KR20160129523A

KR20160129523A - 세포-유리형 dna의 위암 진단 용도

Info

Publication number: KR20160129523A
Application number: KR1020150061790A
Authority: KR
Inventors: 송석길; 김윤섭
Original assignee: 주식회사 넥스바이오
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2016-11-09
Also published as: KR101751962B1

Abstract

본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 위암 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 위암 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 특히 조기 단계의 위암에 특이적인 바이오 마커로서 위암을 초기에 정확하게 진단할 수 있다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 위암 진단, 위암 진행의 평가, 위암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포-유리형 DNA의 위암 진단 용도{Use of Cell-Free DNA for Diagnosing Gastric Cancer}

본 발명은 세포-유리형 DNA의 위암 진단 용도에 관한 것이다.

한국인의 사망원인 중 1위는 암이며 근래의 암 진단 방법 및 치료방법의 비약적인 발전에도 불구하고 암환자가 급증하고 있다. 우리나라에서 위암은 가장 흔한 암으로 전체 암 발생 중 2번째로 많이 발생한다. 2012년에 조사한 암 사망률에 따르면, 인구 10만 명당 폐암으로 사망한 환자는 33.1명; 간암으로 사망한 환자는 22.5명; 위암으로 사망한 환자는 18.6명; 및 대장암으로 사망한 환자는 16.3명으로 전체 암 사망 환자 중 위암으로 사망한 환자는 2번째로 많다. 암 치료에 따른 경제적 손실은 국내 총생산 1.5%인 1조 1천억 원으로 알려져 있으며 사회적 비용이 갈수록 증가하면서 개인과 사회가 비용을 감당하기 힘든 상황에 다다랐다. 지난 30여연 동안 암에 대한 연구는 급속한 진보를 거듭하여 많은 암종 특이적 발암유전자들이나 암억제 유전자들이 동정되었고 이들 유전자들의 기능/기전 연구를 통하여 새로운 치료법을 제시하고 있으나 암은 여전히 인류가 넘어야할 큰 숙제로 남아 있다. 우리나라 위암 발생자수는 매년 증가 추세에 있어서 사전 진단이 필요하며 그에 따른 사전 진단을 위해서 위암 발생의 유전적 요인을 선별할 수 있는 진단방법의 개발이 요구된다. 위암은 위조직에서 악성(암) 세포가 발견되는 경우를 말하며 서구에서는 감소 추세지만, 동양권, 특히 한국에서는 가장 호발하는 악성종양이다.

혈액 내 존재하는 분비체(exosome)는 소량의 단백질, RNA 및 DNA 등을 함유하고 있어 분비체 분석을 통해 세포의 유전체 및 단백체 변화를 확인할 수 있다. 최근 분비체내에 존재하는 펩티드(peptide), 지질(lipid), 마이크로 RNA(micro RNA), mRNA 및 세포-유리형 DNA(cell-free DNA, cfDNA) 연구가 활발히 이루어지고 있으며 암 발병, 염증 및 심장 질환의 바이오마커로 응용할 수 있다는 보고가 다수 있다. 특히, cfDNA는 RNA 또는 micro RNA에 비하여 상온에서 안정하여 진단검사에 적합하다. cfDNA는 소아 림프종(paediatric lymphoma), 유방암(breast cancer), 비소세포폐암(Non-small-cell lung carcinoma), 전립선암(prostate cancer), 난소암(ovarian cancer), 신경아교종(glial tumor), 또는 직장암(rectal cancer)환자에서 수준이 높게 관찰된다는 결과가 보고되었다. 하지만 위암에 대한 cfDNA의 수준에 관한 연구는 보고된 바 없다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0004318호 대한민국 공개특허 제10-2015-0036776호

본 발명자들은 혈액 분비체(blood exosome)내에 존재하는 생물학적 물질로부터 위암 조기 진단에 유용한 새로운 바이오 마커를 발굴하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 혈액 분비체 내에 존재하는 특정의 세포-유리형(cell-free) DNA가 위암 환자에게서 유의적으로 높은 수준으로 나타난다는 것을 실험적으로 확인하고 이의 위암의 진단용 바이오마커로의 사용 가능성을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 특정 세포-유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 위암의 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포-유리형 DNA를 포함하는 위암의 진단용 바이오 마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 위암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 세포-유리형 DNA를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “세포-유리형 DNA (cell-free DNA, cfDNA)”는 인간의 체액에서 순환하는 단편 DNA를 의미한다. 상기 세포-유리형 DNA는 대부분 이중가닥 DNA이며 핵단백질 복합체의 상태로 존재할 수 있다. 상기 세포-유리형 DNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 관찰되므로 질병의 진단 및 예후 예측 목적의 유용한 바이오마커로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 5에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)는 ENTPD6 (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 6) 유전자로부터 유래된 세포-유리형 DNA로서, 본 명세서에서 용어 “ENTPD6 cfDNA”으로도 기재한다.

