KR20140027031A - 홍합 접착 단백질 기반의 생체접착 하이드로젤 - Google Patents

홍합 접착 단백질 기반의 생체접착 하이드로젤 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질을 기반으로 한 생체접착성 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

홍합 접착 단백질 기반의 생체접착 하이드로젤 {Mussel adhesive protein-based bioadhesive hydrogel}
본 발명은 홍합 접착 단백질을 기반으로 한 생체접착성 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
생체접착제는 생물의 세포막, 세포벽, 지질, 단백질, DNA, 성장인자, 세포, 조직 등 단백질, DNA, 성장인자, 세포 등과 같은 다양한 생물시료에 부착 특성을 갖는 물질을 말하며, 조직접착제 또는 지혈제, 조직공학용 지지체, 약물 전달 담체, 조직충진제, 상처 치료, 또는 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다. 생체접착제는 강력한 접착 및 가교 능력이 필요하고, 오랜 기간 생체 내부에서 그 기능을 유지해야 한다. 현재 상용화 또는 실용화되고 있는 생체접착제로는 시아노아크릴레이트 순간 접착제, 피브린 글루, 젤라틴 글루 및 폴리우레탄계 접착제 등이 있다. 그러나, 합성 고분자를 이용한 생체접착제의 경우 생체 내의 수용액이 있는 상태에서 매우 약한 힘을 보이고, 시아노아크릴레이트 계열 생체접착제는 인체에 면역 반응 등의 부작용을 일으키는 것이 큰 한계로 지적되고 있다. 또한, 현재 실제 환자에게 사용되고 있는 피브린 계열의 생체접착제의 경우, 부작용은 적지만 그 접착 능력이 매우 낮은 수준이기 때문에 사용에 한계가 있다. 젤라틴 조직접착제의 경우 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드이 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으키는 문제가 있고, 폴리우레탄계 조직접착제는 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트가 생체 독성이 있다는 문제가 있다.
따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서 젖은 생체조직 표면에서 강력한 접착 및 가교 능력을 가지고, 생체 내에서 최소한의 부작용을 보일 수 있는 이상적인 형태의 생체재료의 개발이 필요하다.
한편, 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다. 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다.
특히, 홍합의 족사 (byssal thread)를 구성하고 있는 미틸러스 에둘리스 foot protein 1 (Mefp-1) 단백질의 경우, 단백질 내에 존재하는 dihydroxy-phenylalanine (DOPA) 잔기가 Fe3 + 이온과 결합하면서 표면에 큐티클 층을 구성하고, 이러한 결합에 의한 단단한 코팅층은 족사가 외부 충격에도 견딜 수 있도록 하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, DOPA 잔기가 DOPA-quinone 으로 산화되면서 주변 DOPA 잔기 및 아미노산과 결합하면서 가교작용을 일으키고 이것이 물 속에서도 강력한 결합을 유지할 수 있도록 도와주는 것으로 알려져 있다. 그러나, 홍합 접착 단백질에서 DOPA와 metal의 결합 및 DOPA의 산화반응을 이용하여 하이드로젤을 만들거나 생체접착제로 응용하려는 시도는 없었다.
본 발명자들은 이전의 연구에서, Mefp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드를 6번 반복하여 Mgfp-5의 양쪽 말단에 융합한 새로운 형태의 홍합 접착 단백질인 fp-151을 개발하였으며, 상기 재조합 홍합 접착 단백질이 대장균에서 대량생산이 가능하고, 정제과정 또한 매우 단순하여 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다 (국제특허공개 WO2006/107183 또는 WO2005/092920).
이러한 대량생산 기술을 바탕으로, 본 발명자들은 대장균 시스템에서 대량생산한 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기를 높은 효율로 DOPA로 전환시키고, 이를 이용해 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤을 제조하였으며, 이와 같이 제조된 하이드로젤이 생체접착제로서 우수한 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 홍합 접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법을 제공하고, 나아가 상기 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤을 포함하는 생체접착제를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 홍합 접착 단백질을 포함하는, 생체접착성 하이드로젤을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생체접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 생체접착제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤(hydrogel)" 이란 많은 양의 물이 고분자 물질의 격자 내에 채워져 팽윤되어 삼차원적인 구조를 유지하며 액체지만 고체와 같은 형태를 띄는 재료를 의미한다. 하이드로젤은 전체 중량의 적어도 20% 이상의 수분을 흡수할 수 있으며, 하이드로젤이 용액 상에서 팽윤된 후에는 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 지니게 된다.
