KR20110021650A - 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 함유하는 응집체에 관한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체 및 이를 포함하는 접착체에 관한 것이다. 본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 세포 나 금속 등 다양한 기질에 대하여 접착력이 매우 우수하고, 특히 수분이 존재하는 경우나 수중에서도 접착력이 유지될 수 있어, 접착제로 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 함유하는 응집체에 관한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체 및 이를 포함하는 접착체에 관한 것이다.
해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질들(adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231; H.J. Cha 등, 2008, Biotechnology Journal 3, 631-638).
홍합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다. 또한 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다. 이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다 (J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879).
특히 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착 기술 분야에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 즉 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시키는 기술이므로 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다 (M. Tirrell 등, 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).
한편, 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 혼합되었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로, 코아세르베이트가 형성되었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시, 참여 전해질은 용액에서 분리되어 응축되고 여전히 액상을 띠게 되며, 이때 표면장력이 줄어들고 점성이 늘어나는 등, 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성질을 띠는 고분자 전해질과의 혼합을 통해서도 일어날 수 있다 (C.G. de Kruif 등, 2004, Current Opinion in Colloid and Interface Science 9, 340-349).
그러나 홍합으로부터 자연 추출한 접착물질이, 기존의 다른 코팅방법과 비교하여 높은 세포 접착능력과 세포의 증식 및 분화를 더욱 촉진시켜주는 결과를 바탕으로 상업적으로 사용되고 있지만, 자연추출물 1 그램을 얻기 위해 일만 마리의 홍합을 필요로 하는 문제가 야기되고 있다(C. V. Benedict 등, 1989, Adhesives from renewable resources, No. 385, 452-483). 따라서 홍합 접착 단백질을 기존 방법보다 효과적으로 이용할 수 있는 방법, 특히 세포접착 활성이 더욱 우수하여 세포의 표면 접착 기술에 효과적으로 적용할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 양이온성인 홍합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체가 홍합 접착 단백질보다 우수한 접착 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 응집체를 포함하는 접착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 응집체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 응집체를 포함하는 접착제를 제공한다.
또한 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 응집체의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래된 접착 단백질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO 2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다.
바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및 (d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 (c)에서 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 또한 상기 (d)에서 융합된 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.
본 발명에서 음이온성 고분자는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질과 결합하여 코아세르베이트 또는 침전물을 형성할 수 있는 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성인 홍합 접착 단백질의 pI (Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 6인 고분자, 보다 더 바람직하게는 pI 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다.
본 발명에서 음이온성 고분자는 예를 들면, 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1kDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 10kDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 17kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명에서 응집체는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자가 결합하여 형성된 코아세르베이트 또는 침전물을 말하며, 상기 코아세르베이트 또는 침전물은 각각 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이거나 침전물을 말한다.
본 발명의 응집체는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 것을 특징으로 한다. 상기 응집체는 양이온성인 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합되어 형성된 코아세르베이트(coacervate) 또는 침전물 형태일 수 있다.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.
상기 용매에서 본 발명의 응집체를 제조하는 경우 적정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다.
상기 용매에 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 각각 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
상기와 같이 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 종래 홍합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수하다. 특히 상기 응집체의 형태가 코아세르베이트일 때뿐만 아니라 침전물일 때도 세포접착 활성이 매우 우수하다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 응집체로 세포 배양 플레이트에 코팅하고 초파리(drosophila) S2 세포를 상기 코팅된 세포 배양 플레이트에 배양한 다음, PBS(phosphate buffered saline)로 씻어내고 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 실시하여 플레이트에 접착된 세포수를 측정함으로써 세포접착 활성을 측정하였다. 그 결과 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 종래 홍합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수함을 확인하였다(<실시예 2> 참조).
