CN117729942A - 用于增加靶向adam9的免疫缀合物治疗癌症的功效的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供治疗ADAM9表达水平增加的受试者的癌症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗ADAM9免疫缀合物。还提供一种增加用抗ADAM9免疫缀合物治疗ADAM9表达水平增加的受试者的癌症的功效的方法。

Description

用于增加靶向ADAM9的免疫缀合物治疗癌症的功效的方法

相关申请

本申请要求2021年3月8日提交的美国临时申请号63/157,954的优先权益，所述申请的整个内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及增加用ADAM9免疫缀合物治疗癌症的功效的方法，所述免疫缀合物包含与至少一种药理学剂缀合的能够特异性结合至“含有去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质9”(“ADAM9”)的抗体或其片段。更具体而言，本发明涉及用抗ADAM9免疫缀合物来更有效治疗易患癌症或诊断患有癌症的患者，其中如通过IHC测定来确定，肿瘤细胞过表达ADAM9。

背景技术

ADAM9为ADAM分子家族的成员。已发现ADAM9的表达与疾病，尤其是癌症相关。已发现ADAM9裂解并释放许多在肿瘤形成和血管生成中具有重要作用的分子，诸如TEK、KDR、EPHB4、CD40、VCAM1和CDH5。ADAM9由多种肿瘤细胞表达，包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、神经胶质瘤、肝癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌和前列腺癌的肿瘤细胞(Yoshimasu，T.等人(2004)“Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer CorrelatesWith Brain Metastasis”，Cancer Res.64：4190-4196；Peduto，L.等人(2005)“CriticalFunction For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer,”Cancer Res.65：9312-9319；Zigrino，P.等人(2005)“ADAM-9Expression And Regulation In Human Skin Melanoma AndMelanoma Cell Lines,”Int.J.Cancer 116:853-859；Fritzsche,F.R.等人(2008)“ADAM9Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With TumourProgression,”BMC Cancer 8:179:1-9；Fry,J.L.等人(2010)“Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9Have Opposing Effects On Breast Cancer CellMigration,”Cancer Res.70,8187-8198；Chang,L.等人(2016)“Combined Rnai TargetingHuman Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer,”Oncology Letters 11:1242-1250；Fan,X.等人(2016)“ADAM9 Expression Is Associatewith Glioma Tumor Grade and Histological Type,and Acts as a Prognostic Factorin Lower-Grade Gliomas,”Int.J.Mol.Sci.17:1276:1-11)。

值得注意的是，已发现ADAM9表达增加与肿瘤恶性程度和转移潜能呈正相关(Amendola,R.S.等人(2015)“ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human NeutrophilsThrough An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,”J.LeukocyteBiol.97(5):951-962；Fan,X.等人(2016)“ADAM9 Expression Is Associate with GliomaTumor Grade and Histological Type,and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas,”Int.J.Mol.Sci.17:1276:1-11；Li,J.等人(2016)“Overexpression ofADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion”,J.Invest.Surg.26(3):127-133)。此外，ADAM9和其分泌可溶性同种型似乎对癌细胞扩散至关重要(Amendola,R.S.等人(2015)“ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An AutocrineCircuit Involving Integrins And CXCR2”,J.Leukocyte Biol.97(5):951-962；Fry,J.L.等人(2010)“Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 HaveOpposing Effects On Breast Cancer Cell Migration”,Cancer Res.70,8187–8198；Mazzocca,A.(2005)“ASecreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion ThroughTumor-Stromal Interactions,”Cancer Res.65:4728-4738；还参见美国专利号9,150,656；7,585,634；7,829,277；8,101,361；和8,445,198号和美国专利公开号2009/0023149)。

因此，许多研究已将ADAM9确定为抗癌治疗的潜在靶标(Peduto，L.(2009)“ADAM9As A Potential Target Molecule In Cancer”，Curr.Pharm.Des.15：2282-2287；Duffy，M.J.等人(2009)“Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression”，Clin.CancerRes.15：1140-1144；Duffy，M.J.等人(2011)“The ADAMs Family Of Proteases：NewBiomarkers And Therapeutic Targets For Cancer？”，Clin.Proteomics 8：9：1-13；Josson，S.等人(2011)“Inhibition of ADAM9 Expression Induces EpithelialPhenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells toRadiation And Chemotherapy”，Prostate71(3)：232-240；还参见美国专利公开号2016/0138113、2016/0068909、2016/0024582、2015/0368352、2015/0337356、2015/0337048、2015/0010575、2014/0342946、2012/0077694、2011/0151536、2011/0129450、2010/0291063、2010/0233079、2010/0112713、2009/0285840、2009/0203051、2004/0092466、2003/0091568和2002/0068062以及PCT公开号WO 2016/077505、WO 2014/205293、WO 2014/186364、WO 2014/124326、WO 2014/108480、WO 2013/119960、WO 2013/098797、WO 2013/049704和WO 2011/100362)。另外，还发现ADAM9的表达与肺病和炎症相关(参见例妇美国专利公开号2016/0068909；2012/0149595；2009/0233300；2006/0270618；和2009/0142301)。抗ADAM9靶向抗体-药物缀合物(ADC)IMGC936当前处于评估癌症患者中的安全性和药代动力学的第I期剂量递增研究中。

然而，尽管存在所有先前进步，但仍非常需要更有效的用于治疗癌症的ADAM9靶向治疗剂和方法。

发明内容

本发明是基于肿瘤组织中ADAM9表达的动态范围的发现和ADAM9表达水平增加的肿瘤对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗作出更大反应的发现。本发明有利地允许治疗对通过向发现ADAM9表达水平增加的患者施用治疗剂，即，抗ADAM9免疫缀合物来进行的治疗作出反应的可能性更大的患者。

本发明还提供一种治疗癌症的方法或一种用于增加癌症治疗有效性的可能性的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的抗ADAM9免疫缀合物，其中发现受试者的组织样品中的ADAM9表达较高。

在一个实施方案中，ADAM9表达的程度和均匀性通过免疫组织化学(IHC)来检测。在另一个实施方案中，ADAM9表达水平通过校准IHC来检测。IHC的非限制性实例包括区分不同水平的ADAM9的IHC方法和诸如本文所述那些的校准IHC方法。ADAM9表达可使用合适评分系统，包括但不限于本文描述的评分方法来评分。例如，ADAM9表达可使用包括染色强度在0、1、2或3范围的校准IHC方法来评分，其中0为最低水平的染色强度并且3为最高水平的染色强度。在某些实施方案中，染色强度2或3评分指示较高ADAM9表达水平。在一些实施方案中，染色强度评分1被视为“较弱”染色；染色强度评分2被视为“中等”染色；并且染色强度评分3被视为“较强”染色。

替代地或另外地，ADAM9表达可使用包括表示为具有染色强度0、1、2或3的细胞百分比的染色均匀性的校准IHC方法来评分。例如，样品中的ADAM9表达水平可通过将染色强度与染色均匀性组合来评分，例如PS1、PS2或PS3。在某些实施方案中，25％或更大、50％或更大或75％或更大PS1的染色指示ADAM9表达水平的增加。在某些实施方案中，25％-49％、50％-74％或75％-100％PS1的染色指示ADAM9表达水平的增加。在一些实施方案中，25％或更大、50％或更大或75％或更大PS2的染色指示ADAM9表达水平的增加。在一些实施方案中，25％-49％、50％-74％或75％-100％PS2的染色指示ADAM9表达水平的增加。在一些实施方案中，25％或更大、50％或更大或75％或更大PS3的染色指示ADAM9表达水平的增加。在一些实施方案中，25％-49％、50％-74％或75％-100％PS3的染色指示ADAM9表达水平的增加。

在一些实施方案中，样品中的ADAM9表达水平被分配给肿瘤比例评分(TPS)。在某些实施方案中，具有大于或等于1％、大于或等于5％、大于或等于10％、大于或等于20％、大于或等于25％、大于或等于30％、大于或等于40％、大于或等于50％、大于或等于60％、大于或等于70％、大于或等于75％、大于或等于80％、大于或等于90％或大于或等于95％的TPS的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，具有大于或等于25％的TPS的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，具有大于或等于50％的TPS的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，具有大于或等于75％的TPS的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。

在一些实施方案中，样品中的ADAM9表达水平被分配给H评分，所述评分将染色强度的组件与样品中的阳性细胞百分比组合。在某些实施方案中，具有50与300之间的H评分的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，具有100与300之间的H评分的肿瘤样品指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，肿瘤样品在H评分为201与300之间的情况下具有高ADAM9表达水平。在某些实施方案中，肿瘤样品在H评分为101与200之间的情况下具有中等ADAM9表达水平。在某些实施方案中，肿瘤样品在H评分为1与100之间的情况下具有低ADAM9表达水平。

在另一实施方案中，测量样品(例如，肿瘤组织样品)中的ADAM9表达并将其与一个或多个参考样品相比较。在一个实施方案中，样品中的ADAM9表达与表现出无或低可检测ADAM9表达的阴性对照样品相比较。在另一个实施方案中，样品中的ADAM9表达与ADAM9表达增加(水平1、2或3)的阳性对照样品相比较。

在某些实施方案中，可用于本发明的方法中的抗ADAM9免疫缀合物包含抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段、接头和细胞毒素。在一个实施方案中，接头可选自由以下组成的组：可裂解接头、不可裂解接头、亲水性接头和基于二羧酸的接头。在另一个实施方案中，接头可选自由以下组成的组：N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)或N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基戊酸酯(磺基-SPP)；N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀酰亚氨基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚氨基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀酰亚氨基-4-(碘乙酰)-氨基苯甲酸酯(SIAB)；和N-琥珀酰亚氨基-[(N-马来酰亚氨基丙酰氨基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。在另一个实施方案中，接头为N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。在另一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：类美登素(maytansinoid)、类美登素类似物、苯二氮类紫杉醇、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、尾海兔素(dolastatin)、尾海兔素类似物、瑞奥西汀(auristatin)、茅屋霉素(tomaymycin)衍生物和来普霉素(leptomycin)衍生物或所述剂的前药。在另一实施方案中，细胞毒性剂为类美登素。在另一个实施方案中，细胞毒性剂为N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。在另一个实施方案中，细胞毒性剂为N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-l-氧代戊基)-美登素(DM4)。

在某些实施方案中，抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

或其药学上可接受的盐，其中：

CB为抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段；

L₂由下式中的一者表示：

其中：

R^x、R^y、R^x’和R^y’在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C_1-4烷基)、-SO₃H、-NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺或任选地被-OH、卤素、SO₃H或NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺取代的C_1-4烷基，其中R₄₀、R₄₁和R₄₂各自独立地为H或C_1-4烷基；

l和k各自独立地为1至10的整数；

L₁由下式表示：

–CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(＝O)-

其中R³和R⁴各自独立地为H或Me，并且L₁中的–C(＝O)-部分连接至D；

D由下式表示：

q为1至20的整数。

在某些实施方案中，本发明的抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或2；

D₁由下式表示：

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含分别具有序列SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中的X为赖氨酸。在一些实施方案中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中的X不存在。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，包含免疫缀合物的组合物(例如，药物组合物)的DAR值在1.0至2.5、1.5至2.5、1.8至2.2或1.9至2.1范围内。在一些实施方案中，DAR为1.8、1.9、2.0或2.1。

本发明还提供本发明的本文所述的免疫缀合物或药物组合物在治疗需要治疗的受试者的癌症的方法或增加需要治疗的受试者的癌症治疗功效的方法中的用途，其中来自受试者的肿瘤样品表现出ADAM9表达水平增加。本发明还提供本发明的本文所述的免疫缀合物或药物组合物在制造供治疗需要治疗的受试者的癌症或增加需要治疗的受试者的癌症治疗功效的药物中的用途，其中来自受试者的肿瘤样品表现出ADAM9表达水平增加。

在某些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤和淋巴癌。在某些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。在某些实施方案中，癌症为腺癌NSCLC、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌、胃癌或结直肠癌(CRC)。