본 발명에서 "홍합 접착 단백질"은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5 (서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 국제공개번호 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 10), fp-131(서열번호 12), fp-353(서열번호 13), fp-153(서열번호 14), fp-351(서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 fp-1 에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 16), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 18), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 19), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 20), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 21), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 22), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 23), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 24) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 25)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체의 예로는, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 variant-RGD 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 전체 티로신 잔기의 20% 이상이 DOPA 로 수정된 것이 바람직하다. 또한, 수용액 상에서 20wt% 이상의 우수한 용해도로 녹을 수 있는 홍합 접착 단백질을 이용하는 것이 바람직하다. 대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 20-30 %이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 DOPA 로 변화된다. 그러나 대장균에서 생산된 홍합 접착 단백질은 티로신 잔기들이 변형되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 DOPA 로 변형시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다.
홍합 접착 단백질에 포함된 티로신 잔기를 DOPA 로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 예시로, 티로시나제를 사용하여 티로신 잔기를 DOPA 잔기로 수정할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, in vitro에서 티로시나제를 이용한 수정반응을 통해서 상기의 DOPA 전환율과 용해도 조건을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산할 수 있음을 보였다 (도 1).
본 발명은 홍합 접착 단백질 기반의 생체접착성 하이드로젤을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤은, 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA 잔기 및 Fe3 + 이온의 결합으로 형성된 하이드로젤일 수 있다.
따라서, 바람직한 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질 및 Fe3 + 이온을 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 생체접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 방법은 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA와 Fe3 + 이온의 결합에 의해 하이드로젤을 제조하는 것이다. DOPA는 Fe3 +을 포함하는 metal과 결합하면서 pH에 따라서 mono-, bis-, tris- 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 각각의 결합 양상에 따라서 DOPA-metal 결합 고유의 색깔을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 기존의 연구에 의해서 DOPA-metal의 결합 수에 의한 색깔 변화는 잘 밝혀져 있다.
상기 방법에서, Fe3 + 이온을 제공하기 위하여 Fe3 + 이온을 포함하는 시약을 사용할 수 있으며, 예를 들어 FeCl3를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질이 30~50wt%로 용해되어 있는 용액에 DOPA:Fe3 + 분자의 비율이 바람직하게는 3:1 혹은 Fe3 +의 비율이 더 적게 되도록 FeCl3 용액을 첨가시키고, NaOH를 이용하여 pH를 11 이상으로 올리면서 하이드로젤을 형성시킬 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명에서 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA 잔기가 산화되어 형성된 하이드로젤일 수 있다.
따라서, 또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA 잔기를 산화시키는 단계를 포함하는, 상기 생체접착성 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 방법은 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA의 산화에 의해 하이드로젤을 제조하는 단계이다. DOPA가 산화가 일어났을 경우 DOPA quinone의 형태로 바뀌면서 DOPA-DOPA 결합을 유도하거나, DOPA quinone이 주변의 amine 그룹 혹은 thiol 그룹과 결합하게 된다.
상기 방법에서, 홍합 접착 단백질에 포함된 DOPA를 산화시키기 위해서 NaIO4를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질이 30~50wt%로 용해되어 있는 용액에 DOPA:IO4 - 분자의 비율이 바람직하게는 2:1 혹은 IO4 -의 비율이 더 적게 되도록 NaIO4 용액을 첨가시키면서 하이드로젤을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 두 가지 방법에 의해서 형성된 하이드로젤의 사진을 도 2에 나타내었고, pH 변화와 산화에 의한 색깔변화가 기존에 알려진 보고대로 이루어졌음을 확인하여 도 7 내지 도 9에 각각 나타내었다. 또한 DOPA와 Fe3 +의 결합양상을 화학적으로 분석하여 도 10에 나타내었다.