또한 본 발명의 응집체는 상기 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 응집체를 이용하였을 때 단일 홍합접착 단백질보다 2배 가량 큰 접착력을 유지하며, 특히 가교제인 티로시나아제(tyrosinase) 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가한 경우 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 우수한 접착력을 유지할 수 있다.(<실시예 3> 참조)
따라서 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 접착용으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 접착제는 상기 응집체를 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 접착제는 통상의 바이오 접착제에 함유되거나 또는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 0.0001 내지 99 중량%로 더 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 계면활성제, 산화제, 가교제 및 충진제(filler)가 있으나, 이에 한정되진 않는다(참조: 미국 공개특허공보 제 2003-65060호 및 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 계면활성제는 양이온성, 음이온성, 비이온성, 양쪽성 계면활성제일 수 있으며, 그 예로는 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate) 및 소듐 도데실벤젠설포네이트(sodium dodecylbenzensulfonate)가 있다. 상기 산화제는 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase), 포름알데하이드, 비스(설포숙시니미딜) 수베레이트(bis(sulfosuccinimidyl) suberate), 3,3'-디티오비스(설포숙시니미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), O2, Fe3 +, H2O2 및 IO4 -로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며(참조: Macromolecules 1998, 31, 4739-4745), 상기 충진제는 콜라겐, 히알루론 산, 콘드로이탄 설페이트(condroitan sulfate), 엘라스틴, 라미닌, 카세인, 하이드록시아페티트, 알부민, 피브로넥틴 및 하이브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 상기 가교제는 티로시나제 또는 글루타알데하이드일 수 있으며, 상기 가교제의 첨가량은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체의 질량 대비 티로시나아제의 경우 0.0001 내지 1 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%일 수 있으며, 글루타알데하이드의 경우 전체 접착 용액 부피 대비 0.001 내지 5 부피%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 부피%, 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 5 부피%일 수 있다.
본 발명의 접착제를 수분이 존재하는 경우나 수중에서 적용하는 경우 상기 가교제는 이에 한정되지 않지만 글루타알데하이드를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 접착제는 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.(<실시예 2> 및 <실시예 3> 참조)
또한 본 발명의 접착제는 수분이 존재하는 경우에도 접착력을 유지할 수 있어, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수중 접착용으로 이용될 수 있다. 상기와 같이 접착제를 수중 접착용으로 사용하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 접착제의 유효성분인 응집체는 코아세르베이트일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 접착제는 수중구조물의 유지, 보수를 위한 친환경 접착제, 보다 바람직하게는 수영장, 욕조, 배 등의 균열의 봉합에 사용될 수 있으며 의료용 접착제, 보다 바람직하게는 연질 (연결) 조직 접착제 (예컨대, 열상 및/또는 절개부를 닫을 때 봉합술 및 스테이플을 대체하는 피부 접착제) 및 경질 (경화된) 조직 접착제 (예컨대, 골 또는 치과용 접착제로서)로 용이하게 사용될 수 있다.(<실시예 3> 참조)
본 발명의 접착제는, 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 적용하기 위해 사용될 수 있으며, 즉 상기 기질을 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다.
특히 본 발명의 접착제는 생체 물질에 적용될 수 있는데, 상기 생체 물질은 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 의미하며, 일예로는, 세포, 조직, 기관, RNA, DNA, 단백질, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 호르몬, 지질 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 물질에 사용되는 경우 본 발명의 접착제는 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 Cell-Tak 제품(BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, 미국)에 준하여 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명의 접착제는 용제형, 수용성, 무용제형일 수 있으며, 기질에 대하여 0.01 내지 100 ug/cm2로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 접착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수(물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자, 의약물, 생리적 또는 대사적 관찰 장치, 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).
또한 본 발명은 접착제에 계면활성제, 산화제, 가교제, 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 응집체의 농도를 조절함으로써 상기 접착제의 접착력을 조절할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 산화제, 계면활성제, 가교제 및 충진제는 상기 기술한 바와 동일하다.
한편 본 발명의 응집체의 제조방법은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 인산염 수용액 또는 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액, 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.
상기 용매에서 본 발명의 응집체를 제조하는 경우 적정 pH는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다. 또한 적정 온도는 4 내지 100℃일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60℃일 수 있으며 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 형성되지 않거나 고분자의 변형이 발생할 수 있기 때문이다
상기 용매에 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 응집체는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 혼합비를 초과하거나 미만인 경우 응집체가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 응집체는 세포 나 금속 등 다양한 기질에 대하여 접착력이 매우 우수하고, 특히 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 접착력이 유지될 수 있어, 접착제로 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 홍합 접착 단백질인 fp-151과 음이온성 고분자인 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 9는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 11은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 12는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 13은 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 홍합 접착 단백질 fp-131과 헤파린을 다양한 pH의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 침전물과 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 15는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 단백질인 페레독신(ferredoxin)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 16는 홍합 접착 단백질 fp-151과 페레독신을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 침전물이 생긴 것을 확인한 결과이다.
