KR102290136B1 - 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 추출용 조성물 - Google Patents

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Abstract

폴리도파민은 소수성 표면을 친수성으로 전환 가능하며, 표면의 성질에 관계없이 다양한 표면에 대한 개질이 가능하다. 표면에 코팅된 폴리도파민은 아민기 및 티올기와 공유결합을 형성할 수 있고, 다양한 금속과 배위결함 함으로써 2차적 표면 개질이 가능하다. 이러한 다재다능성을 활용하여 silica와 결합, DNA와의 결합이 증가하며 흡착제로서도 활용가능하다.

Description

알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 추출용 조성물 {Composition for cell free DNA isolation comprising of alginate-polydopamine-silica complex}
본 발명은 인체에서 채취된 미량의 혈액들을 대상으로 분자유전분석에 사용될 수 있는 양질의 순수한 세포 유리(cell free) DNA를 신속하고 손쉽게 추출할 수 있도록 알지네이트, 실리카, 폴리도파민 복합체를 이용한 새로운 DNA 추출용 조성물에 관한 것이다.
최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있으며, 따라서 암 조기 진단 방법에 대한 연구 비중이 증가하고 있는 추세이다. 그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사 등의 침습적인 방법이 주를 이루고 있다. 특히, 현재 주로 활용되는 조직검사는 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이뤄지기 때문에, 조직 샘플을 채취하기 위해 침이나 펀치, 내시경, 또는 복강경 등을 이용해 인체를 절개하여, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않고, 흉터가 남으며, 회복에도 시간이 걸린다.
이러한 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사를 이용한 분자진단법이 주목을 받고 있다. 액체 생체 검사는 비 침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 검사 결과 도출 속도가 빠르며, 질병의 일부분만 분석할 수 있었던 조직 샘플과 달리, 체액 즉 액체 생체 샘플은 질병에 대해 다각적 분석을 수행할 수 있다. 특히, 액체 생체 검사는 암의 진단에 탁월한 효용성을 발휘할 것으로 전망되며, 혈액, 소변 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능할 것으로 예측된다.
또한, 분자진단법은 체외진단의 대표적인 기술로 혈액, 소변 등의 유전자 정보가 들어 있는 시료로부터, DNA, RNA에서 일어나는 분자 수준 변화를 수치 또는 영상을 통해 검출해 진단하는 기법이다. 이는 정확도가 높으며 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점이 있기 때문에, 유전체 분석기술의 급속한 발전과 함께 비용 절감의 장점을 바탕으로 암 진단 기술에 응용하려는 노력이 시도되고 있다.
또한, 세포 유리 DNA(cell free DNA; cfDNA)는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 유래 DNA를 의미하며, 괴사, 세포 사멸 또는 비뇨기관의 정상세포 및/또는 암세포에서 활성화되어, 다양한 세포 생리학적 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 따라서, 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 유래된 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전함에 따라, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자를 모니터링 하는 데 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 것이다. 실제로 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 반복적인 샘플링을 통해 대량의 단순하고 비-침습적인 검체의 수집이 가능하다. 이에 따라 암 진단에 있어서 가장 비침습적인 액체 생체 검체를 통하여 병원체의 DNA를 검출하고 분석하는 방법이 주목을 받고 있다.
그러나, 혈액, 소변 등 액체 시료 내 cfDNA를 분석하고 유전자에서 발생하는 변이를 발견하여 암을 조기 진단하는 방법에는 현재의 기술로는 많은 한계가 있다(한국 공개 특허 10-2016-0129523). 특히, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액의 시료 내에 cfDNA가 매우 적은 농도로 존재하며, cfDNA가 노화 과정에서 자연스러운 유전자 변이가 발생할 수 있는데, 이는 반드시 암으로 진행되는 것이 아니며 설령 암으로 진행되어도 큰 문제를 일으키지 않는 경우도 있다. 따라서 검출 민감도의 향상 및 정확한 암 조기 진단을 위한 방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
홍합 접착 단백질의 접착력에 관여하는 화학적 작용기를 모방한 폴리도파민 및 폴리노르에피네프린 표면 개질 기법은 수용액 상에서 표면의 성질에 관계없이 다양한 표면에 접착력을 가지는 새로운 표면 개질 기법이며, 표면 개질로 도입된 코팅물질의 화학적 성질에 의해 금속 나노입자를 합성/고정화 하거나 아민 작용기와의 공유결합 형성을 통한 2차 표면 개질을 가능하게 한다. 또한 고분자에 도파민을 접합시켜 고분자에 표면 무관 접착성을 부여하고 이를 이용해 표면을 개질 하는 방법도 가능하다. 이러한 표면개질을 통해 생체재료 및 에너지, 신소재 재료 등의 다양한 복합 재료를 개발하고 다양한 범위에 응용할 수 있다. 핵산가수분해효소들의 작용에 필요한 금속양이온과 착염을 형성함으로써 효소의 활성을 저해시킨다.