또한, 상기 두 가지 방법에 의해서 제조된 하이드로젤의 유변학적 성질을 분석하였다. 유변학적 분석을 통해서 시간(time), 진동수(frequency), 변형율(strain)에 따른 저장탄성율(storage modulus), 손실탄성율(loss modulus), 그리고 이를 통해 계산할 수 있는 손실탄젠트(loss tangent delta) 값을 알 수 있으며, 이를 통해 젤의 형성 시간, 기계적 강도 및 자가회복력 등을 분석할 수 있다. 유변학적 분석 방법으로, 본 발명에서는 25mm 지름의 페러렐 플레이트 (parallel plate)가 회전하는 형태의 유변학 분석기기를 사용하였으며 이제 제한되지는 않는다. 각각의 샘플은 젤 반응을 일으킨 후 바로 넣어주었으며, 바람직하게는 플레이트를 일정 부분을 커버할 수 있는 동일한 양을 넣어주었으나 그 이상의 양이라면 제한되지는 않는다. 이와 같이 상기 두 가지 방법에 의해서 제조된 하이드로젤의 유변학적 성질을 분석한 결과, 두 가지 경우 모두 젤화가 되었을 때 가지는 성질을 가지고 있음을 알 수 있었다(도 3 내지 도 6).
하이드로젤은 실제 조직과 비슷한 기계적 유연함을 가지고 있고, 물을 많이 함유하되, 물에 의해 젤의 결합이 끊어지지 않기 때문에, 수분을 포함하는 젖은 생체 표면과의 접착을 필요로 하고 외부 수분에도 저항성을 가지고 있어야 하는 의료용 접착제 등으로의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 우수한 조직 접착성을 갖는 하이드로젤은 조직 접착제 또는 지혈제, 조직공학용 지지체, 약물 전달 담체, 조직충진제, 상처 치료, 또는 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤을 포함하는 생체접착제 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명에서는, 홍합 접착 단백질을 포함하는 하이드로젤의 용도 중에 하나인 조직접착제로의 가능성을 알아보았다. 구체적으로 실시예에서, 상기 두 가지 방법에 의하여 형성된 홍합 접착 단백질 하이드로젤을, 실험용 돼지 피부 (porcine skin graft) 사이에 각각 넣어 접합시키고, 물 속에서 2시간 동안 반응시킨 후 접착력을 측정하였을 때, 우수한 접착력(50~200KPa)을 나타냄을 확인하였다 (도 11 및 도 12). 또한, 연속적인 접착력 측정을 통해서, 홍합 접착 단백질과 Fe3 +을 포함하는 하이드로젤이 자가회복력을 가짐을 확인하였다 (도 13).