도 17은 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 pH 4.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 18는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 고분자인 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 19는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 pH2.5의 아세트산 용액에서 30:70으로 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 20은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 21은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 22는 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 23은 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 24는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 25는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 26은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 27은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 28은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 29는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 30은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 31은 홍합접착 단백질 mfp-151과 히아루론산(35kDa), 홍합접착 단백질 mfp-131과 히아루론산(35kDa)을 이용한 코아세르베이트의 건조상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 32는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa or 59kDa)로 형성된 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 33은 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 34는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 수중상태에서의 접착력을 소혈청 알부민의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 9는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 11은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(35kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 12는 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 13은 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 홍합 접착 단백질 fp-131과 헤파린을 다양한 pH의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 침전물과 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 15는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 단백질인 페레독신(ferredoxin)을 다양한 pH와 비율로 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 16는 홍합 접착 단백질 fp-151과 페레독신을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 침전물이 생긴 것을 확인한 결과이다.
도 17은 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 pH 4.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 18는 홍합 접착 단백질 fp-151과 음이온성 고분자인 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 19는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 pH2.5의 아세트산 용액에서 30:70으로 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 20은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 21은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH2.5에서 혼합하였을 때 침전물의 형성을 확인한 결과이다.
도 22는 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6의 아세트산 용액에서 80:20으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 23은 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산(35kDa)을 pH 4.6에서 혼합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 24는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 25는 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 26은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 27은 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 이용하여 침전물을 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 28은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 29는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 30은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 31은 홍합접착 단백질 mfp-151과 히아루론산(35kDa), 홍합접착 단백질 mfp-131과 히아루론산(35kDa)을 이용한 코아세르베이트의 건조상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 32는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa or 59kDa)로 형성된 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 33은 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 홍합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 34는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 수중상태에서의 접착력을 소혈청 알부민의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
참조예
1>
홍합 접착 단백질의 제조
<1-1> 홍합 접착 단백질
fp
-151의 제조
상기 홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 4로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 1의 fp-151을 제조하였다.
<1-2> 홍합 접착 단백질
fp
-151-
RGD
의 제조
상기 <실시예 1-1>의 fp-151의 C-말단에 피브로넥틴(fibronectin) RGD 그룹에서 선택된 GRGDSP 서열을 추가하여 서열번호 2의 fp-151-RGD를 제조하였다.
<1-3> 홍합 접착 단백질
fp
-131의 제조
홍합 접착 단백질 fp-131은 상기 <실시예 1-1>의 fp-151과 마찬가지 방식으로 2개의 fp-1 변이체 사이에 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-3A의 유전자(Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다.
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7로 표시되는 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-3의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 3의 fp-131을 제조하였다.
<1-4> 홍합 접착 단백질
fp
-5의 제조
홍합 접착 단백질 fp-5은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 대장균에서 생산한 것이다(D.S. Hwang et. al., applied and environmental microbiology, 3352-3359, 2004).
<
실시예
1>
홍합 접착 단백질을 이용한
코아세르베이트
(
coacervate
) 또는 침전물의 형성
코아세르베이트(coacervate)는 특정 pH조건에서 특정 비율로 음이온성 전해질 고분자와 양이온성 전해질 고분자를 혼합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이다. 상기 코아세르베이트 또는 침전물이 형성되면 용액의 흡광도가 증가되기 때문에 코아세르베이트 또는 침전물의 형성 여부를 확인하기 위해 주로 흡광도를 측정하게 된다(V. Ducel et. al., Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232, 239-247, 2004). 하기 실시예는 상기 참조예에서 제조된 홍합 접착단백질과 음가 전해질 고분자를 혼합한 경우 코아세르베이트 또는 침전물이 형성되는지 여부를 확인한 것이다.
<1-1> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(17
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예 1-1>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 음가 전해질 고분자인 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 확인하였다.
