TW202302155A

TW202302155A - 用於增加靶向ａｄａｍ９之免疫結合物治療癌症之功效的方法

Info

Publication number: TW202302155A
Application number: TW111108273A
Authority: TW
Inventors: 艾瑞克亨利偉斯汀; 卡倫斯羅斯; 克莉斯朵瑪莉沃特金; 德利Ｔ盧; 強尼普 A 史納; 法蘭辛志峰陳
Original assignee: 美商伊繆諾金公司; 美商宏觀基因股份有限公司
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2023-01-16
Also published as: JP2024512392A; EP4304660A1; WO2022192134A1; CN117729942A

Abstract

本揭示案提供治療ADAM9表現水準增加之個體之癌症的方法。該方法包含向該個體投與治療有效量之抗ADAM9免疫結合物。亦提供一種增加用抗ADAM9免疫結合物治療ADAM9表現水準增加之個體之癌症的功效的方法。

Description

用於增加靶向ADAM9之免疫結合物治療癌症之功效的方法

本發明總體上係關於增加用ADAM9免疫結合物治療癌症之功效的方法，該免疫結合物包含與至少一種藥理學劑結合之能夠特異性結合至「含有去整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」(「ADAM9」)的抗體或其片段。更具體而言，本發明係關於用抗ADAM9免疫結合物來更有效治療易患或經診斷患有癌症之患者，其中如藉由IHC檢定來確定，腫瘤細胞過表現ADAM9。

ADAM9為ADAM分子家族之成員。已發現ADAM9之表現與疾病，尤其是癌症相關。已發現ADAM9裂解且釋放許多在腫瘤形成及血管生成中具有重要作用之分子，諸如TEK、KDR、EPHB4、CD40、VCAM1及CDH5。ADAM9由多種腫瘤細胞表現，包括乳癌、結腸癌、胃癌、神經膠質瘤、肝癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胰臟癌及前列腺癌之腫瘤細胞(Yoshimasu, T. 等人(2004) 「 Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis」, Cancer Res. 64:4190-4196；Peduto, L. 等人(2005) 「 Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer,」 Cancer Res. 65:9312-9319；Zigrino, P. 等人(2005) 「 ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines,」 Int. J. Cancer 116:853-859；Fritzsche, F.R. 等人(2008) 「 ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression,」 BMC Cancer 8:179:1-9；Fry, J.L. 等人(2010) 「 Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration,」 Cancer Res. 70, 8187-8198；Chang, L. 等人(2016) 「 Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non ‑ Small Cell Lung Cancer,」 Oncology Letters 11:1242-1250；Fan, X. 等人(2016) 「 ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas,」 Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11)。

值得注意地，已發現ADAM9表現增加與腫瘤惡性程度及轉移潛能呈正相關(Amendola, R.S. 等人(2015) 「 ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2,」 J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fan, X. 等人(2016) 「 ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas,」 Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11；Li, J. 等人(2016) 「 Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion」, J. Invest. Surg. 26(3):127-133)。此外，ADAM9及其分泌可溶性異型體似乎對癌細胞擴散至關重要(Amendola, R.S. 等人(2015) 「 ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2」, J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962；Fry, J.L. 等人(2010) 「 Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration」, Cancer Res. 70, 8187–8198；Mazzocca, A. (2005) 「 A Secreted Form Of ADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions,」 Cancer Res. 65:4728-4738；亦參見美國專利第9,150,656號；第7,585,634號；第7,829,277號；第8,101,361號；及第8,445,198號及美國專利公開案第2009/0023149號)。

因此，許多研究已將ADAM9確定為抗癌治療之潛在靶標(Peduto, L. (2009) 「 ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer」, Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287；Duffy, M.J. 等人(2009) 「 Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression」, Clin. Cancer Res. 15:1140-1144；Duffy, M.J. 等人(2011) 「 The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?」, Clin. Proteomics 8:9:1-13；Josson, S. 等人(2011) 「 Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy」, Prostate 71(3):232-240；亦參見美國專利公開案第2016/0138113號、第2016/0068909號、第2016/0024582號、第2015/0368352號、第2015/0337356號、第2015/0337048號、第2015/0010575號、第2014/0342946號、第2012/0077694號、第2011/0151536號、第2011/0129450號、第2010/0291063號、第2010/0233079號、第2010/0112713號、第2009/0285840號、第2009/0203051號、第2004/0092466號、第2003/0091568號及第2002/0068062號以及PCT公開案第WO 2016/077505號、第WO 2014/205293號、第WO 2014/186364號、第WO 2014/124326號、第WO 2014/108480號、第WO 2013/119960號、第WO 2013/098797號、第WO 2013/049704號及第WO 2011/100362號)。另外，亦發現ADAM9之表現與肺病及炎症相關(參見，例如，美國專利公開案第2016/0068909號；第2012/0149595號；第2009/0233300號；第2006/0270618號；及第2009/0142301號)。抗ADAM9靶向抗體-藥物結合物(ADC) IMGC936當前處於評估癌症患者中之安全性及藥物動力學的第I期劑量遞增研究中。

然而，儘管存在所有先前進步，但仍非常需要用於治療癌症的更有效ADAM9靶向治療劑及方法。

本發明係基於腫瘤組織中ADAM9表現之動態範圍的發現及ADAM9表現水準增加之腫瘤對於用抗ADAM9免疫結合物治療作出更大反應的發現。本發明有利地允許藉由向發現ADAM9表現水準增加之患者投與治療劑，亦即，抗ADAM9免疫結合物來治療對治療作出反應之可能性更大的患者。

本發明亦提供一種治療癌症之方法或一種用於增加癌症治療有效性之可能性之方法，該方法包含向個體投與治療有效劑量之抗ADAM9免疫結合物，其中發現個體之組織樣品中之ADAM9表現較高。

在一個實施例中，ADAM9表現之程度及均勻性藉由免疫組織化學(IHC)來偵測。在另一個實施例中，ADAM9表現水準藉由校準IHC來偵測。IHC之非限制性實例包括區分不同水準之ADAM9的IHC方法及諸如本文所述之校準IHC方法。ADAM9表現可使用合適評分系統，包括但不限於本文描述之評分方法來評分。例如，ADAM9表現可使用包括染色強度在0、1、2或3範圍的校準IHC方法來評分，其中0為最低水準之染色強度且3為最高水準之染色強度。在某些實施例中，染色強度2或3評分指示較高ADAM9表現水準。在一些實施例中，染色強度評分1被視為「較弱」染色；染色強度評分2被視為「中等」染色；且染色強度評分3被視為「較強」染色。

替代地或另外地，ADAM9表現可使用包括表示為具有染色強度0、1、2或3之細胞百分比的染色均勻性的校準IHC方法來評分。例如，樣品中之ADAM9表現水準可藉由將染色強度與染色均勻性組合來評分，例如PS1、PS2或PS3。在某些實施例中，25%或更大、50%或更大或75%或更大PS1之染色指示ADAM9表現水準之增加。在某些實施例中，25%-49%、50%-74%或75%-100% PS1之染色指示ADAM9表現水準之增加。在一些實施例中，25%或更大、50%或更大或75%或更大PS2之染色指示ADAM9表現水準之增加。在一些實施例中，25%-49%、50%-74%或75%-100% PS2之染色指示ADAM9表現水準之增加。在一些實施例中，25%或更大、50%或更大或75%或更大PS3之染色指示ADAM9表現水準之增加。在一些實施例中，25%-49%、50%-74%或75%-100% PS3之染色指示ADAM9表現水準之增加。

在一些實施例中，樣品中之ADAM9表現水準經指派給腫瘤比例評分(TPS)。在某些實施例中，具有大於或等於1%、大於或等於5%、大於或等於10%、大於或等於20%、大於或等於25%、大於或等於30%、大於或等於40%、大於或等於50%、大於或等於60%、大於或等於70%、大於或等於75%、大於或等於80%、大於或等於90%或大於或等於95%之TPS之腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，具有大於或等於25%之TPS之腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，具有大於或等於50%之TPS之腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，具有大於或等於75%之TPS之腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。

在一些實施例中，樣品中之ADAM9表現水準經指派給H評分，該評分將染色強度之組件與樣品中之陽性細胞百分比組合。在某些實施例中，具有50與300之間之H評分的腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，具有100與300之間之H評分的腫瘤樣品指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，腫瘤樣品在H評分為201與300之間的情況下具有高ADAM9表現水準。在某些實施例中，腫瘤樣品在H評分為101與200之間的情況下具有中等ADAM9表現水準。在某些實施例中，腫瘤樣品在H評分為1與100之間的情況下具有低ADAM9表現水準。

在另一實施例中，量測樣品(例如，腫瘤組織樣品)中之ADAM9表現且將其與一或多個參考樣品相比較。在一個實施例中，樣品中之ADAM9表現與表現出無或低可偵測ADAM9表現之陰性對照樣品相比較。在另一個實施例中，樣品中之ADAM9表現與ADAM9表現增加(水準1、2或3)之陽性對照樣品相比較。

在某些實施例中，可用於本發明之方法中之抗ADAM9免疫結合物包含抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段、連接子及細胞毒素。在一個實施例中，連接子可選自由以下組成之群：可裂解連接子、不可裂解連接子、親水性連接子及基於二羧酸之連接子。在另一個實施例中，連接子可選自由以下組成之群：N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)或N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基戊酸酯(磺基-SPP)；N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺甲基)環己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀醯亞胺基4-(馬來醯亞胺甲基)環己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀醯亞胺基-4-(碘乙醯)-胺基苯甲酸酯(SIAB)；及N-琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-馬來醯亞胺)。在另一個實施例中，連接子為N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。在另一個實施例中，細胞毒性劑選自由以下組成之群：類美登醇(maytansinoid)、類美登醇類似物、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、CC-1065類似物、多卡米辛(duocarmycin)、多卡米辛類似物、卡奇黴素(calicheamicin)、多拉司他汀(dolastatin)、多拉司他汀類似物、奧里斯他汀(auristatin)、托梅黴素(tomaymycin)衍生物及輕肌蛋白衍生物或該劑之前藥。在另一實施例中，細胞毒性劑為類美登醇。在另一個實施例中，細胞毒性劑為N(2')-去乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素或N(2')-去乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素。在另一個實施例中，細胞毒性劑為N(2')-去乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-l-側氧基戊基)-美登素(DM4)。

在某些實施例中，抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

(I)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中： CB為抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段； L ₂由下式中之一者表示：

(L2b)或

(L2d)，其中： R ^x、R ^y、R ^x’及R ^y’在每次出現時獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C _1-4烷基)、-SO ₃H、-NR ₄₀R ₄₁R ₄₂ ⁺或視情況經-OH、鹵素、SO ₃H或NR ₄₀R ₄₁R ₄₂ ⁺取代之C _1-4烷基，其中R ₄₀、R ₄₁及R ₄₂各自獨立地為H或C _1-4烷基； l及k各自獨立地為1至10之整數； L ₁由下式表示： –CR ³R ⁴-(CH ₂) _1-8-C(=O)- 其中R ³及R ⁴各自獨立地為H或Me，且L ₁中之–C(=O)-部分連接至D； D由下式表示：

； q為1至20之整數。

在某些實施例中，本發明之抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或2； D ₁由下式表示：

。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，在一些實施例中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中之X為離胺酸。在一些實施例中，在一些實施例中，SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45中之X不存在。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，包含免疫結合物之組成物( 例如，醫藥組成物)之DAR值在1.0至2.5、1.5至2.5、1.8至2.2或1.9至2.1範圍內。在一些實施例中，DAR為1.8、1.9、2.0或2.1。

本發明亦提供本發明的本文所述之免疫結合物或醫藥組成物在治療需要治療之個體之癌症的方法或增加需要治療之個體之癌症治療功效的方法中之用途，其中來自個體之腫瘤樣品展現出ADAM9表現水準增加。本發明亦提供本發明的本文所述之免疫結合物或醫藥組合物在製造供治療需要治療之個體之癌症或增加需要治療之個體之癌症治療功效的藥物中之用途，其中來自個體之腫瘤樣品展現出ADAM9表現水準增加。

在某些實施例中，癌症選自由以下組成之群：肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食管癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑素瘤及淋巴癌。在某些實施例中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、胃癌、乳癌或胰臟癌。在某些實施例中，癌症為腺癌NSCLC、三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌、胃癌或結腸直腸癌(CRC)。

相關申請案

本申請案主張2021年3月8日提交之美國臨時申請案第63/157,954號之優先權益，其整個內容以引用方式併入本文。

本揭示案提供增加對特徵在於ADAM9過表現之癌症之治療的功效或反應可能性的方法。本發明係基於與正常組織相比腫瘤組織中ADAM9表現之動態範圍的發現及ADAM9表現水準增加之腫瘤對於抗ADAM9免疫結合物治療作出更大反應的發現。