본 발명의 생체접착제 조성물은 현재 시중에서 주로 이용되고 있는 시아노아크릴계 접착제 또는 피브린계 접착제 등을 대체하여, 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 외과 수술용 봉합사를 대체 할 수 있고, 불필요한 혈관을 폐색하는데 사용될 수 있으며, 안면조직, 연골 등의 연조직과 뼈, 치아 등의 경조직 지혈 및 봉합에 이용될 수 있고, 가정 상비약으로 적용하는 것이 가능하다. 본 발명의 생체적합성 생체접착제 조성물의 다양한 응용 분야를 정리하면 다음과 같다:
일구현예로, 본 발명의 생체접착제는 인체의 내부 및 외부 표면에 적용될 수 있으며, 즉 본 발명의 생체접착제는 피부와 같은 인체의 외부 표면 또는 외과수술 과정에서 노출되는 내부기관의 표면 등에 국소적으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 조직의 손상된 부분을 접착시키거나 조직에서 공기/유체가 누출되는 것을 봉합하거나, 의료기구를 조직에 접착시키거나 또는 조직의 결함부분을 채우는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "생체 조직"은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장, 소장, 간, 정소, 난소, 경부, 직장, 위, 림프절, 골수 및 신장 등을 포함한다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 상처치유(wound healing)에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체접착제는 상처에 적용되는 드레싱으로 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 피부 봉합에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 생체접착제는 국소적으로 적용되어 상처를 봉합하는 데 이용되어, 봉합사를 대체 할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 탈장 복원에도 적용될 수 있으며, 예를 들어 탈장복원에 이용되는 메쉬의 표면 코팅에 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출을 방지하는 데에도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 지혈에도 이용될 수 있다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 수술 후의 유착방지제로 이용될 수 있다. 유착이란 모든 수술 부위에서 발생하는 것으로 수술 부위의 주변에서 다른 조직들이 상처 주위에 달라붙는 현상이다. 유착은 수술 후 97% 정도 발생을 하며, 특히 그 중에서 5-7%가 심각한 문제를 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위해서 수술시 상처를 최소화 한다거나 소염제를 사용하기도 한다. 또한 섬유소의 형성을 방지하기 위하여 TPA(tissue plasminogen activator)를 활성화 하거나 결정성 용액, 고분자 용액, 고체 막 등의 물리적 장벽을 사용하고 있지만 이러한 방법들은 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있으며 다른 부작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생체접착제는 수술 후에 노출된 조직에 적용되어 그 조직과 주위의 조직 사이에 발생되는 유착을 방지하는 데 이용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
조직공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것을 말하며, 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 본 발명의 생체접착성 하이드로젤은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체(scaffold)를 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 부착될 수 있다. 또한, 상기 생리활성물질은 천연 세포외 기질과 유사하게 유사한 구조의 인공 세포외 기질을 구현하기 위하여 포함될 수 있는 각종 생체분자들을 총칭하기도 한다. 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함하며, 일 예로 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 세포를 들 수 있다. 상기 세포는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포(osteoblast), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 화학물질, 소분자, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 또는 항염증제 등을 포함한다.
상기 소분자는 예를 들어, 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합단백질 또는 그 결합 도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor;FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론류, 인터루킨류, 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스타틴, 엔도스타틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산은 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다.
상기 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항염증제는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 통하여 제공되는 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤은 우수한 생체접착력을 가지므로, 생제접착제, 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달용 담체 등으로 폭넓게 응용될 수 있다.
도 1은 홍합 접착 단백질 fp-1에서의 DOPA 전환율을 아미노산 분석기를 통해서 분석한 결과를 나타낸 것이다. DOPA 및 tyrosine 잔기의 peak intensity를 통해 약 37%의 전환율을 보임을 나타낸 것이다.
도 2는 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤 및 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 이미지를 각각 나타낸 것이다.
도 3은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤 및 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 시간에 따른 저장탄성율을 각각 유변학기로 측정하여 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤의 진동수에 따른 저장탄성율, 손실탄성율, 손실탄젠트 값을 유변학기로 측정하여 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 진동수에 따른 저장탄성율, 손실탄성율, 손실탄젠트 값을 유변학기로 측정하여 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤 및 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 변성율에 따른 손실탄젠트 값과 자가회복에 따른 손실탄젠트 값을 각각 유변학기로 측정하여 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 홍합 접착 단백질 fp-1에 포함된 DOPA 잔기와 Fe3 +의 결합수가 pH에 따라서 변화하는 것을 색깔 변화를 통해 확인한 것을 이미지로 나타낸 것이다.
도 8은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤의 pH에 따른 색깔 변화를 UV-vis spectroscopy를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 색깔 변화를 UV-vis spectroscopy를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤에서의 pH에 따른 DOPA와 Fe3 +의 결합을 라만분광기를 이용하여 화학적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤의 돼지 피부에서의 조직접착력을 인장강도기를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 홍합 접착 단백질 fp-1의 산화를 이용해 형성시킨 하이드로젤의 돼지 피부에서의 조직접착력을 인장강도기를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 홍합 접착 단백질 fp-1과 Fe3 +의 결합을 이용해 형성시킨 하이드로젤의 자가회복력을 알아보기 위해 연속적으로 접착력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 홍합 접착 단백질 기반의 하이드로젤 제조
1-1. 재조합 홍합 접착 단백질 fp -1 variant 의 생산 및 DOPA 수정반응
본 발명에서 사용한 홍합 접착 단백질 fp-1 variant(서열번호 3)는 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 (Genbank No. Q27409; 서열번호 1)의 아미노산 서열에서 AKPSYPPTYK 로 이루어진 펩타이드가 12회 반복 연결된 fp-1 변이체를 대장균에서 생산한 것이다. 상기 홍합 접착 단백질 fp-1 variant의 제조는 국제특허공개 WO2005/092920 에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.
