KR20080065476A - 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자에 대한 폐암재발의 위험을 예측하는 방법, 폐암 환자 또는 폐암 치료를받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는방법, 그에 의하여 작성된 보고서, 폐암 환자 또는 폐암치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한조성물, 키트 및 마이크로어레이 - Google Patents

폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자에 대한 폐암재발의 위험을 예측하는 방법, 폐암 환자 또는 폐암 치료를받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는방법, 그에 의하여 작성된 보고서, 폐암 환자 또는 폐암치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한조성물, 키트 및 마이크로어레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; 상기 시료 중에서 표 1, 표 2 또는 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하여 상기 마커 유전자의 발현 수준에 대한 데이터를 얻는 단계; 및 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계;를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법을 제공한다.
폐암, 재발, 마커 유전자

Description

폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자에 대한 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법, 그에 의하여 작성된 보고서, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이{A method of predicting risk of lung cancer recurrence in a patient after lung cancer treatment or a lung cancer patient, a method of preparing a report on the risk of lung cancer recurrence in a patient after lung cancer treatment or a lung cancer patient and a report prepared by the same, a composition, kit and microarray for diagnosing the risk of lung cancer recurrence in a patient after lung cancer treatment or a lung cancer patient}
본 발명은 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법, 그에 의하여 작성된 보고서, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이에 관한 것이다.
폐암은 세계적으로 암으로 인한 사망 중 가장 큰 원인이다. 폐암은 소세포 암 (small cell lung cancer: SCLC)와 비소세포암 (non-small cell lung cancer: NSCLC)으로 구분되며, 비소세포암이 약 80%를 차지한다. 비소세포암은 3종류의 서브 타입으로 구성된다: 40% 샘암종 (adenocarcinoma), 40% 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma) 및 20% 대세포암 (large cell carcinoma). TMN 병기 구분법 (staging system)이 폐암의 관리에 널리 받아들여지고 있다.
일차 종양은 종양 크기, 부위 및 국부적 병발 (local involvement)에 따라 4개의 T 카테고리 (T1-T4)로 구분된다. 림프 절 확산 (spread)은 폐 내의 기관지/폐 (bronchio/pulmonary) 내로 전달 (N1), 상기 일차 종양과 같은 측면 상의 종격동 확산 (medistinal spread) (N2) 및 상기 일차 폐 종양의 맞은 편으로 종격동 확산 또는 상부클라비움 병발 (supraclavilcular involvement) (N3)로 구분된다. 원격 또는 전이 확산 (metastatic spread)는 없거나 있다 (M0 또는 M1). 일반적으로 전이가 이루어지지 않은 폐암은 외과적 수술을 통하여 제거하는 방법으로 치료를 한다. 그러나, 폐암 제거 수술 후의 재발율은 20 내지 50%로 높다(Cancer : Principles & Practice of Oncology, 56th. ed. In: Devita DV, Hellman S, Rosenberg SA, eds. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001).
종래 폐암 특이적인 마커 유전자를 이용하여 폐암을 진단하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허공개 제2006025057호에는 폐암 특이적 마커를 이용하여 폐암 상태를 검사하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 미국특허공개 제20050272061호에는 폐암 조직과 세포에서 특이적으로 분별적으로 발현되는 L 유전자와 그 산물을 측정하는 단계를 포함하는 개체 중의 암을 진단하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 재발 위험을 임상에서 적용할 수 있을 정도로 효과적으로 예측하는 방법은 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법 및 그에 의하여 작성된 보고서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명은 폐암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계;
상기 시료 중에서 표 1, 표 2 또는 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하여 상기 마커 유전자의 발현 수준에 대한 데이터를 얻는 단계; 및
상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계;를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법은, 폐암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계를 포함한다.
상기 생물학적 시료를 얻는 단계는 폐암 환자로부터 임의의 세포를 포함하는 시료를 얻는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담 및 뇌척수액 등이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되지 않는다. 상기 생물학적 시료는 바람직하게는, 폐암 조직이다. 상기 생물학적 시료를 얻는 것은, 폐암 제거 수술을 하는 동안 제거된 폐암 조직일 수 있으나, 반드시 폐암 제거 수술에 의하여 채취되는 것에 한정되지 않는다. 폐암 조직의 적출은 물질적 또는 레이저 등을 통한 광학적 적출에 의하는 것일 수 있다.
본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법은, 상기 시료 중에서 표 1, 표 2 또는 표 3의 마커 유전자 세트로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하여 상기 마커 유전자의 발현 수준에 대한 데이터를 얻는 단계를 포함한다.