본 발명에서 상기 서열번호 6에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)는 마이크로어레이 프로브 A_16_P0178165에 의해 검출된 것으로서, 인간 7번 염색체, leucine-rich single-pass membrane protein 1의 5’영역 7035bp 및 transmembrane protein 168의 3’영역 269901bp에 위치하는 것으로 확인되며, 본 명세서에서는 용어“A_16_P01781625 cfDNA”으로도 기재한다.

본 발명에서 서열번호 7에 개시된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 개시된 뉴클레오타이드 서열에서 14번째 뉴클레오타이드가 결실된 서열이다.

본 발명에서 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 개시된 뉴클레오타이드 서열에서 14번째 뉴클레오타이드 및 24번째 뉴클레오타이드가 결실된 서열이다.

본 발명에서 서열번호 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 개시된 뉴클레오타이드 서열에서 14번째 뉴클레오타이드가 결실되고, 105번째 뉴클레오타이드가 [T/A](W)인 서열이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포-유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)이다.

본 명세서에서 용어 “상보적”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어“상보적”은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 상기 서열번호 5 내지 0에 개시된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 상기 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 본 발명의 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 상기 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 뉴클레오타이드 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다. 상기 프로브는 추가적으로 방사선 표지, 형광표지, 효소표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있다. 프라이머 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명의 프라이머는 주형인 상기 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 본 발명의 프라이머는 추가적으로 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reaction)에 사용된다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(ploymerase chain reaction), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 뉴클레오타이드 서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction), 핵산뉴클레오타이드 서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 프로브는 마이크로어레이 칩(microarray chip)에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 진단 대상인 위암은 조기 단계의 위암이다. 위암의 진행 정도(stage, 병기)는 위벽의 침윤 정도, 주위 림프절로의 전이 정도와, 간, 복막 또는 폐 등의 다른 장기로의 전이 여부를 종합하여 결정하여, 1기, 2기, 3기 또는 4기로 분류할 수 있다. 위암의 국제 병기 방법(American Joint Committee on Cancer 7판, 2010)에 따르면 위암은 원발암의 침범 깊이에 따라 종양의 증거가 없는 경우에는 T0; 종양이 위벽의 점막층 혹은 점막하층까지 침범한 경우에는 T1; 종양이 근육층 혹은 장막하층까지 침범한 경우에는 T2; 종양이 장막층까지 침범하였으나 주위 장기의 침범이 없는 경우에는 T3; 및 종양이 장막층을 뚫고 나가 비장, 횡행결장, 간, 횡격막, 췌장, 복벽, 부신, 신장, 소장, 또는 후복막 주위의 장기를 침범한 경우에는 T4로 나눈다. 또한, 림프절 전이에 따라 위(stomach) 주위 림프절 전이가 없는 경우에는 N0; 1개에서 2개까지 위 주위 림프절 전이가 있는 경우에는 N1; 3개에서 6개까지 위 주위 림프절 전이가 있는 경우에는 N2; 7개 이상의 위 주위 림프절 전이가 있는 경우에는 N3a 또는 N3b로 분류한다. 원격전이가 없는 경우에는 M0로 분류하며 원격전이가 있는 경우 M1으로 분류한다.

본 발명에서 조기 단계의 위암은 T1 단계에 해당되는 위암을 의미한다.

상기 T1 단계로 분류되는 위암은 T1 조기 위암(early gastric carcinoma) 및 T1 진행성 위암(advanced gastric carcinoma)이 있다. 상기 T1 진행성 위암은 근육층까지 침윤한 일반적인 T2, T3 또는 T4의 진행성 위암과는 다르게 점막하층까지만 침범한 위암을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 조성물을 포함하는 위암의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단용 키트는 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)용 키트 또는 마이크로어레이 칩(microarray chip)일 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응용 키트는 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 프로브는 마이크로어레이칩(microarray chip)에 사용될 수 있으며, 마이크로어레이칩에서 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 지지체(substrate) 상에 고정화된다. 상기 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 지지체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 지지체에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 포함하는 위암의 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 위암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 생물학적 시료로부터 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계.

이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 설명한다.

