WO2011025158A2 - 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트 - Google Patents

홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트 Download PDF

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WO2011025158A2
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adhesive protein
protein
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황동수
송영훈
임성혜
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Definitions

  • the present invention relates to a coacervate comprising a mixed adhesive protein and an anionic polymer, and more particularly, to a coacervate prepared by mixing a mussel adhesive protein and an anionic polymer and a novel use thereof.
  • Advancing adhesive proteins are known to be powerful natural adhesives compared to currently known chemical synthetic adhesives, and they have the flexibility to bend, while exhibiting a tensile strength of about twice that of epoxy resins. Mussel adhesive proteins also have the ability to adhere to various surfaces of plastics, glass, metals, Teflon and biomaterials, and can adhere to wet surfaces in minutes. This property remains an unfinished task in the field of chemical adhesives. In addition, adhesive proteins are known to not attack human cells or cause immune reactions, and are highly applicable to medical fields such as adhesion of living tissues and adhesion of broken teeth during surgery (J. Dove et al., 1986, Journal of American Dental Association 112, 879).
  • the promoted adhesion protein may be used in the field of surface adhesion technology of the cell, which is one of the very important technology for cell culture and tissue engineering, that is, cells and cells for tissue culture It is an important technique for promoting cell proliferation and differentiation because it is an effective adhesion technique to the culture surface (M. Tirrell et al., 2002, Surf. Sci., 500, 61-83).
  • the adhesive material naturally extracted from the cultivation is commercially used on the basis of the high cell adhesion ability and the further promotion of cell proliferation and differentiation compared with other coating methods, to obtain 1 gram of natural extract Problems requiring ten thousand mussels have arisen (CV Benedict et al., 1989, Adhesives from renewable resources, No. 385, 452-483).
  • coacervate is a type of colloidal material formed when anionic and cationic polyelectrolytes are mixed under specific conditions.
  • the absorbance of the solution increases, and the outer solution is round in the form of a round solution.
  • the participant electrolyte is separated from the solution, condensed and still liquid, and the physical properties also change, such as decreasing surface tension and increasing viscosity.
  • Coacervates can also occur through the mixing of proteins with vice versa (CG de Kruif et al., 2004, Current Opinion in Colloid and Interface Science 9, 340-349).
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the coacervate formed by mixing the cationic phosphorylated adhesive protein and the anionic polymer has superior adhesive activity than the mussel adhesive protein and can be usefully used to deliver a bioactive material.
  • an object of the present invention is to provide a coacervate containing an anionic polymer in a promoted adhesive protein or a variant thereof.
  • an object of the present invention is to provide a composition for delivery of a bioactive material comprising the coacetate.
  • It is another object of the present invention to provide a biologically active substance carrier comprising (a) the coacervate and a bioactive material, and (b) the bioactive material is enclosed in the coacervate.
  • the present invention (a) mixing the anionic polymer and the bioactive material to the mixed adhesive protein or a variant thereof and (b) the coacervate formed by the mixed adhesive protein or a variant thereof and the anionic polymer
  • a method for producing a bioactive material carrier comprising the step of forming a coating around the bioactive material.
  • the present invention provides a method of using the coacervate of the present invention for the delivery of a bioactive material, comprising the steps of (a) preparing the coacervate of the present invention and (b) encapsulating the bioactive material in the coacervate. It aims to do it.
  • the present invention provides a coacervate containing an anionic polymer in the mussel adhesive protein or a variant thereof.
  • the present invention also provides an adhesive comprising the coacervate.
  • the present invention provides a composition for delivery of a bioactive material comprising the coacetate.
  • the present invention also provides a biologically active substance carrier comprising (a) the coacervate and a bioactive material, and (b) the bioactive material is enclosed in the coacervate.
  • the present invention (a) mixing the anionic polymer and the bioactive material in the mussel adhesive protein or a variant thereof, and (b) the coacervate formed by the flocked adhesive protein or variant and anionic polymer is a bioactive material It provides a method for producing a bioactive material carrier comprising the step of forming a coating around.
  • the present invention provides a method for preparing coacervate comprising the step of mixing an anionic polymer in a fusion conjugate protein or a variant thereof in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at pH 2.0 to pH 10.0.
  • the invention also provides a use for the coacervate of the invention for adhesion.
  • the present invention also provides a use for the coacervate of the present invention for the delivery of a bioactive material.
  • the present invention also provides a method of using the coacervate of the present invention for the delivery of a bioactive material, comprising the steps of (a) preparing the coacervate of the present invention and (b) encapsulating the bioactive material in the coacervate. do.
  • the present invention also provides the use of the coacervate of the invention for the preparation of a bioactive substance carrier.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing the coacervate of the present invention and (b) encapsulating the bioactive material in the coacervate, the method of using the coacervate of the present invention in the preparation of a bioactive material carrier.
  • the mussel adhesive protein in the present invention is an adhesive protein derived from culturing, but preferably includes all mussel adhesive proteins described in International Publication No. WO2006 / 107183A1 or WO 2005/092920.
  • the promoted adhesive protein is ( a ) a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (b) a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, (c) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 to 10 times It may be a polypeptide fused to at least two or more selected from the group consisting of a polypeptide connected in succession and (d) the polypeptide of (a), the polypeptide of (b) and the polypeptide of (c).
  • the polypeptide is not limited thereto, but may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the polypeptide fused in (d) is Although not limited, it may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • Mutants of the fusion adhesive protein in the present invention preferably include an additional sequence to the carboxyl or amino terminus of the mussel adhesive protein or some amino acids are different under the premise of maintaining the adhesion of the fusion adhesive protein. It may be substituted with an amino acid. More preferably, the polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD is linked to the carboxyl or amino terminus of the fusion conjugate protein or 1 to 100% of the total number of tyrosine residues constituting the fusion conjugate protein. Preferably 5 to 100% may be substituted with 3,4-dihydroxyphenyl—L-alanine (DOPA).
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenyl—L-alanine
  • RGD 3 to 25 amino acids including the RGD include, but are not limited to, RGEKArg Gly Asp, SEQ ID NO: 8), RGDSCArg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 9), RGDCCArg Gly Asp Cys, SEQ ID NO: 10), RGDV (Arg Gly Asp Val, SEQ ID NO: 11), RGDSPASSKP (Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, SEQ ID NO: 12), GRGDS (Gly Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 13), GRGDTP (Gly Arg Gly Asp Thr Pro, SEQ ID NO: 14), GRGDSPCGly Arg Gly Asp Ser Pro, SEQ ID NO: 15), GRGDSPCCGly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, SEQ ID NO: 16), and YRGDSCTyr Arg Gly Asp Ser, SEQ ID NO: 17) May be one or more selected from the group consisting of:
  • the variant of the mussel adhesive protein linked to the polypeptide consisting of 3 to 25 amino acids including RGD at the carboxyl or amino terminus of the fusion adhesive protein is not limited thereto but is preferably in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It may be made of a polypeptide.
  • the mussel adhesive protein in the present invention is not limited thereto, but is preferably inserted into a conventional vector designed to express an external gene so that it can be mass-produced by genetic engineering.
  • the vector may be appropriately selected or newly produced according to the type and characteristics of the host cell for producing the protein.
  • the method of transforming the vector into a host cell and the method of producing a recombinant protein from the transformant can be easily carried out by conventional methods.
  • the anionic polymer may be used without limitation as long as it is a polymer material capable of forming a coacetate by combining with the cationic phosphorus mussel adhesive protein.
  • pi Isoelectric point of the cationic mussel adhesive protein is used.
  • Low polymer more preferably a polymer having a pi value of 2 to 6, even more preferably a polymer having a pi value of 2 to 4.
  • the anionic polymer may be, for example, hyaluronic acid, ferredoxin, polystyrene sulfonic acid, gum arabic, gelatin, albumin. ), Carbopol, high or low methoxyl pectin, sodium carboxymethyl guar gum, xanthan gum, whey protein, legumin (faba bean legumin), carboxymethyl cellulose, alginate, carrageenan, sodium hexametaphosphate, Casein sodium (sodium casinate), hemoglobin (hemoglobin), heparin (heparin) and extracellular polysaccharide B40 (exopolysaccharide B40) may be one or more selected from the group consisting of, the average molecular weight of the anionic polymer is not limited to this, but preferably It may have a molecular weight selected from the group consisting of lkDa to 300kDa, more preferably lOkDa to 100kD, more preferably
  • the biologically active substance is a substance exhibiting a certain pharmacological activity when administered to a living body or applied to the skin surface, but is not limited thereto, and preferably may be at least one selected from the group consisting of drugs, enzymes, cells, and food additives.
  • anticancer agent antibiotic, anti-inflammatory agent, hormone, hormonal antagonist, interleukin, interferon, growth factor, tumor necrosis factor, engecin, lymphocytosis, urokinase, straptokinase, tissue plasminogen activator chaff 1, protease inhibitor, It may be at least one selected from the group consisting of alkylphosphocholine, radioisotope labeling substance, surfactant, cardiovascular drug, gastrointestinal system drug and nervous system drug.
  • the anti-inflammatory agent may be, but not limited to, dexamethasone (dexamethasone).
  • coacervate refers to a kind of colloid produced by mixing the carboxylation protein or a variant thereof and an anionic polymer.
  • Coacervate of the present invention is the mussel adhesive protein or its It is characterized in that the variant contains an anionic polymer.
  • the coacervate may be formed by mixing an anionic polymer with a cationic phosphorylated adhesive protein or a variant thereof.
  • Coacetate of the present invention is not limited thereto, but may preferably be prepared in an aqueous solution, more preferably methanol, ethanol, propane, acetone, aqueous acetic acid solution, more preferably aqueous acetic acid solution, even more preferably o. It may be prepared in an aqueous 1% to 10% acetic acid solution, even more preferably in an aqueous 0.5% to 8% acetic acid solution.
  • the appropriate pH is limited to this, but preferably pH 2.0 to pH 10.0, more preferably may be pH 2.0 to pH 6.0, more preferably pH 2.5 to pH 5.5. If the pH is above or below the coacervate is not formed or the polymer may be modified.
  • the amount of addition of a fused adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer to the solvent is not limited thereto, but preferably 0.001 to 100% (w / v) relative to the total volume of the solvent, and more preferably 0.01 to 30. It may be% (w / v).
  • Coacetate of the present invention is limited to this, but preferably may be prepared by mixing the mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10, more preferably 1: 0.25 to 1 It may be prepared by mixing in a weight ratio of: 2.5, more preferably in a weight ratio of 1: 0.25 to 1: 2.33. This is because coacervate may not be effectively formed when the mixing ratio is above or below. As described above, coacervates prepared by mixing mussel adhesive proteins or variants and anionic polymers thereof have a much higher cell adhesion activity than poly-L-lysine, which is known to have conventionally promoted adhesive protein or cell adhesion activity. great.