상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 1의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 표 1의 마커 유전자로 이루어진 군으로 선택된 2 이상, 4이상, 6이상, 8이상, 10이상, 15이상, 20이상, 30이상, 70이상, 100이상, 150이상, 또는 166개 마커 유전자 전체의 발현 정도를 측정하는 것이다. 이때 상기 폐암은 샘암종 (adenocarcinoma) 또는 편평상피세포암 (squoumous tumor)일 수 있다.
상기 폐암이 샘암종인 경우, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 2의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 표 2의 마커 유전자로 이루어진 군으로 선택된 2 이상, 4이상, 6이상, 8이상, 10이상, 15이상, 20이상, 30이상, 70이상, 100이상, 150이상, 200이상, 250이상 또는 300개 마커 유전자 전체의 발현 정도를 측정하는 것이다.
상기 폐암이 편평상피세포암인 경우, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로 선택된 2 이상, 4이상, 6이상, 8이상, 10이상, 15이상, 20이상, 30이상, 70이상, 100이상, 150이상, 또는 166개 마커 유전자 전체의 발현 정도를 측정하는 것이다.
상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것은, 상기 마커 유전자로부터 발현되는 임의의 발현 산물을 측정하는 것이 포함된다. 예를 들면, 상기 마커 유전자로부터 유래된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "mRNA의 수준 측정"은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호분석법, 노던 블롯팅, DNA 마이크로어레이 등을 포함한 종래 알려진 임의의 방법에 의하여 분석될 수 있다. 바람직하게는, 표 1, 2 및 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자에 특이적인 프로브 가 고정화되어 있는 마이크로어레이 상에 상기 생물학적 시료로부터 분리된 mRNA 또는 그로부터 유도된 cDNA를 혼성화시키고, 그 결과 얻어진 혼성화 정도를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 상기 혼성화 정도는 형광 측정 및 전기적 측정과 같은 당업계에 알려진 임의의 측정 방법에 의하여 측정될 수 있다. 이 경우, 상기 프로브 또는 표적 핵산은 검출가능한 적절한 표지로 표지되어 있을 수 있다. 여기에서, 상기 cDNA는 표 1, 2 및 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자를 표적으로 하는 센스 및 안티 센스 프라이머 쌍을 프라이머로 한 RT-PCR에 의하여 직접적으로 증폭된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "단백질의 수준 측정"은 종래 알려진 임의의 단백질 측정 또는 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 표 1, 2 및 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 분석방법이 사용될 수 있다. 항체를 이용한 단백질 분석 방법에는, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역기염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 ELISA에는 직접적 ELISA, 간접적 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA, 간접적 샌드위치 ELISA 등이 포함된다. 웨스턴 블롯팅이란, 전체 단백질을 분리하고, 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시키고, 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법이다. 그외에 단백질 수준을 측정하는 방법에는, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 효 소, 기질, 조효소, 리간드 등을 이용하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준은 상기 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 한, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의하여 수행된 핵산 증폭에 의하여 얻어진 증폭 산물의 양을 측정함으로써 결정되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법은, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "재발 군"이란 폐암 환자 중에서 폐암 치료를 받은 후에 일정한 기간 내에 폐암이 재발된 환자의 군을 말한다. 바람직하게는, "재발 군"이란 폐암 환자 중에서 폐암 적출 수술을 받은 후 1년 내에 폐암이 재발된 환자의 군을 말한다. 그러나, 폐암 치료의 종류 및 재발의 기준이 되는 기간은 당업자에 의하여 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 상기 "비재발 군"이란 폐암 환자 중에서 폐암 치료를 받은 후에 일정한 기간이 경과하여도 폐암이 재발하지 않은 환자의 군을 말한다. 바람직하게는, "비재발 군"이란 폐암 환자 중에서 폐암 적출 수술을 받은 후 3년이 경과하여도 폐암이 재발하지 않은 환자의 군을 말한다. 그러나, 폐암 치료의 종류 및 비재발의 기준이 되는 기간은 당업자에 의하여 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "재발 군의 발현 수준" 또는 "비재발 군의 발현 수준"이란 표준 발현 수준 (standard expression level)에 해당하는 것으로, 미리 예비 실험을 통하여 폐암 환자의 생물학적 시료 예를 들면, 폐암 조직을 채취하고, 상기 조직에서 상기 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 마커 유전자의 발현 수준을 측정하고, 폐암 치료를 받은 환자 중 시간의 경과에 따라서 재발이 일어나는 재발 군과 재발이 일어나지 않은 비재발 군으로 분류한다. 다음으로, 재발 군과 비재발 군에서 측정된 상기 마커 유전자의 발현 수준을 각각 재발 군 또는 비재발 군의 발현 수준으로 분류한다.