患有可能對抗ADAM9免疫結合物作出反應之癌症的患者可藉由以下來鑑別：(a)使包含來自該癌症之細胞之生物樣品與結合生物樣品之ADAM9蛋白之劑接觸( 例如，在細胞表面上及/或在細胞內部)；(b)偵測結合(a)之該生物樣品之ADAM9蛋白的該劑的結合；(c)對步驟(b)之該結合指派評分，其中該評分基於與一或多個參考樣品之比較來指派；及(d)將步驟(c)中之該評分與參考組織或細胞之評分相比較，其中該癌症ADAM9水準之評分大於表現正常或低ADAM9之參考樣品之評分或該癌症ADAM9水準之評分等於或大於表現高ADAM9之參考樣品之評分將該癌症鑑別為可能對於抗ADAM9免疫結合物作出反應。

對於用抗ADAM9免疫結合物治療敏感之腫瘤可藉由以下來鑑別：(a)量測自該腫瘤獲得之腫瘤組織樣品中之ADAM9表現水準，其中該量測包含使用與一或多個參考樣品中之染色強度或染色均勻性相比，區分表現ADAM9之癌症樣品中之染色強度或染色均勻性的偵測方法；(b)確定該腫瘤組織樣品之ADAM9染色強度評分；及(c)將步驟(b)中確定之ADAM9染色強度評分與藉由量測至少一個參考樣品中之ADAM9蛋白表現來確定之相對值相比較，其中該至少一個參考樣品為對於用抗ADAM9免疫結合物治療不敏感之組織、細胞或細胞球團樣品，且其中步驟(b)中確定之該樣品之ADAM9染色強度評分高於該相對值，將該腫瘤鑑別為對於用抗ADAM9免疫結合物治療敏感。在某些實施例中，偵測方法手動執行或使用自動化系統來執行。在一個實施例中，偵測方法為IHC。在另一個實施例中，IHC為可區分不同水準之ADAM9表現的校準IHC。 I. 定義

除非另外指示，否則如本文所用，術語「ADAM9」或「含有去整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9」係指任何原生人類ADAM9。術語「ADAM9」涵蓋「全長」未加工ADAM (以及在細胞內加工所產生的任何形式之ADAM9)。該術語亦涵蓋ADAM9之天然存在之變異體，例如拼接變異體、對偶基因變異體及異型體。本文所述之ADAM9多肽可自多種來源，諸如自人類組織類型或自另一來源分離，或藉由重組或合成方法製備。ADAM9序列之實例包括但不限於NCBI參考編號NP_003807，及在WO2018/119166、WO2018/119196及WO2020/005945中所描述之彼等者，該等專利均以引用方式併入本文。

術語「過表現」、「表現增加」或「表現升高」可互換使用。ADAM9表現增加係指樣品含有升高水準之ADAM9表現。在一個實例中，ADAM9表現藉由IHC來量測並且藉由與展現限定評分之對照(例如，校準對照)相比較來給予染色強度評分及/或染色均勻性評分(例如，若強度與水準3校準對照相當，則給予測試樣品3之強度評分，或若強度與水準2校準對照相當，則給予測試樣品2之強度)。在一些實施例中，在無校準對照之情況下，染色強度評分藉由病理學家基於他的/她的病理學訓練及經驗來確定。例如，藉由免疫組織化學之評分1、2或3指示ADAM9表現增加。在某些實施例中，評分2或3指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，具有染色強度3之樣品中之細胞的存在指示ADAM9表現增加。染色均勻性亦指示ADAM9表現增加。染色均勻性評分可為樣品中具有相同染色強度之細胞的百分比。

染色強度及染色均勻性評分可單獨或組合使用(例如，PS1、PS2、PS3等)。PS1(亦稱為PS1+)表示樣品中具有1或更大( 例如，2或3)染色強度之腫瘤細胞的百分比。PS2(亦稱為PS2+)表示樣品中具有2或更大( 例如，3)染色強度之腫瘤細胞的百分比。PS3(亦稱為PS3+)表示樣品中具有3染色強度之腫瘤細胞的百分比。在一些實施例中，1%-24%、25%-49%、50%-74%或75%-100% PS1之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，1%或更大、5%或更大、10%或更大、20%或更大、25%或更大、30%或更大、40%或更大、50%或更大、60%或更大、70%或更大、75%或更大、80%或更大、90%或更大或95%或更大PS1之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，25%或更大PS1之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，50%或更大PS1之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS1之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，1%-24%、25%-49%、50%-74%或75%-100% PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，1%或更大、5%或更大、10%或更大、20%或更大、25%或更大、30%或更大、40%或更大、50%或更大、60%或更大、70%或更大、75%或更大、80%或更大、90%或更大或95%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，25%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，50%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，1%-24%、25%-49%、50%-74%或75%-100% PS3之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，1%或更大、5%或更大、10%或更大、20%或更大、25%或更大、30%或更大、40%或更大、50%或更大、60%或更大、70%或更大、75%或更大、80%或更大、90%或更大或95%或更大PS3之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，25%或更大PS3之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，50%或更大PS3之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS3之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，50%或更大PS1及25%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS1及25%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，50%或更大PS1及50%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS1及50%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，75%或更大PS1及75%或更大PS2之染色指示ADAM9表現增加。在一些實施例中，具有大於或等於50% PS1 之染色之樣品被視為「ADAM9陽性」。本文描述之方法可用於藉由向個體投與治療有效量的本文所述之抗ADAM9免疫結合物來治療其腫瘤樣品為ADAM9陽性之個體。

在一些實施例中，腫瘤比例評分(TPS)可用於指示陽性ADAM9表現或「ADAM表現增加」。TPS經計算為在任何強度下染色之樣品中之活腫瘤細胞的百分比。在一些實施例中，TPS針對膜及細胞質染色。在一些實施例中，TPS僅針對膜染色。對於膜染色，TPS包括完全染色或部分染色兩者。如本文所用，「完全」膜染色意謂整個膜周圍染色且「部分」膜染色意謂膜之頂端染色。在一些實施例中，大於或等於1%、大於或等於5%、大於或等於10%、大於或等於20%、大於或等於25%、大於或等於30%、大於或等於40%、大於或等於50%、大於或等於60%、大於或等於70%、大於或等於75%、大於或等於80%、大於或等於90%或大於或等於95%之TPS被視為「ADAM陽性」或「ADAM9表現增加」。在一些實施例中，大於或等於25%之TPS被視為「ADAM陽性」或「ADAM9表現增加」。在一些實施例中，大於或等於50%之TPS被視為「ADAM陽性」或「ADAM9表現增加」。在一些實施例中，大於或等於75%之TPS被視為「ADAM陽性」或「ADAM9表現增加」

在另一實例中，IHC染色結果藉由H評分來分析，該評分將染色強度之組件與陽性細胞百分比組合。其具有0與300之間之值且經定義為： 1 * (以強度類別1來染色之細胞之百分比) + 2 * (以強度類別2來染色之細胞之百分比) + 3 * (以強度類別3來染色之細胞之百分比) = H評分。

在一些實施例中，當與例如來自無癌症或患有不具有較高ADAM9表現之癌症之個體的參考樣品之H評分相比時，具有較高ADAM9表現之腫瘤具有更高H評分。

在一些實施例中，患者樣品中之ADAM9表現水準較高。在一些實施例中，患者樣品中之ADAM9表現水準中等。在一些實施例中，患者樣品中之ADAM9表現水準較低。如本文所用，具有201-300之H評分之樣品被視為具有「較高」ADAM9表現水準。具有101-200之H評分之樣品被視為具有「中等」ADAM9表現水準。具有1-100之H評分之樣品被視為具有「較低」ADAM9表現水準。

在另一實例中，ADAM9表現之增加可藉由偵測到相對於對照值(例如，來自無癌症或患有不具有較高ADAM9值之癌症之個體的組織或細胞中之表現水準)之至少2倍、至少3倍或至少5倍增加來確定。

在一些實施例中，如上所述之染色強度、染色均勻性及染色評分僅針對膜染色。在一些實施例中，如上所述之染色強度、染色均勻性及染色評分針對細胞質染色。在一些實施例中，如上所述之染色強度、染色均勻性及染色評分針對膜染色及細胞質染色之組合(細胞-膜染色)。

「參考樣品」可用於使在本發明之方法中獲得之結果與測試樣品相關聯並對其進行比較。參考樣品可為細胞(例如，細胞株、細胞球團)或組織。「參考樣品」中之ADAM9水準可為ADAM9之絕對量或相對量、量之範圍、最小量及/或最大量、平均量及/或中值量。本揭示案之診斷方法涉及測試樣品中ADAM9之表現水準與「參考值」之間的比較。在一些實施例中，參考值為參考樣品中ADAM9之表現水準。參考值可為預定值且亦可由與測試樣品並行測試之參考樣品來確定(例如，對照生物樣品或在無對照生物樣品之情況下由病理學家基於他的/她的病理學訓練及經驗來確定)。參考值可為單一截止值，諸如中值或平均值或值範圍，諸如置信區間。參考值可針對不同個體亞組來確立，諸如易患癌症之個體、具有早期或晚期癌症之個體、男性及/或女性個體或經歷癌症療法之個體。在本文中描述了正常參考樣品或值及陽性參考樣品或值之實例。

在一些實施例中，參考樣品為來自健康組織，尤其不受癌症影響之相應組織的樣品。此等類型之參考樣品被稱為陰性對照樣品。在其他實施例中，參考樣品為來自表現ADAM9之腫瘤組織之樣品。此等類型之參考樣品被稱為陽性對照樣品。陽性對照樣品亦可用作均勻性(具有相同染色強度之細胞的細胞百分比)及/或與ADAM9表現水準相關之染色強度程度(1、2、3)的比較性指標。陽性對照比較樣品亦稱為校準參考樣品，其表現出染色強度或均勻性之動態範圍。特定癌症之ADAM9之合適陽性及陰性參考水準可藉由量測一或多個合適個體中之ADAM9水準來確定，且此等參考水準可針對特定個體群體來定製(例如，參考水準可經年齡匹配以使得可針對某一年齡組中之特定疾病狀態、表型或其缺乏，在某一年齡之個體之樣品中的ADAM9水準與參考水準之間進行比較)。此等參考水準亦可針對用於量測生物樣品中之ADAM9水準之特定技術(例如，免疫檢定等)來定製，其中ADAM9水準可基於所使用的特定技術而不同。

本文中之術語「初級抗體」係指特異性結合至組織樣品中之靶標蛋白抗原之抗體。初級抗體通常為用於免疫組織化學(IHC)程序中之第一抗體。在一個實施例中，初級抗體為用於IHC程序中之唯一抗體。本文中之術語「次級抗體」係指特異性結合至初級抗體，由此形成初級抗體與後續試劑(若有的話)之間的橋接的抗體。次級抗體通常為用於免疫組織化學程序中之第二抗體。

本發明之「樣品」或「生物樣品」為生物來源，在特定實施例中，諸如來自真核生物體。在較佳實施例中，樣品為人類樣品，但動物樣品亦可用於實踐本發明。本發明尤其可用於癌症樣品，通常包含固體組織樣品。該方法可用於檢查ADAM9之表現態樣或樣品狀態，包括但不限於比較不同類型之細胞或組織、比較不同發育階段及偵測或確定疾病或異常之存在及/或類型。

對於本文中之目的，組織樣品之「切片」係指組織樣品之單一部分或碎片，例如，自組織樣品切割之組織或細胞薄片。應瞭解可獲取組織樣品之多個切片且經受根據本發明之分析。在一些情況下，所選組織部分或切片包含均質細胞群體。在其他情況下，作為非限制性實例，所選部分包含組織區域，例如管腔。所選部分可小至一個細胞或兩個細胞，或可代表例如數千個細胞。

術語「相關聯(correlate/correlating)」意謂以任何方式將第一分析之性能及/或結果與第二分析之性能及/或結果相比較。例如，可將第一分析之結果用於執行第二分析且/或可將第一分析之結果用於確定是否應執行第二分析且/或可將第一分析之結果與第二分析之結果相比較。在一個實施例中，ADAM9表現增加與ADAM9靶向抗癌療法之有效性可能性增加相關。

術語「抗體」意謂能夠透過位於免疫球蛋白分子之可變域中之至少一個抗原識別位點來特異性結合至靶標諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體(antibody/antibodies)」係指單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多株抗體、駱駝抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、胞內抗體及上述任一者之抗原決定基結合片段。具體而言，術語「抗體」包含免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性片段，亦即，含有抗原決定基結合位點之分子。免疫球蛋白分子可為任何類型( 例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別( 例如，IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及IgA ₂)或亞類。抗體可為裸的或結合至其他分子諸如毒素、放射性同位素等。