  • Drosophila S2 cells are cultured in the coated cell culture plate, washed with PBS (phosphate buffered saline) and MTT (3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -y 1) -2, 5 -diphenyltetrazolium bromide) assay was performed to determine the cell adhesion activity by measuring the number of cells adhered to the plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • MTT 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -y 1) -2, 5 -diphenyltetrazolium bromide
  • the coacervate of the present invention maintains an effective adhesion force not only for the microadhesion system such as the cell adhesion activity but also for the adhesion of metal materials such as a large capacity adhesion system, for example, aluminum.
  • the adhesive strength is maintained about twice as large as that of a single mixed adhesive protein, and in particular, when the crosslinking agent tyrosinase or glutaraldehyde is added When present, or excellent in water can be maintained. (See ⁇ Example 4>)
  • coacervate prepared by mixing the exalted adhesive protein or its variants and anionic polymer may be usefully used for adhesion.
  • the adhesive of the present invention is characterized in that it contains the coacervate.
  • the adhesive may further comprise 0.0001 to 99% by weight of a conventional bioadhesive or contained in a pharmacologically acceptable excipient.
  • excipients include, but are not limited to, surfactants, oxidizers, crosslinkers and fillers (see, eg, US Patent Publication Nos. 2003-65060 and 5,015,677).
  • the surfactant may be a cationic, anionic, nonionic, amphoteric surfactant, for example sodium dodecylsulfate and sodium dodecylbenzensulfonate.
  • the oxidizing agent is catechol oxidase, formaldehyde, bis (sulfosuccinimidyl) subberate (bis (sulfosuccinimidyl) suberate), 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate), 0 2 , Fe 3+ , H 2 0 2 and I 4 4 — (Macromolecules 1998, 31, 4739-4745), said layer Ginseng may be selected from the group consisting of collagen, hyaluronic acid, condroitan sulfate, elastin, laminin, casein, hydroxyapatite, albumin, fibronectin and hybrids.
  • the crosslinking agent may be tyrosinase or glutaaldehyde, and the amount of the crosslinking agent is 0.0001 to 1% by weight, more preferably 0.001 to 1% by weight, more preferably 0.001 to 1% by weight based on the mass of the fused adhesive protein or a variant thereof. More preferably 0.01 to 1% by weight, in the case of glutaraldehyde, 0.001 to 5% by volume relative to the total adhesive solution volume, More preferably, it may be from 0 to 5% by volume, even more preferably from 0.1 to 5% by volume.
  • the crosslinking agent is not limited thereto, but glutaraldehyde is more preferably used.
  • the adhesive of the present invention maintains an effective adhesion force not only for microadhesion systems such as cell adhesion activity but also for adhesion of large-capacity adhesion systems, for example, metal materials such as aluminum. (See ⁇ Example 3> and ⁇ Example 4>)
  • the adhesive of the present invention can maintain the adhesive force even in the presence of water, but is not limited thereto, and may be preferably used for underwater bonding.
  • the coacervate which is preferably an active ingredient of the adhesive may be coacervate.
  • the adhesive of the present invention can be used for the sealing of cracks such as environmentally friendly adhesives for maintenance and repair of aquatic structures, more preferably in swimming pools, baths, boats, etc.
  • tissue adhesives eg, skin adhesives to replace sutures and staples when closing lacerations and / or incisions
  • hard (cured) tissue adhesives eg as bone or dental adhesives
  • the adhesive of the present invention can be used for application to a substrate selected from the group consisting of plastic, glass, metal, and polymer synthetic resin, that is, to be used for adhering or fixing the substrate.
  • the method of use is in accordance with the usual method of using an adhesive, and a representative method is an application method.
  • the adhesive of the present invention may be applied to a biological material, which may be derived from all copper, plants, and animals derived from the same.
  • the adhesive of the present invention may be used according to specific usage, dosage amounts, and formulations according to currently available CeU-Tak products (BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, USA).
  • the adhesive of the present invention may be a solvent type, water-soluble, solvent-free type, 0.01 to about the substrate
  • Examples of applications of the adhesive of the present invention include, but are not limited to: (1) adhesion between substrates in water (water or saline water); (2) orthopedic treatments such as bone, ligament, tendons, meniscus and muscle treatments and artificial material implants; (3) ophthalmic junctions, such as treatment of perforation, fissures, incisions, corneal transplantation, artificial corneal insertion; (4) dental joints such as correction devices, dentures, crown mounts, rocking teeth fixation, broken tooth care and layered fixation; (5) surgical treatments such as vascular bonding, tissue bonding, artificial material implantation, wound closure; (6) graft conjugation of plants, conjugation in plants such as wound healing; And (7) drugs, hormones, biological factors, drugs, physiological or metabolic observation devices, antibiotics and transplantation of cells (US Pat. No. 5,015,677).
  • the present invention is to improve the adhesion of the adhesive by treating the adhesive with a substance selected from the group consisting of a surfactant, an oxidizing agent, a crosslinking agent, and a filler, or by adjusting the concentration of coacervate, an active ingredient of the adhesive.
  • a substance selected from the group consisting of a surfactant, an oxidizing agent, a crosslinking agent, and a filler or by adjusting the concentration of coacervate, an active ingredient of the adhesive.
  • a mussel adhesive protein or SEQ ID NO: 2 comprising a coacervate formed by mixing a mussel adhesive protein or a variant thereof with hyaluronic acid or heparin, more preferably a polypeptide of SEQ ID NO: 1 or 3 Coacervate is formed by mixing hyaluronic acid or heparin with the variant, and further mixing red pepper seed oil as an example of a bioactive material shows that the coacervate forms a film around red pepper seed oil. (See ⁇ Example 2>)
  • composition for delivery of a bioactive material of the present invention is characterized in that it comprises a coacervate formed by mixing an anionic polymer with a fused adhesive protein or a variant thereof.
  • composition for delivery of the biologically active substance of the present invention is not limited thereto, and may preferably be in the form of a pharmaceutical composition.
  • composition for delivery of a bioactive substance of the present invention is, but is not limited to, coacervate based on the total weight of the composition, but preferably includes 0.0001 to 50% by weight of coacervate.
  • the composition of the present invention may further contain at least one active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to the active ingredient.
  • composition for delivery of a biologically active substance of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the coacetate described above for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include saline solution, sterile water, Ringer's solution, complete saline solution, textrose solution, maltodextrin solution, Glycerol, ethanol, liposomes and one or more of these components can be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, complete fluids, bacteriostatic agents can be added as necessary.
  • Target organ specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier so that they can be used.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component using an appropriate method in the art or using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA. Can be.
  • composition for delivery of a bioactive material comprising the coacervate is intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, nasal, mucosal Can be delivered in vivo by infusion, by inhalation, oral, or the like. Dosage varies according to the subject's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion, and severity of disease. The daily dosage is about 0.1 to 100 rag / kg, preferably 0.5 to 10 mg / kg, more preferably divided once to several times a day.
  • the bioactive material carrier of the present invention is characterized in that (a) the coacetate and the bioactive material are contained, and (b) the bioactive material is enclosed in the coacervate.
  • the coacervate is not limited thereto, but may preferably be coacervate.
  • the bioactive substance carrier is not limited thereto, but may preferably be a microcapsule.
  • the coacervate may be formed by mixing the mussel adhesive protein or a variant thereof and the anionic polymer in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at pH 2.0 to pH 10.0.
  • the coacervate forms a coating around a bioactive material, for example, pepper seed oil, and effectively encapsulates the bioactive material inside the coacervate, thereby forming a microcapsule which is a bioactive material carrier. Furthermore, there is a characteristic of maintaining the shape even after a long time formed as described above. (See ⁇ Example 2>)
  • the size of the bioactive material carrier formed as described above is not limited thereto, and may be preferably 1 to 50 ⁇ m on a diameter basis.
  • the bioactive substance carrier of the present invention can be encapsulated regardless of whether the bioactive substance is hydrophobic or hydrophilic in the coacervate, the bioactive substance can be effectively delivered by encapsulating the hydrophobic or hydrophilic bioactive substance effectively.
  • the bioactive material is not limited thereto, but may be encapsulated in a dispersion form or a core form in the coacervate.
  • the encapsulation refers to encapsulation of the bioactive material by forming a film around the bioactive material.
  • the bioactive substance carrier of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition, as described above.
  • the method for producing a bioactive material carrier of the present invention is to (a) mixing an anionic polymer and a bioactive material in a mixed adhesive protein or a variant thereof And (b) coacervate formed by the mussel adhesive protein or variants thereof and anionic polymer to form a coating around the bioactive material.
  • the mixing means mixing an anionic polymer and a bioactive material at the same time with mussel adhesive protein or a variant thereof, or more preferably, any one of a mussel adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer is dissolved. It refers to a case in which a bioactive substance is mixed in a solution, and then a further mixing of the mussel adhesive protein or a variant thereof and the anionic polymer in order to induce coacervate formation. Specifically, the mixing ratio of the mussel adhesive protein or a variant thereof and the anionic polymer is the same as described above.
  • mussel adhesive proteins or variants thereof and anionic polymers may be mixed with 0.0001 to 50% by weight, preferably, but not limited to, a solvent set to a suitable pH described above.
  • the bioactive material when mixed in the step (a) is not limited to this, but preferably 0.01 to 20% (v / v) by volume, more preferably 0.1 to 2% by volume in the solvent set to the appropriate pH described above It is preferable to mix with (v / v).
  • the type of solvent, proper pH, and suitable temperature for preparing the biologically active substance carrier are the same as those under which coacervate described above can be effectively formed.
  • the titration solvent is not limited thereto, but may preferably be prepared in a water-soluble solvent, more preferably, an aqueous solution of phosphate or an acetic acid solution, more preferably an aqueous solution of acetic acid, even more preferably an aqueous solution of 0.1% to 10% acetic acid. Even more preferably from 0.5 to 8% May be acetic acid.
  • a proper pH is limited to this but preferably may be pH 2.0 to pH 10.0, more preferably may be pH 2.0 to pH 6.0, more preferably may be pH 2.5 to pH 5.5. If the pH is above or below the coacervate is not formed or the deformation of the polymer occurs because the bioactive material carrier can not be effectively formed.
  • the appropriate temperature may be 4 to 100 ° C and preferably 10 to 60 ° C, because the coacetate does not form or deformation of the polymer may occur when above or below the temperature.
  • the method for preparing coacervate of the present invention is characterized in that it comprises the step of mixing an anionic polymer in a weighted adhesive protein or a variant thereof in a weight ratio of 1: 0.01 to 1:10 at pH 2.0 to pH 10.0.
  • the coacervate of the present invention is not limited thereto, but may preferably be prepared in a water-soluble solvent, more preferably in an aqueous phosphate solution or an acetic acid solution, more preferably an acetic acid solution, even more preferably 0.1% to 10% acetic acid solution. And even more preferably in an aqueous acetic acid solution of 0.5 to 8%.
  • an appropriate pH may be pH 2.0 to pH 10.0, more preferably pH 2.0 to pH 6.0, and more preferably pH 2.5 to pH 5.5. If the pH is above or below the coacervate is not formed or the polymer may be deformed.
  • the proper temperature can be 4 to 100 ° C And it may be preferably 10 to 60 ° C. If the temperature is above or below the coacetate does not form or deformation of the polymer may occur.