상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계는, 통계적 예측 모델을 사용하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지는, 상기 발현 수준이 서로 통계적으로 유의한 차이가 있는지에 의하여 결정된다.
상기 통계적으로 유의한 차이가 있는지 여부는, 당업계에 알려진 통계적 분석 모델을 사용하여 결정되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 통계적 분석 모델은, LDA 모델 (LDA model), QDA 예측 모델 (QDA prediction model), 뉴럴 네트워크 모델 (Neural Network model), 디시전 트리 모델 (Decision Tree model), 서포트 벡터 머신 모델 (Support Vector Machine model), 및 나이브 베이즈 모델 (Naive Bayes model)로 이루어진 군으로부터 선택되는 통계적 예측 모델일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발 현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계는, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나는 경우, 비재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계 또는 상기 마커 유전자의 발현 수준이 비재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나는 경우, 재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계인 것일 수 있다. 또한, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나지 않는 경우, 재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계 또는 상기 마커 유전자의 발현 수준이 비재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나지 않는 경우, 비재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계인 것일 수 있다.
상기 통계적으로 유의한 차이는 재발 군 또는 비재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 높거나 낮은 p 값을 갖는 경우인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 p 값은 0.05 미만인 것일 수 있다.
본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법에 있어서, 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준에 해당하는 것으로 결정되는 경우, 환자의 폐암 재발 위험이 높은 것으로 예측하고, 마커 유전자의 발현 수준이 비재발 군의 발현 수준에 해당하는 것으로 결정되는 경우, 환자의 폐암 재발 위험이 낮은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법에 있어서, 특이도 (specificity)는 바람직하게는 50%이상, 더욱 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 70%이상, 더 더욱 바람직하게는 80%이상, 가장 바람직하게는 90%이다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법에 따른 예측 결과를 표시한 보고서를 작성하는 단계를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법을 제공한다.
상기 보고서에는 시간에 따른 재발의 확률 값을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법에 의하여 작성된 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 제공한다.
본 발명은 또한, 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에는 시료 중의 상기 마커 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물에는 상기 프로브를 안정화시키고, 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 있어서, "프로브"라는 용어는, 표적 핵산과 부분적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥으로서, 표적 핵산과 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 표적 핵산에 완전 상보적인 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 핵산뿐만 아니라, 펩티드 핵산을 포함한 상보적 결합을 할 수 있는 종래 알려진 임의의 핵산 유도체가 포함된다.
상기 프로브와 표적 핵산의 결합 (일반으로, 혼성화라고도 함)은, 서열 의존적으로 일어나는 것으로 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 일반적으로 혼성화 반응은 특정한 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm 보다 약 5℃ 낮은 온도에서 이루어진다. 상기 Tm 은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 결합한 상태를 의미한다. 혼성화 반응 조건의 예는, pH 7.0 내지 8.3, 0.01 내지 1.0M Na+ 이온 농도일 수 있다. 또한, 표적 핵산과 프로브의 특이성을 높이기 위하여는, 표적 핵산과 프로브의 결합을 불안정하게 하는 조건, 예를 들면, 높은 온도, 높은 농도의 불안정화제 (예를 들면 포름아미드)의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 프로브의 길이는 표적 핵산과 서열 특이적으로 결합할 수 있는 것이며, 어떠한 길이의 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 예를 들면, 상기 프로브의 길이는, 7 내지 200 뉴클레오티드, 7 내지 150 뉴클레오티드, 7 내지 100 뉴클레오티드, 7 내지 50 뉴클레오티드, 또는 전장 유전자의 일 가닥의 길이일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로브는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지에는, Cy3 또는 Cy5와 같은 형광표지, 방사성 물질 표지, 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 프로브에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 프로브는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지에는, Cy3 또는 Cy5와 같은 형광표지, 방사성 물질 표지, 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 시료 중의 표적 핵산은 상기 마이크로어레이 중의 상기 프로브와 혼성화되고, 그 혼성화 결과를 측정함으로써 그 존재 여부 및 농도가 측정될 수 있다. 혼성화 과정 중 상기 표적 핵산은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 키트에는 또한, 상기 프로브 또는 프로브 세트를 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험을 측정하는 데 사용하기 위한 과정을 기재한 지침서를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자에 대한, 센스 및 안티센스 프라이머 쌍을 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 키트를 포함한다.
본 명세서 전체에 있어서, "프라이머"란 유리 3' 히드록실기를 갖는 핵산으로서, 주형 핵산과 상보적이거나 부분적으로 상보적이어서 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 중합 반응에 있어서 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 키트는, 또한, 상기 프라이머를 프라이머로 하고, 시료 중의 표적 핵산을 주형으로 하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약에는, 적절한 완충용액, DNA 중합효소 (및/또는 역전사 효소), 4가지 종류의 dNTP가 포함될 수 있다.