상기와 같이 제조된 홍합 접착 단백질 fp-1 variant 를 구성하는 tyrosine 아미노산을 DOPA로 전환시키기 위하여 tyrosinase 효소 (mushroom tyrosinase, SIGMA)를 이용하여 in vitro에서 수정 반응을 시켰다. 구체적으로, 동결건조된 홍합 접착 단백질 fp-1 variant 150mg과 tyrosinase 5mg을 수정반응을 위한 버퍼 용액 (0.1M Sodium phosphate, 20mM Boric acid, 25mM Ascorbic acid, pH 6.8) 100ml에 녹여서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 1~5% 아세트산 용액 3L를 이용하여 4시간 이상씩 3번 갈아주면서 투석을 시킨 후, 동결건조 시켰다. 홍합 접착 단백질 fp-1 variant의 수정 효율 분석하기 위해 아미노산 조성 분석을 수행한 결과, 전체 tyrosine 잔기 중 약 37%가 DOPA로 전환되었음을 확인하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다.
1-2. 홍합 접착 단백질 fp -1 variant 을 이용한 하이드로젤 제조 및 유변학적 분석
상기 <실시예 1-1>을 통해 생산된 홍합 접착 단백질 fp-1 variant를 이용하여 하이드로젤을 제조하기 위하여 두 가지 다른 화학적 결합을 이용하였다. 첫번째는 Fe3 + 이온을 이용하는 DOPA-metal coordination 방법이고, 두번째는 NaIO4의 산화 작용을 이용한 DOPA-DOPA 상호작용 방법이다.
구체적으로, 첫번째 방법을 이용해 하이드로젤을 제조하기 위하여 수정된 fp-1 variant를 30~50wt% 농도로 PBS에 녹인 후, FeCl3 용액을 DOPA: Fe3 +의 비율이 3:1이 되도록 넣어주었다. 그 후, 색깔이 짙은 자주색이 될 때까지 1N NaOH 용액을 넣어주면서 pH를 높임으로써 젤이 형성되었다.
두번째 방법을 이용해 하이드로젤을 제조하기 위하여는, 동일하게 수정된 fp-1 variant를 30~50wt% 농도로 PBS에 녹인 후, NaIO4 용액을 DOPA: IO4 -의 비율이 2:1이 되도록 넣어주었으며, 5분 이내로 짙은 적갈색으로 변하면서 젤이 형성되었다.
형성된 젤의 사진을 도 2에 나타내었다.
이러한 젤이 형성되는 과정에서의 유변학적 특성을 알아보기 위하여 rheometer를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는 먼저 위의 두 가지 방법을 이용하여 제조한 하이드로젤의 시간에 따른 저장탄성률(storage modulus)을 비교하기 위하여, 각각 젤 형성을 유도한 이후 0~900초 사이에서, 10%의 변형률(strain), 10Hz의 진동수(frequency)로 일정하게 유지시켜 주면서 저장탄성률을 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서와 같이, Fe3 + 이온을 이용한 방법은 pH 상승과 동시에 젤이 이미 어느 정도 형성되었음을 알 수 있고, 산화에 의한 방법은 시간에 따라 점점 젤이 형성되는 양상을 보임을 확인할 수 있었다.