생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)를 분리하는 단계

먼저 세포-유리형 DNA의 분리를 위한 생물학적 시료를 준비한다. 상기 생물학적 시료는 생물학적 시료는 체액이며, 상기 세포-유리형 DNA는 상기 체액에서 분비체(exosome)에 포함되어 존재할 수 있다. 상기 분비체는 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 30nm-100nm 크기의 소포(vesicle)로서 세포에서 기원하여 체액으로 방출된다. 상기 체액은 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid), 복수, 흉막 삼출액, 양수, 융모막 융모 샘플, 태반샘플, 기관 세척액(lavage), 간질액 또는 안구액(ocular fluid)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

상기 생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA를 분리한다. 상기 세포-유리형 DNA의 분리는 체액으로부터 분비체(exosome)을 분리하고, 분리된 분비체로부터 핵산을 추출, 분리 및 정제하는 방법을 통해 행할 수 있다.

세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법

세포-유리형 DNA를 분리 정제한 후 서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출한다.

본 발명에서 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있다.

세포-유리형 DNA의 검출이 유전자 증폭 방식으로 행해지는 경우 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한 이후에 상기 PCR의 산물에 대하여 추가적으로 서열분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점은 다음과 같다.

(i) 본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 위암 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 위암 진단용 바이오 마커이다.

(ⅲ) 본 발명의 세포-유리형 DNA는 특히 조기 단계의 위암에 특이적인 바이오 마커로서 위암을 초기에 정확하게 진단할 수 있다.

(ⅳ) 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 위암 진단, 위암 진행의 평가, 위암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 위암 환자 cfDNA의 CGH array 혼성화 및 비교 방법을 보여준다. 패널 1)은 CGH 어레이 혼성화 비교 분석 구성표를 보여준다. 패널 2)는 위암 진행 단계별 공통적으로 관찰되는 DNA 영역 분류를 보여준다. 패널 3)은 Dye swap 분석에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역 분류를 보여준다. Dye swap 분석의 Cutoff는 log ratio ≥ 1 또는 ≤ -1이다. s는 serum; p는 plasma; T1_e는 T1 early carcinoma; T1_a는 T1 advanced carcinoma; T2_a는 T2 advanced carcinoma; 및 T3_a: T3 advanced carcinoma를 각각 의미한다.
도 2는 PCR로 증폭된 ENTPD6 cfDNA의 용융 곡선(melting curve) 분석 결과를 보여준다. x축은 용융 온도; y축은 시간에 따른 형광세기의 변화에 대한 1차 함수값(first derivative of the change in fluorescence, dF/dT); 및 Ct는 사이클 역치(cycle threshold)를 각각 의미한다.

도 3은 PCR로 증폭된 A_16_P01781625 cfDNA의 용융 곡선(melting curve) 분석 결과를 보여준다. x축은 용융 온도; y축은 시간에 따른 형광세기의 변화에 대한 1차 함수값(first derivative of the change in fluorescence, dF/dT); 및 Ct는 사이클 역치(cycle threshold)를 각각 의미한다.
도 4는 본 발명의 ENTPD6 cfDNA에 대한 뉴클레오타이드 서열 분석 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 A_16_P01781625 cfDNA에 대한 뉴클레오타이드서열 분석 결과를 보여준다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 임상시험심사위원회의 승인 및 실험 시료 분양

본 발명의 실험들은 충북대학교 생명윤리심의위원회(Institutional Review Board) 에서 연구승인(CBNU-201412-BMBR-108-01)을 받았다. 모든 실험 시료들은 세브란스병원 유전자은행으로부터 1기(T1), 2기(T2) 및 3기(T3) 위암 환자의 혈청 또는 혈장을 분양받았다.

2. 혈액의 세포-유리형 DNA의 추출 및 정량

1기, 2기 또는 3기 위암 환자의 혈청 100㎕ 또는 혈장 100㎕로부터 miRCURY^TM RNA Isolation Kits - Exosome Isolation(Exiqon, Denmark)을 이용하여 혈액 분비체(blood exosome)를 침전시켜 수득하였다. 상기 수득한 혈액 분비체는 재현탁 버퍼로 현탁하고 페놀(phenol), 클로로폼(chloroform) 및 아이소아밀 알콜(isoamyl alcohol)을 각각 25:24:1로 혼합하여 제조한 DNA 추출용액을 첨가하여 분비체로부터 세포-유리형 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 추출하였다. 상기 추출한 cfDNA는 NanoDrop spectrometer(ND-1000, Micro- Spectrophotometer)를 이용하여 정성 및 정량분석을 수행하였다.