  • the amount of addition of a fused adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer to the solvent may be preferably 0.001 to ioo% (w / v) based on the total volume of the solvent, and more preferably ⁇ to
  • Coacervate of the present invention is limited to this, but preferably may be prepared by mixing the fused adhesive protein or a variant thereof and an anionic polymer in a weight ratio of 1: 0.01 to 1: 10, more preferably 1: 0.25 to 1 It may be prepared by mixing in a weight ratio of 2.5, more preferably in a weight ratio of 1: 0.25 to 1: 2.33. This is because coacervate may not be effectively formed when the mixing ratio is above or below.
  • the present invention provides a use for the coacervate of the present invention to the adhesive as described above.
  • the coacervate of the present invention can also be used for use in the manufacture of adhesives.
  • the present invention also provides a method of using the coacervate of the present invention for adhering, comprising the steps of (a) preparing the coacervate of the present invention and (b) adhering the coacervate to a substrate. Same as
  • the present invention also provides the use of the coacervate of the present invention for the delivery of a bioactive material, as described above.
  • the present invention (a) preparing a coacervate of the present invention and (b) encapsulating a bioactive material inside the coacervate It provides a method of using the coacervate of the present invention for the delivery of a bioactive material comprising, as described above.
  • the present invention provides a use for the preparation of the coacervate of the present invention in the preparation of a bioactive material carrier, as described above.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing the coacervate of the present invention and (b) encapsulating the bioactive material in the coacervate, the method of using the coacervate of the present invention in the preparation of a bioactive material carrier This is as described above.
  • coacervate prepared by mixing the mixed adhesive protein and the anionic polymer is excellent in adhesion to various substrates such as cells or metals, and especially in the presence of water or in water, adhesion can be maintained.
  • Zero can be effectively used, and furthermore, since it has an activity capable of encapsulation of a bioactive material, it can be effectively used as an active ingredient of a composition for delivery of a bioactive material.
  • Figure 1 shows the results of measuring the change in absorbance when the mixture of fp-151, a fusion adhesive protein, and hyaluronic acid (17kDa), an anionic polymer, at various pHs and ratios.
  • Figure 2 shows the results of coacervate formation when mixed adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) in an acetic acid solution of pH 2.5 at 60:40.
  • Figure 3 shows a variety of haptic adhesion protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa) It is the result of measuring the change of absorbance when mixed with pH and ratio.
  • Figure 4 shows the results of coacervate formation when mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa) is mixed at 60:40 in an acetic acid solution of pH 2.5.
  • FIG. 5 is a result of measuring the change in absorbance when the mixed adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) were mixed at various pHs and ratios.
  • Figure 6 shows the results of coacetate formation when the mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) were mixed at 60:40 in an acetic acid solution of pH 2.5.
  • 11 is a result of confirming coacervate formation when the mixed adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed at 80:20 in an acetic acid solution of pH 3.8.
  • FIG. 12 shows coacervate formation when the mixed adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) were mixed at 80:20 in an acetic acid solution of pH 3.8. The result is.
  • FIG. 13 shows the results of measuring changes in absorbance when the mixed adhesive protein fp-151 and heparin were mixed at various pHs and ratios.
  • FIG. 14 shows coacervate formation when mussel adhesive proteins fp-131 and heparin were mixed at 80:20 in acetic acid solution at various pH.
  • FIG. 15 shows coacervate formation when the mixed adhesive protein fp-131 and peredoxin were mixed at 70:30 in an acetic acid solution at pH 4.5.
  • FIG. 16 shows coacervate formation when the mixed adhesive protein fp-5 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed at 80:20 in an acetic acid solution of pH 4.6.
  • FIG. 17 shows the results of measuring changes in absorbance when mussel adhesive protein fp-5 and hyaluronic acid (35kDa) were mixed at pH 4.6.
  • FIG. 18 shows the results of immobilization of red pepper seed oil in microcapsules using coacervate using fusion adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa) and coacervate using mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (35kDa). 19 is a result confirming whether the microcapsule formed in FIG. 18 is maintained for 8 days.
  • FIG. 20 is a result of immobilization of red pepper seed oil in microcapsules using coacervate using the haptic adhesive protein fp-151 and heparin.
  • FIG. 21 shows coacervates using mussel adhesive proteins fp-151 and hyaluronic acid (17kDa), followed by cell adhesion after surface coating.
  • Figure 22 shows mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) Coacervate is formed by using the resultant, and cell adhesion is performed after coating the surface.
  • FIG. 23 shows coacervates using mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (17kDa), and the result of cell adhesion after the surface was coated.
  • FIG. 24 shows coacervates formed using the flocked adhesion protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa), and the result is a result of performing cell adhesion after coating the surface.
  • FIG. 25 shows coacervates formed using the flocked adhesion protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa), and the result of cell adhesion after coating the surface using the same.
  • FIG. 26 shows the results of comparing the adhesive strength of coacervate using the mixed adhesive protein mfp-151 and hyaluronic acid (35kDa), the mixed adhesive protein mfp-131, and hyaluronic acid (35kDa) with the adhesive strength of the single mixed protein.
  • FIG. 27 shows the results of comparing the adhesion in wet state of coacervate formed with mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa or 59kDa) when tyrosinase and glutaraldehyde were added.
  • '28 is a result of comparing the adhesion of the mussel adhesive protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) in the wet state of the coacervate when the tyrosinase and glutaraldehyde is added to the adhesion of the single fusion adhesive protein.
  • Figure 29 shows the addition of tyrosinase and glutaraldehyde
  • the adhesion of coacervate in the aqueous phase using mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa) was compared with that of bovine serum albumin.
  • the mussel adhesive protein fp-151 is a fp-1 consisting of six decapeptides so that decapeptide (decapeptide) consisting of 10 amino acids repeated about 80 times among mussel adhesive proteins fp-1 present in nature can be expressed in Escherichia coli. Variants were synthesized and produced in Escherichia coli after inserting the Mgfp-5 gene (Genbank No. AAS00463 or AY521220) between two fp-1 variants (DS Hwang et. Al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007). ).
  • fp-1 a fp-1 variant (hereinafter referred to as 6xAKPSYPPTYK), in which the peptide consisting of AKPSYPPTYK represented by SEQ ID NO: 4 is repeatedly linked, was prepared 6 times, hereinafter referred to as Mgfp-5
  • Fp-151 of SEQ ID NO: 1 was prepared by combining the 6xAKPSYPPTYK at the N-terminus of 6x and 6xAKPSYPPTYK at the C-terminus of Mgfp-5.
  • Fp-151-RGD of SEQ ID NO: 2 was prepared by adding the GRGDSP sequence selected from the fibronectin RGD group to the C-terminus of fp-151 of ⁇ Example 1-1>.
  • the haptic adhesive protein fp-131 is a gene of the haptic adhesive protein Mgfp-3A (Genbank No. 1) that is naturally present between two fp-1 variants in the same manner as in fp-151 of Example 1-1. BAB16314 or AB049579), and then produced in E. coli.
  • fp-1 a fp-1 variant represented by SEQ ID NO: 7 in which a peptide consisting of AKPSYPPTYK described in SEQ ID NO: 6 is repeatedly linked six times (hereinafter, , 6xAKPSYPPTYK), and 6xAKPSYPPTYK at the N-terminus of Mgfp-3 and 6xAKPSYPPTYK at the C-terminus of Mgfp-3 were prepared to prepare fp-131 of SEQ ID NO: 3.
  • Proliferation Adhesion Protein fp-5 is produced by Escherichia coli (Genbank No. AAS00463 or AY521220) of a naturally occurring mussel adhesion protein Mgfp-5 (DS Hwang et. Al., Applied and environmental microbiology, 3352-). 3359, 2004).
  • Coacervate is a type of colloid produced by mixing anionic and cationic electrolyte polymers in specific proportions under specific pH conditions. Since the absorbance of the solution increases when the coacetate is formed, the absorbance is mainly measured to determine whether coacetate is formed (V. Ducel et. Al. ( Colloids and Surfaces a-Physicochemical and Engineering Aspects, 232, 239-247). , 2004) The following example confirms whether coacetate is formed when the mixed adhesive protein prepared in the reference example and the negative electrolyte polymer are mixed.
  • a hyaluronic acid having a molecular weight of 17 kDa (Lifcore Biomedical; Minesota, USA) is dissolved in 5% acetic acid (pH adjustment with sodium hydroxide) at a concentration of 0.05% (w / v), and a mixed adhesive protein fp dissolved in the same solution as described above.
  • the ratio of -151 in the solute (complexed protein and hyaluronic acid) fraction was increased by 10% (w / w).
  • the hop luminous intensity was measured at 600 nm using a UV-spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, Daejeon, Korea) and the results are described in FIG. 1.
  • the weight ratio of fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) at pH 2.5 is 58:42, at 63:37 and pH 3.5 at pH 3.0.
  • coacervate was best formed.
  • the weight ratio of fp-131 to hyaluronic acid (17kDa) is 41:59 at pH 2.5, 56:44 at ⁇ 3 ⁇ , and coacervate is best formed at 59:41 at pH 3.5. I could confirm it.
  • the weight ratio of (35kDa) was 59:41 at H 2.5, 70:30 at pH 3.0, and coacervate was best formed at 77:27 at H 3.5. Particularly, when the 35kDa hyaluronic acid was used rather than the 17kDa hyaluronic acid, the absorbance increased more than the coacervate.
  • the weight ratio of fp-151 and hyaluronic acid is 62:38 at pH 2.5, 71:29 at pH 3.0, and coacervate is best formed at 75:25 at pH 3.5. I could confirm it. Especially when 59kDa hyaluronic acid was used than 17kDa hyaluronic acid, the absorbance was higher. As it increases a lot, it can be seen that it is formed better than coacervate.
  • coacervates formed by the mixed adhesive protein and hyaluronic acid have an activity capable of forming microcapsules, and in particular, the microcapsules formed as described above are maintained as they are after 8 days. Able to know.
  • the surface-treated 24-well culture plate was coated and confirmed cell adhesion activity through this.
  • fp-151 and poly-L-lysine which are known to have cell adhesion activity, were used as positive controls.
  • a conventionally known precipitation method using sodium bicarbonate was used for the positive control.
  • Drosophila S2 cells used in this experiment were composed of 10% IMS (insect medium supplement, Sigma), 1% antibiotic -antimycotic (Invitrogen), and stromal cells containing 3 ⁇ 1 / ⁇ 1 hygromycin (hyclone) ° 1.
  • Cultures (M3 medium, Sigma) were used to incubate in a 27 ° C incubator. The cells in the culture lxlO 5 pieces / ml by dilution and concentration, into the cells per well 5xl0 4 pieces in the cell culture plate coated with the coacervate and incubated in the incubator for one hour.
  • the cell adhesion activity of the coacervate formed by the mussel conjugated protein fp-151 and hyaluronic acid (17kDa) is more excellent than the positive controls such as fp-151 and poly-L-lysine.