따라서 cfDNA가 액체 시료에서 극히 낮은 수준으로 발견되기 때문에, 높은 품질과 적은 시료 양으로 DNA 추출 프로토콜을 개발하는 것이 분자 분석 과정에서 가장 중요한 단계이며, 본 발명의 본 발명은 폴리도파민을 활용하여 실리카의 표면적을 넓히거나 화학결합을 증가시켜 DNA 결합을 증가시켜, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 액체 시료로부터 cfDNA의 초고감도 검출, 농축, 분리 기술이 확립될 수 있을 것으로 기대한다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0129523호
Bioorthogonal DNA Adsorption on Polydopamine Nanoparticles Mediated by Metal Coordination for Highly Robust Sensing in Serum and Living Cells. ACS Nano. 2018 Sep 25;12(9):9070-9080.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민 복합체가 미량의 검체를 대상으로 분자유전분석에 사용될 수 있는 양질의 순수한 세포 유리(cell free) DNA를 신속하고 손쉽게 추출할 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 예로, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 이용하여 분리된 환자의 검체에서 세포 유리(cell free) DNA 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물의 제조방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 DNA 추출 방법에 따르면 혈액으로부터 신속하고 간편하게 PCR 및 sequencing 등의 분자유전분석에 이용할 수 있는 양질의 순수한 DNA를 제공할 수 있어, 종래 기술에서 요구되는 복잡한 DNA 추출 단계와 그에 따라 소요되는 시간을 줄일 뿐 아니라 대량의 시료 처리도 가능하여 신속성과 경제성을 향상시킬 수 있다. 시간, 비용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 추출에 필요한 원심분리기 또는 자성체 도구들도 필요가 없다. 또한, 본 발명에 따른 DNA 추출 방법은 신선한 혈액을 포함하는 검체 뿐만 아니라 장기간 보관되었던 조직을 대상으로도 잘 적용될 수 있으며, 본 발명에 따라 추출된 DNA 용액을 장기간 냉동 보관하면서 유전자의 반복 확인이 가능하므로, 인체의 다양한 유전자 정보를 확보하는데 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 부착(흡착)을 증가시키기 위한 알지네이트 표면의 폴리도파민-실리카 복합체 형태를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체는 DNA 부착(흡착) 증가에 따라 DNA의 AFP 발현 정확성 증가 및 QIAamp kit 시제품과 비교결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 정상인(healthy control; HC), 알코올성 간질환(liver alcoholic; LA), 간경화(liver cirrhosis; LC) 및 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma; HCC) 환자에서 세포 유리 DNA를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 정상인, 알코올성 간질환, 간경화, 간세포암종 그룹에서의 DNA 농도 차이는 통계적으로 유의한 연관성을 보였다. (p<0.001)
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 암환자에서 경동맥화학색전술(Transcatheter arterial chemoembolization; TACE) 전과 후의 세포 유리 DNA를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포 유리 DNA를 실시간 중합효소연쇄반응으로 AFP와 RPP30 유전자 증폭한 결과를 나타낸 것이다. (a)는 세포 유리 DNA에서 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율에 관한 결과를 나타낸 것이고, (b)는 간세포암종과 비간세포암종에서의 세포 유리 DNA에서 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율에 대한 민감도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 간세포암종과 정상인 비교, (d)는 알코올성 간질환과 간세포성 암종 비교, (e) 간경화과 간세포암종에서의 세포 유리 DNA에서 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율에 대한 민감도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. (f) 암환자에서 경동맥화학색전술(Transcatheter arterial chemoembolization; TACE) 전과 후의 세포 유리 DNA를 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율을 비교 하였으며, 중간값이 경동맥화학색전술 전이 더 높았다. 전-TACE (n = 109), 후-TACE (n = 43).