3. 세포-유리형 DNA의 증폭

GenomePlex 전체 유전체 증폭 키트(whole genome amplication kit, Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 cfDNA를 증폭하였다. 상기 증폭된 cfDNA 500ng에 10x fragmentation을 첨가하고 95℃에서 반응시킨 후 얼음에 두었다. 상기 반응의 반응액에 1x 라이브러리 제조 버퍼(library preparation buffer), 라이브러리 안정화 용액(library stabilization solution) 및 라이브러리 제조 효소(library preparation enzyme)를 첨가하고 순차적으로 16℃에서 20분; 24℃에서 20분; 37℃에서 20분; 및 75℃에서 5분간 반응시킨 후 반응액을 4℃로 유지(hold)하는 조건으로 등온반응(isothermal reaction)을 수행하였다. 상기 반응액에 10x 증폭 마스터 믹스(amplification master mix)와 전체 유전체 증폭(whole genome amplification) DNA 중합효소를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응은 순차적으로 95℃에서 3분; 94℃에서 15초; 및 65℃에서 5분을 1사이클(cycle)로 하여 14사이클을 수행한 후 PCR 반응액을 4℃로 유지하였다. 상기 PCR 반응액에 대하여 GenElute PCR 클린-업(Clean-up) 키트를 이용하여 반응산물을 정제한 후 NanoDrop spectrometer(ND-1000)를 이용하여 정량하였다.

4. 비교유전체부합법(Comparative Genomic Hybridization, CGH) 마이크로 어레이

SurePrintG3 인간 게놈 비교유전체부합법(comparative genomic hybridization, CGH) 마이크로 어레이를 이용하여 상기 증폭한 cfDNA가 어떤 염색체에서 유래한 것인지 확인하였다. 상기 SurePrintG3 인간 게놈 CGH 마이크로 어레이(4 x 180K)는 170,334개의 생물학적 특징들(biological features); 1,000개의 생물학적 프로브들의 복제품들(replicates)(X5); 및 6,539개의 내부 품질관리 특징들(internal quality control features)을 가지고 있으며 UCSC hg18(NCBI Build 36, March 2006)의 유전자 정보(genome source)를 사용하며 13KB(11KB in Ref. seq genes)의 프로브 스페이싱(probe spacing)을 가지고 있다. 상기 cfDNA에 대한 형광표지는 다음과 같이 수행하였다. 상기 cfDNA 2μg에 랜덤 프라이머(random primer), 5x 반응버퍼(reaction buffer), 10x dNTPs, 시아닌(cyanine) 3-dUTP 또는 시아닌 5-dUTP 및 Exo(-) 클레노브 효소(klenow enzyme)를 첨가하고 순차적으로 37℃에서 2시간; 및 65℃에서 10분간 반응시킨 후 4℃를 유지하였다. 상기 형광 표지된 cfDNA는 정제한 후 NanoDrop spectrometer를 이용하여 정량하였다. SurePrintG3 인간 게놈 CGH 마이크로 어레이반응은 다음과 같이 수행하였다. 상기 형광표지 cfDNA에 Cot-1 DNA(1.0㎎/㎖), 10x aCGH 블로킹 시약(blocking agent), 및 2x HI-RPM 혼성화 버퍼(hybridization buffer)를 첨가하고 순차적으로 95℃에서 3분; 및 37℃에서 30분간 반응시킨 후 4℃를 유지하였다. 상기 반응액을 어레이 개스킷(array gasket)에 주입하고 65℃에서 24시간동안 혼성화 반응을 수행하였다. 상기 혼성화 반응이 수행된 칩은 애질런트(Agilent) 올리고-aCGH/ChIP-온-칩 세척버퍼 1 과 에질런트 올리고-aCGH/ChIP-온-칩 세척버퍼 2 를 사용하여 세척하였다.

5. 위암의 진행 단계에 따른 DNA 영역의 분류 및 용융 곡선 분석을 위한 실시간 PCR 프라이머의 디자인

위암의 진행 단계에 따른 DNA 영역의 분류는 각 위암 진행 단계에 대한 혈청 및 혈장 또는 각 위암 진행 단계의 남성 및 여성 환자의 시료로부터 공통적으로 관찰되는 유전자의 선별을 통하여 수행하였다. 예를 들어, 상기 CGH 마이크로 어레이 결과들에 대하여 Dye-swap 방법으로 분석을 수행하고 각 위암 진행 단계들의 유전자들을 밴 다이어그램(venn diagram)을 이용하여 서로 비교하여 공통적으로 관찰되는 유전자들을 선별하였다. T2 단계와 T3 단계의 유전자의 선별은 위암의 진행이 중기 단계로 판단되고 T2 단계와 T3 단계에서 공통적으로 관찰되는 유전자들에 한하여 선별하였다. 상기 선별된 유전자들의 용융 곡선(melting curve) 분석을 위한 실시간 PCR 프라이머들은 상기 CGH 마이크로 어레이에서 확인된 유전자들의 프로브 뉴클레오타이드서열(60mer)을 바탕으로 디자인하였다. GenBank를 이용하여 상기 프로브 뉴클레오타이드 서열과 일치하는 유전자를 검색한 후 검색된 유전자의 뉴클레오타이드서열과 상기 프로브의 뉴클레오타이드서열에 대하여 시퀀스 얼라인먼트(sequence alignment)를 수행하였다. 상기 프로브의 뉴클레오타이드 서열을 중심으로 앰플리콘(amplicon)의 크기가 113bp-183bp가 되도록 프라이머를 디자인하였으며 추가적으로 M13 forward(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)를 5’말단에 정방향(forward)으로 삽입하여 앰플리콘의 뉴클레오타이드 서열분석이 가능하도록 디자인하였다.