附图说明

图1A为示出各种癌症的PDX模型中的ADAM9表达和反应的图表。图1B示出每种癌症类型中的ADAM9流行率数据。图1C示出三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌、胃癌和腺癌非小细胞肺癌(NSCLC)的每个PDX模型的ADAM9染色强度和H评分。

图2示出使用内部研究ADAM9测定的在胃癌、胰腺癌、腺癌非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、结直肠癌(CRC)和食管癌中的ADAM9流行率数据。

图3示出使用Roche组织诊断(RTD)ADAM9稳健原型测定(RPA)的在胃癌、胰腺癌、腺癌非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、结直肠癌(CRC)和食管癌中的ADAM9流行率数据。

图4A-4C为示出胃癌组织样品中的ADAM9表达的图表。图4A示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9 H评分。图4B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图4C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

图5A-5C为示出胰腺癌组织样品中的ADAM9表达的图表。图5A示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9 H评分。图5B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图5C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

图6A-6C为示出腺癌NSCLC组织样品中的ADAM9表达的图表。图6A示出阳性膜和细胞质染色的H评分。图6B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图6C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

图7A-7C为示出TNBC组织样品中的ADAM9表达的图表。图7A示出阳性膜和细胞质染色的H评分。图7B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图7C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

图8A-8C为示出CRC组织样品中的ADAM9表达的图表。图8A示出阳性膜和细胞质染色的H评分。图8B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图8C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

图9A-9C为示出食管癌组织样品中的ADAM9表达的图表。图9A示出阳性膜和细胞质染色的H评分。图9B示出阳性膜和细胞质染色的ADAM9肿瘤比例评分。图9C示出仅阳性膜染色的ADAM9肿瘤比例评分。

具体实施方式

本公开提供增加对特征在于ADAM9过表达的癌症的治疗的功效或反应可能性的方法。本发明是基于与正常组织相比肿瘤组织中ADAM9表达的动态范围的发现和ADAM9表达水平增加的肿瘤对于抗ADAM9免疫缀合物治疗作出更大反应的发现。

患有可能对抗ADAM9免疫缀合物作出反应的癌症的患者可通过以下来鉴别：(a)使包含来自所述癌症的细胞的生物样品与结合生物样品的ADAM9蛋白质的剂接触(例如，在细胞表面上和/或在细胞内部)；(b)检测结合(a)的所述生物样品的ADAM9蛋白质的所述剂的结合；(c)对步骤(b)的所述结合分配评分，其中所述评分基于与一个或多个参考样品的比较来分配；和(d)将步骤(c)中的所述评分与参考组织或细胞的评分相比较，其中所述癌症ADAM9水平的评分大于正常或低ADAM9表达参考样品的评分或所述癌症ADAM9水平的评分等于或大于高ADAM9表达参考样品的评分将所述癌症鉴别为可能对于抗ADAM9免疫缀合物作出反应。

对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗敏感的肿瘤可通过以下来鉴别：(a)测量从所述肿瘤获得的肿瘤组织样品中的ADAM9表达水平，其中所述测量包括使用与一个或多个参考样品中的染色强度或染色均匀性相比，区分ADAM9表达癌症样品中的染色强度或染色均匀性的检测方法；(b)确定所述肿瘤组织样品的ADAM9染色强度评分；和(c)将步骤(b)中确定的ADAM9染色强度评分与通过测量至少一个参考样品中的ADAM9蛋白质表达来确定的相对值相比较，其中所述至少一个参考样品为对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗不敏感的组织、细胞或细胞球团样品，并且其中步骤(b)中确定的所述样品的ADAM9染色强度评分高于所述相对值，将所述肿瘤鉴别为对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗敏感。在某些实施方案中，检测方法手动执行或使用自动化系统来执行。在一个实施方案中，检测方法为IHC。在另一个实施方案中，IHC为可区分不同水平的ADAM9表达的校准IHC。

I.定义

除非另外指示，否则如本文所用，术语“ADAM9”或“含有去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质9”是指任何原生人ADAM9。术语“ADAM9”涵盖“全长”未加工ADAM(以及在细胞内加工所产生的任何形式的ADAM9)。所述术语还涵盖ADAM9的天然存在的变体，例如拼接变体、等位基因变体和同种型。本文所述的ADAM9多肽可从多种来源，诸如从人组织类型或从另一来源分离，或通过重组或合成方法制备。ADAM9序列的实例包括但不限于NCBI参考编号NP_003807，以及在WO2018/119166、WO2018/119196和WO2020/005945中所描述的那些，所述专利均以引用方式并入本文。

术语“过表达”、“表达增加”或“表达升高”可互换使用。ADAM9表达增加是指样品含有升高水平的ADAM9表达。在一个实例中，ADAM9表达通过IHC来测量并且通过与展现限定评分的对照(例如，校准对照)相比较来给予染色强度评分和/或染色均匀性评分(例如，如果强度与水平3校准对照相当，则给予测试样品3的强度评分，或如果强度与水平2校准对照相当，则给予测试样品2的强度)。在一些实施方案中，在没有校准对照的情况下，染色强度评分通过病理学家基于他的/她的病理学训练和经验来确定。例如，通过免疫组织化学的评分1、2或3指示ADAM9表达增加。在某些实施方案中，评分2或3指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，具有染色强度3的样品中的细胞的存在指示ADAM9表达增加。染色均匀性还指示ADAM9表达增加。染色均匀性评分可为样品中具有相同染色强度的细胞的百分比。

染色强度和染色均匀性评分可单独或组合使用(例如，PS1、PS2、PS3等)。PS1(也称为PS1+)表示样品中具有1或更大(例如，2或3)染色强度的肿瘤细胞的百分比。PS2(也称为PS2+)表示样品中具有2或更大(例如，3)染色强度的肿瘤细胞的百分比。PS3(也称为PS3+)表示样品中具有3染色强度的肿瘤细胞的百分比。在一些实施方案中，1％-24％、25％-49％、50％-74％或75％-100％PS1的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，1％或更大、5％或更大、10％或更大、20％或更大、25％或更大、30％或更大、40％或更大、50％或更大、60％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大、90％或更大或95％或更大PS1的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，25％或更大PS1的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，50％或更大PS1的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS1的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，1％-24％、25％-49％、50％-74％或75％-100％PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，1％或更大、5％或更大、10％或更大、20％或更大、25％或更大、30％或更大、40％或更大、50％或更大、60％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大、90％或更大或95％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，25％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，50％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，1％-24％、25％-49％、50％-74％或75％-100％PS3的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，1％或更大、5％或更大、10％或更大、20％或更大、25％或更大、30％或更大、40％或更大、50％或更大、60％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大、90％或更大或95％或更大PS3的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，25％或更大PS3的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，50％或更大PS3的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS3的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，50％或更大PS1和25％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS1和25％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，50％或更大PS1和50％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS1和50％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，75％或更大PS1和75％或更大PS2的染色指示ADAM9表达增加。在一些实施方案中，具有大于或等于50％PS1的染色的样品被视为“ADAM9阳性”。本文描述的方法可用于通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗ADAM9免疫缀合物来治疗其肿瘤样品为ADAM9阳性的受试者。

在一些实施方案中，肿瘤比例评分(TPS)可用于指示阳性ADAM9表达或“ADAM表达增加”。TPS被计算为在任何强度下染色的样品中的活肿瘤细胞的百分比。在一些实施方案中，TPS针对膜和细胞质染色。在一些实施方案中，TPS仅针对膜染色。对于膜染色，TPS包括完全染色或部分染色两者。如本文所用，“完全”膜染色意指整个膜周围染色并且“部分”膜染色意指膜的顶端染色。在一些实施方案中，大于或等于1％、大于或等于5％、大于或等于10％、大于或等于20％、大于或等于25％、大于或等于30％、大于或等于40％、大于或等于50％、大于或等于60％、大于或等于70％、大于或等于75％、大于或等于80％、大于或等于90％或大于或等于95％的TPS被视为“ADAM阳性”或“ADAM9表达增加”。在一些实施方案中，大于或等于25％的TPS被视为“ADAM阳性”或“ADAM9表达增加”。在一些实施方案中，大于或等于50％的TPS被视为“ADAM阳性”或“ADAM9表达增加”。在一些实施方案中，大于或等于75％的TPS被视为“ADAM阳性”或“ADAM9表达增加”

在另一实例中，IHC染色结果通过H评分来分析，所述评分将染色强度的组件与阳性细胞百分比组合。其具有0与300之间的值并且被定义为：

1*(以强度类别1来染色的细胞的百分比)

+2*(以强度类别2来染色的细胞的百分比)

+3*(以强度类别3来染色的细胞的百分比)

＝H评分。

在一些实施方案中，当与例如来自没有癌症或患有不具有较高ADAM9表达的癌症的受试者的参考样品的H评分相比时，具有较高ADAM9表达的肿瘤具有更高H评分。

在一些实施方案中，患者样品中的ADAM9表达水平较高。在一些实施方案中，患者样品中的ADAM9表达水平中等。在一些实施方案中，患者样品中的ADAM9表达水平较低。如本文所用，具有201-300的H评分的样品被视为具有“较高”ADAM9表达水平。具有101-200的H评分的样品被视为具有“中等”ADAM9表达水平。具有1-100的H评分的样品被视为具有“较低”ADAM9表达水平。

在另一实例中，ADAM9表达的增加可通过检测到相对于对照值(例如，来自没有癌症或患有不具有较高ADAM9值的癌症的受试者的组织或细胞中的表达水平)的至少2倍、至少3倍或至少5倍增加来确定。

在一些实施方案中，如上所述的染色强度、染色均匀性和染色评分仅针对膜染色。在一些实施方案中，如上所述的染色强度、染色均匀性和染色评分针对细胞质染色。在一些实施方案中，如上所述的染色强度、染色均匀性和染色评分针对膜染色和细胞质染色的组合(cyto-membrane染色)。

“参考样品”可用于与在本发明的方法中由测试样品获得的结果相关联并与其进行比较。参考样品可为细胞(例如，细胞系、细胞球团)或组织。“参考样品”中的ADAM9水平可为ADAM9的绝对量或相对量、量的范围、最小量和/或最大量、平均量和/或中值量。本公开的诊断方法涉及测试样品中ADAM9的表达水平与“参考值”之间的比较。在一些实施方案中，参考值为参考样品中ADAM9的表达水平。参考值可为预定值并且还可由与测试样品并行测试的参考样品来确定(例如，对照生物样品或在没有对照生物样品的情况下由病理学家基于他的/她的病理学训练和经验来确定)。参考值可为单一截止值，诸如中值或平均值或值范围，诸如置信区间。参考值可针对不同个体亚组来确立，诸如易患癌症的个体、具有早期或晚期癌症的个体、男性和/或女性个体或经历癌症疗法的个体。在本文中描述了正常参考样品或值和阳性参考样品或值的实例。

在一些实施方案中，参考样品为来自健康组织，尤其不受癌症影响的相应组织的样品。这些类型的参考样品被称为阴性对照样品。在其他实施方案中，参考样品为来自表达ADAM9的肿瘤组织的样品。这些类型的参考样品被称为阳性对照样品。阳性对照样品还可用作均匀性(具有相同染色强度的细胞的细胞百分比)和/或与ADAM9表达水平相关的染色强度程度(1、2、3)的比较性指标。阳性对照比较样品还称为校准参考样品，其表现出染色强度或均匀性的动态范围。特定癌症的ADAM9的合适阳性和阴性参考水平可通过测量一个或多个合适受试者中的ADAM9水平来确定，并且这些参考水平可针对特定受试者群体来定制(例如，参考水平可经过年龄匹配以使得可针对某一年龄组中的特定疾病状态、表型或其缺乏，在某一年龄的受试者的样品中的ADAM9水平与参考水平之间进行比较)。这些参考水平还可针对用于测量生物样品中的ADAM9水平的特定技术(例如，免疫测定等)来定制，其中ADAM9水平可基于所使用的特定技术而不同。