도 6은 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포 유리 DNA를 기반으로 측정된 세포 유리 DNA의 농도(cfDNA)와 실시간 중합효소연쇄반응 결과(cfDNA AFP)와 혈중 종양마커인 AFP 단백질 검사(sedrum AFP) 결과의 민감도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 간세포암종을 기준으로 (a) 비간세포암종, (b) 정상인, (c) 알코올성 간질환, (d) 간경화.
도 7은 비드의 형태학을 에너지 분산형 분광분석법(Energy dispersive X-ray spectroscopy; EDS)을 이용하여 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 비드의 형태학을 주사전자현미경(Scanning electron microscopy; SEM)을 이용하여 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 UICC(Union for international cancer control) stage 별 기준에 따른 DNA 조각 분석 결과를 나타낸 것이다. UICC stage별 DNA 농도 차이는 통계적으로 유의한 연관성을 보였다. (p<0.001)
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 복합체에서, 상기 알지네이트의 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 1) 알지네이트를 칼슘 클로라이드와 혼합하여 비드를 제조하는 단계; 2) 비드를 도파민과 반응시키는 단계; 및 3) 비드를 실리카와 반응시키는 단계를 포함하는 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체의 제조방법에서, 단계 1) 이후에 EDC/NHS 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 형성하기 위한 반응이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체의 제조방법에서, 단계 2)는 12시간 동안 수행하는 것이나, 반응 조건에 따라 시험자가 다양하게 조절하며 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "세포-유리(cell-free) DNA(cfDNA)"는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 유래 DNA를 의미하며, 순환 종양 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA) 역시 이에 포함된다. 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액 등의 생물학적 시료로부터 상기 세포 유리 DNA를 분석하여, 체액 검사 방법을 이용한 비 침습적, 비수술적인 방법으로써 암 세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하며, 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안이 될 수 있다. 또한, 상기 세포-유리 DNA의 검출을 통해 암 진단 및 암 환자의 예후를 관찰할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물에서, 상기 알지네이트의 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물에서, 세포 유리 DNA는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액에서 검출할 수 있으나, DNA가 포함되어 있는 검체라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암 진단용 조성물에서, 상기 알지네이트의 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암 진단용 조성물에서, 암 진단은 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액에서 검출할 수 있으나, DNA가 포함되어 있는 검체라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 암 진단용 조성물에서, 암은 다양한 암종을 포함하고 있고, 바람직하게는 간암에 관한 것이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체를 이용하여 분리된 환자의 검체에서 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법에서, 알지네이트의 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법에서, 검체는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액일 수 있으나, DNA가 포함되어 있는 검체라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법에서, 환자는 암 환자인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 간암 환자인 것을 특징으로 하나, DNA를 검출하여 분자 진단 검사가 가능한 질환이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, “분자 진단 검사”는 DNA, RNA, 단백질을 기반으로 유전자와 대사 기능, 의약품 대사, 질병 유발 관계를 평가하는 검사로 면역조직 진단검사, 유전자 진단검사 등을 포함한다. BCC research 분석에 따르면 2007년부터 2014년까지 바이오의약 및 진단 기기 분야의 연평균 성장률은 16.8%로 헬스케어의 분야의 13.5%보다 높게 나타났다. 분자진단 시장의 지속적 성장을 위해서는 신뢰성과 정확성, 신속성, 편의성을 제고할 수 있는 기술적 발전이 필요하다.
본 발명에서 DNA는 특정 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있고, 구체적으로는 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 칩(DNA chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "진단"은 간세포암종의 재생(relapse) 또는 재발(recurrence), 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 간세포암종-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부에 관한 판단을 의미한다.
본 발명에서 "바이오마커(biomarker)"란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고, 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미하는 것으로, DNA, RNA와 같은 유전자, 단백질, 지방질, 대사물질 등과 그 패턴의 변화 등이 이용되고 있다.