  • the positive controls such as fp-151 and poly-L-lysine.
  • the cell adhesion activity of the coacervate formed by the mussel adhesive protein fp-151-RGD and hyaluronic acid (17kDa) was more excellent.
  • ⁇ 4-1> Determination of Coercetate Adhesion Produced by Proliferation Adhesion Proteins fp-151 or fp-131 with Hyaluronic Acid (35kDa) (Dry Conditions)
  • a tyrosinase enzyme is used to convert tyrosine residues of mussel adhesive proteins fp-151 and fp-131 into waveguides. I reacted. Specifically, 5 g / ml of mushroom-derived tyrosinase enzyme and 2 g / L of protein were dissolved in PBS containing 25 mM ascorbic acid, reacted at 37 ° C. for half a day, then dialyzed twice in distilled water and lyophilized. The mixed conjugated proteins mfp-151 and mfp-131 were obtained.
  • Coacervate was prepared by mixing a solution of 151 and hyaluronic acid (35 kDa) at 10 g / L, respectively, in a mass ratio of 8: 2. The coacervate in the liquid colloidal state, which was then centrifuged, was smeared onto an aluminum specimen and attached to a 12 mm X 10 mm width. BSA (bovine serum) at the same concentration for comparison albumin) and a single lyophilized protein mfp-151 or mfp-131 in the same buffer, melted and glued in the same manner, and dried at room temperature for 24 hours to apply pressure to both sides of the bonded aluminum specimen. The tensile strength of the adhesive was measured by quantifying the force with a tensile strength measuring instrument (Instron), and the results are shown in FIG. 26.
  • Instron tensile strength measuring instrument
  • a tyrosinase is mixed with fp-151 at a mass ratio of 1: 200 to coacervate formed by the fused adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (35kDa), or ⁇
  • glutaraldehyde was mixed with 0.5% of the total volume and plated 10 mm ⁇ 10 mm on an aluminum specimen. Attached.
  • fp-151 was dissolved in the same buffer and the same amount of tyrosinase or glutaraldehyde was added and attached in the same manner.
  • tyrosinase (tyrosinase) was added to coacervate formed by mussel adhesion protein fp-131 and hyaluronic acid (59kDa) prepared in ⁇ Example 1-11>.
  • 131 and 1 1000 by mass or glutaraldehyde was mixed with 0.5% of the total volume and plated to 10 mm x 10 mm width on the aluminum specimen to bond them.
  • Tyrosinase was mixed with fp-151 at a mass of 1: 1000 to mass of coacervate formed by the prepared mussel adhesive protein fp-151 and hyaluronic acid (59kDa), and glutaraldehyde was 0.5% of the total volume.
  • the mixture was smeared onto aluminum specimens 10 mm x 10 mm wide and bonded.
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in the same buffer, and the same amount of tyrosinase and glutaraldehyde were added in the same manner, followed by soaking in PBS for 24 hours. The tensile strength of the adhesive was measured and the results are shown in FIG. 29.

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Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 포함하는 코아세르베이트에 관한 것으로, 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 코아세르베이트 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 코아세르베이트는 세포 나 금속 등 다양한 기질에 대하여 접착력이 매우 우수하고, 특히 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 접착력이 유지될 수 있어, 접착제로 효과적으로 사용될 수 있으며, 나아가 생체 활성물질을 봉입(encapsulation)할 수 있는 활성이 있으므로 생체활성물질 전달용 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트
【기술분야】
본 발명은 흥합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 포함하는 코아세르베이트에 관한 것으로， 구체적으로 홍합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 흔합하여 제조된 코아세르베이트 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
해양 생명체인 흥합 (mussel)은 접착 단백질들 (adhesive proteins)을 생산, 분비함으로써 흥합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어， 파도의 층격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다 (J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58， 209-231； H.J. Cha등， 2008， Biotechnology Journal 3, 631ᅳ 638).
흥합 접착 단백질은 현재 알려진 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다. 또한 홍합 접착 단백질은 플라스틱， 유리, 금속， 테플론 및 생체물질 둥의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다. 이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서는 미완의 과제로 남아있다. 또한 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반웅을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 웅용 가능성이 크다 (J. Dove 등， 1986, Journal of American Dental Association 112, 879).
특히 상기 흥합 접착 단백질은 세포의 표면 접 착 기술 분야에도 이용될 수 있는데， 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 증의 하나로， 즉 세포 및 조직 배양을 위해 세포를 세포배양 표면에 효율적으로 접착시키는 기술이므로 세포의 증식 및 분화를 촉진시 키는 데 매우 중요하다 (M. Tirrell 등， 2002, Surf. Sci., 500, 61-83). 그러나 흥합으로부터 자연 추출한 접착물질이， 기존의 다른 코팅 방법과 비교하여 높은 세포 접 착능력과 세포의 증식 및 분화를 더욱 촉진시켜주는 결과를 바탕으로 상업 적으로 사용되고 있지만, 자연추출물 1 그램을 얻기 위해 일만 마리의 홍합을 필요로 하는 문제가 야기되고 있다 (C. V. Benedict 등， 1989, Adhesives from renewable resources, No. 385, 452-483).
따라서 흥합 접착 단백질을 기존 방법보다 효과적으로 이용할 수 있는 방법， 특히 세포접착 활성 이 더욱 우수하여 세포의 표면 접 착 기술에 효과적으로 적용할 수 있는 방법 이 필요한 실정 이다.
한편， 코아세르베이트는 음이온성 고분자 전해질과 양이온성 고분자 전해질이 특정 조건에서 흔합되 었을 때 형성되는 콜로이드 물질의 일종으로， 코아세르베이트가 형성되 었을 때 용액의 흡광도는 증가하게 되고, 용액 상에서 동그란 구 형 태로 외부 용액과 분리되어 존재한다. 코아세르베이트 형성 시 , 참여 전해질은 용액에서 분리되어 웅축되고 여 전히 액상을 띠 게 되며， 이 때 표면장력 이 줄어들고 점성 이 늘어나는 등， 물성도 변화한다. 코아세르베이트는 단백질과 그 반대 성 질을 띠는 고분자 전해질과의 흔합을 통해서도 일어날 수 있다 (C.G. de Kruif 등, 2004， Current Opinion in Colloid and Interface Science 9, 340-349). 코아세르베이트의 낮은 표면장력에 기 인해 약물， 효소, 세포, 식품첨가물 등의 기능성 물질을 미세캡슐 안에 고정화 하는데 쓰이는 기술도 보고되어 있다. (Schmitt C. 등， 1998, Critical Review in Food Science and Nutrition 8, 689-753).
그러나 흥합접 착단백질로부터 코아세르베이트를 형성한 연구는 전혀 없으며 아울러 흥합접착단백질을 생체 활성물질 전달용으로 사용하기 위 한 연구도 전혀 없다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
이에 본 발명자들은 양이온성 인 흥합 접착 단백질과 음이온성 고분자를 흔합하여 형성 된 코아세르베이트가 홍합 접착 단백질보다 우수한 접착 활성 이 있으며 생체 활성물질을 전달하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명올 완성하였다.
따라서 본 발명은 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 코아세르베이트를 포함하는 접 착제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 코아세르베이트를 포함하는 생체활성물질 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고， (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 (a) 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 흔합하는 단계 및 (b) 상기 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이 체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법올 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합하는 단계를 포함하는 코아세르베이트의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 접착에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트를 기질에 접착시키는 단계를 포함하는， 본 발명의 코아세르베이트를 접착에 사용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는， 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및
(b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는， 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 【과제의 해결 수단】
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 , 본 발명은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코아세르베이트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 코아세르베이트를 포함하는 접 착제를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 코아세르베이트를 포함하는 생체활성물질 전달용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고, (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이 체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 흔합하는 단계 및 (b) 상기 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이 체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피 막을 형성하는 단계를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 흥합 접 착 단백질 또는 이 의 변이 체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1: 10의 중량비로 흔합하는 단계를 포함하는 코아세르베이트의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명 의 코아세르베이트를 접 착에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및
(b) 상기 코아세르베이트를 기 질에 접착시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 코아세르베이트를 접착에 사용하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하기 위 한 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는， 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 보다상세히 설명한다. 본 발명에서 홍합 접착 단백질은 흥합에서 유래된 접착 단백질로ᅳ 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 국제공개번호 제 WO2006/107183A1호 또는 제 WO 2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게는 상기 흥합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및 (d) 상기 (a)의 폴리펩타이드， (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 (c)에서 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 또한 상기 (d)에서 융합된 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서 열번호 1 또는 서 열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 흥합 접착 단백질의 변이 체 (mutants)는 바람직하게는 흥합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합 접 착 단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적 인 서 열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 흥합 접 착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 흥합 접 착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐— L-알라닌 (DOPA)로 치환된 것 일 수 있다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGEKArg Gly Asp, 서 열번호 8)， RGDSCArg Gly Asp Ser, 서 열번호 9), RGDCCArg Gly Asp Cys, 서 열번호 10)， RGDV(Arg Gly Asp Val, 서 열번호 11)， RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서 열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서 열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서 열번호 14)， GRGDSPCGly Arg Gly Asp Ser Pro, 서 열번호 15), GRGDSPCCGly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서 열번호 16) 및 YRGDSCTyr Arg Gly Asp Ser, 서 열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있다
상기 흥합 접 착 단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리 펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이 체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서 열번호 2의 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명에서의 상기 홍합 접 착 단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 백터에 발현 가능하도록 삽입하여 , 유전공학적 인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 백터는 단백질을 생산하기 위 한 숙주세포의 종류 및 특성 에 따라 적 절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 백터를 숙주세포에 형 질전환하는 방법 및 형 질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 백터의 선택 , 제작, 형 질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명 이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며 , 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다. 본 발명에서 음이온성 고분자는 상기 양이온성 인 홍합 접 착 단백질과 결합하여 코아세르베이트를 형성할 수 있는 고분자 물질이 라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 상기 양이온성 인 홍합 접 착 단백질의 pi (Isoelectric point)보다 낮은 고분자, 더 바람직하게는 pi 수치가 2 내지 6인 고분자， 보다 더 바람직하게는 pi 수치가 2 내지 4인 고분자일 수 있다. 본 발명에서 음이온성 고분자는 예를 들면， 히아루론산 (hyaluronic acid), 페 레독신 (ferredoxin), 폴리스티 렌술폰산 (poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검 (gum arabic), 젤라틴 (gelatin), 알부민 (albumin), 카보폴 (carbopol), 고 또는 저 메특실 펙틴 (high or low methoxyl pectin), 카르복시메틸 구아검 나트륨 (sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검 (xanthan gum), 유청 단백질 (whey protein), 레구민 (faba bean legumin), 카르복시 메틸 셀를로오스 (carboxymethyl cellulose), 알긴산 (alginate), 캐러지넌 (carrageenan), 핵사메타인산 나트뮴 (sodium hexametaphosphate) , 카제인 나트륨 (sodium casinate), 헤모글로빈 (hemoglobin), 헤파린 (heparin) 및 세포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며 , 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 lkDa 내지 300kDa으로 이루어진 군에서 선택된 분자량을 가질 수 있으며 보다 바람직하게는 lOkDa 내지 100kD, 더 바람직하게는 i7kDa 내지 59kDa, 가장 바람직하게는 17kDa, 35kDa 또는 59kD의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량을 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명에서 생체 활성물질은 생체에 투여되거나 피부 표면에 도포할 경우 일정한 약리 활성을 나타내는 물질로, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약물， 효소， 세포 및 식품첨가물로 이루어진 군에서 선택된 일종 이상일 수 있으며 , 보다 바람직하게는 항암제 , 항생제， 항염증제， 호르몬， 호르몬 길항제， 인터루킨， 인터페론, 성장 인자， 종양 괴사 인자, 엔도록신， 림포특시 , 유로키나제 , 스트랩토키나제， 조직 플라스미노겐 활성 겨 1， 프로테아제 저해제， 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질， 계면활성 제， 심 혈관계 약물， 위 장관계 약물 및 신경 계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 항염증제로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 덱사메타손 (dexamethasone)일 수 있다.