6. cfDNA에 대한 실시간 PCR 및 용융곡선의 분석

성별, 혈청과 혈장 및 위암 진행 단계별로 구분하여 실시간 PCR을 수행하고 용융 곡선 분석을 수행하였다. 실시간 PCR은 cfDNA 50ng, 2x HRM PCR 마스터 믹스(master mix) 및 프라이머 10μM을 혼합하고 순차적으로 95℃에서 5분; 95℃에서 10초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 30초 동안 반응하는 것을 1사이클로 하여 45사이클을 수행하였다. 고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 확인 단계는 Rotorgene Q 장비에서 70℃에서 85℃까지 0.1℃씩 증가시켜 수행하였다. 상기 결과는 30 이하의 Ct(threshold cycle)값; 단일 피크의 용융 곡선; 및 1 이상의 시간에 따른 형광세기의 변화에 대한 1차 함수(first derivative of the change in fluorescencedF/dT)값을 가지는 결과를 정상적 증폭으로 간주하여 분석하였다.

7. DNA 뉴클레오타이드 서열의 분석

용융 곡선 분석을 위하여 실시간 PCR의 앰플리콘들을 성별 또는 위암의 진행단계별로 정제하였다. 상기 앰플리콘의 뉴클레오타이드서열 분석은 M13 forward를 이용하여 수행하였다. 상기 뉴클레오타이드 서열 분석은 앰플리콘의 정제단계; 사이클 시퀀싱(cycle sequencing) 반응단계; Dye terminator 반응산물의 정제단계; 및 ABI3730XL 시퀀서(sequencer) 분석단계로 구성된다. 뉴클레오타이드 서열분석은 다음과 같이 수행하였다. Centricon 100 컬럼을 1.5㎖ 튜브에 결합하고 2㎖ 탈이온수를 주입하였다. 상기 실시간 PCR 반응액을 상기 컬럼에 주입하고 3000xg에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 용출액을 제거하고 콜렉션 바이알(collection vial)을 결합한 후 컬럼을 뒤집어 270xg의 속도로 2분 동안 원심분리를 수행하였다. PCR 반응을 위하여 2.5x Ready Reaction Premix, BigDye 시퀀싱 버퍼, 주형 DNA(상기 정제된 실시간 PCR의 앰플리콘), 프라이머 및 탈이온수를 96 웰(well) 반응플레이트(reaction plates)에 주입하였다. PCR 반응은 순차적으로 96℃에서 1분; 96℃에서 10초; 50℃에서 5초; 및 60℃에서 4분간 반응 하는 것을 1사이클로 하여 25사이클을 수행하였다. BigDye가 표지된 실시간 PCR 산물의 정제를 위하여 에탄올(ethanol)/EDTA/소듐 아세테이트(sodium acetate)침전법을 사용하였다. 상기 BigDye가 표지된 실시간 PCR 산물의 정제는 다음과 같이 수행하였다. 상기 96 웰(well) 반응플레이트(reaction plates)에 125mM EDTA, 3M 소듐 아세테이트 및 100% 에탄올을 첨가하고 알루미늄 테이프로 덮고 뒤집어 혼합하였다. 상기 혼합된 반응 플레이트를 상온에서 15분 동안 방치한 후 4℃에서 1650×g의 속도로 45분간 원심분리를 수행하고 상등액을 제거하였다. 상기 상등액이 제거된 반응플레이트에 70% 에탄올을 첨가하여 펠릿(pellet)을 세척한 후 상온에서 반응플레이트를 건조하였다. 상기 건조된 반응플레이트에 인젝션 버퍼(injection buffer)를 주입하여 펠릿을 현탁하여 펠릿용액을 제조하였다. 상기 펠릿용액에 대하여 ABI3730xl 시퀀서 분석 프로토콜에 따라 뉴클레오타이드서열 분석을 수행하였다. Clustal W2 얼라인먼트 및 Blast N 분석을 통해 뉴클레오타이드서열 비교하여 뉴클레오타이드서열의 삽입, 결손, 치환 및 돌연변이를 탐색하였다.

8. 통계적 분석

성별, 혈청 및 혈장, 위암 진행 단계별 cfDNA 추출량은 Student T test를 이용하여 유의성을 분석하였다.