본 발명에서 "병기" 또는 “UICC(Union for international cancer control) stage”는 암의 진행도를 분류하는 개념으로, 통상적으로 1기에서 4기까지 4단계로 분류하는데, 암의 진행 정도가 심해질수록 숫자가 올라간다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
실시예 1. 알지네이트 표면의 폴리도파민-실리카 복합체의 제조
10 mL of sodium alginate-containing solution (5% w/v in deionized water)를 200 mL of water containing 100 mM calcium chloride에 넣어 비드 구조를 만들고 1시간동안 반응한다. 비드를 5 mM of EDC/NHS에 실온에서 1시간 반응 시키고 Dopamine hydrochloride (5 mM)를 실온에서 12시간 반응시키며, 이때 Tris-HCl용액을 이용하여 pH6.5를 유지시킨다. 비드를 멸균식염수에 씻고 1 mL silica solution 용액에 실온에서 1시간 동안 반응한다
실시예 2. 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체의 DNA 부착(흡착) 증가에 따라 DNA의 AFP 발현 정확성 증가 및 QIAamp 키트(시제품)과 비교
액체질소탱크의 cryotube에 보관중인 세포는 항온수조(37℃)에 재빨리 녹여 세포배양액에 넣고 원심분리한다. 원심분리 후, 상층액은 제거하고 가라앉은 세포를 세포배양한다. 세포배양 된 HepG2, Huh-7의 세포부유액를 이용하여 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체와 QIAamp 키트(시제품)을 통해 cfDNA를 추출한다. QIAamp 키트는 매뉴얼대로 진행하였으며, 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체인 경우는 우선, 세포부유액 또는 혈장(200㎕)에 protein kinase(20㎕)용액 (w/w, 10:1) 비율로 넣어 섞은 후 37℃ 3시간 처리한다. 처리한 용액은 alcohol 용액 200㎕을 넣고, 이 용액에 폴리도파민-실리카 복합체 비드를 넣어 DNA를 복합체 비드 표면과 10분간 실온에서 반응한다. 추가적으로 5 μL calcium chloride solution 10분간 반응하여 wash buffer로 수세하고 50 μL RNase/DNase free water로 최종 DNA를 추출한다.
Droplet 디지털 중합효소 연쇄반응(ddPCR; QX200, Bio-Rad)이 본 연구에서 사용되었으며 각 ddPCR 분석 혼합물은 20μl 반응량으로 수행되었다. 혼합물은 추출된 DNA(1μl), 2배 EvaGreen ddPCR Supermix(10μl), 모든 프라이머는 개별적으로(1μl), 증류수(7μl)로 구성된다. ddPCR 분석 혼합물은 일회용 방울 생성기 카트리지(Bio-Rad)에 로드되었다. 그리고 프라이머용 방울 생성유(Bio-Rad) 70μl를 8개의 유정 각각에 실었다. 그 후 카트리지는 QX200 드롭렛 발전기(Bio-Rad) 내부에 배치되었다. 물방울 생성이 완료되면 물방울은 96웰 PCR 플레이트로 옮겨졌다. 이 접시는 호일로 열봉하여 기존의 열 사이클러(Bio-Rad, T100)에 넣었다. 각 반응 혼합물을 약 12,000방울(Bio-Rad, QX200)로 분할한 다음 5분 동안 95℃, 30초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 5분 동안 4℃, 5분 동안 90℃, 4℃(1사이클), 4℃ 유지하였다. 사이클링된 방울은 QX200 드롭레더(Bio-Rad)로 개별적으로 읽혔다.
실시예 3. 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리DNA농도
DNA 농도는 나노드롭 1000(Thermo Scientific)을 사용하여 평가하였다. 모든 과정은 상온에서 수행되었다. 람다 DNA(Thermo Scientific)가 표준으로 사용되었다. 비교를 위해 QIAamp DNA 미니 키트도 DNA 추출에 사용되었으며, 제조업체의 지침에 따라 우리 시스템과 비교하였다
알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리 DNA농도는 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma; HCC) 환자에서 정상인(healthy control; HC), 알코올성 간질환(liver alcoholic; LA), 간경화(liver cirrhosis; LC) 환자보다 높게 측정되었다.