다음으로는 변형률을 일정하게 유지시켜주면서 진동수의 변화에 따라 저장탄성률과 손실탄성률(loss modulus)을 분석하기 위하여 20% 변형률을 유지시켜주고 0.1~100Hz까지 진동수를 변화시켜주면서 저장탄성률, 손실탄성률을 측정하였고, 손실탄젠트(loss tangent delta) 값을 구하여 Fe3 + 이온을 이용한 젤 제조방법은 도 4에, 산화에 의한 젤 제조방법은 도 5에 각각 나타내었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, Fe3+ 이온을 이용한 젤은 낮은 진동수에서는 모양이 쉽게 변할 수 있는 유동적인 젤 형상을 보였고, 도 5에서 볼 수 있듯이, 산화에 의한 젤은 전체 진동수 영역에서 높은 강도의 stiff한 젤 형상을 보임을 알 수 있다.
또한 각각의 젤을 높은 변형률을 부여해서 깨뜨린 후 본래의 강도를 가지는 젤로 자가회복(self-healing) 될 수 있는지 알아보기 위하여, 진동수를 80Hz로 유지시키면서 변형률을 1~1000%로 변화시켜주면서 손실탄젠트 값을 분석한 이 후, 10%의 변형률로 낮추면서 시간에 따른 손실탄젠트 값을 분석하였다. 그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 Fe3 + 이온을 이용한 젤의 경우에 본래의 강도를 회복하는 것을 알 수 있었고, 산화에 의한 젤은 본래의 강도보다 낮은 강도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 Fe3 + 이온을 이용한 젤의 자가회복력을 연속적인 조직접착력 테스트를 통해서도 확인하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
실시예 2. 홍합 접착 단백질 fp -1 variant 을 이용한 하이드로젤 형성에 관여하는 화학적 결합과정 분석
상기 <실시예 1-2>에서 제조한 홍합 접착 단백질 fp-1 variant를 이용한 하이드로젤의 형성과정에 관여하는 화학적 결합과정을 UV-Visible spectroscopy를 이용한 색깔 변화를 관찰하고 라만분광기를 통하여 분석하였다.
구체적으로 수정된 fp-1 variant를 4mg/ml 농도로 PBS에 녹인 후, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 FeCl3 용액을 넣어준 뒤 pH 따른 색깔 변화를 직접 사진으로 찍어 도 7에 나타내었고, UV-Visible spectroscopy로 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. 그 결과, pH 4.0 이하에서 DOPA와 Fe3 +의 mono 결합을 나타내는 녹색계열의 색을 나타내었고, pH 5.5에서는 bis 결합을 나타내는 파란계열을, pH 8.0 이상에서는 tris 결합을 나타내는 짙은 핑크계열의 색을 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 9에서 볼 수 있듯이, 상기 <실시예 1-2>와 동일한 방법으로 NaIO4 용액을 넣어주었을 때에는 DOPA quinine 형태를 나타내는 적갈색을 나타냄을 확인하였다.
또한, Fe3 + 이온을 이용한 하이드로젤에서의 DOPA와 Fe3 +의 결합양상을 화학적으로 좀 더 확인하기 위하여 라만분광기를 이용해 pH에 따른 스펙트럼을 분석한 결과, pH가 높아질수록 DOPA와 Fe3 +의 결합으로 인해 생기는 피크의 세기가 커짐을 확인할 수 있었고, 이것을 도 10에 나타내었다.
실시예 3. 홍합 접착 단백질 fp -1 variant 를 이용한 하이드로젤의 생체조직접착력 측정
상기 <실시예 1-2>의 방법으로 홍합 접착 단백질 fp-1 variant를 이용한 하이드로젤을 제조하고, 이 하이드로젤이 실제 조직과 유사한 표면에서 접착력을 얼마나 갖는지 알아보기 위하여 접착실험을 수행하였다. 이 때, 젤화 조건은 DOPA:Fe3+의 비율이 3:1, DOPA:IO4 -의 비율이 2:1이 되도록 처리하였다.