구체적으로 17kDa의 분자량을 지닌 히아루론산(Lifcore Biomedical; Minesota, 미국)을 0.05%(w/v) 농도로 5% 아세트산(수산화나트륨으로 pH 조절)에 녹이고, 상기와 동일한 용액에 녹인 홍합 접착 단백질 fp-151을 용질(홍합 접착 단백질 및 히아루론산) 부분에서 차지하는 비율을 10%(w/w)씩 상승시키면서 혼합하였다. 상기 혼합 후, UV-spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, 대전, 한국)를 이용해 600nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.
상기 도 1에 기재된 바와 같이, pH 2.5에서 fp-151과 히아루론산(17kDa)의 중량비가 58:42, pH 3.0에서 63:37, pH 3.5에서 68:32일 때 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 알 수 있었다.
또한 상기 흡광도의 증가가 코아세르베이트의 형성에 의한 것인지를 현미경 사진을 통해 확인하고 그 결과를 도 2에 기재하였다.
상기 도 2에 기재된 바와 같이, 10 μm 정도 크기의 원형체가 형성된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트임을 알 수 있었다. 만일 단순 혼합물이 침전된 것이라면, 도 16 및 도 19에 기재된 바와 같이 불균일한 형태의 응집체가 형성되기 때문이다.
<1-2> 홍합 접착 단백질
fp
-131과 히아루론산(17
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 3 및 도 4에 기재하였다.
상기 도 3 및 도 4에 기재된 바와 같이, fp-131과 히아루론산 (17kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 41:59, pH 3.0에서 56:44, pH 3.5에서 59:41에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다.
<1-3> 홍합 접착 단백질
fp
-151-
RGD
와 히아루론산(17
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예 1-2>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 5 및 도 6에 기재하였다.
상기 도 5 및 도 6에 기재된 바와 같이, fp-151-RGD와 히아루론산의 (17kDa) 중량비가 pH 2.5에서 60:40, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 73:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 fp-151보다 fp-151-RGD를 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
<1-4> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(35
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
히아루론산(35kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 7 및 도 8에 기재하였다.
상기 도 7 및 도 8에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 59:41, pH 3.0에서 70:30, pH 3.5에서 77:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 35kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
<1-5> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(59
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
히아루론산(59kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 9 및 도 10에 기재하였다.
상기 도 9 및 도 10에 기재된 바와 같이, fp-151과 히아루론산 (59kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 62:38, pH 3.0에서 71:29, pH 3.5에서 75:25에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 59kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
<1-6> 홍합 접착 단백질
fp
-151과
페레독신(ferredoxin)을
이용한 침전물 형성
페레독신(ferredoxin)은 pI값이 약 3.48이어서, pH 3.5 이하에서의 실험은 의미가 없기 때문에 보다 높은 pH영역에서 흡광도 측정 실험을 수행하였다. 구체적으로 페레독신(ferredoxin)(대장균 발현용 벡터 pET28a에 삽입된 surrogate ferredoxin(Anabaena sp. PCC7119 유래)를 대량발현 및 정제하여 사용함)을 0.05%(w/v)의 농도로 수산화나트륨으로 pH를 조절한 1% 아세트산에 녹이고, 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 혼합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 15 및 도 16에 기재하였다.
상기 도 15 및 도 16에 기재된 바와 같이, fp-151과 페레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30, pH 5.0에서 70:30, pH 5.5에서 80:20인 경우 흡광도가 가장 높았으며, 특히 본 실시예에서는 코아세르베이트 현미경 사진과 달리, 일정한 원형 액상이 아닌 입자가 뭉친 응집체 형태의 혼합 침전물이 형성됨을 확인하였다.
<1-7> 홍합 접착 단백질
fp
-131과
페레독신을
이용한
코아세르베이트
형성
홍합 접착 단백질로 상기 <참조예 1-3>에서 제조된 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 페레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30일 때, <실시예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 17에 기재하였다.
상기 도 17에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 페레독신(ferredoxin)을 이용한 경우 코아세르베이트가 형성됨을 알 수 있었다.
<1-8> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 폴리스티렌술폰산(
poly
styrene
sulfonic
acid)을 이용한 침전물 형성
폴리스티렌술폰산(sigma사)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 실험을 진행하고 그 결과를 도 18 및 도 19에 기재하였다.