실시예 4. 암환자에서 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리 DNA농도
DNA 조각 분석은 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Agilent Bioanalyzer 2100 계측기와 High Sensitivity DNA Kit(애질런트테크놀로지스)에 의해 마이크로 플루이드 기반의 플랫폼을 사용하여 측정하였다. 애질런트 2100 소프트웨어 분석은 DNA의 정의된 각 표면적에 대한 평균 크기를 자동으로 결정하고 각 샘플에 대한 전기영동 프로그램으로 표시된다. Agilent Bioanalyzer 2100으로 측정된 값으로 경동맥화학색전술(TACE) 전 후 비교분석 하였다.
암환자에서 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리 DNA농도는 경동맥화학색전술 전, 후 비교에서 혈중 종양 마커 AFP검사 보다 우수하게 비교 되었다.
실시예 5. 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리DNA의 유전자 분석 및 다른 진단마커와 비교
qPCR(RG6200, Corbett Research)은 SYBR Green Master Mix(qiagen)를 사용하여 3번 수행되었다. 모든 반응은 25 μL의 최종 볼륨에서 수행되었다. PCR 사이클링 조건은 40 사이클로 5분 동안 95℃, 5초간 95℃, 10초간 60℃를 포함한다. cfDNA AFP 표현은 AFP 유전자 발현을 기준 유전자인 RRP30(2-Ct)과 비교하여 구했다. 데이터 분석을 위해 40을 초과하는 Ct 값은 제외되었다. 프라이머 순서는 다음과 같다:
AFP Forward Primer: 5'-AAATGCTTCTTGCT-3'
AFP Reverse Primer: 5'-GCCACGACGAATAGTTTGT-3',
RPP30 Forward Primer: 5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'
RPP30 Reverse Primer: 5'-GCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
생존해석을 위한 AFP/RPP30의 차단값은 2.0으로 결정되었다.
알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리DNA의 유전자를 실시간 중합효소연쇄반응으로 AFP와 RPP30 유전자를 증폭한 결과, 간세포성암 환자에서 정상인, 알코올성 간질환, 간경화 환자보다 높은 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율이 나타났다(도 5a). 도 5(b)는 간세포암종과 비간세포암종에서, (c)는 간세포암종과 정상인 비교, (d)는 알코올성 간질환(liver alcoholic; LA, 상단) 및 간세포성 암종(hepatocellular carcinoma; HCC) DNA와 비교, (e) 간경화과 간세포암종에서의 세포 유리 DNA에서 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율에 대한 민감도와 특이도를 갖고 있다. 도 5(f)는 암환자에서 경동맥화학색전술(Transcatheter arterial chemoembolization; TACE) 전과 후의 세포 유리 DNA를 AFP와 RPP30 핵산 발현 비율을 비교 하였으며, 중간값이 경동맥화학색전술 전이 더 높았다.
실시예 6. 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리DNA를 기반으로 측정된 농도와 실시간 중합효소연쇄반응 결과와 혈중 종양 마커인 AFP검사와 비교
cfDNA DNA 농도는 나노드롭 1000(Thermo Scientific)을 사용하여 평가하였다. 모든 과정은 상온에서 수행되었다. 람다 DNA(Thermo Scientific)가 표준으로 사용되었다. 비교를 위해 QIAamp DNA 미니 키트도 DNA 추출에 사용되었으며, 제조업체의 지침에 따라 우리 시스템과 비교하였다. cfDNA AFP는 qPCR(RG6200, Corbett Research)은 SYBR Green Master Mix(qiagen)를 사용하여 3번 수행되었다. 모든 반응은 25 μL의 최종 볼륨에서 수행되었다. PCR 사이클링 조건은 40 사이클로 5분 동안 95℃, 5초간 95℃, 10초간 60℃를 포함한다. cfDNA AFP 표현은 AFP 유전자 발현을 기준 유전자인 RRP30(2-Ct)과 비교하여 구했다. 데이터 분석을 위해 40을 초과하는 Ct 값은 제외되었다. 프라이머 순서는 다음과 같다:
AFP Forward Primer: 5'-AAATGCTTCTTGCT-3'
AFP Reverse Primer: 5'-GCCACGACGAATAGTTTGT-3',
RPP30 Forward Primer: 5'-GATTTGGACCTGCGAGCG-3'
RPP30 Reverse Primer: 5'-GCGGCTGTCTCCACAAGT-3'
생존해석을 위한 AFP/RPP30의 차단값은 2.0으로 결정되었다.