구체적으로 지방 등이 제거된 돼지 유래의 피부 샘플 (Stellen Medical)을 PBS에 담궈서 알루미늄 시편에 시아노아크릴레이트 본드로 고정시킨 후, 피부 샘플 사이에 하이드로젤을 처리하였다. 하이드로젤을 처리한 후 피부 샘플을 접합시킨 후, Fe3 +을 이용한 하이드로젤은 각각의 버퍼 pH에, NaIO4를 이용한 하이드로젤은 건조상태에서의 가교 시간의 차이를 둔 이후에, PBS에 담군채로 2시간 동안 가교 반응을 진행시켰다. 이 후, 인장강도 측정기 (Instron)을 이용하여 접착력을 측정하였다.
그 결과, Fe3 +을 이용한 하이드로젤은 가교 버퍼 pH가 증가함에 따라 접착력도 증가하는 것을 확인하였고, 이를 도 11에 나타내었다. NaIO4를 이용한 하이드로젤은 건조상태에서의 가교 시간이 증가함에 따라 접착력도 향상됨을 확인하였고, 이를 도 12에 나타내었다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Mussel adhesive protein-based adhesive hydrogel <130> DPP20133947KR <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Met Glu Gly Ile Lys Leu Asn Leu Cys Leu Leu Cys Ile Phe Thr Phe 1 5 10 15 Asp Val Leu Gly Phe Ser Asn Gly Asn Ile Tyr Asn Ala His Val Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Tyr Lys Lys Leu Pro Asn Ala 35 40 45 Tyr Pro Tyr Gly Thr Lys Pro Glu Pro Val Tyr Lys Pro Val Lys Thr 50 55 60 Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Lys Pro Pro Thr Tyr Gln Gln Leu Lys Lys 65 70 75 80 Lys Val Asp Tyr Arg Pro Thr Lys Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Gly Ser 85 90 95 Lys Thr Asn Tyr Leu Pro Leu Ala Lys Lys Leu Ser Ser Tyr Lys Pro 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Tyr Asn Ala Lys Thr Asn Tyr Pro Pro Val Tyr Lys 115 120 125 Pro Lys Met Thr Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Pro Ser Tyr Pro 130 135 140 Pro Thr Tyr Lys Ser Lys Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Ile Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 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sequence derived from fp-1 <400> 2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant <400> 3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 115 120 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 variant-RGD <400> 4 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 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Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 115 120 125 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 130 135 140 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 145 150 155 160 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 165 170 175 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 180 185 190 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 210 215 220 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 225 230 235 240 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 245 250 255 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 260 265 270 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 275 280 285 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 290 295 300 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 305 310 315 320 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 325 330 335 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 340 345 350 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 355 360 365 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 370 375 380 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 385 390 395 400 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 405 410 415 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 420 425 430 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 435 440 445 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 450 455 <210> 6 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-3 <400> 6 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 7 <211> 787 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 7 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Arg 65 70 75 80 His Val His Arg His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Leu His Arg His Arg Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Asn His Val His Arg His Ser Val Leu 115 120 125 His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Arg His Val His Arg 130 135 140 His Asn Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Val His Asp His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln 165 170 175 Val Leu His Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val 180 185 190 His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu 195 200 205 His Gly His Val His Thr His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly 225 230 235 240 His Ile His Thr His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln 245 250 255 Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu 275 280 285 His Gly His Val His Met His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys 290 295 300 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His His Val Val His Lys 305 310 315 320 His Val His Ser His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg 325 330 335 Val Glu His Gln His Val His Lys His His Val Leu His Arg His Val 340 345 350 His Ser His His Val Val His Ser His Val His Lys His Arg Val Val 355 360 365 His Ser His Val His Lys His Asn Val Val His Ser His Val His Arg 370 375 380 His Gln Ile Leu His Arg His Val His Arg His Gln Val Val His Arg 385 390 395 400 His Val His Arg His Leu Ile Ala His Arg His Ile His Ser His Gln 405 410 415 Ala Ala Val His Arg His Val His Thr His Val Phe Glu Gly Asn Phe 420 425 430 Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu Arg Ile Arg His Gly Ile Ile 435 440 445 Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met 450 455 460 Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys 465 470 475 480 Phe Val Gln Leu Gly Asn Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His 485 490 495 His Ser Thr Ser Phe Arg Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp 500 505 510 Asn Asn Ile Glu Gln Ile Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln 515 520 525 Ser Thr Asp Gly Asp Ile Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp 530 535 540 Val Ala Pro Ile Ala