상기 도 18 및 도 19에 기재된 바와 같이, fp-151과 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 30:70로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다. 특히 본 실시예에서는 코아세르베이트 현미경 사진과 달리, 일정한 원형 액상이 아닌 입자가 뭉친 응집체 형태의 혼합 침전물이 형성됨을 확인하였다.
<1-9> 홍합 접착 단백질
fp
-151-
RGD
과 폴리스티렌술폰산을 이용한 침전물 형성
폴리스티렌술폰산(Sigma)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-3>과 동일한 방법으로 침전물이 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 20 및 도 21에 기재하였다.
상기 도 20 및 도 21에 기재된 바와 같이, fp-151-RGD와 폴리스티렌술폰산을 pH 2.5에서 80:20로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가되었으며, 침전물이 형성됨을 알 수 있었다.
<1-10> 홍합 접착 단백질
fp
-131과 히아루론산(35
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-5>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.
<1-11> 홍합 접착 단백질
fp
-131과 히아루론산(59
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예 1-3>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산(35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때, <실시예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.
<1-12> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 헤파린(
heparin
)을 이용한 침전물 및
코아세르베이트
형성
헤파린(heparin, sigma)과 fp-151의 흡광도 측정 실험이 pH 4.0, pH 5.0, pH 5.5에서 각각 수행되었다. 헤파린을 0.02%(w/v)의 농도로 상기 pH를 지니는 100mM sodium acetate buffer에 녹이고, 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 혼합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 13 및 도 14에 기재하였다.
상기 도 13 및 도 14에 기재된 바와 같이, fp-151과 헤파린의 중량비가 pH 에 관계없이 90:10인 경우 흡광도가 가장 높았으며, 도 14에서 pH 5.0에서는 코아세르베이트, pH 4.0과 pH 5.5 에서는 응집침전물이 생김을 확인하였다.
<1-13> 홍합 접착 단백질
fp
-5과 히아루론산(35
kDa
)을 이용한
코아세르베이트
형성
상기 <참조예1-4>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-5를 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1-4>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 22 및 도 23에 기재하였다.
상기 도 22 및 도 23에 기재된 바와 같이, fp-5과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 4.6에서 80:20로 혼합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다.
<
실시예
2>
응집체의 세포접착 활성
<2-1> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(17
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
세포접착 활성
상기 <실시예 1-1>에서 형성된 코아세르베이트를 이용하여, 표면이 처리되지 않은 24-웰 배양 플레이트를 코팅하고 이를 통해 세포접착 활성을 확인하였다. 이때 양성 대조군으로 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 fp-151 및 poly-L-lysine을 사용하였다. 상기 양성 대조군에 대해서는 종래 공지된 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 의한 침전법을 이용하였다.(Fulkerson, J.P. 등 (1990) Journal of Orthopaedic Research 8 (6), pp. 793-798, (1990))
구체적으로 본 실험에서 사용된 초파리(Drosophila) S2 세포(Invitrogen)를 10% IMS (insect medium supplement, Sigma), 1% antibiotic-antimycotic (Invitrogen) 및 3μl/ml hygromycin(hyclone)이 포함된 곤충세포배양액(M3 medium, Sigma)을 사용하여 27℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 세포를 상기 배양액에 1x105개/ml 농도로 희석하고, 상기 코아세르베이트로 코팅된 세포배양접시에 웰당 5x104개로 상기 세포를 넣고 1시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 배양 후, 살아있는 세포를 정량화하기 위해서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 실시하였다. 먼저 상기 배양 후에 붙어있지 않은 세포를 제거하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 씻어낸 후 300㎕의 MTT 용액을 웰에 주입하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아에서 MTT를 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원시켜주기 때문에 MTT 시약을 넣고 2시간 추가 배양한 후, MTT 포르마잔으로 환원된 것을 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용출한 다음, 분광기(spectrophotometer)를 통하여 570nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 24에 기재하였다.
상기 도 24에 기재된 바와 같이, fp-151 및 poly-L-lysine등의 양성 대조군에 비하여, 홍합접착단백질 fp-151과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<2-2> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성
상기 <실시예 1-8>에서 형성된 침전물을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 25에 기재하였다.