本文中的术语“初级抗体”是指特异性结合至组织样品中的靶标蛋白质抗原的抗体。初级抗体通常为用于免疫组织化学(IHC)程序中的第一抗体。在一个实施方案中，初级抗体为用于IHC程序中的唯一抗体。本文中的术语“次级抗体”是指特异性结合至初级抗体，由此形成初级抗体与后续试剂(如果有的话)之间的桥接的抗体。次级抗体通常为用于免疫组织化学程序中的第二抗体。

本发明的“样品”或“生物样品”为生物来源，在特定实施方案中，诸如来自真核生物体。在优选的实施方案中，样品为人样品，但动物样品也可用于实践本发明。本发明尤其可用于癌症样品，通常包括固体组织样品。所述方法可用于检查ADAM9的表达方面或样品状态，包括但不限于比较不同类型的细胞或组织、比较不同发育阶段和检测或确定疾病或异常的存在和/或类型。

对于本文中的目的，组织样品的“切片”是指组织样品的单一部分或碎片，例如，从组织样品切割的组织或细胞薄片。应了解可获取组织样品的多个切片并且经受根据本发明的分析。在一些情况下，所选组织部分或切片包含均质细胞群体。在其他情况下，作为非限制性实例，所选部分包含组织区域，例如管腔。所选部分可小至一个细胞或两个细胞，或可代表例如数千个细胞。

术语“相关联(correlate/correlating)”意指以任何方式将第一分析的性能和/或结果与第二分析的性能和/或结果相比较。例如，可将第一分析的结果用于执行第二分析且/或可将第一分析的结果用于确定是否应执行第二分析且/或可将第一分析的结果与第二分析的结果相比较。在一个实施方案中，ADAM9表达增加与ADAM9靶向抗癌疗法的有效性可能性增加相关。

术语“抗体”意指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变结构域中的至少一个抗原识别位点来特异性结合至靶标诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体(antibody/antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、骆驼抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、胞内抗体和上述任一者的表位结合片段。具体而言，术语“抗体”包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有表位结合位点的分子。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类。抗体可为裸的或缀合至其他分子诸如毒素、放射性同位素等。

由于在此分子上存在特定结构域或部分或构型(“表位”)，抗体能够“免疫特异性结合”至多肽或蛋白质或非蛋白质分子。含有表位的分子可具有免疫原性活性，以使得其在动物中引起抗体生产反应；这些分子称为“抗原”。如果相对于替代性表位，如本文所用的抗体更频繁地、更迅速地、以更长持续时间和/或以更大亲和力与另一个分子的区域(即，表位)反应或缔合，则所述抗体被认为“免疫特异性”结合所述表位。例如，免疫特异性结合至病毒表位的抗体为与其免疫特异性结合至其他病毒表位或非病毒表位相比，以更大亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长持续时间来结合所述病毒表位的抗体。阅读此定义，还应理解例如免疫特异性结合至第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合至第二靶标。因此，“免疫特异性结合”至特定表位不一定要求(但其可包括)排他地结合至所述表位。通常，但不一定，提及结合意指“免疫特异性”结合。如果此结合表现出受体结合至其相应配体的特异性，则两个分子被认为能够以“生理特异性”方式彼此结合。

术语“单克隆抗体”是指均质抗体群体，其中单克隆抗体包含参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在或非天然存在)。单克隆抗体为高度特异性的，针对单一表位(或抗原位点)。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖其片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')₂Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包含具有所需特异性的抗原识别位点和结合至抗原的能力的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。所述术语不意图在抗体来源或其产生方式(例如，融合瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)方面受到限制。所述术语包括如上在“抗体”定义下所述的完整免疫球蛋白以及片段等。制备单克隆抗体的方法为本领域中已知的。可使用的一种方法为Kohler，G.等人(1975)“Continuous Cultures Of Fused CellsSecreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256:495-497的方法或其改进。通常，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔中发育。抗体通过用免疫原性量的含有所需表位的细胞、细胞提取物或蛋白质制剂免疫动物来产生。免疫原可为但不限于原代细胞、培养细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可在其用作免疫原之前培养一段时间(例如，至少24小时)。细胞可本身或与非变性佐剂诸如Ribi组合来用作免疫原(参见例如Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in AntibodyProduction”,ILAR J.37(3):119-125)。通常，当用作免疫原时，细胞应保持完整并且优选地为有活力的。与破裂细胞相比，完整细胞可允许抗原更好地通过免疫的动物来检测。使用变性或刺激性佐剂，例如，弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)，可使细胞破裂并因此为不鼓励的。免疫原可在定期间隔时间多次施用，诸如每两周或每周，或可以在动物(例如，组织重组体)中保持活力的方式施用。或者，可对现有单克隆抗体和对于所需病原性表位具有免疫特异性的任何其他等效抗体进行测序并且通过在本领域中已知的任何手段来重组产生。在一个实施方案中，对此抗体进行测序并然后将多核苷酸序列选殖至载体中以便表达或增殖。编码感兴趣抗体的序列可保持在宿主细胞的载体中并然后可将宿主细胞扩增并冷冻以便将来使用。此类抗体的多核苷酸序列可用于遗传操作以便产生亲和力优化的嵌合抗体、人源化抗体和/或犬类化抗体，从而改善本发明的抗体以及免疫缀合物的亲和力或其他特性。将抗体人源化的一般原则涉及保持抗体的抗原结合部分的基本序列，同时将抗体的非人剩余部分用人抗体序列交换。

天然抗体(诸如天然IgG抗体)由与两条“重链”复合的两条“轻链”组成。每个轻链含有可变结构域(“VL”)和恒定结构域(“CL”)。每个重链含有一个可变结构域(“VH”)、三个恒定结构域(“CH1”、“CH2”和“CH3”)和位于CH1结构域与CH2结构域之间的“铰链”区(“H”)。相比之下，scFv为通过经由短连接肽将轻链可变结构域和重链可变结构域连接在一起而制成的单链分子。

因此，天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本结构单元为具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常表达为约150,000Da的糖蛋白质。每个链的氨基末端(“N末端”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变结构域。每个链的羧基末端(“C末端”)部分界定恒定区，其中轻链具有单一恒定结构域并且重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，IgG分子的轻链的结构为n-VL-CL-c并且IgG重链的结构为n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中n和c分别表示多肽的N末端和C末端)。

术语“抗ADAM9抗体”或“结合ADAM9的抗体”是指能够以足够亲和力结合ADAM9以使抗体可用作靶向ADAM9的诊断剂和/或治疗剂的抗体。抗ADAM9抗体与无关非ADAM9蛋白质的结合程度是抗体与ADAM9的结合的小于约10％，如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合ADAM9的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。抗ADAM9抗体的实例为本领域中已知的并且公开于WO2018/119166、WO2018/119196和WO2020/005945中，所述专利以引用方式并入本文。结合至ADAM9的其他示例性抗体可购自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich和其他公司。可商购获得的抗ADAM9抗体的实例包括来自以下公司的抗ADAM9抗体：Cell Signaling Technology产品号2099和产品号4151、ThermoFisher产品号PA5-14338、产品号PA5-17080和产品号PA5-76732、Abcam ab186833、Sigma-Aldrich产品号HPA004000、GeneTex目录号GTX130025、LifeSpan BioSciences LS-C100638、LS-C502670和LS-C124856、Novus Biologicals目录号27120002、AffinityBiosciences目录号AF7559、CusaBio CSB-PA618774ESR2HU、ProSci目录号19-633和62-909、Biorbyt目录号orb229445和orb192735、Bioss目录号bs-4204R和bs-4304R-生物素、GBiosciences目录号ITA7379、Abbex目录号abx103793和Spring Bioscience抗ADAM9抗体(J12H2L3)。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、直链抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用并且是指能够通过特定抗体来识别和特异性结合的抗原的部分。当所述抗原为多肽时，表位可由连续氨基酸和通过蛋白质的三重折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性后得以保留，而通过三重折叠来形成的表位通常在蛋白质变性后丧失。表位通常包含呈独特空间构型的至少3个和更通常至少5个或8-10个氨基酸。

“结合亲和力”是指在分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的通用方法来测量，所述方法包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的各种方法为本领域中已知的，其中任一者可用于本发明的目的。下文描述了特定说明性实施方案。

如本文所用，术语“免疫缀合物”或“缀合物”是指连接至细胞结合剂(即，抗ADAM9抗体或其片段)的化合物或其衍生物并且通过通式C-L-A来定义，其中C＝细胞毒素，L＝接头，并且A＝细胞结合剂或抗ADAM9抗体或抗体片段。免疫缀合物还可通过呈逆序的通式A-L-C来定义。

“接头”为能够以稳定、共价方式将化合物(通常为药物，诸如类美登素)连接至细胞结合剂(诸如抗ADAM9抗体或其片段)的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可对酸诱导裂解、光诱导裂解、肽酶诱导裂解、酯酶诱导裂解和二硫键裂解敏感或基本上对其有抵抗力。合适接头为本领域中熟知的并且包括例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。接头还包括带电荷接头和其亲水性形式，如本文描述并在本领域中已知。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述细胞群体的特征在于不受调控的细胞生长的哺乳动物中的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。在一些实施方案中，癌症的实例包括非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。在一些实施方案中，癌症的实例包括腺癌NSCLC、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌、胃癌或结直肠癌。

“肿瘤”和“赘生物”是指由于过度细胞生长或增殖导致的任何组织肿块，其为良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前期病变。

术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法等效物是指来源于肿瘤或癌前期病变的总细胞群体，包括构成大部分肿瘤细胞群体的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞(癌症干细胞)两者。如本文所用，当仅涉及缺少更新和分化的能力的那些肿瘤细胞时，术语“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤性”来修饰，以便区分那些肿瘤细胞与癌症干细胞。

术语“受试者”是指成为特定治疗的接受者的任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物和其类似动物。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中关于人受试者时可互换使用。

术语“药物制剂”是指以下制剂：其呈允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分。此制剂可为无菌的。

如本文公开的抗体或抗体免疫缀合物的“有效量”为足以执行具体规定用途的量。

术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病或病症的抗体、抗体免疫缀合物或其他药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓并在某一实施方案中停止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并在某一实施方案中停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓和与癌症相关的一个或多个症状。参见本文中的“治疗”的定义。在所述药物可预防现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，其可为细胞抑制性和/或细胞毒性的。

术语“有利地作出反应”通常是指在受试者中引起有益状态。关于癌症治疗，所述术语是指对受试者提供治疗效果。癌症中的积极治疗效果可以许多方法来测量(参见W.A.Weber,J.Nucl.Med.50:1S-10S(2009))。例如，肿瘤生长抑制、分子标志物表达、血清标志物表达和分子成像技术全部都可用于评估抗癌治疗剂的治疗功效。关于肿瘤生长抑制，根据NCI标准，<42％的T/C为抗肿瘤活性的最低水平。<10％的T/C被视为高抗肿瘤活性水平，其中T/C(％)＝经过治疗的人的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积x100。癌症治疗的其他有利反应可包括增加的无进展存活(PFS)、无疾病存活(DFS)或总体存活(OS)、完全反应(CR)、部分反应(PR)或在一些情况下稳定疾病(SD)、进行性疾病(PD)减少、进展时间(TTP)减少。

当在本文中使用时，措词“标记物”是指直接或间接地缀合至抗体以便产生“标记的”抗体的可检测化合物或组合物。标记物可本身为可检测的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)或在酶性标记物的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

术语诸如“治疗(treating/treatment/to treat)”或“减轻(alleviating/toalleviate)”是指1)治愈所诊断的病理病状或病症、减缓所述病状或病症、减轻所述病状或病症的症状和/或停止所述病状或病症的进展的治疗性措施和2)防止和/或减缓靶向病理病状或病症的发展的预防或防范措施两者。因此，需要治疗的那些包括已经患有病症的那些；倾向于患有病症的那些；和病症待预防的那些，在某些实施方案中，如果患者显示出以下一者或多者，则受试者根据本发明的方法成功地“治疗”癌症：恶病体质减少、存活时间增加、肿瘤进展时间延长、肿瘤质量减少、肿瘤负荷减少和/或肿瘤转移时间、肿瘤复发时间延长、肿瘤反应、完全反应、部分反应、稳定疾病、进行性疾病、无进展存活(PFS)、总体存活(OS)，其各自通过如国家癌症研究院(National Cancer Institute)和美国食品药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)对于批准新药物所设定的标准来测量。参见Johnson等人,(2003)J.Clin.Oncol.21(7):1404-1411。