본 발명에서 코아세르베이트는 상기 흥합 접 착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 흔합함으로써 생성된 콜로이드의 일종을 말한다.
본 발명의 코아세르베이트는 상기 홍합 접 착 단백질 또는 이의 변이 체에 음이온성 고분자를 포함된 것을 특징으로 한다. 상기 코아세르베이트는 양이온성 인 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 흔합되어 형성될 수 있다.
본 발명의 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매， 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판을， 아세톤, 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며， 더 바람직하게는 아세트산 수용액， 보다 더 바람직하게는 o. l% 내지 10%의 아세트산 수용액， 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.
상기 용매에서 본 발명의 코아세르베이트를 제조하는 경우 적 정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며， 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며， 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형 이 발생할 수 있기 때문이다.
상기 용매에 흥합 접 착 단백질 또는 이의 변이 체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 각각 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 100%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 30 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 코아세르베이트는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 홍합 접 착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합하여 제조될 수 있으며 , 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로, 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 흔합하여 제조될 수 있다. 상기 흔합비를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다. 상기와 같이 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 흔합하여 제조된 코아세르베이트는 종래 흥합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리 -엘-라이신 (poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수하다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 코아세르베이트로 세포 배양 플레이트에 코팅하고 초파리 (drosophila) S2 세포를 상기 코팅된 세포 배양 플레이트에 배양한 다음, PBS(phosphate buffered saline)로 씻어내고 MTT(3 - (4 , 5 -dimethylthiazol- 2 -y 1) - 2 , 5 -diphenyltetrazolium bromide) 분석을 실시하여 플레이트에 접착된 세포수를 측정함으로써 세포접착 활성을 측정하였다. 그 결과 흥합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 혼합하여 제조된 코아세르베이트는 종래 흥합 접착 단백질이나 세포접착 활성이 있는 것으로 알려진 폴리 -엘-라이신 (poly-L-lysine)보다 세포접착 활성이 매우 우수함을 확인하였다 (〈실시예 3〉 참조).
또한 본 발명의 코아세르베이트는 상기 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템， 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 코아세르베이트를 이용하였을 때 단일 흥합접착 단백질보다 2배 가량 큰 접착력을 유지하며, 특히 가교제인 티로시나아제 (tyrosinase) 또는 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 첨가한 경우 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 우수한 접착력을 유지할 수 있다. (〈실시예 4〉 참조)
따라서 상기 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자를 흔합하여 제조된 코아세르베이트는 접착용으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 접 착제는 상기 코아세르베이트를 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 접 착제는 통상의 바이오 접 착제에 함유되거나 또는 약리학적으로 허용가능한 부형 제를 0.0001 내지 99 중량 %로 더 포함할 수 있다. 부형제의 예로는 계면활성제， 산화제， 가교제 및 층진제 (filler)가 있으나， 이에 한정되진 않는다 (참조: 미국 공개특허공보 제 2003-65060호 및 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 계면활성 제는 양이온성 , 음이온성， 비 이온성 , 양쪽성 계면활성제일 수 있으며 , 그 예로는 소듐 도데실설페이트 (sodium dodecylsulfate) 및 소듐 도데실벤젠설포네이트 (sodium dodecylbenzensulfonate)가 있다. 상기 산화제는 카테콜 옥시 데이즈 (catechol oxidase), 포름알데하이드, 비스 (설포숙시니미 딜) 수베레이트 (bis(sulfosuccinimidyl) suberate), 3,3'- 디티오비스 (설포숙시니미딜프로피오네이트) (3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), 02, Fe3+ , H202 및 I04—로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며 (참조: Macromolecules 1998, 31, 4739-4745), 상기 층진제는 콜라겐, 히알루론 산， 콘드로이탄 설페이트 (condroitan sulfate), 엘라스틴, 라미닌， 카세인， 하이드록시아페티트， 알부민， 피브로넥틴 및 하이브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 상기 가교제는 티로시나제 또는 글루타알데하이드일 수 있으며， 상기 가교제의 첨가량은 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체의 질량 대비 티로시나아제의 경우 0.0001 내지 1 중량 %, 보다 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 «¾, 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%일 수 있으며， 글루타알데하이드의 경우 전체 접착 용액 부피 대비 0.001 내지 5 부피 %， 보다 바람직하게는 o.Ol 내지 5 부피 %， 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 5 부피%일 수 있다.
본 발명의 접착제를 수분이 존재하는 경우나 수중에서 적용하는 경우 상기 가교제는 이에 한정되지 않지만 글루타알데하이드를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 접착제는 세포접착 활성 등의 미세접착 시스템뿐만 아니라 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다. (〈실시예 3>및 〈실시예 4〉 참조)
또한 본 발명의 접착제는 수분이 존재하는 경우에도 접착력을 유지할 수 있어， 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수중 접착용으로 이용될 수 있다. 상기와 같이 접착제를 수중 접착용으로 사용하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 접착제의 유효성분인 코아세르베이트는 코아세르베이트일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 접착제는 수중구조물의 유지, 보수를 위한 친환경 접착제， 보다 바람직하게는 수영장， 욕조, 배 등의 균열의 봉합에 사용될 수 있으며 의료용 접착제， 보다 바람직하게는 연질
(연결) 조직 접착제 (예컨대， 열상 및 /또는 절개부를 닫을 때 봉합술 및 스테이플을 대체하는 피부 접착제) 및 경질 (경화된) 조직 접착제 (예컨대， 골 또는 치과용 접착제로서)로 용이하게 사용될 수 있다. (〈실시예 4> 참조) 본 발명의 접착제는, 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 적용하기 위해 사용될 수 있으며， 즉 상기 기질을 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다. 특히 본 발명의 접착제는 생체 물질에 적용될 수 있는데, 상기 생체 물질은 생물로 분류되는 모든 동， 식물 및 상기 동， 식물로부터 휴래된 일부를 의미하며， 일예로는， 세포， 조직， 기관， RNA, DNA, 단백질, 펩타이드， 폴리뉴클레오타이드, 호르몬, 지질 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 물질에 사용되는 경우 본 발명의 접착제는 구체적 인 사용법 , 사용량 및 제형 등은， 현재 시판되는 CeU-Tak 제품 (BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, 미국)에 준하여 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명의 접 착제는 용제형 , 수용성， 무용제형 일 수 있으며， 기 질에 대하여 0.01 내지
100 ug/cm2로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 접 착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수 (물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈， 인대， 힘줄， 반월 (meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정 형외과적 치료; (3) 천공， 열창， 절개 등의 치료, 각막 이식， 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치， 가공의치， 치관 장착, 흔들리는 치아 고정， 부러진 치아 치료 및 층진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합， 세포조직 접합, 인공재료 이식 , 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접 합， 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자， 의 약물, 생리 적 또는 대사적 관찰 장치， 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다 (참조: 미국 특허 제 5,015,677호).
또한 본 발명은 접 착제에 계면활성 제 , 산화제 , 가교제 , 및 충진제 (filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 코아세르베이트의 농도를 조절함으로써 상기 접 착제의 접 착력을 조절할 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5,015,677호). 상기 산화제， 계면활성계， 가교제 및 층진제는 상기 기술한 바와 동일하다. 상기와 같이 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이 체 및 음이온성 고분자를 흔합하여 형성된 코아세르베이트는 생체 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명의 일실시 예에서 홍합 접 착 단백질 또는 그의 변이 체와 히아루론산 또는 헤파린을 흔합하여 형성된 코아세르베이트， 보다 더 바람직하게는 서 열번호 1 또는 3의 폴리펩타이드로 이루어진 홍합 접착 단백질 또는 서 열번호 2의 변이체에 히아루론산이나 헤파린을 흔합하여 코아세르베이트를 형성하고 이를 생체 활성물질의 예로 고추씨 기름를 추가 흔합한 결과 상기 코아세르베이트가 고추씨기름 주위에 피 막을 형성함을 알 수 있다. (〈실시 예 2> 참조)
따라서 본 발명 의 생체 활성물질 전달용 조성물은 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 흔합되어 형성된 코아세르베이트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 생체 활성물질 전달용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약학적 조성물의 형 태일 수 있다.
본 발명의 생체 활성물질 전달용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 코아세르베이트， 이 에 한정되지 않지.만 바람직하게는 코아세르베이트를 0.0001 내지 50 중량 %로 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명 의 생체 활성물질 전달용 조성물은, 투여를 위해서 상기 기 재한 코아세르베이트 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식 염수, 멸균수， 링거 액 , 완층 식 염수, 텍스트로즈 용액 , 말토 덱스트린 용액 , 글리세를， 에탄올， 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 흔합하여 사용할 수 있으며 , 필요에 따라 항산화제， 완층액 , 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 회석제， 분산제， 계면활성제， 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액 , 현탁액 , 유탁액 등과 같은 주사용 제형 , 환약， 캡슐， 과립 또는 정 제로 제제화할 수 있으며， 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이 적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍 턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 코아세르베이트를 포함하는 생체 활성물질 전달용 조성물은 정맥내 (intravein), 복막내 (intraperitoneal), 근육내 (intramuscular), 피하내 (subcutaneous), 피내 (intradermal)， 비내 (nasal), 점 막내 (mucosal), 흡입 (inhalation) 및 경구 (oral) 등의 경로로 주입 함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중， 연령 , 성별, 건강상태 , 식 이 , 투여시간, 투여방법 , 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.1 내지 100 rag/kg 이고， 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg 이며 , 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다. 한편 본 발명의 생체 활성물질 전달체는 (a) 상기 코아세르베이트 및 생체 활성물질을 포함하고， (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것을 특징으로 한다.
상기 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 코아세르베이트일 수 있다. 상기 생체 활성물질 전달체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 마이크로 캡슐일 수 있다.
상기 코아세르베이트는 앞서 기 재한 바와 같이， 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이 체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합되어 형성될 수 있다.