상기 도 25에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<2-3> 홍합 접착 단백질
fp
-151-
RGD
와 히아루론산(17
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
세포접착 활성
상기 <실시예 1-3>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 26에 기재하였다.
상기 도 26에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<2-4> 홍합 접착 단백질
fp
-151-
RGD
과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성
상기 <실시예 1-9>에서 형성된 침전물을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 27에 기재하였다.
상기 도 27에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD과 폴리스티렌술폰산에 의해 형성된 침전물의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<2-5> 홍합 접착 단백질
fp
-131 과 히아루론산(17
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
세포접착 활성
상기 <실시예 1-2>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 28에 기재하였다.
상기 도 28에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
<2-6> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(35
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
세포접착 활성
상기 <실시예 1-4>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 29에 기재하였다.
상기 도 29에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
<2-7> 홍합 접착 단백질
fp
-151 과 히아루론산(59
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
세포접착 활성
상기 <실시예 1-5>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 2-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 30에 기재하였다.
상기 도 30에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<
실시예
3>
응집체의 접착력 측정
<3-1> 홍합 접착 단백질
fp
-151 또는
fp
-131과 히아루론산(35
kDa
)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (건조조건)
홍합접착단백질 fp-151과 fp-131의 타이로신 잔기를 도파로 바꾸기 위해 티로시나제 효소반응을 하였다. 구체적으로 5ug/ml의 버섯유래 티로시나제 효소와 2g/L의 단백질을 25mM의 아스코르빈산(ascorbic acid)을 포함한 PBS에 녹여 37℃에서 반나절 반응시키고 증류수에 두 번 투석하고 동결건조함으로써 수정된 홍합접착단백질 mfp-151과 mfp-131를 수득하였다.
수산화나트륨으로 pH 3.8로 맞춘 100mM 아세테이트 버퍼에 mfp-151과 히아루론산(35kDa)을 각각 10g/L로 녹인 용액을 질량비 8:2로 섞어 코아세르베이트를 제조하였다. 그리고 이를 원심분리하여 응축된 액상 콜로이드 상태의 코아세르베이트를 알루미늄 시편에 12mm x 10mm 넓이로 도말하여 접착시켰다. 비교실험을 위해 같은 농도의 BSA(bovine serum albumin)와 동결건조 상태의 단일 홍합접착 단백질 mfp-151 또는 mfp-131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 방법으로 붙이고 이를 24시간 동안 상온에서 말려 접착된 알루미늄 시편의 양쪽에 힘을 가해 탈착시에 가해지는 힘을 인장강도 측정기기(Instron)로 정량하여 접착제의 인장강도를 측정하였고 그 결과를 도 31에 기재하였다.
상기 도 31에 기재된 바와 같이 홍합접착 단백질과 히아루론산을 이용한 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
<3-2> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(35
kDa
또는 59
kDa
)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (수분조건)
상기 <실시예 3-1>에서 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 가교제인 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:200으로 섞거나, 혹은 상기 <실시예 1-5>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다. 비교실험을 위해 fp-151을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)나 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙였다.
상기 샘플 위에 증류수에 담근 거즈를 감고 건조되지 않도록 랩으로 감았다. 이를 3시간 동안 37℃에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 32에 기재하였다.
상기 도 32에 기재된 바와 같이, 두가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
<3-3> 홍합 접착 단백질
fp
-131과 히아루론산(59
kDa
)에 의해 형성된
코아세르베이트의
접착력 측정 (수분조건)
상기 <실시예 3-2>에서와 같은 방법으로, 상기 <실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-131과 질량대비 1:1000으로 섞거나 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다.
비교실험을 위해 fp-131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 3시간 동안 온도 30℃, 습도 90%에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 33에 기재하였다.
상기 도 33에 기재된 바와 같이, 두 가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
<3-4> 홍합 접착 단백질
fp
-151과 히아루론산(59
kDa
)에 의해 형성된
코아세
르베이트의 접착력 측정 (수중조건)
상기 <실시예 3-2>에서와 같은 방법으로, 상기 <실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산(59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제(tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:1000으로 혼합하고 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다.
비교실험을 위해 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제(tyrosinase)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 24시간 동안 PBS에 담근 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 34에 기재하였다.