由於在此分子上存在特定域或部分或構型(「抗原決定基」)，抗體能夠「免疫特異性結合」至多肽或蛋白或非蛋白分子。含有抗原決定基之分子可具有免疫原性活性，以使得其在動物中引起抗體生產反應；此等分子稱為「抗原」。若相對於替代性抗原決定基，如本文所用之抗體更頻繁地、更迅速地、以更大持續時間及/或以更大親和力與另一個分子之區域( 亦即，抗原決定基)反應或締合，則該抗體被認為「免疫特異性」結合該抗原決定基。例如，免疫特異性結合至病毒抗原決定基之抗體為與其免疫特異性結合至其他病毒抗原決定基或非病毒抗原決定基相比，以更大親和力、親合力、更容易地及/或以更大持續時間來結合該病毒抗原決定基的抗體。閱讀此定義，亦應理解例如免疫特異性結合至第一靶標之抗體(或部分或抗原決定基)可以或可以不特異性或優先結合至第二靶標。因此，「免疫特異性結合」至特定抗原決定基不一定要求(但其可包括)排他地結合至該抗原決定基。通常，但不一定，提及結合意謂「免疫特異性」結合。若此結合展現出受體結合至其相應配位體的特異性，則兩個分子被認為能夠以「生理特異性」方式彼此結合。

術語「單株抗體」係指均質抗體群體，其中單株抗體包含參與抗原之選擇性結合的胺基酸(天然存在或非天然存在)。單株抗體為高度特異性的，針對單一抗原決定基(或抗原位點)。術語「單株抗體」不僅涵蓋完整單株抗體及全長單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab') ₂Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白、人源化單株抗體、嵌合單株抗體及包含具有所需特異性之抗原識別位點及結合至抗原之能力的免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態。該術語不意欲在抗體來源或其產生方式( 例如，融合瘤、噬菌體選擇、重組表現、轉殖基因動物等)方面受到限制。該術語包括如上在「抗體」定義下所述之完整免疫球蛋白以及片段等。製備單株抗體之方法在此項技術中為已知的。可使用之一種方法為Kohler，G. 等人(1975) 「 Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,」 Nature 256:495-497之方法或其改進。通常，單株抗體在小鼠、大鼠或兔中發育。抗體藉由用免疫原性量之含有所要抗原決定基之細胞、細胞提取物或蛋白製劑免疫動物來產生。免疫原可為但不限於原代細胞、培養細胞株、癌細胞、蛋白、肽、核酸或組織。用於免疫之細胞可在其用作免疫原之前培養一段時間( 例如，至少24小時)。細胞可本身或與非變性佐劑諸如Ribi組合來用作免疫原(參見，例如Jennings, V.M. (1995) 「 Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production」, ILAR J. 37(3):119-125)。通常，當用作免疫原時，細胞應保持完整且較佳為有活力的。與破裂細胞相比，完整細胞可允許抗原更好地藉由經免疫動物來偵測。使用變性或刺激性佐劑，例如，弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)，可使細胞破裂且因此為不鼓勵的。免疫原可在定期間隔時間多次投與，諸如每兩週或每週，或可以在動物( 例如，組織重組體)中保持活力的方式投與。或者，可對現有單株抗體及對於所要病原性抗原決定基具有免疫特異性之任何其他等效抗體進行測序且藉由在此項技術中已知之任何手段來重組產生。在一個實施例中，對此抗體進行測序且然後將多核苷酸序列選殖至載體中以便表現或增殖。編碼感興趣抗體之序列可保持在宿主細胞之載體中且然後可將宿主細胞擴增並冷凍以便將來使用。此類抗體之多核苷酸序列可用於遺傳操作以便產生親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體及/或犬類化抗體，從而改善本發明之抗體以及免疫結合物之親和力或其他特性。將抗體人源化之一般原則涉及保持抗體之抗原結合部分之基本序列，同時將抗體之非人類剩餘部分用人類抗體序列交換。

天然抗體(諸如天然IgG抗體)由與兩條「重鏈」複合的兩條「輕鏈」組成。各輕鏈含有可變域(「VL」)及恆定域(「CL」)。各重鏈含有一個可變域(「VH」)、三個恆定域(「CH1」、「CH2」及「CH3」)及位於CH1域與CH2域之間的「鉸鏈」區(「H」)。相比之下，scFv為藉由經由短連接肽將輕鏈可變域及重鏈可變域連接在一起而製成的單鏈分子。

因此，天然存在之免疫球蛋白( 例如，IgG)之基本結構單元為具有兩條輕鏈及兩條重鏈之四聚體，通常表現為約150,000 Da之醣蛋白。各鏈之胺基末端(「N末端」)部分包括主要負責抗原識別之約100至110或更多個胺基酸的可變域。各鏈之羧基末端(「C末端」)部分界定恆定區，其中輕鏈具有單一恆定域且重鏈通常具有三個恆定域及鉸鏈區。因此，IgG分子之輕鏈之結構為n-VL-CL-c且IgG重鏈之結構為n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n及c分別表示多肽之N末端及C末端)。

術語「抗ADAM9抗體」或「結合ADAM9之抗體」係指能夠以足以使抗體可用作靶向ADAM9之診斷劑及/或治療劑的親和力結合ADAM9之抗體。抗ADAM9抗體與無關非ADAM9蛋白質之結合程度小於抗體與ADAM9之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合ADAM9之抗體具有≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM或≤0.1 nM之解離常數(Kd)。抗ADAM9抗體之實例在此項技術中為已知的且揭示於WO2018/119166、WO2018/119196及WO2020/005945中，該等專利以引用方式併入本文。結合至ADAM9之其他示範性抗體可購自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich及其他公司。可商購獲得之抗ADAM9抗體之實例包括來自以下公司之抗ADAM9抗體：Cell Signaling Technology Product #2099及#4151、ThermoFisher Product # PA5-14338、#PA5-17080及# PA5-76732、Abcam ab186833、Sigma-Aldrich Product # HPA004000、 GeneTex目錄號GTX130025、LifeSpan BioSciences LS-C100638、LS-C502670及LS‑C124856、Novus Biologicals目錄#27120002、Affinity Biosciences目錄# AF7559、CusaBio CSB-PA618774ESR2HU、ProSci目錄# 19-633及62-909、Biorbyt目錄# orb229445及orb192735、Bioss目錄# bs-4204R及bs-4304R-生物素、G Biosciences目錄# ITA7379、Abbex目錄# abx103793及Spring Bioscience抗ADAM9抗體(J12H2L3)。

術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分且係指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、直鏈抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。

術語「抗原決定基」或「抗原決定簇」在本文中可互換使用且係指能夠藉由特定抗體來識別及特異性結合的抗原之部分。當該抗原為多肽時，抗原決定基可由連續胺基酸及藉由蛋白質之三重折疊並置之非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定基通常在蛋白變性後得以保留，而藉由三重折疊來形成之抗原決定基通常在蛋白變性後喪失。抗原決定基通常包含呈獨特空間構型之至少3個及更通常至少5個或8-10個胺基酸。

「結合親和力」係指在分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間的非共價相互作用之總和強度。除非另外指出，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間的1:1相互作用之內在結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之通用方法來量測，該等方法包括本文所述之方法。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常更快地結合抗原且傾向於保持結合更長時間。量測結合親和力之各種方法在此項技術中為已知的，其中之任一者可用於本發明之目的。下文描述了特定說明性實施例。

如本文所用，術語「免疫結合物」或「結合物」係指連接至細胞結合劑(亦即，抗ADAM9抗體或其片段)之化合物或其衍生物且藉由通式C-L-A來定義，其中C=細胞毒素，L=連接子，且A=細胞結合劑或抗ADAM9抗體或抗體片段。免疫結合物亦可藉由呈逆序之通式A-L-C來定義。

「連接子」為能夠以穩定、共價方式將化合物(通常為藥物，諸如類美登醇)連接至細胞結合劑(諸如抗ADAM9抗體或其片段)的任何化學部分。在化合物或抗體保持活性之條件下，連接子可對酸誘導裂解、光誘導裂解、肽酶誘導裂解、酯酶誘導裂解及二硫鍵裂解敏感或基本上對其有抵抗力。合適連接子在此項技術中為熟知的且包括例如二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接子亦包括帶電荷連接子及其親水性形式，如本文描述且在此項技術中已知。

術語「癌症」及「癌性」係指或描述細胞群體之特徵在於不受調控之細胞生長的哺乳動物中之生理疾患。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及各種類型之頭頸癌。在一些實施例中，癌症之實例包括非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、胃癌、乳癌或胰臟癌。在一些實施例中，癌症之實例包括腺癌NSCLC、三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌、胃癌或結腸直腸癌。

「腫瘤」及「贅生物」係指由於過度細胞生長或增殖導致的任何組織腫塊，其為良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括癌前期病變。

術語「癌細胞」、「腫瘤細胞」及語法等效物係指來源於腫瘤或癌前期病變的總細胞群體，包括構成大部分腫瘤細胞群體之非致瘤性細胞及致瘤性幹細胞(癌症幹細胞)兩者。如本文所用，當僅涉及缺少更新及分化之能力的彼等腫瘤細胞時，術語「腫瘤細胞」將由術語「非致瘤性」來修飾，以便區分彼等腫瘤細胞與癌症幹細胞。

術語「個體」係指成為特定治療之接受者的任何動物(例如，哺乳動物)，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、齧齒類動物及其類似動物。通常，術語「個體」及「患者」在本文中關於人類個體時可互換使用。

術語「醫藥調配物」係指以下製劑：其呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分。此調配物可為無菌的。

如本文揭示之抗體或抗體免疫結合物之「有效量」為足以執行具體規定用途之量。

術語「治療有效量」係指有效「治療」個體或哺乳動物中之疾病或病症的抗體、抗體免疫結合物或其他藥物之量。在癌症的情況下，藥物之治療有效量可減少癌細胞之數目；減少腫瘤大小；抑制(亦即，在一定程度上減緩且在某一實施例中停止)癌細胞浸潤至周圍器官中；抑制(亦即，在一定程度上減緩且在某一實施例中停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上緩和與癌症相關之一個或多個症狀。參見本文中之「治療」之定義。在該藥物可預防現有癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞之程度上，其可為細胞抑制性及/或細胞毒性的。

術語「有利地作出反應」通常係指在個體中引起有益狀態。關於癌症治療，該術語係指對個體提供治療效果。癌症中之積極治療效果可以許多方法來量測(參見W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50:1 S-10S (2009))。例如，腫瘤生長抑制、分子標誌物表現、血清標誌物表現及分子成像技術全部都可用於評估抗癌治療劑之治療功效。關於腫瘤生長抑制，根據NCI標準，＜42%之T/C為抗腫瘤活性之最低水準。＜10%之T/C被視為高抗腫瘤活性水準，其中T/C(%)=經治療者之中值腫瘤體積/對照組之中值腫瘤體積x100。癌症治療之其他有利反應可包括增加的無進展存活(PFS)、無疾病存活(DFS)或總體存活(OS)、完全反應(CR)、部分反應(PR)或在一些情況下穩定疾病(SD)、進行性疾病(PD)減少、進展時間(TTP)減少。

當在本文中使用時，措詞「標記物」係指直接或間接地結合至抗體以便產生「經標記」抗體的可偵測化合物或組成物。標記物可本身為可偵測的(例如，放射性同位素標記物或螢光標記物)或在酶性標記物的情況下，可以催化可偵測之受質化合物或組成物之化學改變。

術語諸如「治療(treating/treatment/to treat)」或「減輕(alleviating/to alleviate)」係指1)治癒所診斷之病理疾患或病症、減緩該疾患或病症、減輕該疾患或病症之症狀及/或停止該疾患或病症之進展的治療性措施及2)防止及/或減緩靶向病理疾患或病症之發展的預防或防範措施兩者。因此，需要治療之彼等者包括已經患有病症之彼等者；傾向於患有病症之彼等者；及病症待預防之彼等者，在某些實施例中，若患者顯示出以下一或多者，則個體根據本發明之方法成功地「治療」癌症：惡病體質減少、存活時間增加、腫瘤進展時間延長、腫瘤質量減少、腫瘤負荷減少及/或腫瘤轉移時間、腫瘤復發時間延長、腫瘤反應、完全反應、部分反應、穩定疾病、進行性疾病、無進展存活(PFS)、總體存活(OS)，其各者藉由如國家癌症研究院(National Cancer Institute)及美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration)對於批准新藥物所設定之標準來量測。參見Johnson等人, (2003) J. Clin. Oncol. 21(7): 1404-1411。

「無進展存活」(PFS)亦被稱為「腫瘤進展時間」(YIP)，指示在治療期間及之後，癌症不生長之時間長度。無進展存活可包括患者已經歷完全反應或部分反應之時間量以及患者已經歷穩定疾病之時間量。