실험결과

1. 위암 환자의 혈액 시료

세브란스병원 유전자은행으로부터 다양한 연령대인 1기 조기 위암(T1 early gastric carcinoma, T1_e) 환자, 1기 진행성 위암(T1 advanced gastric carcinoma, T1_a) 환자, 2기 진행성 위암(T2 advanced gastric carcinoma, T2_a) 환자 및 3기 진행성 위암(T3 advanced gastric carcinoma, T3_a) 환자의 혈청과 혈장, 총 100건을 무작위로 분양받았다(표 1). T1_e 단계의 남성 환자는 54세-74세, T1_e 단계의 여성 환자는 39세-50세, T1_a 단계의 남성 환자는 56세-83세, T1_a 단계의 여성 환자는 63세-76세, T2_a 단계의 남성 환자는 43세-77세, T2_a 단계의 여성 환자는 39세-81세, T3_a 단계의 남성 환자는 40세-74세, T3_a 단계의 여성 환자는 34세-72세이다.

2. cfDNA 정량 분석

cfDNA에 대한 정량분석을 수행하였다. T1_e단계의 위암환자로부터 정제된 cfDNA의 양은 다음과 같다. 남성 환자의 혈청: 444.2± 264.6ng; 여성 환자의 혈청: 3795.1± 710.3ng; 남성 환자의 혈장: 486.2± 648.4ng; 및 여성 환자의 혈장: 6131± 646.9ng. T1_a단계의 위암환자로부터 정제된 cfDNA의 양은 다음과 같다. 남성 환자의 혈청: 385.0± 331.1ng; 여성 환자의 혈청: 4048.9± 3666.3ng; 남성 환자의 혈장: 30.6± 293.8ng; 및 여성 환자의 혈장: 1627.5± 1583.2ng. T2_a 단계의 위암환자로부터 정제된 cfDNA의 양은 다음과 같다. 남성 환자의 혈청: 578.5± 282.2ng; 여성 환자의 혈청: 387.6± 92.2ng; 남성 환자의 혈장: 497.9± 306.2ng; 및 여성 환자의 혈장: 453.7± 182.5ng. T3_a 단계의 위암환자로부터 측정한 cfDNA의 양은 다음과 같다. 남성 환자의 혈청: 704.8± 243.8ng; 여성 환자의 혈청: 789.7± 140.4ng; 남성 환자의 혈장: 583.7± 341.2ng; 및 여성 환자의 혈장: 2816.5± 1348.2ng. 상기 결과를 통해 확인한 결과, 남성과 여성, 혈청과 혈장 또는 위암 진행 단계별 혈액의 cfDNA 방출량은 유의적인 통계적 차이가 없었으나 남성 환자 혈청의 경우, 위암이 진행할수록 cfDNA 방출량이 증가됨을 확인하였다.

3. CGH 마이크로 어레이 분석을 통한 DNA 영역의 분석

CGH 마이크로 어레이 분석을 위하여 각각의 시료에서 분리된 cfDNA 50ng에 대하여 전체 유전자 증폭방법을 적용하여 증폭하였으며 상기 증폭된 cfDNA 1μg에 대하여 혈청과 혈장, 위암의 진행 단계 또는 환자의 성별에 따라 시아닌 3 또는 시아닌 5로 표지하였다. CGH 마이크로 어레이 분석의 결과는 애질런트 스캐너(Agilent scanner)를 이용하여 이미지를 수득하였으며 애질런트 유전자 워크벤치(Agilent genomic workbench)를 이용하여 분석하였다.

각 단계에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역은 Dye-swap 형태로 비교분석하였다. Log ratio ≥ 1 또는 ≤ -1 기준으로 위암의 진행단계, 혈청과 혈장 및 환자의 성별에서 유의적으로 차이를 보이는 DNA 영역을 분류하였다. 구분된 DNA 영역은 밴 다이어그램분석을 이용하여 각 칩에서 혈청과 혈장, 위암 진행 단계 및 환자의 성별에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역을 구분하였다(도 1).

T1_e와 T1_a를 비교한 CGH 마이크로 어레이 칩으로부터는 T1_e 단계의 DNA 영역이 166개, 및 T1_a 단계의 DNA 영역이 115개가 관찰되었으며 T1_a와 T2_a를 비교한 CGH 마이크로 어레이 칩에서는 T1_a 단계의 DNA 영역이 264개, 및 T2_a 단계의 DNA 영역이 227개가 관찰되었다. T3_a와 T1_e를 비교한 CGH 마이크로 어레이 칩으로부터는 T3_a 단계의 DNA 영역이 673개, 및 T1_e 단계의 DNA 영역이 812개가 관찰되었다. 각 칩에서 분류된 DNA 영역에 대하여 Dye-swap 비교 분석을 수행하였다. 수행결과, T1_e 단계는 37개, T1_a는 5개, T2_a 와 T3_a 단계는 4개의 DNA 영역이 관찰되었다(표 2, 3, 4). 하기 표 2는 T1_e 단계에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역을 보여준다. 표 3은 T1_a 단계에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역을 보여준다. 표 4는 T2_a 단계와 T3_a 단계에서 공통적으로 관찰되는 DNA 영역을 보여준다. 상기 표 2, 3, 및 4에서 유전자 기호(Gene symbol), 유전자 이름(Gene name) 및 첨부번호(accession#)가 포함되지 않는 영역은 인트론(intron) 영역을 의미한다.