상기 프라이머의 길이는 표적 핵산과 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 중합효소 연쇄반응에서 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 것이면, 어떠한 길이의 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 예를 들면, 상기 프라이머의 길이는, 7 내지 200 뉴클레오티드, 7 내지 150 뉴클레오티드, 7 내지 100 뉴클레오티드, 7 내지 50 뉴클레오티드, 또는 전장 유전자의 일 가닥의 길이일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 프라이머는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지에는, Cy3 또는 Cy5와 같은 형광표지, 방사성 물질 표지, 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트가 기판 상에 고정화되어 있는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 것을 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5.445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 상기 기판은, 플레이트, 막, 및 미세구 (또는 비드)와 같은 다양한 형상을 가질 수 있다.
상기 프로브에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 프로브는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지에는, Cy3 또는 Cy5와 같은 형광표지, 방사성 물질 표지, 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
하기 표 1은 폐암 조직 적출한 후, 상기 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발한 환자 (재발 군)와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자 (비재발 군)에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 총 환자 수는 60명이며, 이들 중 19명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 41명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
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하기 표 2는 폐암 조직 적출한 후, 샘암종(adenocarcinoma)으로 분류된 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발한 환자와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 샘암종(adenocarcinoma)으로 분류된 폐암을 가진 총 환자 수는 23명이며, 이들 중 8명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 15명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
하기 표 3은 폐암 조직 적출한 후, 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)으로 분류된 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발된 환자와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)로 분류되는 폐암을 가진 총 환자 수는 37명이며, 이들 중 11명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 26명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
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표 1, 2 및 3에서, gene name 은 유전자 명칭을 나타내고, gene symbol은 유전자를 나타내는 기호를 나타내고, Genbank Accession #는 Genbank 허가번호를 나타내는 것으로 상기 Genbank 데이터베이스는 일반 공중에게 자유롭게 접근가능한 데이터베이스이다. T-test p 값은 폐암 적출 수출을 받은 환자에 대하여 재발한 환자에서의 발현 평균값과 재발하지 않은 환자에서의 발현 평균값의 차이의 정도를 통계적으로 분석한 값이다. 여기서, 발현의 정도는 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 사용한 혼성화 분석을 통하여 측정하였다. Fold change (abs)는 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 사용한 혼성화 분석에 있어서, 폐암 적출 수술을 받은 환자에 대하여 재발한 환자에서의 발현 평균과 재발하지 않은 환자에서의 발현 평균의 비율을 나타내는 값이다.
표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 값은, 재발한 환자와 재발하지 않은 환자에 있어서 T-test p 값이 모두 0.05 미만으로서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 따라서, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자는 폐암 적출 수출을 받은 환자에 대하여 추후에 폐암이 재발할지 여부를 예측할 수 있는 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 또한, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자는 재발한 환자의 발현 평균에 대한 재발하지 않은 환자의 발현평균의 비율이 모두 1.5배 이상으로서, 재발한 환자에서 그 발현이 현저하게 증가되는 것으로 확인되었다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 폐암의 재발과 관련된 마커 유전자의 선별
본 실시예에서는 종양의 크기가 3cm 미만이고 림프 절 전이가 없는 1기 폐암 조직 (즉, N0M0T1 기)을 적출하고, 적출된 폐암 조직으로부터 즉시 총 RNA를 분리하였다. 적출된 모든 종양 조직은 RNA 추출 전에 가시화를 개선하기 위하여 헤마톡실린으로 가볍게 염색하였다. 각 미세 절단된 표본은 90% 이상이 종양 세포로 구성되었다.
괴사 영역 (necrotic region)을 피하기 위하여, 종양 괴 (tumor mass)의 가장자리로부터 5mmx 5mm 크기의 종양 조직의 하나 또는 2개의 단편(pieces)를 즉시 -80℃에 저장하였다.
상기 미세 절단된 종양 조직을 1ml Trizol 시약 (Life Technologies, Rockville, MD) 중에 넣고, 보텍싱(vortexing)에 의하여 즉시 균질화하였다. Trizol 시약 프로토콜에 따라 총 RNA를 분리하였다. 분리된 상기 총 RNA의 질은 0.6M 포름아미드 및 에티디움 브로마이드를 포함하는 1% 아가로즈 겔을 사용한 전기영동에 의하여 분석하였다. 총 RNA의 양은 Nanodrop 분광기 (Nanodrop Technologies, Rockland, DE)를 사용하여 분석하였다.