「完全反應」或「完全緩解」或「CR」指示腫瘤或癌症之所有體征回應於治療而消失。這並不總是意指癌症已治癒。

如本文所用，「部分反應」或「PR」係指回應於治療，一或多種腫瘤或病變之大小或體積或身體中癌症之程度減少。

「穩定疾病」係指不存在進展或復發之疾病。在穩定疾病中，既沒有足夠腫瘤縮小以便符合部分反應，亦沒有足夠腫瘤增加以便可充當進行性疾病。

「進行性疾病」係指出現一或多個新病變或腫瘤及/或現有非靶標病變之明確進展。進行性疾病亦可係指自治療開始，由於腫瘤之質量或擴散增加而導致腫瘤生長超過20%。

「無疾病存活」(DFS)係指在治療期間及之後，患者保持無疾病之時間長度。

「總體存活」(OS)係指與原始或未治療個體或患者相比，預期壽命延長。

如本文所用，「烷基」係指一個至二十個碳原子之飽和直鏈或支鏈一價烴基團。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH ₂CH(CH ₃) ₂)、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。較佳地，烷基具有一個至十個碳原子。更佳地，烷基具有一個至四個碳原子。

基團中碳原子之數目可在本文中由字首「C _x-xx」來指定，其中x及xx為整數。例如，「C _1-4烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。

術語「化合物」或「細胞毒性化合物」或「細胞毒性劑」可互換使用。其意欲包括其結構或式或任何衍生物已在本發明中得以揭示或其結構或式或任何衍生物已以引用方式併入的化合物。該術語亦包括本發明揭示之所有分子式之化合物的立體異構物、幾何異構物、互變異構物、溶劑化物、代謝物及鹽( 例如，醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括前述任一者之任何溶劑化物、水合物及多晶型物。在本申請案描述之本發明之某些態樣中具體敘述「立體異構物」、「幾何異構物」、「互變異構物」、「溶劑化物」、「代謝物」、「鹽」、「結合物」、「結合物鹽」、「溶劑化物」、「水合物」或「多晶型物」不應理解為在使用術語「化合物」而不敘述此等其他形式的本發明之其他態樣中有意遺漏此等形式。

術語「對掌性」係指分子具有鏡像搭配物之不可重疊特性，而術語「非對掌性」係指分子在其鏡像搭配物上可重疊。

術語「立體異構物」係指如下化合物，其具有相同化學構造及連接性，但是其原子在空間中之不同取向不能藉由圍繞單一鍵旋轉來互相轉化。

「非鏡像異構物」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且其分子彼此不為鏡像之立體異構物。非鏡像異構物具有不同物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非鏡像異構物之混合物可在諸如結晶、電泳及層析之高解析度分析程序下分離。

「鏡像異構物」係指化合物之彼此爲不可重疊鏡像之兩個立體異構物。

本文所用之立體化學定義及慣例通常遵循S. P. Parker編, McGraw-Hill, Dictionary of Chemical Terms(1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及Eliel, E.及Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994。本發明化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構形式存在。預期本發明化合物之所有立體異構形式形成本發明之一部分，該等形式包括但不限於非鏡像異構物、鏡像異構物及阻轉異構體、以及其混合物諸如外消旋混合物。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即，其具有使平面偏振光之平面旋轉之能力。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示分子圍繞其對掌性中心之絕對組態。字首d及l或(+)及(-)係用於指定平面偏振光經化合物旋轉之標志，其中(-)或l意指化合物爲左旋的。字首為(+)或d之化合物為右旋的。針對給定化學結構，此等立體異構物為相同的，只不過其彼此為鏡像。特定立體異構物亦可稱爲鏡像異構物，且此類異構物之混合物常常稱爲鏡像異構混合物。鏡像異構物之50:50混合物稱爲外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或製程中不存在立體選擇或立體特異性時存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指兩種鏡像異構物質之等莫耳濃度混合物，其缺乏光學活性。

術語「互變異構物」或「互變異構形式」係指可經由低能量障壁來互相轉化的不同能量之結構異構物。例如，質子互變異構物(亦稱為質子移變互變異構物)包括經由質子之遷移進行的互相轉化，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構化。價鍵互變異構物包括藉由一些鍵結電子之重組進行的互相轉化。

術語「陽離子」係指具有正電荷之離子。陽離子可為一價(例如，Na ⁺、K ⁺、NH ₄ ⁺等)、二價(例如，Ca ²⁺、Mg ²⁺等)或多價(例如，Al ³⁺等)。較佳地，陽離子為一價。

如本文所用，片語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機鹽或無機鹽。示範性鹽包括但是不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、蔗糖鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、雙羥萘酸鹽( 亦即，1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸))鹽、鹼金屬( 例如，鈉及鉀)鹽、鹼土金屬( 例如，鎂)鹽及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包含另一種分子，諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。相對離子可為使母體化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽可在其結構中具有多於一個帶電荷原子。多個帶電荷原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的實例可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電荷原子及/或一或多個相對離子。

若本發明化合物為鹼，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由在此項技術中可獲得之任何合適方法來製備，例如用無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸及其類似酸，或用有機酸，諸如乙酸、順丁烯二酸、丁二酸、扁桃酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、哌喃糖苷酸諸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸、α羥基酸諸如檸檬酸或酒石酸、胺基酸諸如天冬胺酸或麩胺酸、芳族酸諸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸諸如對甲苯磺酸或乙磺酸或類似酸來處理遊離鹼。

若本發明化合物為酸，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由任何合適方法來製備，例如用無機鹼或有機鹼，諸如胺(第一胺、第二胺或第三胺)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或類似物來處理遊離酸。合適鹽之說明性實例包括但不限於衍生自胺基酸諸如甘胺酸及精胺酸、氨、第一胺、第二胺及第三胺及環胺諸如哌啶、嗎啉及哌嗪之有機鹽，及衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。

如本文所用，術語「溶劑化物」意指進一步包括化學計算量或非化學計算量之藉由非共價分子間力來結合的溶劑的化合物，該溶劑諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇或類似物。化合物之溶劑化物或水合物藉由向化合物添加至少一莫耳當量之羥基溶劑諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水以便導致亞胺部分之溶劑化或水合來容易地製備。

術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸由NH ₂-C(R ^aa’R ^aa)-C(=O)OH表示，其中R ^aa及R ^aa’各自獨立地為H，具有1至10個碳原子之視情況經取代之直鏈、支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，芳基，雜芳基或雜環基，或者R ^aa及N末端氮原子可一起形成雜環( 例如，如在脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基」係指當一個氫原子自胺基酸之胺末端移除且/或羥基自胺基酸之羧基末端移除的相應殘基，諸如-NH-C(R ^aa’R ^aa)-C(=O)-。當胺基酸或胺基酸殘基在不指示α碳之特定立體化學的情況下提及時，其意欲包括L-異構物及R-異構物兩者。例如，「Ala」包含L-丙胺酸及R-丙胺酸兩者。

術語「肽」係指藉由肽(醯胺)鍵來連接的胺基酸單體之短鏈。在一些實施例中，肽含有2至20個胺基酸殘基。在其他實施例中，肽含有2至10個胺基酸殘基。在其他實施例中，肽含有2至5個胺基酸殘基。如本文所用，當肽為藉由特定胺基酸序列表示的本文所述之細胞毒性劑或連接子之一部分時，肽可在兩個方向上連接至細胞毒性劑或連接子之其餘部分。例如，二肽X1-X2包括X1-X2及X2-X1。類似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3及X3-X2-X1，且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4及X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3及X4表示胺基酸殘基。當肽或肽殘基在不指示各胺基酸或胺基酸殘基之立體化學的情況下提及時，其意欲包括L-異構物及R-異構物兩者。然而，當肽或肽殘基中之一或多個胺基酸或胺基酸殘基之立體化學經指定為D-異構物時，未指定立體化學之肽或肽殘基中之另一個胺基酸或胺基酸殘基意欲僅包括天然L-異構物。例如，「Ala-Ala-Ala」意欲包括Ala中之各者可為L-異構物或R-異構物的肽或肽殘基；而「Ala-D-Ala-Ala」意欲包括L-Ala-D-Ala-L-Ala。

如本文所用，藥物-抗體比率(DAR)為共價連接至一個抗體分子之細胞毒性劑的平均數目(亦即，q之平均值)。

除非上下文另有明確規定，否則如在本揭示案及請求項中所用之單數形式「一個/種(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。

應理解，當在本文中用語言「包含」描述各實施例時，亦提供以術語「由...組成」及/或「實質上由...組成」描述之其他相似實施例。

如本文中之片語諸如「A及/或B」中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」及「B」兩者。同樣地，如在片語諸如「A、B及/或C」中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。 II. 生物樣品

生物樣品經常用固定劑來固定。通常使用醛固定劑諸如福馬林(甲醛)及戊二醛。使用其他固定技術諸如乙醇(alcohol)浸泡(Battifora及Kopinski, J. Histochem. Cytochem，(1986)34:1095)來固定之組織樣品亦為合適的。所用樣品亦可包埋於石蠟中。在一個實施例中，組織樣品均經福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。在另一個實施例中，在選擇一或多個部分用於分析之前，對FFPE塊進行蘇木精及伊紅染色，以便選擇FFPE核心樣品之特定區域。由此等顆粒樣本製備組織塊之方法已用於各種預後因子之先前IHC研究中，且/或為熟習此項技術者熟知的。(參見，例如，Abbondanzo等人Am J Clin Pathol, 1.990年5月;93(5):698-702；Aflred等人, Arch Surg. 1990年1月;125(l):l07-13)。

簡言之，可將任何完整器官或組織切割成相當較小碎片並在各種固定劑(例如福馬林、乙醇等)中培育不同時段直到組織「固定」為止。樣品可實際上為自體內手術移除之任何完整組織。可將樣品切割成適合於在組織病理學實驗室中常規使用之設備的適當較小碎片。切割碎片之大小通常在幾毫米至幾釐米範圍內。 III. 偵測抗體結合物

在一些實施例中，將通常單株類型的針對ADAM9之抗體連接到至少一種劑以便形成偵測抗體結合物。為了增加抗體分子作為診斷劑之功效，按照慣例，連接或共價結合或複合至少一種所要分子或部分。此分子或部分可為但不限於至少一種報道分子。報道分子經定義為可使用檢定來偵測之任何部分。已結合至抗體的報道分子之非限制性實例包括酶、放射性標記物、半抗原、螢光標記物、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、光親和分子、有色顆粒及/或配位體諸如生物素。

具有足夠選擇性、特異性或親和力之任何細胞結合劑(例如，抗體或多肽)可用作偵測ADAM9多肽之基礎。此類性質可使用為熟習此項技術者已知之習知免疫篩檢方法來評估。除了標準抗原結合位點以外，結合至抗體分子中之生物活性分子的位點包括駐留於可結合抗原之可變域中之位點。另外，可變域參與抗體自身結合(Kang等人, 1988)且含有藉由抗抗體來識別之抗原決定基(獨特位)(Kohler等人, 1989)。

蛋白結合(例如，抗體)結合物之某些實例為蛋白結合劑(例如，抗體)連接至可偵測標記物之彼等結合物。「可偵測標記物」為由於其特定功能性質及/或化學特性而可偵測的化合物及/或元素，其使用允許其所附接之抗體得以偵測，且/或若需要，則進一步定量。

許多合適成像劑與用於將其附接至抗體之方法一樣在此項技術中為已知的(參見，例如，美國專利第5,021,236號；第4,938,948號；及第4,472,509號，其各自以引用方式併入本文)。所用成像部分可為例如順磁性離子；放射性同位素；螢光染料；NMR可偵測物質；及/或X射線成像。

預期作為蛋白結合(例如，抗體)結合物來使用之示範性螢光標記物包括例如Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5,6-FAM、Dylight 488、異硫氰酸螢光素、綠色螢光蛋白(GFP)、HEX、6- JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、藻紅蛋白、REG、羅丹明綠(Rhodamine Green)、羅丹明紅(Rhodamine Red)、四甲基羅丹明(TMR)、泛影酶原(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基羅丹明、得克薩斯紅(Texas Red)及此等標記物之衍生物(亦即鹵化類似物，其用異硫氰酸酯或用於結合之其他連接子等來修飾)。示範性放射性標記物為氚。

可用於本發明中之蛋白結合(例如，抗體)偵測結合物包括在活體外使用之彼等者，其中抗體連接至次級結合配位體及/或酶(酶標籤)，該酶在與顯色受質接觸後產生有色產物。合適酶之實例包括尿素酶、鹼性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶及/或葡萄糖氧化酶。較佳次級結合配位體為生物素及/或抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白化合物。此類標記物之用途為熟習此項技術者熟知的且描述於例如美國專利第3,817,837號；第3,850,752號；第3,939,350號；第3,996,345號；第4,277,437號；第4,275,149號及第4,366,241號；該等專利各自以引用方式併入本文。