4. cfDNA의 용융 곡선 실시간 PCR 분석

상기 분석된 DNA 영역 중 T1_e 단계에서 ENTPD6 cfDNA; 및 T1_a 단계에서 A_16_P01781625 cfDNA를 선택하여 용융 곡선 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 용융 곡선 분석을 위한 실시간 PCR 프라이머는 앰플리콘의 크기가 각 DNA 영역의 프로브 뉴클레오타이드 서열을 중심으로 113bp 내지 183bp가 되도록 디자인하였으며 5’말단에 M13 froward를 정방향(forward)으로 추가하여 뉴클레오타이드서열 분석에 이용할 수 있도록 하였다(표 5).

용융곡선 실시간 PCR 분석은 사이클 역치(cycle threshold, Ct)의 값이 30 이하이며 단일 용융곡선이 관찰되는 조건에 한하여 정상적인 PCR 산물로 간주하여 분석을 수행하였다. T1_e 단계에서 관찰되는 DNA 영역 중에서 선택된 ENTPD6 DNA 영역에 대하여 용융곡선 실시간 PCR 분석을 수행하였다(도 2).

ENTPD6의 용융곡선 분석결과(용융 피크)는 다음과 같다.

남성 환자의 혈청의 경우, T1_e = 79.37℃; T1_a = 79.4℃; 및 T2_a = 79.45℃로 분석되었으며 T3_a 단계는 증폭되지 않아 분석할 수 없었다. 여성 환자의 혈청의 경우, T1_e = 79.35℃; 및 T2_a = 79.4℃로 분석되었으며, T1_a 및 T3_a 단계는 증폭되지 않아 분석할 수 없었다. 남성 환자의 혈장의 경우, T1_e = 79.27℃; 및 T3_a = 79.47℃로 분석되었으며 T1_a 및 T2_a 단계는 증폭되지 않아 분석할 수 없었다. 여성 환자의 혈장의 경우, T1_e = 79.37℃에서 분석되었으며 T1_a, T2_a, 및 T3_a 단계는 증폭되지 않아 분석할 수 없었다. 상기 결과들 중에서 T1_a, T2_a 및 T3_a 단계의 시료들에 대한 분석들은 Ct = 30 이하의 조건을 만족하였다.

T1_a 단계에서 관찰되는 DNA 영역 중에서 선택된 A_16_P01781625에 대하여 용융곡선 실시간 PCR 분석을 수행하였다(도 3).

A_16_P01781625의 용융곡선 분석결과(용융 피크)는 다음과 같다.

남성 환자의 혈청의 경우, T1_e = 78.83℃; T1_a = 78.77℃; T2_a = 78.75℃; 및 T3_a = 78.65℃로 분석되었다. 여성 환자의 혈청의 경우, T1_e = 78.8℃; T1_a = 78.75℃; T2_a = 78.6℃; 및 T3_a = 78.5℃로 분석되었다. 남성 환자의 혈장의 경우, T1_e = 78.63℃; T1_a = 78.55℃; T2_a = 78.65℃; 및 T3_a = 78.45℃로 분석되었다. 여성 환자의 혈장의 경우, T1_e = 78.78℃; T1_a = 78.75℃; T2_a = 78.78℃; 및 T3_a = 78.65℃로 분석되었다. 상기 결과들 중에서 T1_e, T1_a 및 T2_a 단계에서 Ct = 30 이하의 조건을 만족하였다.

5. cfDNA 뉴클레오타이드 서열 분석 결과

상기 용융곡선 실시간 PCR 산물들에 대해 뉴클레오타이드 서열 분석을 수행하였다(도 4, 5 및 표 6, 7). 표 6은 뉴클레오타이드서열 분석을 통해 확인한 ENTPD6 cfDNA, ENTPD6 cfDNA의 유전자 변이, 및 A_16_P01781625 cfDNA의 뉴클레오타이드 서열을 나타내며, 표 8은 ENTPD6와 A_16_P01781625에 일치하는 염색체와 cfDNA의 뉴클레오타이드서열 특성을 보여준다. 표 7에서 “-”는 A의 결실(deletion)을 의미하며 “W"는 A로 관찰되거나 T로 치환된 것을 의미한다.