“无进展存活”(PFS)也被称为“肿瘤进展时间”(YIP)，指示在治疗期间和之后，癌症不生长的时间长度。无进展存活可包括患者已经历完全反应或部分反应的时间量以及患者已经历稳定疾病的时间量。

“完全反应”或“完全缓解”或“CR”指示肿瘤或癌症的所有体征响应于治疗而消失。这并不总是意指癌症已治愈。

如本文所用，“部分反应”或“PR”是指响应于治疗，一种或多种肿瘤或病变的大小或体积或身体中癌症的程度减少。

“稳定疾病”是指不存在进展或复发的疾病。在稳定疾病中，既没有足够肿瘤缩小以便符合部分反应，也没有足够肿瘤增加以便可充当进行性疾病。

“进行性疾病”是指出现一个或多个新病变或肿瘤和/或现有非靶标病变的明确进展。进行性疾病也可是指从治疗开始，由于肿瘤的质量或扩散增加而导致肿瘤生长超过20％。

“无疾病存活”(DFS)是指在治疗期间和之后，患者保持无疾病的时间长度。

“总体存活”(OS)是指与原始或未治疗个体或患者相比，预期寿命延长。

如本文所用，“烷基”是指一个至二十个碳原子的饱和直链或支链一价烃基团。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH₂CH(CH₃)₂)、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基和其类似基团。优选地，烷基具有一个至十个碳原子。更优选地，烷基具有一个至四个碳原子。

基团中碳原子的数目可在本文中由字首“C_x-xx”来指定，其中x和xx为整数。例如，“C_1-4烷基”为具有1至4个碳原子的烷基。

术语“化合物”或“细胞毒性化合物”或“细胞毒性剂”可互换使用。其意图包括其结构或式或任何衍生物已在本发明中得以公开或其结构或式或任何衍生物已以引用方式并入的化合物。所述术语还包括本发明公开的所有分子式的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物和盐(例如，药学上可接受的盐)。所述术语还包括前述任一者的任何溶剂化物、水合物和多晶型物。在本申请描述的本发明的某些方面中具体叙述“立体异构体”、“几何异构体”、“互变异构体”、“溶剂化物”、“代谢物”、“盐”、“缀合物”、“缀合物盐”、“溶剂化物”、“水合物”或“多晶型物”不应理解为在使用术语“化合物”而不叙述这些其他形式的本发明的其他方面中有意遗漏这些形式。

术语“手性”是指分子具有镜像配偶体的不可重叠特性，而术语“非手性”是指分子在其镜像配偶体上可重叠。

术语“立体异构体”是指如下化合物，其具有相同化学构造和连接性，但是其原子在空间中的不同取向不能通过围绕单一键旋转来互相转化。

“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可在诸如结晶、电泳和色谱的高分辨率分析程序下分离。

“对映异构体”是指化合物的彼此为不可重叠镜像的两个立体异构体。

本文所用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker编,McGraw-Hill,Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork,1994。本发明化合物可含有不对称或手性中心，并且因此以不同立体异构形式存在。预期本发明化合物的所有立体异构形式形成本发明的一部分，所述形式包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体、以及其混合物诸如外消旋混合物。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，其具有使平面偏振光的平面旋转的能力。在描述光学活性化合物时，字首D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。字首d和l或(+)和(-)是用于指定平面偏振光被化合物旋转的标志，其中(-)或l意指化合物为左旋的。字首为(+)或d的化合物为右旋的。针对给定化学结构，这些立体异构体为相同的，只不过其彼此为镜像。特定立体异构体也可称为对映异构体，并且此类异构体的混合物常常称为对映异构混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或制程中不存在立体选择或立体特异性时存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种对映异构体质的等摩尔浓度混合物，其缺乏光学活性。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可经由低能障来互相转化的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子移变互变异构体)包括经由质子的迁移进行的互相转化，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些键结电子的重组进行的互相转化。

术语“阳离子”是指具有正电荷的离子。阳离子可为一价(例如，Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺等)、二价(例如，Ca²⁺、Mg²⁺等)或多价(例如，Al³⁺等)。优选地，阳离子为一价。

如本文所用，词组“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性盐包括但是不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐“甲磺酸盐”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即，1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸))盐、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可涉及包含另一种分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可为使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个带电荷原子。多个带电荷原子为药学上可接受的盐的一部分的实例可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电荷原子和/或一个或多个抗衡离子。

如果本发明化合物为碱，则所需药学上可接受的盐可通过在本领域中可获得的任何合适方法来制备，例如用无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸和其类似酸，或用有机酸，诸如乙酸、马来酸、丁二酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸、α羟基酸诸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸诸如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸诸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸诸如对甲苯磺酸或乙磺酸或类似酸来处理游离碱。

如果本发明化合物为酸，则所需药学上可接受的盐可通过任何合适方法来制备，例如用无机碱或有机碱，诸如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等来处理游离酸。合适盐的说明性实例包括但不限于衍生自氨基酸诸如甘氨酸和精氨酸、氨、伯胺、仲胺和叔胺和环胺诸如哌啶、吗啉和哌嗪的有机盐，和衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。

如本文所用，术语“溶剂化物”意指还包括化学计算量或非化学计算量的通过非共价分子间力来结合的溶剂的化合物，所述溶剂诸如水、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇等。化合物的溶剂化物或水合物通过向化合物添加至少一摩尔当量的羟基溶剂诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水以便导致亚胺部分的溶剂化或水合来容易地制备。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸由NH₂-C(R^aa’R^aa)-C(＝O)OH表示，其中R^aa和R^aa’各自独立地为H，具有1至10个碳原子的任选地被取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，芳基，杂芳基或杂环基，或者R^aa和N末端氮原子可一起形成杂环(例如，如在脯氨酸中)。术语“氨基酸残基”是指当一个氢原子从氨基酸的胺末端移除且/或羟基从氨基酸的羧基末端移除的相应残基，诸如-NH-C(R^aa’R^aa)-C(＝O)-。当氨基酸或氨基酸残基在不指示α碳的特定立体化学的情况下提及时，其意图包括L-异构体和R-异构体两者。例如，“Ala”包含L-丙氨酸和R-丙氨酸两者。

术语“肽”是指通过肽(酰胺)键来连接的氨基酸单体的短链。在一些实施方案中，肽含有2至20个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽含有2至10个氨基酸残基。在其他实施方案中，肽含有2至5个氨基酸残基。如本文所用，当肽为通过特定氨基酸序列表示的本文所述的细胞毒性剂或接头的一部分时，肽可在两个方向上连接至细胞毒性剂或接头的其余部分。例如，二肽X1-X2包括X1-X2和X2-X1。类似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3和X3-X2-X1，并且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4和X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3和X4表示氨基酸残基。当肽或肽残基在不指示每个氨基酸或氨基酸残基的立体化学的情况下提及时，其意图包括L-异构体和R-异构体两者。然而，当肽或肽残基中的一个或多个氨基酸或氨基酸残基的立体化学被指定为D-异构体时，未指定立体化学的肽或肽残基中的另一个氨基酸或氨基酸残基意图仅包括天然L-异构体。例如，“Ala-Ala-Ala”意图包括Ala中的每一者可为L-异构体或R-异构体的肽或肽残基；而“Ala-D-Ala-Ala”意图包括L-Ala-D-Ala-L-Ala。

如本文所用，药物-抗体比率(DAR)为共价连接至一个抗体分子的细胞毒性剂的平均数目(即，q的平均值)。

除非上下文另有明确规定，否则如在本公开和权利要求中所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。

应理解，当在本文中用语言“包含”描述每个实施方案时，还提供以术语“由...组成”和/或“实质上由...组成”描述的其他相似实施方案。

如本文中的词组诸如“A和/或B”中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”两者。同样地，如在词组诸如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

II.生物样品

生物样品经常用固定剂来固定。通常使用醛固定剂诸如福尔马林(甲醛)和戊二醛。使用其他固定技术诸如乙醇(alcohol)浸泡(Battifora和Kopinski,J.Histochem.Cytochem，(1986)34:1095)来固定的组织样品也是合适的。所用样品还可包埋于石蜡中。在一个实施方案中，组织样品均是福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的。在另一个实施方案中，在选择一个或多个部分用于分析之前，对FFPE块进行苏木精和伊红染色，以便选择FFPE核心样品的特定区域。由这些颗粒样本制备组织块的方法已用于各种预后因子的先前IHC研究中，且/或为本领域技术人员熟知的。(参见例如Abbondanzo等人Am J ClinPathol,1.990年5月；93(5):698-702；Aflred等人,Arch Surg.1990年1月；125(1):107-13)。

简言之，可将任何完整器官或组织切割成相当较小碎片并在各种固定剂(例如福尔马林、乙醇等)中孵育不同时段直到组织“固定”为止。样品可实际上为从体内手术移除的任何完整组织。可将样品切割成适合于在组织病理学实验室中常规使用的设备的适当较小碎片。切割碎片的大小通常在几毫米至几厘米范围内。

III.检测抗体缀合物

在一些实施方案中，将通常单克隆类型的针对ADAM9的抗体连接到至少一种剂以便形成检测抗体缀合物。为了增加抗体分子作为诊断剂的功效，按照惯例，连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。此分子或部分可为但不限于至少一种报导分子。报导分子被定义为可使用测定来检测的任何部分。已缀合至抗体的报导分子的非限制性实例包括酶、放射性标记物、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒和/或配体诸如生物素。

具有足够选择性、特异性或亲和力的任何细胞结合剂(例如，抗体或多肽)可用作检测ADAM9多肽的基础。此类性质可使用为本领域技术人员已知的常规免疫筛选方法来评估。除了标准抗原结合位点以外，结合至抗体分子中的生物活性分子的位点包括驻留于可结合抗原的可变结构域中的位点。另外，可变结构域参与抗体自身结合(Kang等人,1988)并且含有通过抗抗体来识别的表位(独特位)(Kohler等人,1989)。

蛋白质结合(例如，抗体)缀合物的某些实例为蛋白质结合剂(例如，抗体)连接至可检测标记物的那些缀合物。“可检测标记物”为由于其特定功能性质和/或化学特性而可检测的化合物和/或元素，其使用允许其所附接的抗体得以检测，且/或如果需要，则进一步定量。

许多合适成像剂与用于将其附接至抗体的方法一样为本领域中已知的(参见例如美国专利号5,021,236；4,938,948；和4,472,509，其各自以引用方式并入本文)。所用成像部分可为例如顺磁性离子；放射性同位素；荧光染料；NMR可检测物质；和/或X射线成像。

预期作为蛋白质结合(例如，抗体)缀合物来使用的示例性荧光标记物包括例如Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、Dylight 488、异硫氰酸荧光素、绿色荧光蛋白质(GFP)、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、藻红蛋白质、REG、罗丹明绿(Rhodamine Green)、罗丹明红(Rhodamine Red)、四甲基罗丹明(TMR)、泛影酶原(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明、得克萨斯红(Texas Red)和这些标记物的衍生物(即卤化类似物，其用异硫氰酸酯或用于结合的其他接头等来修饰)。示例性放射性标记物为氚。

可用于本发明中的蛋白质结合(例如，抗体)检测缀合物包括在活体外使用的那些，其中抗体连接至次级结合配体和/或酶(酶标签)，所述酶在与显色底物接触后产生有色产物。合适酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和/或葡萄糖氧化酶。优选的次级结合配体为生物素和/或抗生物素蛋白质和链霉抗生物素蛋白质化合物。此类标记物的用途为本领域技术人员熟知的并且描述于例如美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241；所述专利各自以引用方式并入本文。