상기 코아세르베이트는 생체 활성물질， 예를 들어 고추씨기름 주위에 피막을 형성하여， 코아세르베이트 내부에 상기 생체 활성물질을 효과적으로 봉입할 수 있어 , 생체 활성물질 전달체인 마이크로 캡슐을 형성할 수 있다. 나아가 상기와 같이 형성된 장시간이 경과하여도 그 형 태를 유지하는 특성 이 있다. (〈실시 예 2> 참조)
상기와 같이 형성된 생체 활성물질 전달체의 크기는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 지름기준으로 1 내지 50um 수 있다.
본 발명 의 생체 활성물질 전달체는 상기 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질이 소수성 이든 친수성 이든 관계없이 봉입 이 가능하므로， 소수성 또는 친수성 생체 활성물질을 효과적으로 봉입 함으로써 생체 활성물질을 효과적으로 전달할 수 있다. 상기 생체 활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 상기 코아세르베이트의 내부에 분산 형 태나 코어 형 태로 봉입될 수 있다. 상기 봉입은 생체 활성물질의 주변에 피막을 형성함으로써 생체 활성물질을 encapsulation하는 것을 말한다.
본 발명의 생체 활성물질 전달체는 약학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있으며 , 이에 대해서는 앞서 기 재한 것과 같다. 한편 본 발명의 생체 활성물질 전달체의 제조방법은 (a) 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이 체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 흔합하는 단계 및 (b) 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 흔합은 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 동시에 흔합하는 경우를 의미하거나 보다 바람직하게는 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 어느 하나가 녹아있는 용액에 생체 활성물질을 흔합하고, 이후 상기 코아세르베이트 형성을 유도하기 위해 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자중 나머지 하나를 추가 흔합하는 경우를 의미한다. 구체적으로 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자의 흔합비는 앞서 기재한 바와 동일하다. 또한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체와 음이온성 고분자는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 앞서 기재한 적정 pH로 설정된 용매에 0.0001 내지 50 중량 %로 흔합할 수 있다. 또한 상기 (a) 단계에서 흔합시 생체 활성물질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 앞서 기재한 적정 pH로 설정된 용매에 부피대비 0.01 내지 20%(v/v), 보다 더 바람직하게는 0.1내지 2%(v/v)로 흔합하는 것이 바람직하다.
상기 생체 활성물질 전달체를 제조하기 위한 용매의 종류, 적정 pH, 적정 온도는 앞서 기재한 코아세르베이트가 효과적으로 형성될 수 있는 조건과 동일하다.
구체적으로 적정 용매는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매, 보다 바람직하게는 인산염 수용액 또는 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며, 더 바람직하게는 아세트산 수용액， 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액, 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 일 수 있다.
적정 pH는 이에 한정되지만 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며， 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며 , 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미만인 경우 상기 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형 이 발생되므로 생체 활성물질 전달체가 효과적으로 형성될 수 없기 때문이다. 또한 적정 온도는 4 내지 100 °C일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60°C일 수 있으며， 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 상기 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형 이 발생할 수 있기 때문이다. 한편 본 발명의 코아세르베이트의 제조방법은 흥합 접 착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1: 10의 중량비로 흔합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 코아세르베이트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 수용성 용매 , 보다 바람직하게는 인산염 수용액 또는 아세트산 수용액에서 제조될 수 있으며， 더 바람직하게는 아세트산 수용액， 보다 더 바람직하게는 0.1% 내지 10%의 아세트산 수용액， 더욱 더 바람직하게는 0.5 내지 8%의 아세트산 수용액에서 제조될 수 있다.
상기 용매에서 본 발명의 코아세르베이트를 제조하는 경우 적정 pH는 pH 2.0 내지 pH 10.0일 수 있으며 , 보다 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 6.0일 수 있으며， 더 바람직하게는 pH 2.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 상기 pH를 초과하거나 미 만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형 이 발생할 수 있기 때문이다. 또한 적정 온도는 4 내지 100°C일 수 있으며 바람직하게는 10 내지 60°C일 수 있으며 상기 온도를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 형성되지 않거나 고분자의 변형 이 발생할 수 있기 때문이다.
상기 용매에 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이 체 및 음이온성 고분자의 첨가량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 용매 전체 부피 대비 0.001 내지 ioo%(w/v)일 수 있으며 보다 더 바람직하게는 αοι 내지
30 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 코아세르베이트는 이에 한정되지만 바람직하게는 상기 흥합 접착 단백질 또는 이의 변이 체와 음이온성 고분자를 1:0.01 내지 1: 10의 중량비로 흔합하여 제조될 수 있으며 , 보다 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.5의 중량비로， 더 바람직하게는 1:0.25 내지 1:2.33의 중량비로 흔합하여 제조될 수 있다. 상기 흔합비를 초과하거나 미만인 경우 코아세르베이트가 효과적으로 형성되지 않을 수 있기 때문이다.
한편 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 접 착에 사용하기 위 한 용도를 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다. 특히 본 발명 의 코아세르베이트는 접착제 제조에 사용하기 위한 용도로도 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트를 기 질에 접착시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 코아세르베이트를 접 착에 사용하는 방법을 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하기 위한 용도를 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다. 또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는, 본 발명 의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하는 방법을 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다.
또한 본 발명은 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하기 위 한 용도를 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다.
또한 본 발명은 (a) 본 발명의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및 (b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질올 봉입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하는 방법을 제공하며 이에 대해서는 앞서 기 재한 바와 같다.
【발명의 효과】
본 발명에서 흥합 접착 단백질 및 음이온성 고분자를 흔합하여 제조된 코아세르베이트는 세포 나 금속 등 다양한 기 질에 대하여 접착력 이 매우 우수하고， 특히 수분이 존재하는 경우 또는 수중에서도 접착력 이 유지 될 수 있어 , 접 착제로 효과적으로 사용될 수 있으며， 나아가 생체 활성물질을 봉입 (encapsulation)할 수 있는 활성 이 있으므 생체활성물질 전달용 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 흥합 접 착 단백질인 fp-151과 음이온성 고분자인 히아루론산 (17kDa)을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정 한 결과이다.
도 2는 흥합 접착 단백질 fp— 151과 히아루론산 (17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 혼합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 3은 흥합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (17kDa)을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 홍합 접 착 단백질 fp-131과 히아루론산 (17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 흥합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정 한 결과이다. 도 6은 홍합 접 착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 8은 흥합 접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 9는 홍합 접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 홉광도의 변화를 측정 한 결과이다.
도 10은 흥합 접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)을 pH 2.5의 아세트산 용액에서 60:40으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 11은 흥합 접 착 단백질 fp-131과 히아루론산 (35kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 12는 흥합 접 착 단백질 fp-131과 히아루론산 (59kDa)을 pH 3.8의 아세트산 용액에서 80:20으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 13은 흥합 접착 단백질 fp-151과 헤파린을 다양한 pH와 비율로 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 홍합 접 착 단백질 fp-131과 헤파린을 다양한 pH의 아세트산 용액에서 80:20으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다.
도 15은 흥합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 pH 4.5의 아세트산 용액에서 70:30으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결과이다. 도 16은 흥합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산 (35kDa)을 pH 4.6의 아세트산 용액에서 80:20으로 흔합하였을 때 코아세르베이트 형성을 확인한 결^이다. 도 17는 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산 (35kDa)을 pH 4.6에서 흔합하였을 때 흡광도의 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 흥합접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트와 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트를 이용해 고추씨기름을 미세캡슐안에 고정화한 결과이다. 도 19는 도 18에서 형성된 미세캡술이 8일 동안 유지되는지 여부를 확인한 결과이다.
도 20는 흥합접착 단백질 fp-151과 헤파린을 이용한 코아세르베이트를 이용해 고추씨기름을 미세캡슐 안에 고정화한 결과이다. 도 21는 홍합 접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고， 이를 이용하여 표면을 코팅 한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 22은 홍합 접 착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 23은 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (17kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착올 수행한 결과이다.
도 24는 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고， 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 25은 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)을 이용하여 코아세르베이트를 형성하고, 이를 이용하여 표면을 코팅한 후 세포접착을 수행한 결과이다.
도 26은 흥합접착 단백질 mfp-151과 히아루론산 (35kDa), 흥합접착 단백질 mfp-131과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트의 건조상태에서의 접착력을 단일 흥합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 27는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa or 59kDa)로 형성된 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 흥합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 '28은 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 습윤상태에서의 접착력을 단일 흥합접착 단백질의 접착력과 비교 실험한 결과이다.
도 29는 티로시나아제와 글루타르알데히드를 첨가하였을 때 홍합접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)을 이용한 코아세르베이트의 수증상태에서의 접착력을 소혈청 알부민의 접착력과 비교 실험한 결과이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〈참조예 1>
홍합 접착단백질의 제조
<1-1>흥합 접착단백질 fp-151의 제조
상기 홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드 (decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6개의 데카펩타이드로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자 (Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 넣은 후， 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서， 서열번호 4로 표시되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 fp-1 변이체 (이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp-5의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서열번호 1의 fp-151을 제조하였다. <l-2> 홍합 접착 단백질 fp— 151-RGD의 제조
상기 〈실시 예 1-1〉의 fp-151의 C-말단에 피브로넥틴 (fibronectin) RGD 그룹에서 선택된 GRGDSP 서 열을 추가하여 서 열번호 2의 fp-151- RGD를 제조하였다.
<1-3> 홍합 접착 단백질 fp-131의 제조
흥합 접 착 단백질 fp-131은 상기 〈실시 예 1-1〉의 fp-151과 마찬가지 방식으로 2개의 fp-1 변이 체 사이에 자연에 존재하는 흥합 접 착 단백질 Mgfp-3A의 유전자 (Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 넣은 후, 대장균에서 생산한 것이다.
구체적으로 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서 열에서， 서 열번호 6으로 기 재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서 열번호 7로 표시되는 fp-1 변이 체 (이하， 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3의 N-말단에 상기 6xAKPSYPPTYK을 조합하고 또한 Mgfp— 3의 C-말단에 6xAKPSYPPTYK를 조합하여 서 열번호 3의 fp-131을 제조하였다.
<1-4> 홍합 접착 단백질 fp-5의 제조
흥합 접 착 단백질 fp-5은 자연에 존재하는 홍합 접 착 단백질 Mgfp- 5의 유전자 (Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 대장균에서 생산한 것이다 (D.S. Hwang et. al., applied and environmental microbiology, 3352- 3359， 2004).
〈실시예 1> 홍합 접착 단백질을 이용한 코아세르베이트 (coacervate)의 형성
코아세르베이트 (coacervate)는 특정 pH조건에서 특정 비율로 음이온성 전해질 고분자와 양이온성 전해질 고분자를 흔합함으로써 생성된 콜로이드의 일종이다. 상기 코아세르베이트가 형성되면 용액의 흡광도가 증가되기 때문에 코아세르베이트 의 형성 여부를 확인하기 위해 주로 흡광도를 측정하게 된다 (V. Ducel et. al.( Colloids and Surfaces a- Physicochemical and Engineering Aspects, 232， 239-247, 2004). 하기 실시 예는 상기 참조예에서 제조된 흥합 접 착단백질과 음가 전해질 고분자를 흔합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인한 것이다.