상기 도 34에 기재된 바와 같이, 두 가지 가교제(tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 BSA에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
<110> POSTECH Foundation
<120> Agglomerate comprising adhesion protein isolated from mussel and
anionic polymers
<130> DPP20102958KR
<150> KR2009-0078666
<151> 2009-08-25
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 196
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-151
<400> 1
Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
20 25 30
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
35 40 45
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu
50 55 60
Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly
100 105 110
Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr
115 120 125
Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys
195
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-151-RGD
<400> 2
Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
20 25 30
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
35 40 45
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu
50 55 60
Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly
100 105 110
Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr
115 120 125
Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
130 135 140
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
165 170 175
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
180 185 190
Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro
195 200
<210> 3
<211> 172
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-131
<400> 3
Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala
20 25 30
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
35 40 45
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala
50 55 60
Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly
65 70 75 80
Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn
85 90 95
Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala
100 105 110
Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro
115 120 125
Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro
130 135 140
Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu
165 170
<210> 4
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-3
<400> 4
Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp
20 25 30
Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
35 40 45
<210> 5
<211> 76
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-5
<400> 5
Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His
1 5 10 15
Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr
20 25 30
Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys
35 40 45
Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg
50 55 60
Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
65 70 75
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment sequence derived from FP-1
<400> 6
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP-1
<400> 7
Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys
20 25 30
Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr
35 40 45
Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
50 55 60
<210> 8
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 1
<400> 8
Arg Gly Asp
1
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 2
<400> 9
Arg Gly Asp Ser
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 3
<400> 10
Arg Gly Asp Cys
1
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 4
<400> 11
Arg Gly Asp Val
1
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 5
<400> 12
Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 6
<400> 13
Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 7
<400> 14
Gly Arg Gly Asp Thr Pro
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 8
<400> 15
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 9
<400> 16
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGD Group 10
<400> 17
Tyr Arg Gly Asp Ser
1 5
Claims (29)
- 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 혼합된 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및
(d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드로
이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 응집체. - 제2항에 있어서, 상기 (c)의 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 응집체.
- 제2항에 있어서, 상기 (d) 융합된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는, 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-terminal)에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 응집체.
- 제5항에 있어서, RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것인 응집체.
- 제5항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate), 헤모글로빈(hemoglobin), 헤파린(heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 응집체.
- 제9항에 있어서, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 1kDa 내지 300kDa인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 응집체는 상기 홍합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합된 것인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 응집체는 상기 홍합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 혼합하여 제조된 것인 응집체.
- 제1항에 있어서, 상기 응집체는 코아세르베이트(coacervate) 또는 침전물인 응집체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 응집체를 포함하는 접착제.
- 제14항에 있어서, 상기 접착제는 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 접착되는 것인 접착제.
- 제14항에 있어서, 상기 접착제는 생체물질에 적용되는 것인 접착제.
- 제14항에 있어서, 상기 접착제는 수중 접착용인 것인 접착제.
- 제14항에 있어서, 상기 접착제는 계면활성제, 산화제, 가교제, 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질을 더욱 포함하는 것인 접착제.
- 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는 응집체의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및
(d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드로
이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 응집체의 제조방법. - 제20항에 있어서, 상기 (c)의 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 응집체의 제조방법.
- 제20항에 있어서, 상기 (d) 융합된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인 응집체의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는, 홍합 접착 단백질의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-terminal)에 RGD(Arg-Gly-Asp)를 포함하는 3 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 응집체의 제조방법.
- 제23항에 있어서, RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 표시되는 것인 응집체의 제조방법.
- 제23항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인 응집체의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질의 변이체는 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것인 응집체의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 히아루론산(hyaluronic acid), 페레독신(ferredoxin), 폴리스티렌술폰산(poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검(gum arabic), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 카보폴(carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴(high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨(sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검(xanthan gum), 유청 단백질(whey protein), 레구민(faba bean legumin), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 알긴산(alginate), 캐러지넌(carrageenan), 헥사메타인산 나트륨(sodium hexametaphosphate), 카제인 나트륨(sodium casinate) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 응집체의 제조방법.
- 제27항에 있어서, 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 1kDa 내지 300kDa인 응집체의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 응집체는 코아세르베이트(coacervate) 또는 침전물인 응집체의 제조방법.
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