经由通过低强度紫外线产生的反应性氮烯中间物，含有叠氮基的分子还可用于形成与蛋白质的共价键(Potter&Haley,1983)。具体而言，嘌呤核苷酸的2-叠氮基和8-叠氮基类似物已用作定点光探针以便鉴别粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白质(Owens&Haley,1987；Atherton等人,1985)。2-叠氮基和8-叠氮基核苷酸也已用于定位纯化蛋白质的核苷酸结合结构域(Khatoon等人,1989；King等人,1989；和Dholakia等人,1989)并可用作抗体结合剂。

用于将抗体附接或缀合至其结合部分的多种方法为本领域中已知的。一些附接方法涉及使用金属螯合物络合物，其使用附接至抗体的例如有机螯合剂，诸如二乙三胺五乙酸酐(DTP A)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲-3(美国专利号4,472,509和4,938,948，其各自以引用方式并入本文)。单克隆抗体还可在偶合剂诸如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。具有荧光素标志物的蛋白质结合(例如，抗体)缀合物在这些偶合剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利号4,938,948中，例如乳腺肿瘤的成像使用单克隆抗体来实现，并且可使用接头诸如甲基-对羟基苯甲亚氨酸酯或N-琥珀酰亚氨基-3-(4-羟苯基)-丙酸酯，将可检测成像部分结合至抗体。

在其他实施方案中，预期通过使用不改变抗体组合位点的反应条件在免疫球蛋白的Fc区中选择性地引入巯基来将免疫球蛋白衍生化。公开根据此方法产生的抗体缀合物表现出改进的寿命、特异性和灵敏度(美国专利号5,196,066，其以引用方式并入本文)。也在文献(O'Shannessy等人,1987)中公开效应分子或报导分子的位点特异性附接，其中报导分子或效应分子缀合至Fc区中的碳水化合物残基。

在其他实施方案中，免疫球蛋白用核素诸如氚来放射性标记。在另外实施方案中，使用纳米金颗粒(诸如约0.5nm-40nm的大小)和/或量子点(Hayward,Calif.)。

IV.酶和底物(色原)

底物和指示剂可用于检测ADAM9，诸如下文提供的示例性实施方案。

辣根过氧物酶(HRP)为首先与过氧化氢形成复合物并且然后导致其分解，由此产生水和原子氧的酶。与许多其他酶一样，HRP和一些HRP样活性可通过过量底物来抑制。在HRP与过量过氧化氢之间形成的复合物为无催化活性的并且在不存在电子供体(例如，显色物质)时可逆地受到抑制。过量过氧化氢和不存在电子供体导致内源HRP活性猝灭。

当用于测定系统中时，HRP也可用于将规定底物转化成其活化色原，由此导致变色。HRP酶可通过许多方法来缀合至抗体、蛋白质、肽、聚合物或其他分子。此类方法为本领域中已知的。将戊二醛添加至含有HRP与抗体的混合物的溶液中会导致更多抗体分子彼此缀合，而非与酶缀合。在两步骤程序中，HRP首先与双官能试剂反应。在第二阶段中，仅活化HRP与抗体混合，导致更加有效得多的标记并且没有聚合。使用两步骤戊二醛程序，HRP也缀合至(链霉)抗生物素蛋白质。此形式用于例如其中LAB和LSAB为底物的程序中。与生物素缀合还涉及两个步骤，因为生物素必须首先衍生为生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺酯或生物素酰肼，然后可使其与HRP酶的ε氨基反应。

3,3'-二氨基联苯胺(DAB)为诸如HRP的酶的底物，其产生非常不溶于乙醇和其他有机溶剂中的棕色最终产物。DAB的氧化也导致聚合，由此产生与四氧化锇反应的能力，并且由此增加其染色强度和电子密度。在用于强化聚合DAB的光密度的若干金属和方法中，氯化金与硫化银的组合似乎为最成功的。

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)为诸如HRP的酶的底物。在氧化后，形成可溶于乙醇中的玫瑰红最终产物。因此，用AEC处理的样本不能浸没于乙醇或乙醇溶液(例如，Harris苏木精)中。相反，应使用水性复染剂和封固剂。AEC不幸地对于进一步氧化敏感并且在暴露于过量光时，强度减弱。因此建议在黑暗中储存。

4-氯-1-萘酚(CN)为诸如HRP的酶的底物并且沉淀为蓝色最终产物。因为CN可溶于乙醇和其他有机溶剂中，所以样本不能脱水，暴露于乙醇复染剂，或使用含有有机溶剂的封固剂来盖片。不同于DAB，CN倾向于从沉淀部位扩散。

对苯二胺二盐酸盐/邻苯二酚(Hanker-Yates试剂)为诸如HRP的酶的电子供体底物并且给出不溶于乙醇和其他有机溶剂中的深蓝色反应产物。与聚合DAB一样，此反应产物可用锇酸染色(osmicated)。在免疫过氧化物酶技术中已用Hanker-Yates试剂实现不同结果。

牛小肠碱性磷酸酶(AP)(分子量100kD)为通过破坏P-0键来将磷酸酯基团从有机酯移除(通过水解)并转移的酶；暂时地形成中间酶-底物键。AP的主要金属活化剂为Mg²⁺、Mn²⁺和Ca²⁺。

AP尚未广泛用于免疫组织化学中直到公布未标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)程序为止。用于此程序中的可溶性免疫复合物具有大约560kD的分子量。与PAP技术相比，APAAP程序的主要优点为不存在由内源性过氧化物酶活性造成的干扰。因为内源性过氧化物酶活性对于PAP染色的潜在干扰，所以推荐APAAP技术用于血液和骨髓涂片。来自骨骼、肾脏、肝脏和一些白血球的内源性碱性磷酸酶活性可通过将1mM左旋咪唑添加至底物溶液来抑制，但已发现5mM更有效。小肠碱性磷酸酶未被左旋咪唑充分抑制。

在免疫碱性磷酸酶染色法中，所述酶将萘酚磷酸酯(底物)水解成酚类化合物和磷酸酯。酚类偶合至无色重氮盐(色原)以便产生不溶性的有色偶氮染料。已成功使用底物和色原的多种不同组合。

萘酚AS-MX磷酸酯可以其酸形式或作为钠盐来使用。色原Fast Red TR和FastBlue BB分别产生亮红色或蓝色最终产物。两者可溶于乙醇和其他有机溶剂中，因此必须使用水性封固剂。当染色细胞涂片时，Fast Red TR为优选的。

附加示例性底物包括萘酚AS-BI磷酸酯、萘酚AS-TR磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸酯(BCIP)。其他可能色原包括例如Fast RedLB、Fast Garnet GBC、硝基四氮唑蓝(NBT)、碘硝基四氮唑紫(INT)和所述结构的衍生物。

V.免疫检测方法

在更进一步实施方案中，抗体可用于检测野生型和/或突变体配体蛋白质、多肽和/或肽。野生型和/或突变体配体特异性抗体可用于本发明的方法中。仅举几个实例，一些免疫检测方法包括流动式细胞测量术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和西方墨点法。各种可用免疫检测方法的步骤已描述于科技文献中，诸如例如Doolittle M H和Ben-Zeev O,Methods MolBiol.1999；109:215-37；Gulbis B和Galand P,Hum Pathol.1993Dec；24(12):1271-85；和De Jager R等人,Semin Nucl Med.1993Apr；23(2):165-79，所述文献各自以引用方式并入本文。

通常，免疫结合方法包括获得疑似包含配体蛋白质、多肽和/或肽的样品，并且根据本发明，视情况而定在有效允许形成免疫复合物的条件下，将样品与第一配体结合肽(例如，抗配体抗体)接触。

在抗原检测方面，所分析的生物样品可为疑似包含野生型或突变体配体蛋白质特异性抗原的任何样品，诸如组织切片或样本、均化组织提取物、生检吸出物、细胞、上述含有野生型或突变体ADAM9组合物中任一者的分离和/或纯化形式或甚至与组织接触的任何生物流体，包括血液和/或血清，但组织样品或提取物为优选的。

在有效条件下且持续足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时段，将所选生物样品与抗体接触通常是大约仅将抗体组合物添加至样品并孵育混合物持续足够长以便抗体与所存在的任何配体蛋白质抗原形成免疫复合物，即，结合至所述抗原的时段。在此时间之后，通常将洗涤样品-抗体组合物，诸如组织切片、ELISA板、斑点印迹或西方墨点，以便移除任何非特异性结合的抗体物质，从而仅允许检测特异性结合在初级免疫复合物内的那些抗体。

通常，免疫复合物形成的检测为本领域中熟知的并且可通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于标记物或标志物，诸如任何那些放射性、荧光、生物和酶性标签的检测。关于此类标记物的用途的美国专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，所述专利各自以引用方式并入本文。当然，可发现通过使用次级结合配体诸如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白质配体结合布置的附加优势，如在本领域中已知。

用于检测的抗配体抗体可本身连接至可检测标记物，其中然后仅检测此标记物，由此允许确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，结合在初级免疫复合物内的第一抗体可藉助于针对所述抗体具有结合亲和力的第二结合剂来检测。在这些情况下，第二结合剂可连接至可检测标记物。第二结合剂本身通常为抗体，其因此可称为“次级”抗体或聚合物检测系统。在有效条件下且持续足以允许形成次级免疫复合物的时段，使初级免疫复合物与标记的次级结合剂或抗体/聚合物检测系统接触。然后，通常洗涤次级免疫复合物，以便移除任何非特异性结合的标记次级抗体或配体，并且然后检测次级免疫复合物中的剩余标记物。

其他方法包括通过两步法来检测初级免疫复合物。针对所述抗体具有结合亲和力的第二结合剂(诸如抗体)用于形成次级免疫复合物，如上所述。洗涤后，再次在有效条件下且持续足以允许形成免疫复合物(第三免疫复合物)的时段，使次级免疫复合物与针对第二抗体具有结合亲和力的第三结合剂或抗体接触。第三配体或抗体连接至可检测标记物，允许检测由此形成的第三免疫复合物。如果需要，此系统可提供信号扩增。

在另一个实施方案中，生物素化单克隆或多克隆抗体用于检测靶标抗原，并且然后第二步骤抗体用于检测附接至复合生物素的生物素。在所述方法中，待测试的样品首先在包含第一步骤抗体的溶液中孵育。如果靶标抗原存在，一些抗体结合至所述抗原以形成生物素化抗体/抗原复合物。然后，抗体/抗原复合物通过在链霉抗生物素蛋白质(或抗生物素蛋白质)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中孵育来扩增，其中每个步骤将附加生物素位点添加至抗体/抗原复合物。重复扩增步骤直到实现合适扩增水平为止，在此时间点将样品在包含针对生物素的第二步骤抗体的溶液中孵育。此第二步骤抗体如例如用酶来标记，所述酶可用于通过使用色原底物的组织酶学来检测抗体/抗原复合物的存在。通过合适扩增，可产生宏观可见的蛋白质结合(例如，抗体)缀合物。

另一种已知的免疫检测方法利用免疫-PCR(聚合酶链反应)方法。PCR方法使用通过释放抗体的低pH或高盐缓冲液来冲洗的DNA/生物素/链霉抗生物素蛋白质/抗体复合物。然后，使用所得洗涤溶液以通过具有合适控制的合适引子来执行PCR反应。在特定实施方案中，PCR的巨大扩增能力和特异性可用于检测单一抗原分子。此检测可实时发生。例如，涵盖使用定量实时PCR。

在患有各种疾病形式的患者的临床诊断和/或监测中，与来自正常受试者的对应生物样品中的水平相比，检测到ADAM9突变体和/或ADAM9水平的改变，指示患者患有所述疾病。然而，如为本领域技术人员已知，此临床诊断不一定孤立地基于此方法来进行。本领域技术人员非常熟悉对生物标志物的类型和/或量的显著差异的区分，所述差异代表生物标志物的阳性鉴别和/或低水平和/或背景变化。事实上，背景表达水平通常用于形成“截止值，高于所述值的检测增加将被评定为显著和/或阳性的。

