释放曲线测定

称取约10mg载药微球，将其悬浮于1mL 10mM PBS中，37℃孵育，在不同时间点取出全部上清液，再加入等量的新鲜PBS。用Elisa试剂盒测量上清液中药物浓度。如图2所示为不同微球的释放曲线，提示NGF、EPO蛋白的释放持续约2周。

实施例2：PLGA载药微球对坐骨神经损伤大鼠的神经保护作用

(1)大鼠坐骨神经损伤模型制备与PLGA微球注射

1)大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，取出鼠毛后碘伏消毒，右后肢作切口；

2)钝性分离肌肉暴露坐骨神经；

3)在臀大肌下面神经中央区作2mm的神经损伤切口，尽量减少其他部位组织损伤；

4)将0.5mLPLGA微球悬液，分别含微球100mg注射到神经损伤周围，对照组注射0.5mLPBS或0.5mL空载PLGA微球。

5)缝合伤口，单笼常规饲养。

(2)坐骨神经的透射电镜观察

1)手术后4周取材坐骨神经标本，浸泡于3％戊二醛溶液中4摄氏度固定过夜；

2)随后将标本固定于OsO4溶液，4摄氏度3-4小时；

3)低度酒经脱水后，包埋于环氧树脂做成标本；

4)做横断切面1-1.5μm厚切片，使用0.5％甲苯胺(0.5％硼酸盐配制)，使用投射电镜进行观察坐骨神经再生情况。如图3所示，PBS对照组与PLGA空载体对照组神经纤维明显退化，轴突直径不规则，大小不一，能够观察到明显的成纤维细胞侵入；相比之下，NGF/PLGA与EPO/PLGA对照组损伤的神经结构形态有明显改善，髓鞘形成较好，成纤维侵入少；NGF/EPO/PLGA复合微球处理组动物，坐骨神经损伤改善最为明显。提示：NGF/EPO/PLGA复合微球铰单一的NGF/PLGA或EPO/PLGA微球具有明显较好的神经损伤保护功能。

Claims

1.一种具有坐骨神经保护功能的PLGA复合微球，其特征在于同时携带神经保护因子(NGF)与促红细胞生成素(EPO)。

2.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于能够同时缓释NGF与EPO。

3.根据权利要求1所述的PLGA微球，其粒径在10μm至30μm。

4.根据权利要求2所述缓释NGF，其缓释时间在一周以上。

5.根据权利要求2所述缓释EPO，其缓释时间在一周以上。