알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체를 활용하여 추출된 세포유리 DNA를 기반으로 측정된 농도와 실시간 중합효소연쇄반응 결과와 혈중종양마커 AFP검사 비교결과로서, 다른검사항목에 비해 추출된 세포유리 DNA 농도가 높은 민감도와 특이도를 갖는다.
실시예 7. 알지네이트-폴리도파민-실리카 복합체 비드의 형태학
도 7, 8은 비드의 형태학에 관한 것으로, SU8200(히타치)을 이용한 주사전자현미경 에너지분산형 분광분석법(SEM/EDS)을 이용하여 조사하였다. 표면 형태학은 2 kV의 가속 전압과 4.7 mm의 작업 거리에서 주사전자현미경(SEM 모드)를 통해 얻어졌다(도 8). 모든 이미지는 1K의 비율로 확대되었다. 준비된 비드 샘플은 성능 저하 또는 충전 효과를 방지하기 위해 주사전자현미경 스터브에 장착되고 오스뮴(두께 3.0nm)으로 코팅된 양면 접착 테이프에 부착되었다. 또한, 실리콘 니트라이드(Si3N4) 창을 통합한 옥탄 엘라이트 슈퍼 EDS 시스템(AMETEK, Inc., Paoli, PA)을 사용하여 원소 구성과 분포를 EDS 모드로 분석하였다(도 7). EDS 매핑은 10 kV에서 30초간 124.5 eV 분해능으로 달성되었다. 광전자의 이륙 각도는 29.1°로 설정되었다. 선택한 영역에 대해 각 측정을 세 번 반복했고, 그 결과는 TEAMTM EDS 분석 시스템(AMETEK, Inc.)을 사용하여 분석하였다.
실시예 8. UICC(Union for international cancer control) stage별 cfDNA 조각의 농도
cfDNA 조각 분석은 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 Agilent Bioanalyzer 2100 계측기와 High Sensitivity DNA Kit(애질런트테크놀로지스)에 의해 마이크로 플루이드 기반의 플랫폼을 사용하여 측정했다. 애질런트 2100 소프트웨어 분석은 DNA의 정의된 각 표면적에 대한 평균 크기를 자동으로 결정하고 각 샘플에 대한 전기영동 프로그램을 표시된다. Agilent Bioanalyzer 2100으로 측정된 값으로 UICC stage별 비교분석 하였다.

Claims (17)

  1. 알지네이트 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것인 알지네이트, 폴리도파민 및 실리카를 포함하는 복합체
  2. 삭제
  3. 1) 알지네이트를 칼슘 클로라이드와 혼합하여 비드를 제조하는 단계;
    1-1) EDC/NHS 반응을 수행하는 단계;
    2) 비드를 도파민과 반응시키는 단계; 및
    3) 비드를 실리카와 반응시키는 단계를 포함하는
    알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체의 제조방법
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 단계 2)는 12시간 동안 수행하는 것인, 알지네이트, 실리카 및 폴리도파민을 포함하는 복합체의 제조방법
  6. 알지네이트 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것인 알지네이트, 폴리도파민 및 실리카를 포함하는 복합체를 포함하는 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 세포 유리 DNA는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액에서 검출하는 것인, 세포 유리(cell free) DNA 검출용 조성물
  9. 알지네이트 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것인 알지네이트, 폴리도파민 및 실리카를 포함하는 복합체를 포함하는 암 진단용 조성물
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서, 암 진단은 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액을 사용하는 것인, 암 진단용 조성물
  12. 제9항에 있어서, 암은 간암인 것을 특징으로 하는, 암 진단용 조성물
  13. 알지네이트 표면에 실리카 및 폴리도파민이 위치하는 것인 알지네이트, 폴리도파민 및 실리카를 포함하는 복합체를 이용하여 분리된 환자의 검체에서 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 검체는 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 분리된 조직 또는 체액인 것인, 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법
  16. 제13항에 있어서, 환자는 암 환자인 것을 특징으로 하는, 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법
  17. 제16항에 있어서, 암은 간암인 것을 특징으로 하는, 세포 유리(cell free) DNA를 검출하는 방법
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