在一个实施方案中，将ADAM9的免疫检测(通过免疫组织化学)针对强度和均匀性来评分(染色细胞的百分比-仅膜、仅细胞质或膜与细胞质的组合)。ADAM9表达强度的比较量表涉及0-阴性、0-1-极弱、1-弱、1-2-弱至中度、2-中度、2-3-中度至强烈、3-强烈。数量上，评分0表示在肿瘤细胞中未观察到染色(例如，仅膜、仅细胞质或膜与细胞质的组合)。评分1表示在肿瘤细胞中微弱/几乎不可察觉的染色(例如，仅膜、仅细胞质或膜与细胞质的组合)。对于评分2，在肿瘤细胞中观察到中度染色(例如，仅膜、仅细胞质或膜与细胞质的组合)。最后，评分3表示肿瘤细胞中的强烈染色(例如，仅膜、仅细胞质或膜与细胞质的组合)。

VI.ADAM9结合剂

结合ADAM9的任何抗体可用于本发明的检测方法中。治疗上有效的抗ADAM9抗体的实例可发现于WO2018/119196和WO2020/005945中，所述专利以引用方式并入本文。结合至ADAM9的抗体还可购自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich和其他公司。ADAM9的全长氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列为本领域中已知的并且也在本文中提供。用于检测ADAM9的特别有用抗体为兔单克隆抗体(Cell Signaling Technologies#41515)。

VII.抗ADAM9免疫缀合物

本发明还包括用于增加缀合物(在本文中也称为免疫缀合物)的功效的方法，所述缀合物包含抗ADAM9抗体、抗体片段、功能等效物、改进抗体和其连接或缀合至细胞毒素(药物)或前药的如本文公开的方面。示例性ADAM9免疫缀合物可发现于WO2018/119196和WO2020/005945中，所述专利以引用方式并入本文。

合适药物或前药为本领域中已知的。在某些实施方案中，药物或前药为细胞毒性剂。用于本发明的细胞毒性缀合物中的细胞毒性剂可为导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以某种方式减少细胞活力的任何化合物，并且包括例如类美登素和类美登素类似物、苯二氮类紫杉醇、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、烯二炔诸如卡奇霉素、尾海兔素和尾海兔素类似物包括瑞奥西汀、茅屋霉素衍生物、来普霉素衍生物、胺甲蝶呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春花碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和吗啉基多柔比星。在某些实施方案中，细胞毒性剂为类美登素和类美登素类似物。

在一些实施方案中，可用于本公开的方法中的ADAM9免疫缀合物为由下式表示的免疫缀合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

CB为抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段；

L₂由下式中的一者表示：

其中：

R^x、R^y、R^x’和R^y’在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C_1-4烷基)、-SO₃H、-NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺或任选地被-OH、卤素、SO₃H或NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺取代的C_1-4烷基，其中R₄₀、R₄₁和R₄₂各自独立地为H或C_1-4烷基；

l和k各自独立地为1至10的整数；

L₁由下式表示：

–CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(＝O)-

其中R³和R⁴各自独立地为H或Me，并且L₁中的–C(＝O)-部分连接至D；

D由下式表示：

q为1至20的整数。

在一些实施方案中，对于如上所述的式(I)免疫缀合物，Rx、Ry、Rx’和Ry’均为H；并且l和k各自独立地为2至6的整数；并且其余变量如上对于式(I)所述。

在一些实施方案中，对于如上所述的式(I)免疫缀合物，A为含有2至5个氨基酸残基的肽；并且其余变量如上对于式(I)或在第1特定实施方案中所述。在一些实施方案中，A为可通过蛋白酶裂解的肽。在一些实施方案中，可通过蛋白酶裂解的肽在肿瘤组织中表达。在一些实施方案中，A为具有与–NH-CR¹R²-S-L₁-D共价连接的氨基酸的肽，所述氨基酸选自由以下组成的组：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，其各自独立地为L或D异构体。在一些实施方案中，连接至–NH-CR1R2-S-L1-D的氨基酸为L氨基酸。在一些实施方案中，A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO:51)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:52)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:53)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro和D-Ala-tBu-Gly，其中每个肽中的第一氨基酸连接至L₂基团并且每个肽中的最后一个氨基酸连接至–NH-CR¹R²-S-L₁-D；并且其余变量如上对于式(I)所述。

在一些实施方案中，对于如上所述的式(I)免疫缀合物，R¹和R²均为H；并且其余变量如上对于式(I)所述。

在一些实施方案中，对于如上所述的式(I)免疫缀合物，L₁为–(CH₂)_4-6-C(＝O)-；并且其余变量如上对于式(I)所述。

在一些实施方案中，对于如上所述的式(I)免疫缀合物，D由下式表示：

并且其余变量如对于式(I)所述。

在某些实施方案中，对于式(I)免疫缀合物，抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含选自表1和2列出的那些的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域、CDR_H3结构域、CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3。

表1.示例性重链可变区CDR氨基序列

表2.示例性轻链可变区CDR氨基序列

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有选自由以下组成的组的序列的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域：

(a)分别为SEQ ID NO:1、3和5以及SEQ ID NO:16、19、20；

(b)分别为SEQ ID NO:1、3和5以及SEQ ID NO:17、19、20；

(c)分别为SEQ ID NO:1、4和5以及SEQ ID NO:17、19、20；和

(d)分别为SEQ ID NO:2、4和5以及SEQ ID NO:18、19、21。

在某些实施方案中，抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有选自由以下组成的组的序列的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域：

(a)分别为SEQ ID NO:1、3和6以及SEQ ID NO:16、19、20；

(b)分别为SEQ ID NO:1、3和7以及SEQ ID NO:16、19、20；

(c)分别为SEQ ID NO:1、3和8以及SEQ ID NO:16、19、20；

(d)分别为SEQ ID NO:1、3和9以及SEQ ID NO:16、19、20；

(e)分别为SEQ ID NO:1、3和10以及SEQ ID NO:16、19、20；

(f)分别为SEQ ID NO:1、3和11以及SEQ ID NO:16、19、20；

(g)分别为SEQ ID NO:1、3和12以及SEQ ID NO:16、19、20；

(h)分别为SEQ ID NO:1、3和13以及SEQ ID NO:16、19、20；

(i)分别为SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20；和

(j)分别为SEQ ID NO:1、3和15以及SEQ ID NO:16、19、20。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ IDNO:1的CDR_H1结构域、具有序列SEQ ID NO:3的CDR_H2结构域和具有序列SEQ ID NO:5的CDR_H3结构域以及具有序列SEQ ID NO:16的CDR_L1结构域、具有序列SEQ ID NO:19的CDR_L2结构域和具有序列SEQ ID NO:20的CDR_L3结构域。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ IDNO:1的CDR_H1结构域、具有序列SEQ ID NO:3的CDR_H2结构域和具有序列SEQ ID NO:14的CDR_H3结构域以及具有序列SEQ ID NO:16的CDR_L1结构域、具有序列SEQ ID NO:19的CDR_L2结构域和具有序列SEQ ID NO:20的CDR_L3结构域。

在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有与选自由以下组成的组的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)：

(a)分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:35；

(b)分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:36；

(c)分别为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:36；和

(d)分别为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:37。

在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有选自由以下组成的组的序列的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)：

(a)分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:35；

(b)分别为SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:36；

(c)分别为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:36；和

(d)分别为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:37。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有与选自由以下组成的组的序列至少90％、至少95％或至少99％一致的序列的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)：

(a)分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:35；

(b)分别为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:35；

(c)分别为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35；

(d)分别为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35；

(e)分别为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:35；

(f)分别为SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:35；

(g)分别为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35；

(h)分别为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35；

(i)分别为SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35；和

(j)分别为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有选自由以下组成的组的序列的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)：

(a)分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:35；

(b)分别为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:35；

(c)分别为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35；

(d)分别为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:35；

(e)分别为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:35；

(f)分别为SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:35；

(g)分别为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35；

(h)分别为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35；

(i)分别为SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35；和

(j)分别为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ IDNO:22的重链可变结构域(VH)和具有序列SEQ ID NO:35的轻链可变结构域(VL)。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ IDNO:33的重链可变结构域(VH)和具有序列SEQ ID NO:35的轻链可变结构域(VL)。

表3.示例性重链可变区和轻链可变区氨基酸序列

/>

/>

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体为包含Fc区的全长抗体。在一些实施方案中，Fc区为包含以下各者的变体Fc区：

(a)选自由以下组成的组的减少变体Fc区对于FcγR的亲和力的一个或多个氨基酸修饰：L234A、L235A和L234A和L235A；和/或

(b)在S442处引入半胱氨酸残基的氨基酸修饰，其中所述编号为如Kabat中的EU索引；和/或

(c)选自由以下组成的组的延长变体Fc区对于FcRn的半衰期的一个或多个氨基酸取代：M252Y、S254T和T256E

在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含具有选自由以下组成的组的序列的重链和轻链：

(a)分别为SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:50；

(b)分别为SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:50；和

(c)分别为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:50。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含具有选自由以下组成的组的序列的重链和轻链：

(a)分别为SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:50；

(b)分别为SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:50；

(c)分别为SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50；

(d)分别为SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50；

(e)分别为SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50；

(f)分别为SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:50；和

(g)分别为SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。

在某些实施方案中，人源化/优化抗ADAM9抗体包含具有序列SEQ ID NO:40的重链和具有序列SEQ ID NO:50的轻链。

在某些实施方案中，人源化/优化抗ADAM9抗体包含具有序列SEQ ID NO:45的重链和具有序列SEQ ID NO:50的轻链。

在某些实施方案中，SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47中的X为赖氨酸。

在某些实施方案中，SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47中的X不存在。

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:49和SEQID NO:50的重链和轻链。在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:50的重链和轻链。

表4.全长重链和轻链氨基酸序列

/>

/>

在某些实施方案中，本发明的抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或2；

D由下式表示：

在某些实施方案中，本发明的抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或2；

D₁由下式表示：

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含分别具有序列SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中的X为赖氨酸。在一些实施方案中，在一些实施方案中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中的X不存在。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，包含免疫缀合物的组合物(例如，药物组合物)的DAR值在1.0至2.5、1.5至2.5、1.8至2.2或1.9至2.1范围内。在一些实施方案中，DAR为1.8、1.9、2.0或2.1。

在某些实施方案中，抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或10的整数；

D由下式表示：

在某些实施方案中，抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或10的整数；

D₁由下式表示：

在某些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含分别具有序列SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44中的X为赖氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44中的X不存在。在一些实施方案中，人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在一些实施方案中，包含免疫缀合物的组合物(例如，药物组合物)的DAR值在1.0至5.0、1.0至4.0、1.5至4.0、2.0至4.0、2.5至4.0、2.9至3.3、3.3至3.8、1.5至2.5或1.8至2.2范围内。在一些实施方案中，DAR小于4.0、小于3.8、小于3.6、小于3.5、小于3.0或小于2.5。在一些实施方案中，DAR在3.0至3.2范围内。在一些实施方案中，DAR在3.5至3.7范围内。在一些实施方案中，DAR为3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6或3.7。在一些实施方案中，DAR在1.9至2.1范围内。在一些实施方案中，DAR为1.9、2.0或2.1。

在某些实施方案中，抗ADAM9免疫缀合物包含共价连接至由下式表示的类美登素化合物DM21-C的人源化抗ADAM9抗体：

其中D₁具有以下结构：

人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50的重链和轻链。在某些实施方案中，抗ADAM9免疫缀合物为由以下结构表示的IMGC936：

其中：

CBA为包含分别具有序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50的重链和轻链的人源化抗ADAM9抗体；并且；

q为2；

D₁由下式表示：

VIII.药物组合物和治疗方法

如本文提供，包含本文提供的人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段的本发明的抗ADAM9免疫缀合物具有结合存在于细胞表面上的ADAM9并介导细胞杀伤的能力。具体而言，包含药理学剂的本发明的免疫缀合物得以内在化并且经由药理学剂的活性来介导细胞杀伤。此细胞杀伤活性可通过诱导抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的免疫缀合物来增强。