透過藉由低強度紫外線產生之反應性氮烯中間物，含有疊氮基之分子亦可用於形成與蛋白質之共價鍵(Potter & Haley, 1983)。具體而言，嘌呤核苷酸之2-疊氮基及8-疊氮基類似物已用作定點光探針以便鑑別粗細胞提取物中之核苷酸結合蛋白(Owens & Haley, 1987；Atherton等人, 1985)。2-疊氮基及8-疊氮基核苷酸亦已用於定位經純化蛋白之核苷酸結合域(Khatoon等人, 1989；King等人, 1989；及Dholakia等人, 1989)並可用作抗體結合劑。

用於將抗體附接或結合至其結合部分的多種方法在此項技術中為已知的。一些附接方法涉及使用金屬螯合物絡合物，其使用附接至抗體的例如有機螯合劑，諸如二乙三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3a-6a-二苯基甘脲-3(美國專利第4,472,509號及第4,938,948號，其各自以引用方式併入本文)。單株抗體亦可在偶合劑諸如戊二醛或高碘酸鹽存在下與酶反應。具有螢光素標誌物之蛋白結合(例如，抗體)結合物在此等偶合劑存在下或藉由與異硫氰酸酯反應來製備。在美國專利第4,938,948號中，例如乳腺腫瘤之成像使用單株抗體來達成，且可使用連接子諸如甲基-對羥基苯甲亞胺酸酯或N-琥珀醯亞胺基-3-(4-羥苯基)-丙酸酯，將可偵測成像部分結合至抗體。

在其他實施例中，預期藉由使用不改變抗體組合位點之反應條件在免疫球蛋白之Fc區中選擇性地引入巰基來將免疫球蛋白衍生化。揭示根據此方法產生之抗體結合物表現出經改良之壽命、特異性及靈敏度(美國專利第5,196,066號，其以引用方式併入本文)。亦在文獻(O'Shannessy等人, 1987)中揭示效應分子或報道分子之位點特異性附接，其中報道分子或效應分子結合至Fc區中之碳水化合物殘基。

在其他實施例中，免疫球蛋白用核素諸如氚來放射性標記。在另外實施例中，使用奈米金顆粒(諸如約0.5 nm-40 nm之大小)及/或量子點(Hayward, Calif.)。 IV. 酶及受質(色原)

受質及指示劑可用於偵測ADAM9，諸如下文提供之示範性實施例。

辣根過氧物酶(HRP)為首先與過氧化氫形成複合物且然後導致其分解，由此產生水及原子氧的酶。與許多其他酶一樣，HRP及一些HRP樣活性可藉由過量受質來抑制。在HRP與過量過氧化氫之間形成之複合物為無催化活性的且在不存在電子給予體(例如，顯色物質)時可逆地受到抑制。過量過氧化氫及不存在電子給予體導致內源HRP活性猝滅。

當用於檢定系統中時，HRP亦可用於將規定受質轉化成其活化色原，由此導致變色。HRP酶可藉由許多方法來結合至抗體、蛋白、肽、聚合物或其他分子。此類方法在此項技術中為已知的。將戊二醛添加至含有HRP與抗體之混合物的溶液中會導致更多抗體分子彼此結合，而非與酶結合。在兩步驟程序中，HRP首先與雙官能試劑反應。在第二階段中，僅經活化HRP與抗體混合，導致更加有效得多的標記且沒有聚合。使用兩步驟戊二醛程序，HRP亦結合至(鏈黴)抗生物素蛋白。此形式用於例如其中LAB及LSAB為受質的程序中。與生物素結合亦涉及兩個步驟，因為生物素必須首先衍生為生物素基-N-羥基琥珀醯亞胺酯或生物素醯肼，然後可使其與HRP酶之ε胺基反應。

3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)為諸如HRP之酶之受質，其產生非常不溶於乙醇及其他有機溶劑中的棕色最終產物。DAB之氧化亦導致聚合，由此產生與四氧化鋨反應之能力，且由此增加其染色強度及電子密度。在用於強化聚合DAB之光密度的若干金屬及方法中，氯化金與硫化銀之組合似乎為最成功的。

3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)為諸如HRP之酶之受質。在氧化後，形成可溶於乙醇中的玫瑰紅最終產物。因此，用AEC處理之樣本不能浸沒於乙醇或乙醇溶液(例如，Harris蘇木精)中。相反，應使用水性複染劑及封固劑。AEC不幸地對於進一步氧化敏感且在暴露於過量光時，強度減弱。因此建議在黑暗中儲存。

4-氯-1-萘酚(CN)為諸如HRP之酶之受質並且沉澱為藍色最終產物。因為CN可溶於乙醇及其他有機溶劑中，所以樣本不能脫水，暴露於乙醇複染劑，或使用含有有機溶劑之封固劑來蓋片。不同於DAB，CN傾向於自沉澱部位擴散。

對苯二胺二鹽酸鹽/鄰苯二酚(Hanker-Yates試劑)為諸如HRP之酶之電子給予體受質且給出不溶於乙醇及其他有機溶劑中的深藍色反應產物。與經聚合DAB一樣，此反應產物可用鋨酸染色(osmicated)。在免疫過氧化物酶技術中已用Hanker-Yates試劑達成不同結果。

牛小腸鹼性磷酸酶(AP)(分子量100 kD)為藉由破壞P-0鍵來將磷酸酯基團自有機酯移除(藉由水解)並轉移的酶；暫時地形成中間酶-受質鍵。AP之主要金屬活化劑為Mg ²⁺、Mn ²⁺及Ca ²⁺。

AP尚未廣泛用於免疫組織化學中直到公佈未經標記鹼性磷酸酶抗鹼性磷酸酶(APAAP)程序為止。用於此程序中之可溶性免疫複合物具有大約560 kD之分子量。與PAP技術相比，APAAP程序之主要優點為不存在由內源性過氧化物酶活性造成之干擾。因為內源性過氧化物酶活性對於PAP染色之潛在干擾，所以推薦APAAP技術用於血液及骨髓塗片。來自骨骼、腎臟、肝臟及一些白血球之內源性鹼性磷酸酶活性可藉由將1 mM左旋咪唑添加至受質溶液來抑制，但已發現5 mM更有效。小腸鹼性磷酸酶未經左旋咪唑充分抑制。

在免疫鹼性磷酸酶染色法中，該酶將萘酚磷酸酯(受質)水解成酚類化合物及磷酸酯。酚類偶合至無色重氮鹽(色原)以便產生不溶性的有色偶氮染料。已成功使用受質及色原之多種不同組合。

萘酚AS-MX磷酸酯可以其酸形式或作為鈉鹽來使用。色原Fast Red TR及Fast Blue BB分別產生亮紅色或藍色最終產物。兩者可溶於乙醇及其他有機溶劑中，因此必須使用水性封固劑。當染色細胞塗片時，Fast Red TR為較佳的。

附加示範性受質包括萘酚AS-BI磷酸酯、萘酚AS-TR磷酸酯及5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸酯(BCIP)。其他可能色原包括例如Fast Red LB、Fast Garnet GBC、硝基四氮唑藍(NBT)、碘硝基四氮唑紫(INT)及該等結構之衍生物。 V. 免疫偵測方法

在更進一步實施例中，抗體可用於偵測野生型及/或突變體配位體蛋白、多肽及/或肽。野生型及/或突變體配位體特異性抗體可用於本發明之方法中。僅舉幾個實例，一些免疫偵測方法包括流動式細胞量測術、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)、免疫放射檢定、螢光免疫檢定、化學發光檢定、生物發光檢定及西方墨點法。各種可用免疫偵測方法之步驟已描述於科技文獻中，諸如例如Doolittle M H及Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999;109:215-37；Gulbis B及Galand P, Hum Pathol. 1993 Dec;24(12): 1271-85；及De Jager R等人, Semin Nucl Med. 1993 Apr;23(2): 165-79，該等文獻各自以引用方式併入本文。

通常，免疫結合方法包括獲得疑似包含配位體蛋白、多肽及/或肽之樣品，且根據本發明，視情況而定在有效允許形成免疫複合物之條件下，將樣品與第一配位體結合肽(例如，抗配位體抗體)接觸。

在抗原偵測方面，所分析之生物樣品可為疑似包含野生型或突變體配位體蛋白特異性抗原之任何樣品，諸如組織切片或樣本、均化組織提取物、生檢吸出物、細胞、上述含有野生型或突變體ADAM9組成物中任一者之經分離及/或經純化形式或甚至與組織接觸之任何生物流體，包括血液及/或血清，但組織樣品或提取物為較佳的。

在有效條件下且持續足以允許形成免疫複合物(初級免疫複合物)的時段，將所選生物樣品與抗體接觸通常係大約僅將抗體組成物添加至樣品且培育混合物持續足夠長以便抗體與所存在之任何配位體蛋白抗原形成免疫複合物，亦即，結合至該等抗原的時段。在此時間之後，通常將洗滌樣品-抗體組成物，諸如組織切片、ELISA板、斑點印跡或西方墨點，以便移除任何非特異性結合之抗體物質，從而僅允許偵測特異性結合在初級免疫複合物內之彼等抗體。

通常，免疫複合物形成之偵測在此項技術中為熟知的且可透過應用許多方法來達成。此等方法通常基於標記物或標誌物，諸如任何彼等放射性、螢光、生物及酶性標籤之偵測。關於此類標記物之用途的美國專利包括美國專利第3,817,837號；第3,850,752號；第3,939,350號；第3,996,345號；第4,277,437號；第4,275,149號及第4,366,241號，該等專利各自以引用方式併入本文。當然，可發現透過使用次級結合配位體諸如第二抗體及/或生物素/抗生物素蛋白配位體結合佈置的附加優勢，如在此項技術中已知。

用於偵測之抗配位體抗體可本身連接至可偵測標記物，其中然後僅偵測此標記物，由此允許確定組成物中初級免疫複合物之量。或者，結合在初級免疫複合物內之第一抗體可藉助於針對該抗體具有結合親和力之第二結合劑來偵測。在此等情況下，第二結合劑可連接至可偵測標記物。第二結合劑本身通常為抗體，其因此可稱為「次級」抗體或聚合物偵測系統。在有效條件下且持續足以允許形成次級免疫複合物之時段，使初級免疫複合物與經標記之次級結合劑或抗體/聚合物偵測系統接觸。然後，通常洗滌次級免疫複合物，以便移除任何非特異性結合之經標記次級抗體或配位體，且然後偵測次級免疫複合物中之剩餘標記物。

其他方法包括藉由兩步法來偵測初級免疫複合物。針對該抗體具有結合親和力之第二結合劑(諸如抗體)用於形成次級免疫複合物，如上所述。洗滌後，再次在有效條件下且持續足以允許形成免疫複合物(第三免疫複合物)之時段，使次級免疫複合物與針對第二抗體具有結合親和力之第三結合劑或抗體接觸。第三配位體或抗體連接至可偵測標記物，允許偵測由此形成之第三免疫複合物。若需要，此系統可提供信號擴增。

在另一個實施例中，生物素化單株或多株抗體用於偵測靶標抗原，且然後第二步驟抗體用於偵測附接至複合生物素之生物素。在該方法中，待測試之樣品首先在包含第一步驟抗體之溶液中培育。若靶標抗原存在，一些抗體結合至該抗原以形成生物素化抗體/抗原複合物。然後，抗體/抗原複合物藉由在鏈黴抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA及/或互補生物素化DNA之連續溶液中培育來擴增，其中各步驟將附加生物素位點添加至抗體/抗原複合物。重複擴增步驟直到達成合適擴增水準為止，在此時間點將樣品在包含針對生物素之第二步驟抗體之溶液中培育。此第二步驟抗體如例如用酶來標記，該酶可用於藉由使用色原受質之組織酶學來偵測抗體/抗原複合物之存在。藉由合適擴增，可產生宏觀可見的蛋白結合(例如，抗體)結合物。

另一種已知的免疫偵測方法利用免疫-PCR(聚合酶鏈反應)方法。PCR方法使用藉由釋放抗體之低pH或高鹽緩衝液來沖洗的DNA/生物素/鏈黴抗生物素蛋白/抗體複合物。然後，使用所得洗滌溶液以藉由具有合適控制之合適引子來執行PCR反應。在特定實施例中，PCR之巨大擴增能力及特異性可用於偵測單一抗原分子。此偵測可即時發生。例如，涵蓋使用定量即時PCR。

在患有各種疾病形式之患者的臨床診斷及/或監測中，與來自正常個體之對應生物樣品中之水準相比，偵測到ADAM9突變體及/或ADAM9水準之改變，指示患者患有該疾病。然而，如為熟習此項技術者已知，此臨床診斷不一定孤立地基於此方法來進行。熟習此項技術者非常熟悉對生物標誌物之類型及/或量的顯著差異的區分，該等差異代表生物標誌物之陽性鑑別及/或低水準及/或背景變化。事實上，背景表現水準通常用於形成「截止值，高於該值之偵測增加經評定為顯著及/或陽性的。