ENTPD6 cfDNA에 대한 뉴클레오타이드서열 분석 결과, ENTPD6 cfDNA 뉴클레오타이드서열은 인간 20번 염색체, ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 6 (ENTPD6) isoform 1 & 2와 일치하였다. 모든 위암 단계에서 분석된 ENTPD6 cfDNA에서 25188153번째(ENTPD6 cfDNA의 14번째) 아데닌(adenine)의 결손이 확인되었으며, T1_e 단계에서 분석된 ENTPD6 cfDNA에서는 25188244 번째(ENTPD6 cfDNA의 105번째) 뉴클레오타이드서열에서 아데닌과 티민이 동시에 관찰되었다.

A_16_P01781625 cfDNA에 대한 뉴클레오타이드서열 분석 결과, A_16_P01781625 cfDNA의 뉴클레오타이드서열은 인간 7번 염색체, leucine-rich single-pass membrane protein 1의 5’영역 7035bp 및 transmembrane protein 168의 3’영역 269901bp에 위치하는 것으로 확인되었다. 각 위암단계에서 발견된 A_16_P01781625 cfDNA는 유전자 돌연변이가 발견되지 않았다. 결과적으로 ENTPD6 cfDNA와 A_16_P01781625 cfDNA의 뉴클레오타이드 서열은 CGH 마이크로 어레이의 프로브 정보와 일치하였으며 ENTPD6 cfDNA에서 위암 단계에 따른 뉴클레오타이드 서열의 결손, 치환 및 돌연변이가 관찰되었다.

결론

본 발명에서는 혈액으로 방출되는 cfDNA 수준과 유전체 특성을 분석하였으며 위암 진행에 따라서 특정 cfDNA의 수준이 증가됨을 관찰하였다. 용융곡선 (Melting curve) 실시간 PCR 분석에서 위암 진행 시기 특이적 cfDNA로서 ENTPD6 cfDNA 및 A_16_P01781625 cfDNA를 발굴 및 확인하였으며, 증폭된 상기 cfDNA의 DNA 염기서열을 분석하여 검증하였다. 특히 T1_e 시기에서 ENTPD6, T1_e, T1_a 및 T2_a 시기에서 A_16_P01781625는 Ct = 30 이하이며 단일 용융 곡선(melting curve)이 관찰되어서 위암 및 위암의 진행 시기에 따른 특이적 후보 cfDNA 라고 간주할 수 있다. 본 발명에서 확보된 혈액 cfDNA 수준 및 발굴된 cfDNA의 특성은 위암 진행 단계 측정 바이오마커, 치료 진행 평가, 항암제 성능 및 적합성 평가 응용할 수 있을 것이라 기대한다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Use of Cell-Free DNA for Diagnosing Gastric Cancer <130> MP15-0135 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of ENTPD6 <400> 1 ctggggctct cagtagttgc 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer of ENTPD6 <400> 2 tggtgttccc aaactgttc 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer of AP_16_P01781625 <400> 3 ctgcctacaa cctcacccta a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer of AP_16_P01781625 <400> 4 tagaacatgg tcccgggtta 20 <210> 5 <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agggacggag tttaaacctt tcgaaaagta aattgcctga atagaagtat aactgaggat 60 tgaaagactg aatcagatac gcgcttctgt tcccatgaac agtttgggaa caccaa 116 <210> 6 <211> 91 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 taagactcac atcgaggtaa actgcttgtt ttaagaacta acctctgtcc ttaattcagt 60 ctcctattcc taacccggga ccatgntcta a 91 <210> 7 <211> 115 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agggacggag tttaaccttt cgaaaagtaa attgcctgaa tagaagtata actgaggatt 60 gaaagactga atcagatacg cgcttctgtt cccatgaaca gtttgggaac accaa 115 <210> 8 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agggacggag tttaaccttt cgaaagtaaa ttgcctgaat agaagtataa ctgaggattg 60 aaagactgaa tcagatacgc gcttctgttc ccatgaacag tttgggaaca ccaa 114 <210> 9 <211> 115 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 agggacggag tttaaccttt cgaaaagtaa attgcctgaa tagaagtata actgaggatt 60 gaaagactga atcagatacg cgcttctgtt cccatgaaca gttwgggaac accaa 115

Claims

서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 위암 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 유전자 증폭반응은 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이(microarray)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 위암은 조기 단계의 위암인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 진단용 키트.
서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 포함하는 위암의 진단용 바이오 마커.
위암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 5, 6, 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 생물학적 시료로부터 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid), 또는 복수인 것을 특징으로 하는 방법.