因此，本发明的免疫缀合物具有治疗与ADAM9的表达相关或由其表征的任何疾病或病状的能力。如以上论述，ADAM9为在许多血液和实体恶性肿瘤中表达的肿瘤-胚胎抗原，其与展现较少分化形态的高阶肿瘤相关，并且与不良临床结果关联。因此，无限制地，本发明的免疫缀合物可用于治疗癌症，尤其通过ADAM9的表达来表征的癌症。

在其他特定实施方案中，本发明的免疫缀合物可以可用于治疗肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤和淋巴癌。在其他特定实施方案中，本发明的免疫缀合物可以可用于治疗非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC))或胰腺癌。

在其他实施方案中，本发明的免疫缀合物可以可用于治疗非小细胞肺癌(鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌或大细胞未分化癌)、结直肠癌(腺癌、胃肠类癌瘤、胃肠基质肿瘤、原发性结直肠淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鳞状细胞癌)或乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC))。

除了其用于疗法中以外，本发明的免疫缀合物可以可检测地标记并用于诊断癌症或对肿瘤和肿瘤细胞成像。

本发明的组合物包括可用于制造可用于制备单位剂型的药物组合物(例如，不纯或非无菌组合物)和药物组合物(即，适用于向受试者或患者施用的组合物)的原料药物组合物。此类组合物包含预防或治疗有效量的本发明的免疫缀合物，或此类剂与药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的本发明的免疫缀合物和药学上可接受的载体。

在具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认药典中列出用于在动物中并且更具体而言在人中使用。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介物。总体上，本发明的组合物的成分例如以液体、干燥冻干粉末或无水浓缩物形式，在指示活性剂数量的气密密封容器诸如小瓶、安瓿或囊袋中，单独地或混合在一起以单位剂型提供。当组合物通过输注来施用时，其可使用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来施配。当组合物通过注射来施用时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得所述成分可在施用前混合。

本发明还提供药物包装或试剂盒，其包含填充有单独的或与此药学上可接受的载体一起的本发明的免疫缀合物的一个或多个容器。另外，可用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂还可包括在药物包装或试剂盒中。本发明还提供一种药物包装或试剂盒，其包含填充有本发明的药物组合物的成分中的一者或多者的一个或多个容器。视情况，呈由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知可与这些容器相联，所述通知反映所述机构批准制造、使用或销售用于人施用。

本发明提供可用于上述方法中的试剂盒。试剂盒可包含本发明的免疫缀合物中的任一者。试剂盒可还包括一个或多个容器中可用于治疗癌症的一种或多种其他预防剂和/或治疗剂。

可提供本发明的组合物以便通过向受试者施用有效量的本发明的免疫缀合物来治疗、预防和改善与疾病、病症相关的一个或多个症状。在优选的方面中，此类组合物基本上纯化(即，基本上不含限制其效应或产生不期望的副作用的物质)。在具体实施方案中，受试者为动物，优选地为哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、马、猫、犬、啮齿动物等)或灵长类动物(例如，猴，诸如石蟹猕猴、人等)。在一个优选的实施方案中，受试者为人。

各种递送系统为已知的并且可用于施用本发明的组合物，例如囊封于脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达抗体或融合蛋白质的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人(1987)“Receptor-Mediat ed In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier Syste m,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸等。

施用本发明的免疫缀合物的方法包括但不限于胃肠外施用(例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜上和黏膜(例如，鼻内和经口途径)。在具体实施方案中，本发明的免疫缀合物肌肉内、静脉内或皮下施用。组合物可通过任何常规途径，例如通过输注或快速浓注来施用，并且可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部。

本发明还规定本发明的免疫缀合物的制剂封装在指示分子数量的气密密封容器诸如小瓶、安瓿或囊袋中。在一个实施方案中，此类分子以液体、干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物形式，在气密密封容器中提供并且可例如用水或盐水来重构至适于向受试者施用的合适浓度。优选地，本发明的免疫缀合物以干燥无菌冻干粉末形式在气密密封容器中提供。优选地，本发明的免疫缀合物以液体形式在气密密封容器中提供。

本发明的免疫缀合物的冻干制剂应在2℃与8℃之间储存于其原始容器中并且分子应在重构后12小时内，优选的6小时、5小时、3小时或1小时内施用。在替代性实施方案中，此类分子以液体形式，在指示分子、融合蛋白质或缀合分子的数量和浓度的气密密封容器中提供。优选地，此类免疫缀合物在以液体形式提供时，在气密密封容器中提供。

本发明的药物组合物可向需要治疗的区域局部施用；此可通过例如且不限于局部输注、注射或藉助于植入物来实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜诸如硅橡胶膜或纤维。优选地，在施用本发明的免疫缀合物时，必须注意使用分子不吸附的材料。

本发明的组合物可在泡囊，尤其脂质体中递送(参见Langer(1990)“New MethodsOf Drug Delivery”，Science 249：1527-1533)；Treat等人，在LIPOSOMES IN THE THERAPYOF INFECTIOUSDISEASE AND CANCER中，Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，NewYork，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页)。

实施例

现已总体上描述本发明，通过参考以下实施例，更容易理解本发明。以下实施例说明了本发明的诊断或治疗方法中的各种组合物方法。实施例意图说明但决不限制本发明范围。

PDX材料和方法

动物模型：将源自患者的肿瘤样品植入在6-8周龄无胸腺裸-Foxnlnu小鼠中。当肿瘤达到100-300mm³的平均肿瘤体积时，动物按照肿瘤体积来匹配到用于给药的治疗组或对照组中。通过静脉内注射，向小鼠给予媒介物、非靶向ADC(O.1mg/kg类美登素DM有效载荷)或IMGC936(抗ADAM9免疫缀合物、8.6mg/kg ADC或O.1mg/kg类美登素DM有效载荷)。每周两次获取肿瘤测量结果和体重。

功效：抗肿瘤活性通过NCI标准来定义：治疗的小鼠相对于对照小鼠的平均肿瘤体积(％)＞42％(无活性)、≤42％(活性)和＜10％(高度活性)。

IHC材料和方法

组织样品：所用的全部组织样品为FFPE(福尔马林固定和石蜡包埋)完整组织样品，除了在对于食管癌记录时，一些样品为来自组织微阵列(TMA)的组织芯以外。

免疫组织化学：

ADAM9的仅研究用途免疫组织化学(IHC)测定使用Ventana Discovery Ultra自动染色机来执行。ADAM9的初级抗体为购自Cell Signaling Technologies(目录号4151S)的兔单克隆抗体。此测定用于PDX研究。简单描述IHC方案：使用32分钟孵育条件使用CC1缓冲液(VMSI，目录号950-224)进行抗原回收。添加一滴抑制剂CM并孵育8分钟。在37℃下，将载玻片与储备浓度的第一ADAM9抗体(0.25mg/mL)于稀释剂(VMSI，760-219)中的1：100稀释液(2.5ug/mL)一起孵育32分钟。作为阴性对照，在相同条件下，将样本与IgG兔抗体(客户目录号I-1000)一起孵育。抗ADAM9抗体的酶检测使用缀合至HQ的抗兔IgG(VMSI，目录号760-4815)，随后使用缀合至HRP的抗HQ(VMSI，目录号760-2020)孵育12分钟来完成。抗ADAM9抗体使用ChromoMap DAB检测试剂盒(VMSI，目录号760-159)来检测。通过在二氨基联苯胺(DAB)和硫酸铜存在下与过氧化氢反应来使色原沉积。

检测FFPE样品中的ADAM9的免疫组织化学(IHC)测定由Roche TissueDiagnostics(RTD)开发并证实。稳健原型测定(RPA)使用Spring Bioscience抗ADAM9(J12H2L3)抗体，并且在Ventana Benchmark ULTRA染色平台上进行Ventana OptiView DAB检测。根据所公布调查结果，在膜和细胞质型样中观察到高质量染色。在显色过程中，RPA测定在各种测定参数下展示一致染色，并且满足特异性、准确性和分析精度的标准。

简单描述IHC方案：使用以CC1缓冲液(VMSI,目录号950-224)进行的92分钟孵育条件，进行抗原回收。在36℃下，将载玻片与储备浓度的初级抗体于稀释剂90103(VMSI)中的1:282稀释液一起孵育16分钟。储备抗体浓度是指抗体由制造商提供给Ventana的浓度。作为阴性对照，在相同条件下，将样本与IgG兔单克隆抗体一起孵育。使用OptiViewTM检测试剂盒(VMSI，目录号760-700)来检测抗ADAM9抗体。抗ADAM9抗体的酶检测使用结合至HQ的次级山羊抗小鼠和抗兔IgG，随后使用结合至HRP的抗HQ来完成。通过在二氨基联苯胺(DAB)和硫酸铜存在下与过氧化氢反应来使色原沉积。次级抗体、HRP多聚体和所有色原试剂在仪器的预设时间施加。

评分和数据分析：染色强度由认证的解剖病理学家以0(阴性)至3的半定量整数量表来评分。记录在每个强度水平下，细胞质、膜和细胞质和/或膜(cyto-membrane)的阳性染色细胞的百分比。评分是基于ADAM9至细胞膜和细胞质的定域。在肿瘤样品中，对有活力的恶性细胞进行评分。

计算H评分。H评分将染色强度的组件与阳性细胞百分比组合。其具有0与300之间的值并且被定义为：

1*(以强度类别1来染色的细胞的百分比)

+2*(以强度类别2来染色的细胞的百分比)

+3*(以强度类别3来染色的细胞的百分比)

＝H评分

实施例1.PDX研究

在源自腺癌非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌和胃癌肿瘤的PDX模型中分析IMGC936的活性。按照H评分，ADAM9表达的范围为27至226，其中80％样品具有高于101的H评分(表5)。0.1mg/kg IMGC936(8.6mg/kg抗体)的单一剂量为良好耐受的。在所测试肿瘤类型中，在35个模型中的24个(69％)中，IMGC936为有活性或高活性的，并且在6个模型(4个NSCLC、2个TNBC)中完全消退。24个IMGC936敏感模型具有65与224之间的H评分。11个不敏感模型具有27与226之间的H评分。在此项研究中具有高于50的H评分的所有PDX模型对于IMGC936作出反应(图1A)。每个癌症类型的ADAM9流行率数据展示于图1B中。每个PDX模型的H评分和染色强度展示于图1C中。

表5.来自NSCLC腺癌、胃癌、TNBC和胰腺癌PDX模型的结果

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实施例2.ADAM9流行率

ADAM9在多个肿瘤类型中高度表达。大部分肿瘤样品具有中等至高水平的ADAM9，其中62％腺癌NSCLC、65％TNBC、73％胃癌和85％胰腺癌样品具有101至300的H评分(图2)。还研究结直肠癌(CRC)和食管癌中的ADAM9表达。ADAM9表达在CRC和食道癌中较低，分别有40％和32％样品具有高于100的H评分。其余肿瘤样品具有较低水平的ADAM9表达(H评分1至100)，其中1.2％NSCLC和20％CRC样品为ADAM9阴性的。