在一個實施例中，將ADAM9之免疫偵測(藉由免疫組織化學)針對強度及均勻性來評分(經染色細胞之百分比-僅膜、僅細胞質或膜與細胞質之組合)。ADAM9表現強度之比較量表涉及0-陰性、0-1-極弱、1-弱、1-2-弱至中度、2-中度、2-3-中度至強烈、3-強烈。數量上，評分0表示在腫瘤細胞中未觀察到染色( 例如，僅膜、僅細胞質或膜與細胞質之組合)。評分1表示在腫瘤細胞中微弱/幾乎不可察覺之染色( 例如，僅膜、僅細胞質或膜與細胞質之組合)。對於評分2，在腫瘤細胞中觀察到中度染色( 例如，僅膜、僅細胞質或膜與細胞質之組合)。最後，評分3 表示腫瘤細胞中之強烈染色( 例如，僅膜、僅細胞質或膜與細胞質之組合)。 VI. ADAM9結合劑

結合ADAM9之任何抗體可用於本發明之偵測方法中。治療上有效之抗ADAM9抗體之實例可發現於WO2018/119196及WO2020/005945中，該等專利以引用方式併入本文。結合至ADAM9之抗體亦可購自Abcam、Thermofisher、Sigma-Aldrich及其他公司。ADAM9之全長胺基酸(aa)及核苷酸(nt)序列在此項技術中為已知的且亦在本文中提供。用於偵測ADAM9之特別有用抗體為兔單株抗體(Cell Signaling Technologies # 41515)。 VII. 抗ADAM9免疫結合物

本發明亦包括用於增加結合物(在本文中亦稱為免疫結合物)之功效的方法，該等結合物包含抗ADAM9抗體、抗體片段、功能等效物、經改良抗體及其連接或結合至細胞毒素(藥物)或前藥的如本文揭示之態樣。示範性ADAM9免疫結合物可發現於WO2018/119196及WO2020/005945中，該等專利以引用方式併入本文。

合適藥物或前藥在此項技術中為已知的。在某些實施例中，藥物或前藥為細胞毒性劑。用於本發明之細胞毒性結合物中之細胞毒性劑可為導致細胞死亡或誘導細胞死亡或以某種方式減少細胞活力的任何化合物，且包括例如類美登醇及類美登醇類似物、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065及CC-1065類似物、多卡米辛及多卡米辛類似物、烯二炔諸如卡奇黴素、多拉司他汀及多拉司他汀類似物包括奧里斯他汀、托梅黴素衍生物、輕肌蛋白衍生物、胺甲蝶呤、順鉑、卡鉑、柔紅黴素、多柔比星、長春新鹼、長春花鹼、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥及嗎啉基多柔比星。在某些實施例中，細胞毒性劑為類美登醇及類美登醇類似物。

在一些實施例中，可用於本揭示案之方法中之ADAM9免疫結合物為由下式表示之免疫結合物：

(I)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中： CB 為抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段； L ₂由下式中之一者表示：

(L2b)或

； q為1至20之整數。

在一些實施例中，對於如上所述之式(I)免疫結合物，Rx、Ry、Rx’及Ry’皆為H；且l及k各自獨立地為2至6之整數；並且其餘變數如上對於式(I)所述。

在一些實施例中，對於如上所述之式(I)免疫結合物，A為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如上對於式(I)或在第1特定實施例中所述。在一些實施例中，A為可藉由蛋白酶裂解之肽。在一些實施例中，可藉由蛋白酶裂解之肽在腫瘤組織中表現。在一些實施例中，A為具有與–NH-CR ¹R ²-S-L ₁-D共價連接之胺基酸的肽，該胺基酸選自由以下組成之群：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val，其各自獨立地為L或D異構物。在一些實施例中，連接至–NH-CR1R2-S-L1-D之胺基酸為L胺基酸。在一些實施例中，A選自由以下組成之群：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:51)、b-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 52)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 53)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly，其中各肽中之第一胺基酸連接至L ₂基團且各肽中之最後一個胺基酸連接至–NH-CR ¹R ²-S-L ₁-D；且其餘變數如上對於式(I)所述。

在一些實施例中，對於如上所述之式(I)免疫結合物，R ¹及R ²均為H；且其餘變數如上對於式(I)所述。

在一些實施例中，對於如上所述之式(I)免疫結合物，L ₁為–(CH ₂) _4-6-C(=O)-；且其餘變數如上對於式(I)所述。

在一些實施例中，對於如上所述之式(I)免疫結合物，D由下式表示：

；且其餘變數如對於式(I)所述。

在某些實施例中，對於式(I)免疫結合物，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含選自表1及2列出之彼等者的CDR _H1域、CDR _H2域、CDR _H3域、CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3。表1. 示範性重鏈可變區CDR胺基序列

CDR _H1	CDR _H2	CDR _H3
SYWMH (SEQ ID NO: 1) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 8相同)	EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 3) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 35相同)	GGYYYYGSRDYFDY (SEQ ID NO: 5) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 10相同)
SYWIH (SEQ ID NO: 2) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 34相同)	EIIPIFGHTNYNERFQG (SEQ ID NO: 4) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 36相同)	GGYYYYFNSGTLDY (SEQ ID NO: 6) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 37相同)
		GGYYYYIGKGVLDY (SEQ ID NO: 7) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 38相同)
		GGYYYYPRFGWLDY (SEQ ID NO: 8) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 39相同)
		GGYYYYTGKGVLDY (SEQ ID NO: 9) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 40相同)
		GGYYYYDSNAVLDY (SEQ ID NO: 10) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 41相同)
		GGYYYYFHSGTLDY (SEQ ID NO: 11) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 42相同)
		GGYYYYFNKAVLDY (SEQ ID NO: 12) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 43相同)
		GGYYYYGGSGVLDY (SEQ ID NO: 13) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 44相同)
		GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO: 14) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 45相同)
		GGYYYYYNSGTLDY (SEQ ID NO: 15) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 46相同)

表2.示範性輕鏈可變區CDR胺基序列

CDR _L1	CDR _L2	CDR _L3
KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO: 16) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 62相同)	AASDLES (SEQ ID NO: 19) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 13相同)	QQSHEDPFT (SEQ ID NO: 20) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 14相同)
RASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO: 17) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 63相同)		QQSYSTPFT (SEQ ID NO: 21) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 65相同)
RASQSVDYSGDSYLN (SEQ ID NO: 18) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 64相同)

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域： (a) 相應地SEQ ID NO: 1、3及5以及SEQ ID NO: 16、19、20； (b) 相應地SEQ ID NO: 1、3及5以及SEQ ID NO: 17、19、20； (c) 相應地SEQ ID NO: 1、4及5以及SEQ ID NO: 17、19、20；及 (d) 相應地SEQ ID NO: 2、4及5以及SEQ ID NO: 18、19、21。

在某些實施例中，抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域： (a) 相應地SEQ ID NO: 1、3及6以及SEQ ID NO: 16、19、20； (b) 相應地SEQ ID NO: 1、3及7以及SEQ ID NO: 16、19、20； (c) 相應地SEQ ID NO: 1、3及8以及SEQ ID NO: 16、19、20； (d) 相應地SEQ ID NO: 1、3及9以及SEQ ID NO: 16、19、20； (e) 相應地SEQ ID NO: 1、3及10以及SEQ ID NO: 16、19、20； (f) 相應地SEQ ID NO: 1、3及11以及SEQ ID NO: 16、19、20； (g) 相應地SEQ ID NO: 1、3及12以及SEQ ID NO: 16、19、20； (h) 相應地SEQ ID NO: 1、3及13以及SEQ ID NO: 16、19、20； (i) 相應地SEQ ID NO: 1、3及14以及SEQ ID NO: 16、19、20；及 (j) 相應地SEQ ID NO: 1、3及15以及SEQ ID NO: 16、19、20。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:1之CDR _H1域、具有序列SEQ ID NO:3之CDR _H2域及具有序列SEQ ID NO:5之CDR _H3域以及具有序列SEQ ID NO:16之CDR _L1域、具有序列SEQ ID NO:19之CDR _L2域及具有序列SEQ ID NO:20之CDR _L3域。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:1之CDR _H1域、具有序列SEQ ID NO:3之CDR _H2域及具有序列SEQ ID NO:14之CDR _H3域以及具有序列SEQ ID NO:16之CDR _L1域、具有序列SEQ ID NO:19之CDR _L2域及具有序列SEQ ID NO:20之CDR _L3域。

在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)： (a) 相應地SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:35； (b) 相應地SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:36； (c) 相應地SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:36；及 (d) 相應地SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:37。

在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)： (a) 相應地SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:35； (b) 相應地SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:36； (c) 相應地SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:36；及 (d) 相應地SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:37。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有與選自由以下組成之群之序列至少90%、至少95%或至少99%一致之序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)： (a) 相應地SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:35； (b) 相應地SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:35； (c) 相應地SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:35； (d) 相應地SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:35； (e) 相應地SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:35； (f) 相應地SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:35； (g) 相應地SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:35； (h) 相應地SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:35； (i) 相應地SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35；及 (j) 相應地SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)： (a) 相應地SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:35； (b) 相應地SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:35； (c) 相應地SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:35； (d) 相應地SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:35； (e) 相應地SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:35； (f) 相應地SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:35； (g) 相應地SEQ ID NO:31及SEQ ID NO:35； (h) 相應地SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:35； (i) 相應地SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35；及 (j) 相應地SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:22之重鏈可變域(VH)及具有序列SEQ ID NO:35之輕鏈可變域(VL)。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:33之重鏈可變域(VH)及具有序列SEQ ID NO:35之輕鏈可變域(VL)。表3. 示範性重鏈可變區及輕鏈可變區胺基酸序列

VH	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 22) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 17相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NE R F QG RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 23) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 18相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYW I H WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NE R F QG RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYGSRDYF DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 24) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 19相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FNSGTL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 25) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 20相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY IGKGVL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 26) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 21相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY PRFGWL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 27) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 22相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY TGKGVL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 28) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 23相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY DSNAVL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 29) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 24相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FHSGTL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 30) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 25相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY FNKAVL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 31) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 26相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY GGSGVL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 32) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 27相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVGE IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY PRQGFL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 33) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 28相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPI F GHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYY YNSGTL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO: 34) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 29相同)
VL	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC KASQSVD Y S GDSYMN WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSHEDPF T FGQGTKLEI K (SEQ ID NO: 35) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 55相同)
	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC R ASQSVD Y S GDSYMN WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQSHEDPF T FGQGTKLEI K (SEQ ID NO: 36) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 56相同)
	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISC R ASQSVD Y S GDSY L N WY QQKPGQPPKL LIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YC QQS YST PF T FGQGTKLEI K (SEQ ID NO: 37) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 57相同)

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體為包含Fc區之全長抗體。在一些實施例中，Fc區為包含以下各者之變異體Fc區： (a) 選自由以下組成之群的減少變異體Fc區對於FcγR之親和力的一或多個胺基酸修飾：L234A、L235A及L234A及L235A；及/或 (b) 在S442處引入半胱胺酸殘基之胺基酸修飾，其中該編號為如Kabat中之EU索引；及/或 (c) 選自由以下組成之群的延長變異體Fc區對於FcRn之半衰期的一或多個胺基酸取代：M252Y、S254T及T256E

在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈： (a) 相應地SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:50； (b) 相應地SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:50；及 (c) 相應地SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:50。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含具有選自由以下組成之群之序列的重鏈及輕鏈： (a) 相應地SEQ ID NO:41及SEQ ID NO:50； (b) 相應地SEQ ID NO:42及SEQ ID NO:50； (c) 相應地SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:50； (d) 相應地SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:50； (e) 相應地SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50； (f) 相應地 SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:50；及 (g) 相應地SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:50。

在某些實施例中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體包含具有序列SEQ ID NO:40之重鏈及具有序列SEQ ID NO:50之輕鏈。

在某些實施例中，人源化/最佳化抗ADAM9抗體包含具有序列SEQ ID NO:45之重鏈及具有序列SEQ ID NO:50之輕鏈。

在某些實施例中，SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47中之X為離胺酸。

在某些實施例中，SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47中之X不存在。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。表4. 全長重鏈及輕鏈胺基酸序列