분리된 상기 총 RNA의 질과 양이 우수한 것을 확인하고, 상기 RNA를 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 시켜, cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA는 인 비트로 전사 반응을 통해 cRNA를 합성하는 주형으로 사용되는데 이때 비오틴으로 변형된 UTP를 반응액에 첨가함으로써 합성된 cRNA는 비오틴으로 표지가 되었다. 다음으로, 상기 합성된 비오틴 표지된 cRNA를 히드록시 라디칼과 반응시켜 50 내지 200 bp 크기로 단편화하였다. 상기 단편화된 cRNA 시료 10 ㎍을 Affymetrix GeneChip array (인간 133 plus ver 2) 상에 주입하고 45℃에서 16시간 동안 혼성화 반응을 시켰다. 다음으로, 세척하고, 피코에리쓰린 (phycoerythrin: PE)으로 표지된 스트렙타비딘으로 혼성화된 비오틴을 염색하였는데, 이때 신호를 증폭하기 위하여 비오틴화된 항-스트렙타비딘 항체를 첨가하여 염색하였다. 염색된 마이크로어레이 표면을 532nm 파장의 빛으로 조사하고 570nm 파장의 형광을 검출하여 형광 강도를 측정하였다.
얻어진 데이터는 ArrayAssistTM (Stratagene, Inc., San Diego, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 데이터 전처리는 분석에 사용된 전체 마이크로어레이들에 대해 형광 강도 값을 log2로 치환한 후 핵산 서열의 GC 함량을 고려하여 전체 마이크로어레이 대하여 형광 강도 평균을 맞춰주는 다중 마이크로어레이 수준 (multi-microarray level)의 노말화 방법인 GCRMA (log2 transformation) 방법을 적용하여 처리하였다. 그룹 비교는, unpaired t-test, 퍼뮤테이션 =100. 보정한 p-값 No/FDR 조건으로 수행하였다. 데이터 필터링은 발현 수준 (재발 및 비재발, 그 룹 평균) > 5 및 fold change ≥ 1.5을 만족하는 데이터만을 취하였다. probeset_id 별 개수(count)는, 샘암종 (ADC), 편평세포암종 (SQC), 또는 세포 형태와 무관하게 재발군과 비재발 군에서의 상기 필터링 기준을 만족하는 수준의 유전자 발현 차이가 나는 프로브 세트 개수로 정의하였다.
분석 결과, 총 폐암 조직, 샘암종 (ADC) 및 편평세포암종 (SQC)에 대하여 양성 발현으로 선택된 마커의 수는 하기 표 4와 같다.
표 4.
총 폐암 조직 샘암종 편평세포암종
프로브 개수 166 300 166
상기 형광 강도 측정에 의하여 얻어진 각 유전자의 발현에 관련된 데이터를 확보하였다. 이렇게 수집된 유전자의 발현에 관련된 데이터와 폐암의 재발과의 연관성을 확인하기 위하여, 폐암 제거 수술을 받은 환자를 5년 동안 모니터링하여, 폐암이 재발하는지를 확인하였다. 만약 폐암 제거 수술 후 1년 내에 폐암이 재발하는 경우, 폐암 재발 그룹으로 분류하고, 3년이 경과하였는데도 폐암이 재발하지 않는 경우에는, 재발하지 않는 그룹으로 분류하였다. 이렇게 얻어진 폐암 제거 수술을 받은 환자 중 재발 그룹과 비재발 그룹에 대한 데이터를 확보하였다.
다음으로, 상기 폐암 제거 수술 시에 분석된 각 유전자의 발현 패턴과, 그 후에 환자 관찰을 통하여 얻어진 재발 및 비재발 그룹과의 상호연관성을 분석하였다. 그 결과를 표 1, 2 및 3에 나타내었다.
표 1은 폐암 조직 적출한 후, 상기 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레이 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발한 환자와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 총 환자 수는 60명이며, 이들 중 19명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 41명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
표 2는 폐암 조직 적출한 후, 샘암종(adenocarcinoma)로 분류되는 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레이 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발한 환자와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 샘암종(adenocarcinoma)로 분류되는 폐암을 가진 총 환자 수는 23명이며, 이들 중 8명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 15명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
표 3은 폐암 조직 적출한 후, 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)로 분류되는 폐암 세포의 유전자 발현 패턴을 마이크로어레이 상의 프로브와의 혼성화 분석을 통하여 분석하고, 1년 내에 폐암이 재발한 환자와 3년이 경과하여도 재발하지 않은 환자에서의 발현 수준에 있어서 차이가 있는 것으로 판단되는 마커 유전자를 선발한 결과를 나타내는 표이다. 편평상피세포암(squamous cell carcinoma)로 분류되는 폐암을 가진 총 환자 수는 37명이며, 이들 중 11명이 폐암 조직 적출 후 1년 내에 재발하였으며, 26명은 3년이 경과하여도 재발하지 않았다.