<1-1> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (17kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-1>에서 제조된 홍합 접 착 단백질 fp-151과 음가 전해질 고분자인 히아루론산 (hyaluronic acid)을 흔합한 경우 코아세르베이트가 형성되는지 확인하였다.
구체적으로 17kDa의 분자량을 지닌 히아루론산 (Lifcore Biomedical; Minesota, 미국)을 0.05%(w/v) 농도로 5% 아세트산 (수산화나트륨으로 pH 조절)에 녹이고， 상기와 동일한 용액에 녹인 흥합 접 착 단백질 fp-151을 용질 (흥합 접 착 단백질 및 히아루론산) 부분에서 차지하는 비율을 10%(w/w)씩 상승시 키면서 흔합하였다. 상기 흔합 후， UV- spectrphotometer (Optizen 3220UVbio, Mecasys, 대전， 한국)를 이용해 600nm 파장에서 홉광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 기 재하였다.
상기 도 1에 기재된 바와 같이， pH 2.5에서 fp-151과 히아루론산 (17kDa)의 중량비가 58:42， pH 3.0에서 63:37, pH 3.5에서 68:32일 때 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 알 수 있었다.
또한 상기 흡광도의 증가가 코아세르베이트의 형성에 의 한 것인지를 현미경 사진을 통해 확인하고 그 결과를 도 2에 기 재하였다.
상기 도 2에 기 재된 바와 같이 , 10 um 정도 크기의 원형 체가 형성된 것을 확인할 수 있었으며， 이는 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트임을 알 수 있었다.
<1-2> 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (17kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-3>에서 제조된 흥합 접 착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 1-1〉과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 3 및 도 4에 기 재하였다.
상기 도 3 및 도 4에 기 재된 바와 같이 , fp-131과 히아루론산 (17kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 41:59, ρΗ 3Ό에서 56:44, pH 3.5에서 59:41에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다.
<1-3> 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-2〉에서 제조된 홍합 접 착 단백질 fp-151-RGD를 사용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 1-1〉과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 5 및 도 6에 기 재하였다.
상기 도 5 및 도 6에 기 재된 바와 같이， fp-151-RGD와 히아루론산의 (17kDa) 중량비가 pH 2.5에서 60:40， pH 3.0에서 70:30， pH 3.5에서 73:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 fp-151보다 fp-151-RGD를 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다. <1-4> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
히아루론산 (35kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 1-1〉과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 7 및 도 8에 기 재하였다.
상기 도 7 및 도 8에 기재된 바와 같이， fp-151과 히아루론산
(35kDa)의 중량비가 H 2.5에서 59:41， pH 3.0에서 70:30， H 3.5에서 77:27에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 35kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성 됨을 알 수 있었다.
<1-5> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
히아루론산 (59kDa)을 사용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 1-1〉과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 9 및 도 10에 기재하였다.
상기 도 9 및 도 10에 기 재된 바와 같이， fp-151과 히아루론산 (59kDa)의 중량비가 pH 2.5에서 62:38， pH 3.0에서 71:29, pH 3.5에서 75:25에서 코아세르베이트가 가장 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 특히 17kDa 히아루론산보다 59kDa 히아루론산을 이용한 경우 흡광도가 보다 많이 증가하므로 코아세르베이트 보다 잘 형성됨을 알 수 있었다.
<1-6> 흥합 접착 단백질 fp-131과 페레독신을 이용한 코아세르베이트 형성
흥합 접 착 단백질로 상기 〈참조예 1-3>에서 제조된 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 페 레독신의 중량비가 pH 4.5에서 70:30일 때，〈실시 예 1-1>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 17에 기 재하였다.
상기 도 15에 기 재된 바와 같이 , 흥합 접착 단백질 fp-131과 페레독신 (ferredoxin)을 이용한 경우 코아세르베이트가 형성됨을 알 수 있었다.
<1-7> 흥합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-3>에서 제조된 흥합 접 착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp-131과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때，〈실시 예 1-5〉와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 11에 기 재하였다. <1-8> 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (59kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-3〉에서 제조된 흥합 접 착 단백질 fp-131을 사용한 것을 제외하고는 상기 fp— 131과 히아루론산 (59kDa)의 중량비가 pH 3.8에서 80:20일 때，〈실시 예 1-6>과 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 12에 기 재하였다.
<1-9> 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린 (heparin)을 이용한 코아세르베이트 형성
헤파린 (heparin, sigma)과 fp—151의 흡광도 측정 실험 이 pH 4.0, pH
5.0, pH 5.5에서 각각 수행되었다. 헤파린을 0.02%(w/v)의 농도로 상기 pH를 지 니는 lOOmM sodium acetate buffer에 녹이고， 동일한 용액에 녹인 fp-151을 10%씩 비율 변화로 10~90%까지 흔합하고 흡광도를 특정하여 그 결과를 도 13 및 도 14에 기 재하였다.
상기 도 13 및 도 14에 기 재된 바와 같이 , fp-151과 헤파린의 중량비가 pH 5.0에서 90: 10인 경우 홉광도가 가장 높았으며 , 도 14에서 코아세르베이트가 형성됨을 확인하였다.
<1-10> 홍합 접착 단백질 fp-5과 히아루론산 (35kDa)을 이용한 코아세르베이트 형성
상기 〈참조예 1-4>에서 제조된 홍합 접 착 단백질 fp-5를 사용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 1-4>와 동일한 방법으로 코아세르베이트가 형성되는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 16 및 도 17에 기재하였다. 상기 도 16 및 도 17에 기 재된 바와 같이， fp-5과 히아루론산 (35kDa)의 중량비가 pH 4.6에서 80:20로 흔합하였을 때 흡광도가 가장 많이 증가됨을 알 수 있었다.
〈실시예 2>
코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성 <2-l> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡술 형성 활성
수산화나트륨으로 pH 3.8로 맞춘 lOOmM 아세테이트 버퍼에 fp- 151을 10g/L로 녹인 다음, 최종부피의 1%양의 고추씨기름을 더해 이를 유화하기 위해 10분 동안 교반하였다. 상기 교반 후, 히아루론산을 fp- 151과 질량비가 8:2(fp-151: 히아루론산)가 되도록 고추씨기름의 유화액에 히아루론산 (35kDa)을 추가적으로 첨가하였다.
상기 첨가 후， 미세캡슐이 형성되는지 여부를 고추씨 기름이 띄는 형광을 이용하여 형광현미경 (이 ympus)을 통해 확인하고 그 결과를 도 18에 기 재하였다. 또한 8일 경과할 때까지 미세캡슐이 유지되는지 여부를 확인하여 그 결과를 도 19에 기 재하였다.
상기 도 18 및 도 19에 기 재된 바와 같이， 흥합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트는 미세캡술을 형성할 수 있는 활성 이 있으며 , 특히 상기와 같이 형성된 미세캡슐이 8일이 경과하여도 그대로 유지됨을 알 수 있다.
<2-2> 흥합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슬 형성 활성
흥합 접 착 단백질로 fp— 131을 이용한 것을 제외하고 상기 〈실시 예
2-1>과 동일한 방법으로 흥합 접 착 단백질 fp-131과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성 된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성 이 있는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 18 및 도 19에 기재하였다.
상기 도 18 및 도 19에 기 재된 바와 같이 , 흥합 접 착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트는 미세캡슐을 형성할 수 있는 활성 이 있으며， 특히 상기와 같이 형성 된 미세캡슐이 8일이 경과하여도 그대로 유지됨을 알 수 있다. <2-3> 홍합 접착 단백질 fp-151과 헤파린에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슬 형성 활성
히아루론산 대신 헤파린을 이용한 것과 fp-151과 헤파린의 질량비가 9:1이 되도록 한 것을 제외하고 상기 〈실시 예 2-1〉과 동일한 방법으로 홍합 접 착 단백질 fp-151과 헤파린에 의해 형성된 코아세르베이트의 미세캡슐 형성 활성 이 있는지 여부를 확인하고 그 결과를 도 20에 기 재하였다.
〈실시예 3>
코아세르베이트의 세포접착 활성
<3-1> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (17ki)a)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성
상기 〈실시 예 1-1>에서 형성된 코아세르베이트를 이용하여， 표면이 처 리되지 않은 24-웰 배양 플레이트를 코팅하고 이를 통해 세포접착 활성을 확인하였다. 이 때 양성 대조군으로 세포접 착 활성 이 있는 것으로 알려진 fp- 151 및 poly-L-lysine을 사용하였다. 상기 양성 대조군에 대해서는 종래 공지된 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate)에 의한 침 전법을 이용하였다. (Fulkerson, J.P. 등 (1990) Journal of Orthopaedic Research 8 (6)， pp. 793-798, (1990)) 구체적으로 본 실험에서 사용된 초파리 (Drosophila) S2 세포 (Invitrogen)를 10% IMS (insect medium supplement, Sigma), 1% antibiotic -antimycotic (Invitrogen) 및 3μ1/πι1 hygromycin(hyclone) °1 포함된 곤층세포배양액 (M3 medium, Sigma)을 사용하여 27°C 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 세포를 상기 배양액에 lxlO5개 /ml 농도로 회석하고, 상기 코아세르베이트로 코팅된 세포배양접시에 웰당 5xl04개로 상기 세포를 넣고 1시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 배양 후， 살아있는 세포를 정량화하기 위해서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 실시하였다. 먼저 상기 배양 후에 붙어 있지 않은 세포를 제거하기 위해 PBS(phosphate buffered saline)로 씻어 낸 후 300^의 MTT 용액을 웰에 주입하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아에서 MTT를 MTT 포르마잔 (formazan)으로 환원시켜주기 때문에 MTT 시 약을 넣고 2시간 추가 배양한 후， MTT 포르마잔으로 환원된 것을 dimethylsulfoxide(DMSO)로 용출한 다음， 분광기 (spectrophotometer)를 통하여 570nm에서 홉광도를 측정하고 그 결과를 도 21에 기 재하였다.
상기 도 21에 기 재된 바와 같이 , fp-151 및 poly-L-lysine등의 양성 대조군에 비하여， 홍합접 착단백질 fp-151과 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접 착 활성 이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
<3-2> 흥합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성
상기 〈실시 예 1— 3>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 3-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 22에 기재하였다.
상기 도 22에 기재된 바와 같이， 홍합 접착 단백질 fp-151-RGD와 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 더욱 우수함을 알수 있었다.
<3-3> 홍합 접착 단백질 fp-131 과 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착활성
상기 〈실시예 1-2〉에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 〈실시예 3-1〉과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 23에 기재하였다.
상기 도 23에 기재된 바와 같이, 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (17kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다. <3-4> 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착활성
상기 〈실시예 1-4>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 〈실시예 3-1>과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 24에 기재하였다.
상기 도 24에 기재된 바와 같이， 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
<3-5> 흥합 접착 단백질 fp-151 과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성
상기 〈실시 예 1-5>에서 형성된 코아세르베이트을 이용한 것을 제외하고는 상기 〈실시 예 3-1〉과 동일한 방법으로 세포접착 활성을 측정하고 그 결과를 도 25에 기 재하였다.