重鏈	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGEIIPIFGHTNYNEKFKSRFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCARGGYYYYGSRDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX (SEQ ID No: 38) X為離胺酸(K)或不存在 (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 50相同)
	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGEIIPIFGHTNYNEKFKSRFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCARGGYYYYPRFGWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX (SEQ ID No: 39) X為離胺酸(K)或不存在 (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 51相同)
	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGEIIPIFGHTNYNEKFKSRFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCARGGYYYYPRQGFLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGX (SEQ ID No: 40) X為離胺酸(K)或不存在 (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 52相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPE A A GGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGX (SEQ ID No: 41) 其中X為離胺酸(K)或不存在 (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 141相同)
	EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMHWVRQA PGKGLEWVGE IIPIFGHTNY NEKFKSRFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCARGG YYYYPRQGFL DYWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSL C LS PGX (SEQ ID No: 42) 其中X為離胺酸(K)或不存在 (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 142相同)
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輕鏈	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT ISCKASQSVD YSGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATY YCQQSHEDPF TFGQGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC (SEQ ID NO:50) (與WO2020/005945中之SEQ ID NO: 68相同)

在某些實施例中，本發明之抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

(II')，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或2； D由下式表示：

。

在某些實施例中，本發明之抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

(II)，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或2； D ₁由下式表示：

。

在某些實施例中，抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

(III’)，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或10之整數； D由下式表示：

。

在某些實施例中，抗ADAM9免疫結合物由下式表示：

(III)，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或10之整數； D ₁由下式表示：

。

在某些實施例中，人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:44中之X為離胺酸。在一些實施例中，SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:44中之X不存在。在一些實施例中，人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在一些實施例中，包含免疫結合物之組成物( 例如，醫藥組成物)之DAR值在1.0至5.0、1.0至4.0、1.5至4.0、2.0至4.0、2.5至4.0、2.9至3.3、3.3至3.8、1.5至2.5或1.8至2.2範圍內。在一些實施例中，DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0或小於2.5。在一些實施例中，DAR在3.0至3.2範圍內。在一些實施例中，DAR在3.5至3.7範圍內。在一些實施例中，DAR為3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6或3.7。在一些實施例中，DAR在1.9至2.1範圍內。在一些實施例中，DAR為1.9、2.0或2.1。

在某些實施例中，抗ADAM9免疫結合物包含共價連接至由下式表示之類美登醇化合物DM21-C的人源化抗ADAM9抗體：

(DM21-C)，其中D ₁具有以下結構：

。

人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。在某些實施例中，抗ADAM9免疫結合物為由以下結構表示之IMGC936：

，其中： CBA為包含分別具有序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈的人源化抗ADAM9抗體；且； q為2； D ₁由下式表示：

。 VIII. 醫藥組成物及治療方法

如本文提供，包含本文提供之人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段的本發明之抗ADAM9免疫結合物具有結合存在於細胞表面上之ADAM9並介導細胞殺傷的能力。具體而言，包含藥理學劑之本發明之免疫結合物得以內在化且經由藥理學劑之活性來介導細胞殺傷。此細胞殺傷活性可藉由誘導抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之免疫結合物來增強。

因此，本發明之免疫結合物具有治療與ADAM9之表現相關或由其表徵之任何疾病或疾患的能力。如以上論述，ADAM9為在許多血液及實體惡性腫瘤中表現之腫瘤-胚胎抗原，其與展現較少分化形態之高階腫瘤相關，且與不良臨床結果關聯。因此，無限制地，本發明之免疫結合物可用於治療癌症，尤其藉由ADAM9之表現來表徵之癌症。

在其他特定實施例中，本發明之免疫結合物可以可用於治療肺癌(例如，非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食管癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑素瘤及淋巴癌。在其他特定實施例中，本發明之免疫結合物可以可用於治療非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌( 例如，三陰性乳癌(TNBC))或胰臟癌。

在其他實施例中，本發明之免疫結合物可以可用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌、非鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)、結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌)或乳癌( 例如，三陰性乳癌(TNBC))。

除了其用於療法中以外，本發明之免疫結合物可以可偵測地標記且用於診斷癌症或對腫瘤及腫瘤細胞成像。

本發明之組成物包括可用於製造可用於製備單位劑型之醫藥組成物( 例如，不純或非無菌組成物)及醫藥組成物( 亦即，適用於向個體或患者投與之組成物)的原料藥物組成物。此類組成物包含預防或治療有效量之本發明之免疫結合物，或此類劑與醫藥學上可接受之載劑之組合。較佳地，本發明之組成物包含預防或治療有效量之本發明之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。

在具體實施例中，術語「醫藥學上可接受之」意指由聯邦或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認藥典中列出用於在動物中且更具體而言在人類中使用。術語「載劑」係指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑( 例如，弗氏佐劑(完全及不完全)、賦形劑或媒劑。總體上，本發明之組成物之成分例如以液體、乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式，在指示活性劑數量之氣密密封容器諸如小瓶、安瓿或囊袋中，單獨地或混合在一起以單位劑型提供。當組成物藉由輸注來投與時，其可使用含有無菌藥用級水或鹽水之輸注瓶來施配。當組成物藉由注射來投與時，可提供注射用無菌水或鹽水之安瓿以使得該等成分可在投與前混合。

本發明亦提供醫藥包裝或套組，其包含填充有單獨的或與此醫藥學上可接受之載劑一起的本發明之免疫結合物的一或多個容器。另外，可用於治療疾病之一或多種其他預防劑或治療劑亦可包括在醫藥包裝或套組中。本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含填充有本發明之醫藥組成物之成分中的一或多者之一或多個容器。視情況，呈由管理藥品或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構規定之形式的通知可與此等容器相聯，該通知反映該機構批准製造、使用或銷售用於人類投與。

本發明提供可用於上述方法中之套組。套組可包含本發明之免疫結合物中之任一者。套組可進一步包含一或多個容器中可用於治療癌症之一或多種其他預防劑及/或治療劑。

可提供本發明之組成物以便藉由向個體投與有效量之本發明之免疫結合物來治療、預防及改善與疾病、病症相關之一或多個症狀。在較佳態樣中，此類組成物基本上經純化( 亦即，基本上不含限制其效應或產生不期望之副作用的物質)。在具體實施例中，個體為動物，較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物( 例如，牛、馬、貓、犬、齧齒動物等)或靈長類動物( 例如，猴，諸如石蟹獼猴、人類等)。在一個較佳實施例中，受試者為人類。

各種遞送系統為已知的且可用於投與本發明之組成物，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊中，能夠表現抗體或融合蛋白之重組細胞，經受體介導之胞吞作用(參見，例如，Wu 等人(1987) 「 Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, 」J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，構建作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分的核酸等。

投與本發明之免疫結合物之方法包括但不限於非經腸投與( 例如，皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜上及黏膜( 例如，鼻內及經口途徑)。在具體實施例中，本發明之免疫結合物經肌肉內、靜脈內或皮下投與。組成物可藉由任何習知途徑，例如藉由輸注或快速濃注來投與，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身或局部。

本發明亦規定本發明之免疫結合物之製劑封裝在指示分子數量之氣密密封容器諸如小瓶、安瓿或囊袋中。在一個實施例中，此類分子以液體、乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物形式，在氣密密封容器中提供且可例如用水或鹽水來重構至適於向個體投與之合適濃度。較佳地，本發明之免疫結合物以乾燥無菌凍乾粉末形式在氣密密封容器中提供。較佳地，本發明之免疫結合物以液體形式在氣密密封容器中提供。

本發明之免疫結合物之凍乾製劑應在2℃與8℃之間儲存於其原始容器中且分子應在重構後12小時內，較佳6小時、5小時、3小時或1小時內投與。在替代性實施例中，此類分子以液體形式，在指示分子、融合蛋白或結合分子之數量及濃度的氣密密封容器中提供。較佳地，此類免疫結合物在以液體形式提供時，在氣密密封容器中提供。

本發明之醫藥組成物可向需要治療之區域局部投與；此可藉由例如且不限於局部輸注、注射或藉助於植入物來達成，該植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜諸如矽橡膠膜或纖維。較佳地，在投與本發明之免疫結合物時，必須注意使用分子不吸附之材料。

本發明之組成物可在泡囊，尤其脂質體中遞送( 參見Langer(1990) 「New Methods Of Drug Delivery 」 ,Science 249:1527-1533)；Treat 等人, in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss, New York, 第353- 365頁 (1989)；Lopez-Berestein, 同上, 第3 17-327頁)。實例

現已總體上描述本發明，透過參考以下實例，更容易理解本發明。以下實例示出本發明之診斷或治療方法中之各種組成物方法。實例意欲示出但是決非限制本發明範圍。 PDX 材料及方法

動物模型：將源自患者之腫瘤樣品植入在6-8週齡無胸腺裸-Foxn1nu小鼠中。當腫瘤達到100-300 mm ³之平均腫瘤體積時，動物按照腫瘤體積來匹配到用於給藥之治療組或對照組中。藉由靜脈內注射，向小鼠給予媒劑、非靶向ADC (0.1 mg/kg類美登醇DM有效載荷)或IMGC936 (抗ADAM9免疫結合物、8.6 mg/kg ADC或0.1 mg/kg類美登醇DM有效載荷)。每週兩次獲取腫瘤量測結果及體重。

功效：抗腫瘤活性藉由NCI標準來定義：經治療小鼠相對於對照小鼠之平均腫瘤體積(%) ＞ 42% (無活性)、≤ 42% (活性)及＜10% (高度活性)。 IHC 材料及方法

組織樣品：所用的全部組織樣品為FFPE(經福馬林固定及石蠟包埋)完整組織樣品，除了在對於食管癌記錄時，一些樣品為來自組織微陣列(TMA)之組織芯以外。

免疫組織化學：ADAM9之僅研究用途免疫組織化學(IHC)檢定使用Ventana Discovery Ultra自動染色機來執行。ADAM9之初級抗體為購自Cell Signaling Technologies (目錄號4151S)之兔單株抗體。此檢定用於PDX研究。簡單描述IHC方案：使用以CC1緩衝液(VMSI，目錄號950-224)進行之32分鐘培育條件，進行抗原回收。添加一滴抑制劑CM且培育8分鐘。在37℃下，將載玻片與儲備濃度之初級ADAM9抗體(0.25 mg/mL)於稀釋劑(VMSI，760-219)中之1:100稀釋液(2.5 ug/mL)一起培育32分鐘。作為陰性對照，在相同條件下，將樣本與IgG兔抗體(客戶目錄號I-1000)一起培育。抗ADAM9抗體之酶偵測使用結合至HQ之抗兔IgG (VMSI，目錄號760-4815)，隨後使用結合至HRP之抗HQ (VMSI，目錄號760-2020)培育12分鐘來完成。抗ADAM9抗體使用ChromoMap DAB偵測套組(VMSI，目錄號760-159)來偵測。藉由在二胺基聯苯胺(DAB)及硫酸銅存在下與過氧化氫反應來使色原沉積。

偵測FFPE樣品中之ADAM9之免疫組織化學(IHC)檢定由Roche Tissue Diagnostics (RTD)開發並證實。穩健原型檢定(RPA)使用Spring Bioscience抗ADAM9 (J12H2L3)抗體，且在Ventana Benchmark ULTRA染色平台上進行Ventana OptiView DAB偵測。根據所公佈調查結果，在膜及細胞質型樣中觀察到高品質染色。在顯色過程中，RPA檢定在各種檢定參數下展示一致染色，且滿足特異性、準確性及分析精度之標準。

簡單描述IHC方案：使用以CC1緩衝液(VMSI, 目錄號950-224)進行之92分鐘培育條件，進行抗原回收。在36℃下，將載玻片與儲備濃度之初級抗體於稀釋劑90103 (VMSI)中之1:282稀釋液一起培育16分鐘。儲備抗體濃度係指抗體由製造商提供給Ventana之濃度。作為陰性對照，在相同條件下，將樣本與IgG兔單株抗體一起培育。使用OptiViewTM偵測套組(VMSI，目錄號760-700)來偵測抗ADAM9抗體。抗ADAM9抗體之酶偵測使用結合至HQ之次級山羊抗小鼠及抗兔IgG，隨後使用結合至HRP之抗HQ來完成。藉由在二胺基聯苯胺(DAB)及硫酸銅存在下與過氧化氫反應來使色原沉積。次級抗體、HRP多聚體及所有色原試劑在儀器之預設時間施加。

評分及資料分析：染色強度由經認證解剖病理學家以0(陰性)至3之半定量整數量表來評分。記錄在各強度水準下，細胞質、膜及細胞質及/或膜(細胞-膜)之陽性染色細胞之百分比。評分係基於ADAM9至細胞膜及細胞質之定域。在腫瘤樣品中，對有活力的惡性細胞進行評分。

計算H評分。H評分將染色強度之組件與陽性細胞百分比組合。其具有0與300之間之值且經定義為： 1 * (以強度類別1來染色之細胞之百分比) + 2 * (以強度類別2來染色之細胞之百分比) + 3 * (以強度類別3來染色之細胞之百分比) = H評分實例 1. PDX 研究