표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 값은, 재발한 환자와 재발하지 않은 환자에 있어서 T-test p 값이 모두 0.05 미만으로서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 따라서, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자는 폐암 적출 수출을 받은 환자에 대하여 추후에 폐암이 재발할지 여부를 예측할 수 있는 마커 유전자로서 사용될 수 있다. 또한, 표 1, 2 및 3의 Genbank 허가번호에 해당하는 마커 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자는 재발한 환자의 발현 평균에 대한 재발하지 않은 환자의 발현 평균의 비율이 모두 1.5배 이상으로서, 재발한 환자에서 그 발현이 현저하게 증가되는 것으로 확인되었다.
그 외 폐암 제거 수술을 받은 환자의 재발 여부와 나이, 성별, 흡연 상태, 세포형태, 암기 (pstage), 종양 크기와의 상관 관계를 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 5, 6 및 7에 나타낸 바와 같다.
표 5.
변수 통계학적 분석방법 결과
성별(특성) chi-square test 차이 없음: p 값=0.552
나이(수치) 2-sample t-test 차이 없음: p 값=0.559
흡연(특성) chi-square test 차이 없음: p 값=0.813
세포형태(특성) chi-square test 차이 없음: p 값=0.682
암기(pstage)(특성) Fisher's exact test 차이 없음: p 값=0.305
종양 크기(수치) 2-sample t-test 차이 있음: p 값=0.039
전이(특성) - 전이 없음.
표 5은, 암의 종류를 세포 형태에 따라 구분하지 않은 60명의 종양 환자에 대하여 분석한 결과이다. 60명 중 재발 환자는 19명이며, 비재발 환자는 41명이었 다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 재발 여부 및 종양 크기를 제외하고 나머지 분석에서 혼란 (confounder)를 가져올 가능성이 있는 임상 정보들은 재발과 비재발 군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않음을 알 수 있다. 즉, 분석된 결과는 재발 여부에 대해서만 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타내는 유전자 목록이라고 할 수 있다.
표 6.
변수 통계학적 분석방법 결과
성별(특성) Fisher's exact test 차이 없음: p 값=1.000
나이(수치) 2-sample t-test 차이 없음: p 값=0.618
흡연(특성) chi-square test 차이 없음: p 값=0.6570
세포형태(특성) - 모두 샘암종(ADC)
암기(pstage)(특성) Fisher's exact test 차이 없음: p 값=0.085
종양 크기(수치) 2-sample t-test 차이 없음: p 값=0.051
전이(특성) - 전이 없음.
표 6은, 암의 종류를 세포 형태에 따라 구분하였을 경우, 샘암종에 해당하는 23명의 종양 환자에 대하여 분석한 결과이다. 23명 중 재발 환자는 8명이며, 비재발 환자는 15명이었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 재발 여부를 제외하고 나머지 분석에서 혼란 (confounder)를 가져올 가능성이 있는 임상 정보들은 재발과 비재발 군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않음을 알 수 있다. 즉, 분석된 결과는 재발 여부에 대해서만 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타내는 유전자 목록이라고 할 수 있다.
표 7.
변수 통계학적 분석방법 결과
성별(특성) - 모두 남자
나이(수치) 2-sample t-test 차이 없음: p 값=0.328
흡연(특성) chi-square test 차이 없음: p 값=1.000
세포형태(특성) - 모두 편평세포암조(SQC)
암기(pstage)(특성) Fisher's exact test 차이 없음: p 값=1.000
종양 크기(수치) 2-sample t-test 차이 없음: p 값=0.417
전이(특성) - 전이 없음.
표 7은, 암의 종류를 세포 형태에 따라 구분하였을 경우, 편평세포암종에 해당하는 37명의 종양 환자에 대하여 분석한 결과이다. 37명 중 재발 환자는 11명이며, 비재발 환자는 26명이었다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 재발 여부를 제외하고 나머지 분석에서 혼란 (confounder)를 가져올 가능성이 있는 임상 정보들은 재발과 비재발 군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않음을 알 수 있다. 즉, 분석된 결과는 남자 폐암 환자 중 편평세포암종 (SQC) 내에서 재발 여부에 대해서만 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타내는 유전자 목록이라고 할 수 있다.