상기 도 25에 기 재된 바와 같이， 홍합 접 착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 세포접착 활성 이 더욱 우수함을 알 수 있었다.
〈실시예 4>
코아세르베이트의 접착력 측정
<4-1> 흥합 접착 단백질 fp-151 또는 fp-131과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (건조조건) 홍합접착단백질 fp-151과 fp-131의 타이로신 잔기를 도파로 바꾸기 위해 티로시나제 효소반웅을 하였다. 구체적으로 5 g/ml의 버섯유래 티로시나제 효소와 2g/L의 단백질을 25mM의 아스코르빈산 (ascorbic acid)을 포함한 PBS에 녹여 37°C에서 반나절 반웅시키고 증류수에 두 번 투석하고 동결건조함으로써 수정된 흥합접 착단백질 mfp-151과 mfp-131를 수득하였다.
수산화나트륨으로 pH 3.8로 맞춘 lOOmM 아세테이트 버퍼 에 mfp-
151과 히아루론산 (35kDa)을 각각 10g/L로 녹인 용액을 질량비 8:2로 섞어 코아세르베이트를 제조하였다. 그리고 이를 원심분리하여 웅축된 액상 콜로이드 상태의 코아세르베이트를 알루미늄 시편에 12mm X 10mm 넓 이로 도말하여 접 착시 켰다. 비교실험을 위해 같은 농도의 BSA(bovine serum albumin)와 동결건조 상태의 단일 흥합접 착 단백질 mfp-151 또는 mfp- 131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 방법으로 붙이고 이를 24시간 동안 상온에서 말려 접착된 알루미늄 시편의 양쪽에 힘을 가해 탈착시에 가해지는 힘을 인장강도 측정기기 (Instron)로 정량하여 접착제의 인장강도를 측정하였고 그 결과를 도 26에 기 재하였다.
상기 도 26에 기재된 바와 같이 홍합접착 단백질과 히아루론산을 이용한 코아세르베이트의 접착력 이 단일 홍합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다. <4-2> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa 또는
59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (수분조건)
상기 〈실시 예 4-1>에서 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (35kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 가교제인 티로시나아제 (tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:200으로 섞거나， 혹은 상기 〈실시 예 1-5>에서 제조된 흥합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 전체 부피 대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm X 10mm 넓 이로 도말하여 이를 접 착시 켰다. 비교실험을 위해 fp-151을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제 (tyrosinase)나 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙였다.
상기 샘플 위에 증류수에 담근 거즈를 감고 건조되지 않도록 램으로 감았다. 이를 3시간 동안 37°C에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 27에 기 재하였다.
상기 도 27에 기 재된 바와 같이， 두가지 가교제 (tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 흥합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 흥합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다. <4-3> 흥합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (수분조건)
상기 〈실시예 4-2〉에서와 같은 방법으로, 상기 〈실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-131과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제 (tyrosinase)를 fp-131과 질량대비 1:1000으로 섞거나 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 전체 부피대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓이로 도말하여 이를 접착시켰다.
비교실험을 위해 fp-131을 같은 버퍼에 녹여 동일한 양의 티로시나아제 (tyrosinase)와 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 3시간 동안 온도 30°C, 습도 90%에서 둔 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 28에 기재하였다.
상기 도 28에 기재된 바와 같이, 두 가지 가교제 (tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 흥합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력이 단일 흥합접착단백질에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.
<4-4> 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트의 접착력 측정 (수중조건)
상기 〈실시예 4-2>에서와 같은 방법으로， 상기 〈실시예 1-11>에서 제조된 홍합 접착 단백질 fp-151과 히아루론산 (59kDa)에 의해 형성된 코아세르베이트에 티로시나아제 (tyrosinase)를 fp-151과 질량대비 1:1000으로 흔합하고 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 전체 부피 대비 0.5%로 섞어 알루미늄 시편에 10mm x 10mm 넓 이로 도말하여 이를 접착시켰다.
비교실험을 위해 소혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 같은 버퍼 에 녹여 동일한 양의 티로시나아제 (tyrosinase)와 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 넣고 같은 방법으로 붙이고 이를 24시 간 동안 PBS에 담근 후 접착제의 인장강도를 측정하고 그 결과를 도 29에 기재하였다.
상기 도 29에 기 재된 바와 같이 , 두 가지 가교제 (tyrosinase, glutaraldehyde)를 첨가한 홍합 접착 단백질과 히아루론산에 의해 형성된 코아세르베이트의 접 착력 이 BSA에 비해 더욱 우수함을 알 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자가 포함된 코 아세르베이트 (coacervate).
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 흥합 접착 단백질은 (a) 서열번호 4의 아미노 산서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드,
(c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴 리펩타이드 및
(d) 상기 (a)의 폴리펩타이드， (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 이종 이상이 융합된 폴리펩타이드로
이루어진 군에서 선택된 일종 이상인 코아세르베이트.
【청구항 3】
게 2항에 있어서， 상기 (c)의 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인 코아세르베이트.
【청구항 4】
제 2항에 있어서, 상기 (d) 융합된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산서열로 이루어진 것인 코아세르베이트.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 흥합 접착 단백질의 변이체는, 상기 흥합 접착 단백질의 카르복실말단 (carboxyl-terminal) 또는 아미노말단 (amino- terminal)에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩 타이드가 연결된 것인 코아세르베이트.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， RGD를 포함하는 폴리 펩타이드는 서 열번호 8， 서 열 번호 9， 서 열번호 10, 서 열번호 11， 서 열번호 12， 서 열번호 13, 서열번호 14， 서 열번호 15， 서 열번호 16 및 서 열번호 17으로 이루어진 군으로부터、선 택된 아미노산 서 열로 표시되는 것인 코아세르베이트.
【청구항 7】
제 5항에 있어서， 상기 흥합 접착 단백질의 변이체는 서 열번호 2의 아 미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드인 코아세르베이트.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 흥합 접착 단백질의 변이체는 홍합 접착 단백 질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐- L-알라닌 (DOPA)로 치환된 것인 코아세르베이트.
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 음이온성 고분자는 히아루론산 (hyaluronic acid), 페 레독신 (ferredoxin), 폴리스티 렌술폰산 (poly styrene sulfonic acid), 아라비아 검 (gum arabic), 젤라틴 (gelatin), 알부민 (albumin), 카보폴 (carbopol), 고 또는 저 메톡실 펙틴 (high or low methoxyl pectin), 카르복 시데틸 구아검 나트뮴 (sodium carboxymethyl guar gum), 잔탄 검 (xanthan gum), 유청 단백질 (whey protein), 레구민 (faba bean legumin), 카르복시 메 틸 셀를로오스 (carboxymethyl cellulose), 알긴산 (alginate), 캐러지넌 (carrageenan), 핵人! "메타인산 나트晉 (sodium hexametaphosphate), "제인 나트륨 (sodium casinate), 헤모글로빈 (hemoglobin), 헤파린 (heparin) 및 세 포외 다당체 B40(exopolysaccharide B40)으로 이루어진 군에서 선택된 하 나 이상인 코아세르베이트.
【청구항 10】
제 9항에 있어서 , 상기 음이온성 고분자의 평균 분자량은 lkDa 내지 300kDa인 코아세르베이트.
【청구항 111
제 1항에 있어서 , 상기 코아세르베이트는 상기 흥합 접 착 단백질과 음 이온성 고분자가 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합하여 형성된 것인 코아 세르베이트.
【청구항 12]
저 U항에 있어서， 상기 코아세르베이트는 상기 흥합 접 착 단백질과 음 이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 흔합하여 형성된 것인 코아세르 베이트.
【청구항 13】
거 U항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 포함하는 접 착제 .
【청구항 14】
게 13항에 있어서， 상기 접 착제는 플라스틱 , 유리， 금속, 및 고분자 합 성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기 질에 접착되는 것인 접착제 .
【청구항 15】
거 113항에 있어서 , 상기 접 착제는 생체물질에 적용되는 것인 접착제 .
【청구항 16】
제 13항에 있어서， 상기 접착제는 수중 접착용인 것인 접착제.
【청구항 17】
제 13항에 있어서 , 상기 접착제는 계면활성제， 산화제ᅳ 가교제， 및 층 진제 (filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질을 더욱 포함하 는 것인 접착제.
【청구항 18]
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 포함하는 생 체활성물질 전달용 조성물.
【청구항 19】
제 18항에 있어서， 상기 코아세르베이트는 상기 흥합 접착 단백질 또 는 이의 변이체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합되어 형성된 것인 생체활성물질 전달용 조성물.
【청구항 20]
게 18항에 있어서， 상기 생체 활성물질은 항암제, 항생제, 항염증제, 호르몬, 호르몬 길항제， 인터루킨， 인터페론, 헤파린， 효소, 성장 인자， 종양 괴사 인자， 엔도특신, 림포톡시， 유로키나제, 스트랩토키나제, 조직 플라스미 노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물 질 계면활성제， 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 생체 활성물질 전달용 조성물.
【청구항 21]
(a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트 및 생체 활 성물질을 포함하고,
(b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질이 봉입된 것 을 특징으로 하는 생체 활성물질 전달체.
【청구항 22]
제 21항에 있어서, 상기 생체 활성물질 전달체는 마이크로 캡슐인 것 인 생체 활성물질 전달체.
【청구항 23]
(a) 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자 및 생체 활성물질을 흔합하는 단계 및
(b) 상기 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체 및 음이온성 고분자에 의해 형성된 코아세르베이트가 생체 활성물질 주위에 피막을 형성하는 단계 를 포함하는 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
【청구항 24】
제 23항에 있어서， 상기 (a) 단계에서 상기 흥합 접착 단백질 또는 이 의 변이체와 음이온성 고분자를 pH 2.0 내지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합하는 것인 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
【청구항 25】
겨 123항에 있어서, 상기 생체 활성물질 전달체는 마이크로 캡슐인 것 인 생체 활성물질 전달체의 제조방법.
【청구항 26】
흥합 접착 단백질 또는 이의 변이체에 음이온성 고분자를 pH 2.0내 지 pH 10.0에서 1:0.01 내지 1:10의 중량비로 흔합하는 단계를 포함하는 코 아세르베이트의 제조방법.
【청구항 27]
거 U항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 접착에 사용 하기 위한 용도.
【청구항 28】
(a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및
(b) 상기 코아세르베이트를 기질에 접착시키는 단계를 포함하는， 제 1 항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 접착에 사용하는 방법 .
【청구항 29]
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달에 사용하기 위 한 용도.
【청구항 30】
(a) 게 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및
(b) 상기 코아세르베이트의 내부에 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는， 게 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 생체활성 물질 전달에 사용하는 방법 .
【청구항 31]
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 생체활성물질 전달체 제조에 사용하기 위 한 용도.
【청구항 32]
(a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 준비하는 단계 및
(b) 상기 코아세르베이트의 내부에 상기 생체 활성물질을 봉입하는 단계를 포함하는， 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 코아세르베이트를 생 체활성물질 전달체 제조에 사용하는 방법 .
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