ADAM9在TNBC、NSCLC、CRC、胃、胰腺和食道癌中高度表达。大部分肿瘤样品表达高水平的ADAM9，其中85％胃癌、100％胰腺癌、63％TNBC、96％NSCLC腺癌、90％CRC、54％食管癌样品具有高于100的H评分(图3)。另外，在所有适应症中评估的218/220个(99％)病例在膜或细胞质中表达ADAM9。

a.胃癌

三十九个完整组织胃癌病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，39/39个病例(100％)展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为170(图4A和4B)，并且72％样品展示出膜ADAM9染色(图4C)。阳性染色被定义为高于背景的任何染色。

b.胰腺癌

四十二个完整组织胰腺癌病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，42/42(100％)展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为195(图5A和5B)，并且93％样品展示出膜ADAM9染色(图5C)。

c.腺癌NSCLC

二十五个完整组织NSCLC腺癌病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，25/25个病例(100％)展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为169(图6A和6B)，并且96％样品展示出膜ADAM9染色(图6C)。

d.TNBC

二十七个完整组织三阴性乳腺癌病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，26/27(96.3％)个样品展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为123(图7A和7B)，并且85％样品展示出膜ADAM9染色(图7C)。

e.CRC

四十一个完整组织三CRC癌症病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，41/41(100％)个样品展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为144(图8A和8B)，并且95％样品展示出膜ADAM9染色(图8C)。

f.食管癌

四十六个完整组织三食管癌病例可针对生物标志物评估来进行评估。总的，45/46(97.8％)个样品展示出阳性细胞质或膜染色，其中平均H评分为105(图9A和9B)，并且76％样品展示出阳性ADAM9仅膜染色(图9C)。

实施例3.第I期临床研究中的ADAM9表达水平评估

进行IMGC936在患有晚期实体肿瘤的患者中的1期、首次人、开放标签、剂量递增研究，以便表征通过IV输注的IMGC936的安全性、耐受性、PK、药效动力学、免疫原性和初步抗肿瘤活性。登记患有不可切除、复发性或难治性、局部晚期或转移性非鳞状NSCLC、TNBC、CRC、胃食管癌或胰腺癌的参与者。对于所有参与者，收集经由IHC染色来确定ADAM9表达的肿瘤样本并将进行测定。

将对档案和/或新鲜预处理收获肿瘤样本进行ADAM9表达分析。参与者具有鉴定档案肿瘤样本块(例如，FFPE)或来自档案肿瘤样本的未染色载玻片或同时期肿瘤生检物，用于评估ADAM9表达。如果不能鉴定合适样品，则参与者可经历新鲜肿瘤生检以便获得用于测试的样本。

将分析参与者的ADAM9表达以便确定IMGC936的抗肿瘤活性与ADAM9表达之间的相关性。肿瘤比例评分(TPS)可用于指示患者样品中ADAM9的阳性或阴性染色。TPS被计算为显示在任何强度下部分或完全膜染色和细胞质染色的活肿瘤细胞的百分比。还可针对仅膜染色来计算TPS评分，即，显示在任何强度下部分或完全膜染色的活肿瘤细胞的百分比。来自健康受试者的参考样品可用作基线对照或阴性对照。参考样品可来自与从中收集参与者的肿瘤样本的组织对应的健康受试者中的组织。参考样品还可来自参与者的对应健康组织。另外地或替代地，来自表达ADAM9的肿瘤组织的参考样品可用作阳性对照。

Claims (83)

1.一种治疗需要治疗的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的抗ADAM9免疫缀合物，其中来自所述受试者的肿瘤样品表现出ADAM9表达水平增加。

2.一种增加需要治疗的受试者的癌症治疗的功效的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的抗ADAM9免疫缀合物，其中来自所述受试者的肿瘤样品表现出ADAM9表达水平增加。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述ADAM9表达水平增加使用一种检测方法来确定，所述检测方法区分与一个或多个参考样品中的染色强度和/或染色均匀性相比，ADAM9表达癌症样品中的染色强度和/或染色均匀性。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述检测方法为免疫组织化学(IHC)。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品为福尔马林固定石蜡包埋的样品。

6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中在所述肿瘤细胞的仅细胞质、仅膜或细胞质与膜的组合(cyto-membrane)中，针对ADAM9表达来确定染色强度和/或染色均匀性。

7.如权利要求6所述的方法，其中仅对于所述肿瘤细胞的膜，确定染色强度和/或染色均匀性。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50与300之间的H评分。

9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有100与300之间的H评分。

10.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有H评分在201与300之间的高ADAM9表达水平。

11.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有H评分在101与200之间的中等ADAM9表达水平。

12.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有H评分在1与100之间的低ADAM9表达水平。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有针对ADAM9表达水平的2或更大的IHC染色强度评分。

14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有针对ADAM9表达水平的3或更大的IHC染色强度评分。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％或更大PS1的染色。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS1的染色。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS1的染色。

18.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS1的染色。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，所述肿瘤样品具有25％或更大PS2的染色。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS2的染色。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS2的染色。

22.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS2的染色。

23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％或更大PS3的染色。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS3的染色。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS3的染色。

26.如权利要求1至22中任一项所述的方法，所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS3的染色。

27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤和淋巴癌。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述癌症为腺癌NSCLC、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌、胃癌或结直肠癌。

30.如权利要求3至29中任一项所述的方法，其中所述一个或多个参考样品包括组织、细胞或细胞球团。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述一个或多个参考样品为阴性参考样品。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

或其药学上可接受的盐，其中：

CB为抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段；

L₂由下式中的一者表示：

其中：

R^x、R^y、R^x’和R^y’在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C_1-4烷基)、-SO₃H、-NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺或任选地被-OH、卤素、SO₃H或NR₄₀R₄₁R₄₂ ⁺取代的C_1-4烷基，其中R₄₀、R₄₁和R₄₂各自独立地为H或C_1-4烷基；

l和k各自独立地为1至10的整数；

L₁由下式表示：

–CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(＝O)-

其中R³和R⁴各自独立地为H或Me，并且L₁中的所述–C(＝O)-部分连接至D；

D由下式表示：

q为1至20的整数。

33.如权利要求32所述的方法，其中Rx、Ry、Rx’和Ry’均为H；并且l和k各自独立地为2至6的整数。

34.如权利要求32或33所述的方法，其中A为含有2至5个氨基酸残基的肽。

35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中A为可通过蛋白酶裂解的肽。

36.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ IDNO:51)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:52)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:53)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro和D-Ala-tBu-Gly，其中每个肽中的第一氨基酸连接至L₂基团并且每个肽中的最后一个氨基酸连接至–NH-CR¹R²-S-L₁-D。

37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中R¹和R²均为H。

38.如权利要求32至37中任一项所述的方法，其中L₁为–(CH₂)_4-6-C(＝O)-。

39.如权利要求32至38中任一项所述的方法，其中D由下式表示：

40.如权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ ID NO:1的CDR_H1结构域、具有序列SEQ ID NO:3的CDR_H2结构域和具有序列SEQID NO:14的CDR_H3结构域以及具有序列SEQ ID NO:16的CDR_L1结构域、具有序列SEQ ID NO:19的CDR_L2结构域和具有序列SEQ ID NO:20的CDR_L3结构域。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含具有序列SEQ ID NO:33的重链可变结构域(VH)和具有序列SEQ ID NO:35的轻链可变结构域(VL)。

43.如权利要求41所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体包含具有序列SEQ ID NO:45的重链和具有序列SEQ ID NO:50的轻链。

44.如权利要求32所述的方法，其中所述抗ADAM9免疫缀合物由下式表示：

其中：

CBA为人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段，其包含分别具有序列SEQ ID NO:1、3和14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR_H1结构域、CDR_H2结构域和CDR_H3结构域以及CDR_L1结构域、CDR_L2结构域和CDR_L3结构域；

q为1或2；

D₁由下式表示：

45.如权利要求44所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体或其ADAM9结合片段包含分别具有序列SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。

46.如权利要求44所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:50的重链和轻链。

47.如权利要求44所述的方法，其中所述人源化抗ADAM9抗体包含分别具有序列SEQ IDNO:49和SEQ ID NO:50的重链和轻链。

48.如权利要求44所述的方法，其中所述抗ADAM9免疫缀合物为IMGC936。

49.一种鉴别可能对于抗ADAM9免疫缀合物治疗作出反应的癌症的方法，所述方法包括：

(a)使包含来自所述癌症的细胞的生物样品与结合所述生物样品的ADAM9蛋白质的剂接触；

(b)检测结合(a)的所述生物样品的ADAM9蛋白质的所述剂的结合；

(c)向步骤(b)的所述结合分配评分，其中所述评分基于与一个或多个参考样品的比较来分配；和

(d)将步骤(c)中的所述评分与参考组织或细胞的评分相比较，其中所述癌症ADAM9水平的评分大于正常或低ADAM9表达参考样品的评分或所述癌症ADAM9水平的评分等于或大于高ADAM9表达参考样品的评分将所述癌症鉴别为可能对于抗ADAM9免疫缀合物作出反应。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、食管癌、乳腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤和淋巴癌。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、胃癌、乳腺癌或胰腺癌。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述癌症为腺癌NSCLC、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌、胃癌或结直肠癌。

53.一种鉴别对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗敏感的肿瘤的方法，所述方法包括：

(a)测量从所述肿瘤获得的肿瘤组织样品中的ADAM9表达水平，其中所述测量包括使用一种检测方法，所述检测方法区分与一个或多个参考样品中的染色强度或染色均匀性相比，ADAM9表达癌症样品中的染色强度或染色均匀性；

(b)确定所述肿瘤组织样品的ADAM9染色强度评分；和

(c)将步骤(b)中确定的ADAM9染色强度评分与通过测量至少一个参考样品中的ADAM9蛋白质表达来确定的相对值相比较，其中所述至少一个参考样品为对于用抗ADAM9免疫缀合物治疗不敏感的组织、细胞或细胞球团样品，并且其中步骤(b)中确定的所述样品的ADAM9染色强度评分高于所述相对值将所述肿瘤鉴别为对于所述治疗敏感。

54.如权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述检测方法手动执行或使用自动化系统来执行。

55.如权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述检测方法为IHC。

56.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中所述样品为福尔马林固定石蜡包埋的样品。

57.如权利要求55或56所述的方法，其中在所述肿瘤细胞或癌细胞的仅细胞质、仅膜或细胞质与膜的组合(cyto-membrane)中，针对ADAM9表达来确定染色强度和/或染色均匀性。

58.如权利要求57所述的方法，其中仅对于所述肿瘤细胞或癌细胞的膜，确定染色强度和/或染色均匀性。

59.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述样品具有50与300之间的H评分。

60.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述样品具有100与300之间的H评分。

61.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述样品具有H评分在201与300之间的高ADAM9表达水平。

62.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述样品具有H评分在101与200之间的中等ADAM9表达水平。

63.如权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述样品具有H评分在1与100之间的低ADAM9表达水平。

64.如权利要求55至63中任一项所述的方法，其中所述样品具有针对ADAM9表达水平的2或更大的IHC染色强度评分。

65.如权利要求55至63中任一项所述的方法，其中所述样品具有针对ADAM9表达水平的3或更大的IHC染色强度评分。

66.如权利要求55至65中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％或更大PS1的染色。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS1的染色。

68.如权利要求66所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS1的染色。

69.如权利要求55至65中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS1的染色。

70.如权利要求55至69中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％或更大PS2的染色。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS2的染色。

72.如权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS2的染色。

73.如权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS2的染色。

74.如权利要求55至73中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％或更大PS3的染色。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述肿瘤样品具有50％或更大PS3的染色。

76.如权利要求74所述的方法，其中所述肿瘤样品具有75％或更大PS3的染色。

77.如权利要求74所述的方法，其中所述肿瘤样品具有25％-49％、50％-74％或75％-100％PS3的染色。

78.如权利要求49至77中任一项所述的方法，其还包括向患有所述癌症或肿瘤的受试者施用治疗有效量的所述抗ADAM9免疫缀合物。

79.如权利要求49至78中任一项所述的方法，其中所述抗ADAM9免疫缀合物如权利要求32至48中任一项所定义。

80.如权利要求1至7、27至58、78和79中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品具有大于或等于1％、大于或等于5％、大于或等于10％、大于或等于20％、大于或等于25％、大于或等于30％、大于或等于40％、大于或等于50％、大于或等于60％、大于或等于70％、大于或等于75％、大于或等于80％、大于或等于90％或大于或等于95％的肿瘤比例评分(TPS)。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述肿瘤样品具有大于或等于25％的TPS。

82.如权利要求80所述的方法，其中所述肿瘤样品具有大于或等于50％的TPS。

83.如权利要求80所述的方法，其中所述肿瘤样品具有大于或等于75％的TPS。