실시예 2 : 통계적 모델을 이용한 폐암 재발의 위험의 예측
본 실시예에서는, 실시예 1에서 얻어진 재발 및 비재발 환자에서 수십된 마커 유전자의 발현 수준을 토대로, 통계적 분석 모델을 사용하여 폐암의 재발 위험을 예측할 수 있는지를 확인하였다.
분석은, 총 폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여 얻어진 각각의 데이터 중 일부는 통계적 모델의 예측 정확도 기준을 설정하기 위한 러닝 세트 (learning set)로 사용하고, 나머지 데이터를 상기 러닝 세트 데이터를 이용하여 설정된 예측 정확도 조건이 실제로 정확한지를 확인하였다.
총 폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여 각각 사용된 러닝 세트와 테스트 세트에 대한 데이터는 각각 다음과 표 8, 9 및 10과 같다.
표 8.
총 폐암 조직 비재발 재발 총계
러닝 세트 28 15 43
테스트 세트 13 4 17
계 41 19 60
표 9.
샘암종 비재발 재발 총계
러닝 세트 9 6 15
테스트 세트 6 2 8
계 16 8 23
표 10.
편평세포암종 비재발 재발 총계
러닝 세트 17 7 24
테스트 세트 9 4 13
계 26 11 37
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 QDA 예측 모델 (QDA prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 11, 12, 및 13과 같다. 표 11, 12, 및 13에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 76.4%이상이었다.
표 11. 총 폐암조직에 대한 QDA 예측 모델 (QDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 10 1 11
재발 3 3 6
정확도 (overall accuracy) 76.4%
표 11에서 정확도는 총 시료에 대한 진실 값과 일치하는 예측 값의 백분율이다. 즉 정확도는 =(17-4)x100/17 =76.4%. 이하 동일하게 계산하였다.
표 12. 샘암종 조직에 대한 QDA 예측 모델 (QDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 6 0 6
재발 0 2 2
정확도 (overall accuracy) 100%
표 13. 편평세포암종 조직에 대한 QDA 예측 모델 (QDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 9 2 11
재발 0 2 2
정확도 (overall accuracy) 84.6%
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 LDA 예측 모델 (LDA prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 14, 15, 및 16과 같다. 표 14, 15, 및 16에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 76.4%이상이었다.
표 14. 총 폐암조직에 대한 LDA 예측 모델 (LDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 10 1 11
재발 3 3 6
정확도 (overall accuracy) 76.4%
표 15. 샘암종 조직에 대한 LDA 예측 모델 (LDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 6 0 6
재발 0 2 2
정확도 (overall accuracy) 100%
표 16. 편평세포암종 조직에 대한 LDA 예측 모델 (LDA prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 9 1 10
재발 0 3 3
정확도 (overall accuracy) 92.3%
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 뉴럴 네트워크 예측 모델 (Neural network prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 17, 18, 및 19과 같다. 표 17, 18, 및 19에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 59.46%이상이었다.
표 17. 총 폐암조직에 대한 뉴럴 네트워크 예측 모델 (Neural network prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 40 1 41
재발 18 1 19
정확도 (overall accuracy) 68.33%
표 18. 샘암종 조직에 대한 뉴럴 네트워크 예측 모델 (Neural network prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 14 1 15
재발 1 7 8
정확도 (overall accuracy) 91.3%
표 19. 편평세포암종 조직에 대한 뉴럴 네트워크 예측 모델 (Neural network prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 20 6 26
재발 9 2 11
정확도 (overall accuracy) 59.46%
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 디시전 트리 예측 모델 (Decision tree prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 20, 21, 및 22과 같다. 표 20, 21, 및 22에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 61.67%이상이었다.
표 20. 총 폐암조직에 대한 디시전 트리 예측 모델 (Decision tree prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 35 6 41
재발 17 2 19
정확도 (overall accuracy) 61.67%
표 21. 샘암종 조직에 대한 디시전 트리 예측 모델 (Decision tree prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 15 0 15
재발 8 0 8
정확도 (overall accuracy) 65.22%
표 22. 편평세포암종 조직에 대한 디시전 트리 예측 모델 (Decision tree prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 25 1 26
재발 2 9 11
정확도 (overall accuracy) 91.89%
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 서포트 벡 터 머신 예측 모델 (Support vector machine prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 23, 24, 및 25와 같다. 표 23, 24, 및 25에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 65%이상이었다.