Asp Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala 545 550 555 560 Asp Asn His Val Lys Asn Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn 565 570 575 Asp Val Ala Gln Ile Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr 580 585 590 Ala Tyr Asp His Val Asn Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val 595 600 605 Asn Asp Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln 610 615 620 Thr Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp His Val 625 630 635 640 Asn Asp Ile Gly Asp Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly 645 650 655 Val Ala Lys Asn His Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His 660 665 670 Ile Gln His Leu Lys Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn 675 680 685 Asn His Ala Thr Lys Asn Leu Leu Gln Ser Ala Leu Gln His Lys Gln 690 695 700 Gln Thr Ile Glu Arg Glu Ile Gln His Lys Arg His Leu Ser Glu Lys 705 710 715 720 Glu Asp Ile Asn Leu Gln His Glu Asn Ala Met Lys Ser Lys Val Ser 725 730 735 Tyr Asp Gly Pro Val Phe Asn Glu Lys Val Ser Val Val Ser Asn Gln 740 745 750 Gly Ser Tyr Asn Glu Lys Val Pro Val Leu Ser Asn Gly Gly Gly Tyr 755 760 765 Asn Gly Lys Val Ser Ala Leu Ser Asp Gln Gly Ser Tyr Asn Glu Gly 770 775 780 Tyr Ala Tyr 785 <210> 8 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5 <400> 8 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 9 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-6 <400> 9 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg 35 40 45 Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys 50 55 60 Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg 85 90 95 Ser Gly Tyr <210> 10 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151 <400> 10 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 11 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-151-RGD <400> 11 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 12 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-131 <400> 12 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 13 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-353 <400> 13 Met Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly 20 25 30 Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu 35 40 45 Phe Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn 50 55 60 His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr 85 90 95 Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His 100 105 110 Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Lys Leu Ala 115 120 125 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 145 150 155 160 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu 165 170 175 <210> 14 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-153 <400> 14 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Glu Phe Ser 50 55 60 Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn His Tyr 65 70 75 80 His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys 85 90 95 Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn 100 105 110 Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys 115 120 125 Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Lys Leu Ala Asp Tyr 130 135 140 Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr 145 150 155 160 Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly 165 170 175 Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu 180 185 <210> 15 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-351 <400> 15 Met Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly 20 25 30 Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu 35 40 45 Phe Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ser Asn 50 55 60 His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly 65 70 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RGD Group 5 <400> 20 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 6 <400> 21 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 7 <400> 22 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 8 <400> 23 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 9 <400> 24 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 10 <400> 25 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5

Claims (16)

  1. 홍합 접착 단백질을 포함하는, 생체접착성 하이드로젤.
  2. 제1항에 있어서, 홍합 접착 단백질에 포함된 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine) 잔기 및 Fe3 + 이온의 결합으로 형성된 하이드로젤.
  3. 제1항에 있어서, 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기가 산화되어 형성된 하이드로젤.
  4. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 전체 티로신 잔기의 20% 이상이 도파로 수정된 것인 하이드로젤.
  5. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 5 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 6 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 7 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 또는 상기에서 2종 이상의 단백질이 연결된 융합 단백질인 하이드로젤.
  6. 제5항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질, 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질, 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 융합 단백질인 하이드로젤.
  7. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열이 1회 내지 12회 연속하여 연결된 단백질인 하이드로젤.
  8. 제7항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 하이드로젤.
  9. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 하이드로젤.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 16 내지 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 하이드로젤.
  11. 제10항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 하이드로젤.
  12. 홍합 접착 단백질 및 Fe3 + 이온을 반응시키는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 생체접착성 하이드로젤의 제조방법.
  13. 홍합 접착 단백질에 포함된 도파 잔기를 산화시키는 단계를 포함하는,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 생체접착성 하이드로젤의 제조방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로젤을 포함하는 생체접착제 조성물.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체.
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