표 23 총 폐암조직에 대한 서포트 벡터 머신 예측 모델 (Support vector machine prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 37 4 41
재발 17 2 19
정확도 (overall accuracy) 65%
표 24. 샘암종 조직에 대한 서포트 벡터 머신 예측 모델 (Support vector machine prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 15 0 15
재발 1 7 8
정확도 (overall accuracy) 95.65%
표 25. 편평세포암종 조직에 대한 서포트 벡터 머신 예측 모델 (Support vector machine prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 24 2 26
재발 1 10 11
정확도 (overall accuracy) 91.89%
폐암조직, 샘암종 및 편평세포암종에 대하여, 상기 테스트 세트를 나이브 베이즈 예측 모델 (Naive Bayes prediction model)을 사용하여 예측한 결과는 하기 표 26, 27, 및 28과 같다. 표 26, 27, 및 28에 나타낸 바와 같이, 예측 정확도는 58.33%이상이었다.
표 26. 총 폐암조직에 대한 나이브 베이즈 예측 모델 (Naive Bayes prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 26 15 41
재발 10 9 19
정확도 (overall accuracy) 58.33%
표 27. 샘암종 조직에 대한 나이브 베이즈 예측 모델 (Naive Bayes prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 15 0 15
재발 1 7 8
정확도 (overall accuracy) 95.65%
표 28. 편평세포암종 조직에 대한 나이브 베이즈 예측 모델 (Naive Bayes prediction model)을 사용한 예측한 결과
분류 예측 값 (predicted class) 계
비재발 재발
진실 값(true class) 비재발 24 2 26
재발 1 10 11
정확도 (overall accuracy) 91.89%
본 실시예에 사용된 예측 모델들은 통계적 분야에서는 통상적으로 사용되고 있는 모델들로 당업자라면 용이하게 선택하여 사용할 수 있는 것이다.
본 발명의 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법에 의하면, 폐암 제거 수출을 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 높은 정확도로 예측할 수 있다.
본 발명의 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법에 의하면, 폐암 제거 수출을 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 높은 정확도로 예측한 결과를 포함하는 보고서를 작성할 수 있다.
본 발명의 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서에 의하면, 폐암 제거 수출을 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 높은 정확도로 예측한 결과를 포함한다.
본 발명의 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이에 의하면, 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하는데 효율성을 높일 수 있다.

Claims (24)

  1. 폐암 환자로부터 생물학적 시료를 얻는 단계;
    상기 시료 중에서 표 1, 표 2 또는 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하여 상기 마커 유전자의 발현 수준에 대한 데이터를 얻는 단계; 및
    상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계;를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료를 얻는 단계는 폐암 조직을 적출하는 단계인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 1의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 샘암종이고, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 2의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피세포암이고, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 표 3의 마커 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는, 상기 마커 유전자로부터 유래된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준 또는 비재발 군의 발현 수준에 해당하는지를 결정하는 단계는, 통계적 예측 모델을 사용하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 예측 모델은 LDA 모델 (LDA model), QDA 예측 모델 (QDA prediction model), 뉴럴 네트워크 모델 (Neural Network model), 디시전 트 리 모델 (Decision Tree model), 서포트 벡터 머신 모델 (Support Vector Machine model), 및 나이브 베이즈 모델 (Naive Bayes model)로 이루어진 군으로부터 선택되는 통계적 예측 모델을 사용하는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 상기 마커 유전자의 발현 수준이 재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나는 경우, 비재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계 또는 상기 마커 유전자의 발현 수준이 비재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 차이가 나는 경우, 재발 군에 해당하는 것으로 결정하는 단계인 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 차이는 재발 군 또는 비재발 군의 발현 수준과 통계적으로 유의하게 높거나 낮은 p 값을 갖는 경우인 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 p 값은 0.05 미만인 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 발현 수준은 마이크로어레이 상에서 측정되는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 핵산 마이크로어레이인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 발현 수준은 상기 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 한 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의하여 수행된 핵산 증폭에 의하여 얻어진 증폭 산물의 양을 측정함으로써 결정되는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 발현 수준은 상기 마커 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 검출하는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질의 검출은 상기 단백질에 특이적인 항체에 의하여 검출되는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발의 위험을 예측하는 방법.
  17. 제1항에 따른 예측 결과를 표시하는 보고서를 작성하는 단계를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하 는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 보고서에는 시간에 따른 재발의 확률 값을 포함하는 것인 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서를 작성하는 방법.
  19. 제17항에 따른 방법에 의하여 작성된 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 환자의 폐암 재발 위험성에 대한 보고서.
  20. 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물.
  21. 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트를 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이에 고정화되어 있는 것인, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 키트.
  23. 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커 유전자에 대한, 센스 및 안티센스 프라이머 쌍을 포함하는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 키트.
  24. 표 1, 표 2 및 표 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자로부터 선택된 하나 이상의 프로브 또는 프로브 세트가 기판 상에 고정화되어 있는, 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 마이크로어레이.
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