在源自腺癌非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌及胃癌腫瘤之PDX模型中分析IMGC936之活性。按照H評分，ADAM9表現之範圍為27至226，其中80%樣品具有高於101之H評分(表5)。0.1 mg/kg IMGC936 (8.6 mg/kg抗體)之單一劑量為良好耐受的。在所測試腫瘤類型中，在35個模型中之24個(69%)中，IMGC936為有活性或高活性的，且在6個模型(4個NSCLC、2個TNBC)中完全消退。24個IMGC936敏感模型具有65與224之間之H評分。11個不敏感模型具有27與226之間之H評分。在此項研究中具有高於50之H評分的所有PDX模型對於IMGC936作出反應(圖1A)。各癌症類型之ADAM9流行率資料展示於圖1B中。各PDX模型之H評分及染色強度展示於圖1C中。表 5. 來自NSCLC腺癌、胃癌、TNBC及胰臟癌PDX模型之結果

適應症	模型	研究組織 H 評分	結果	反應率
NSCLC腺癌	CTG-2533	224	高活性	8/12
CTG-1502	211	無活性
CTG-0165	182	高活性
CTG-0192	163	活性
CTG-1680	157	活性
CTG-2539	160	高活性
CTG-0765	147	高活性
CTG-0743	190	高活性
CTG-0838	27	無活性
CTG-2536	177	無活性
CTG2540	187	無活性
CTG-1342	87	活性
胃癌	CTG-0148	85	無活性	4/8
CTG-0146	127	活性
CTG-1868	195	活性
CTG-0485	77	無活性
CTG-0707	176	活性
CTG-0936	226	無活性
CTG-1234	185	活性
CTG-0353	41	無活性
TNBC	CTG-2353	209	活性	6/7
CTG-1883	78	高活性
CTG-0437	202	高活性
CTG-2215	65	活性
CTG-2518	173	活性
CTG-2488	108	高活性
CTG-0012	155	無活性
胰臟癌	CTG-0780	183	活性	6/8
CTG-1485	190	活性
CTG-1983	203	活性
CTG-0889	185	活性
CTG-0723	170	活性
CTG-1057	158	無活性
CTG-1149	162	活性
CTG-0306	205	無活性

實例 2. ADAM9 流行率

ADAM9在多個腫瘤類型中高度表現。大部分腫瘤樣品具有中等至高水準之ADAM9，其中62%腺癌NSCLC、65% TNBC、73%胃癌及85%胰臟癌樣品具有101至300之H評分(圖2)。亦研究結腸直腸癌(CRC)及食管癌中之ADAM9表現。ADAM9表現在CRC及食道癌中較低，分別有40%及32%樣品具有高於100之H評分。其餘腫瘤樣品具有較低水準之ADAM9表現(H評分1至100)，其中1.2% NSCLC及20% CRC樣品為ADAM9陰性的。

ADAM9在TNBC、NSCLC、CRC、胃、胰腺及食道癌中高度表現。大部分腫瘤樣品表現高水準之ADAM9，其中85%胃癌、100%胰臟癌、63% TNBC、96% NSCLC腺癌、90% CRC、54%食管癌樣品具有高於100之H評分(圖3)。另外，在所有適應症中評估之218/220個(99%)病例在膜或細胞質中表現ADAM9。 a . 胃癌

三十九個完整組織胃癌病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，39/39個病例(100%)展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為170(圖4A及4B)，且72%樣品展示出膜ADAM9染色(圖4C)。陽性染色經定義為高於背景之任何染色。 b. 胰臟癌

四十二個完整組織胰臟癌病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，42/42 (100%)展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為195(圖5A及5B)，且93%樣品展示出膜ADAM9染色(圖5C)。 c. 腺癌 NSCLC

二十五個完整組織NSCLC腺癌病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，25/25個病例(100%)展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為169(圖6A及6B)，且96%樣品展示出膜ADAM9染色(圖6C)。 d. TNBC

二十七個完整組織三陰性乳癌病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，26/27 (96.3%)個樣品展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為123(圖7A及7B)，且85%樣品展示出膜ADAM9染色(圖7C)。 e. CRC

四十一個完整組織三CRC癌症病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，41/41 (100%)個樣品展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為144(圖8A及8B)，且95%樣品展示出膜ADAM9染色(圖8C)。 f. 食管癌

四十六個完整組織三食管癌病例可針對生物標誌物評估來進行評估。總之，45/46 (97.8%)個樣品展示出陽性細胞質或膜染色，其中平均H評分為105(圖9A及9B)，且76%樣品展示出陽性ADAM9僅膜染色(圖9C)。實例 3. 第 I 期臨床研究中之 ADAM9 表現水準評估

進行IMGC936在患有晚期實體腫瘤之患者中之1期、首次人類、開放標籤、劑量遞增研究，以便表徵藉由IV輸注之IMGC936之安全性、耐受性、PK、藥效動力學、免疫原性及初步抗腫瘤活性。登記患有不可切除、復發性或難治性、局部晚期或轉移性非鱗狀NSCLC、TNBC、CRC、胃食管癌或胰臟癌之參與者。對於所有參與者，收集經由IHC染色來確定ADAM9表現之腫瘤樣本且將進行檢定。

將對檔案及/或新鮮預處理收穫腫瘤樣本進行ADAM9表現分析。參與者具有經鑑定檔案腫瘤標本塊(例如，FFPE)或來自檔案腫瘤標本之未染色載玻片或同時期腫瘤生檢物，用於評估ADAM9表現。若不能鑑定合適樣品，則參與者可經歷新鮮腫瘤生檢以便獲得用於測試之標本。

將分析參與者之ADAM9表現以便確定IMGC936之抗腫瘤活性與ADAM9表現之間的相關性。腫瘤比例評分(TPS)可用於指示患者樣品中ADAM9之陽性或陰性染色。TPS經計算為顯示在任何強度下部分或完全膜染色及細胞質染色的活腫瘤細胞之百分比。亦可針對僅膜染色來計算TPS評分，亦即，顯示在任何強度下部分或完全膜染色的活腫瘤細胞之百分比。來自健康個體之參考樣品可用作基線對照或陰性對照。參考樣品可來自與收集參與者之腫瘤樣本的組織對應的健康個體中之組織。參考樣品亦可來自參與者之對應健康組織。另外地或替代地，來自表現ADAM9之腫瘤組織之參考樣品可用作陽性對照。

圖1A為顯示各種癌症之PDX模型中之ADAM9表現及反應的圖表。圖1B顯示每種癌症類型中之ADAM9流行率資料。圖1C顯示三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌、胃癌及腺癌非小細胞肺癌(NSCLC)之各PDX模型之ADAM9染色強度及H評分。圖2顯示使用內部研究ADAM9檢定的在胃癌、胰臟癌、腺癌非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)、結腸直腸癌(CRC)及食管癌中之ADAM9流行率資料。圖3顯示使用Roche組織診斷(RTD) ADAM9穩健原型檢定(RPA)的在胃癌、胰臟癌、腺癌非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)、結腸直腸癌(CRC)及食管癌中之ADAM9流行率資料。圖4A-4C為顯示胃癌組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖4A顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9 H評分。圖4B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖4C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖5A-5C為顯示胰臟癌組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖5A顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9 H評分。圖5B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖5C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖6A-6C為顯示腺癌NSCLC組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖6A顯示陽性膜及細胞質染色之H評分。圖6B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖6C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖7A-7C為顯示TNBC組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖7A顯示陽性膜及細胞質染色之H評分。圖7B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖7C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖8A-8C為顯示CRC組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖8A顯示陽性膜及細胞質染色之H評分。圖8B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖8C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖9A-9C為顯示食管癌組織樣品中之ADAM9表現的圖表。圖9A顯示陽性膜及細胞質染色之H評分。圖9B顯示陽性膜及細胞質染色之ADAM9腫瘤比例評分。圖9C顯示僅陽性膜染色之ADAM9腫瘤比例評分。

Claims

一種治療需要治療之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與治療有效量之抗ADAM9免疫結合物，其中來自該個體之腫瘤樣品展現出ADAM9表現水準增加。
一種增加需要治療之個體之癌症治療的功效的方法，其包含向該個體投與治療有效量之抗ADAM9免疫結合物，其中來自該個體之腫瘤樣品展現出ADAM9表現水準增加。
如請求項1或2之方法，其中該ADAM9表現水準增加使用一偵測方法來確定，該偵測方法區分與一或多個參考樣品中之染色強度或染色均勻性相比，表現ADAM9癌症樣品中之染色強度或染色均勻性。
如請求項3之方法，其中該偵測方法為免疫組織化學(IHC)。
如請求項1至4中任一項之方法，其中該腫瘤樣品為經福馬林固定石蠟包埋樣品。
如請求項3至5中任一項之方法，其中在該等腫瘤細胞之僅細胞質、僅膜或細胞質與膜之組合(細胞-膜)中，針對ADAM9表現來確定染色強度及/或染色均勻性。
如請求項6之方法，其中僅對於該等腫瘤細胞之膜，確定染色強度及/或染色均勻性。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有50與300之間之H評分。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有100與300之間之H評分。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有H評分在201與300之間的高ADAM9表現水準。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有H評分在101與200之間的中等ADAM9表現水準。
如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有H評分在1與100之間的低ADAM9表現水準。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有針對ADAM9表現水準的2或更大之IHC染色強度評分。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有針對ADAM9表現水準的3或更大之IHC染色強度評分。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%或更大PS1之染色。
如請求項15之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS1之染色。
如請求項15之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS1之染色。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS1之染色。
如請求項1至18中任一項之方法，該腫瘤樣品具有25%或更大PS2之染色。
如請求項19之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS2之染色。
如請求項19之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS2之染色。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS2之染色。
如請求項1至22中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%或更大PS3之染色。
如請求項23之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS3之染色。
如請求項23之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS3之染色。
如請求項1至22中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS3之染色。
如請求項1至26中任一項之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食管癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑素瘤及淋巴癌。
如請求項27之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、胃癌、乳癌或胰臟癌。
如請求項28之方法，其中該癌症為腺癌NSCLC、三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌、胃癌或結腸直腸癌(CRC)。
如請求項3至29中任一項之方法，其中該一或多個參考樣品包含組織、細胞或細胞球團。
如請求項30之方法，其中該一或多個參考樣品為陰性參考樣品。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該抗ADAM9免疫結合物由下式表示：
(I)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中： CB 為抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段； L ₂由下式中之一者表示：
(L2b)或
(L2d)，其中： R ^x、R ^y、R ^x’及R ^y’在每次出現時獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C _1-4烷基)、-SO ₃H、-NR ₄₀R ₄₁R ₄₂ ⁺或視情況經-OH、鹵素、SO ₃H或NR ₄₀R ₄₁R ₄₂ ⁺取代之C _1-4烷基，其中R ₄₀、R ₄₁及R ₄₂各自獨立地為H或C _1-4烷基； l及k各自獨立地為1至10之整數； L ₁由下式表示： –CR ³R ⁴-(CH ₂) _1-8-C(=O)- 其中R ³及R ⁴各自獨立地為H或Me，且L ₁中之該–C(=O)-部分連接至D； D由下式表示：
； q為1至20之整數。
如請求項32之方法，其中Rx、Ry、Rx’及Ry’皆為H；且l及k各自獨立地2至6之整數。
如請求項32或33之方法，其中A為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
如請求項32至34中任一項之方法，其中A為可藉由蛋白酶裂解之肽。
如請求項32至34中任一項之方法，其中A選自由以下組成之群：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 51)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 52)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 53)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly，其中各肽中之第一胺基酸連接至L ₂基團且各肽中之最後一個胺基酸連接至–NH-CR ¹R ²-S-L ₁-D。
如請求項32至36中任一項之方法，其中R ¹及R ²均為H。
如請求項32至37中任一項之方法，其中L ₁為–(CH ₂) _4-6-C(=O)-。
如請求項32至38中任一項之方法，其中D由下式表示：
。
如請求項32至39中任一項之方法，其中該抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段。
如請求項40之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:1之CDR _H1域、具有序列SEQ ID NO:3之CDR _H2域及具有序列SEQ ID NO:14之CDR _H3域以及具有序列SEQ ID NO:16之CDR _L1域、具有序列SEQ ID NO:19之CDR _L2域及具有序列SEQ ID NO:20之CDR _L3域。
如請求項41之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含具有序列SEQ ID NO:33之重鏈可變域(VH)及具有序列SEQ ID NO:35之輕鏈可變域(VL)。
如請求項41之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體包含具有序列SEQ ID NO:45之重鏈及具有序列SEQ ID NO:50之輕鏈。
如請求項32之方法，其中該抗ADAM9免疫結合物由下式表示：
，其中： CBA為人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，其包含分別具有序列SEQ ID NO:1、3及14以及SEQ ID NO:16、19、20的CDR _H1域、CDR _H2域及CDR _H3域以及CDR _L1域、CDR _L2域及CDR _L3域； q為1或2； D ₁由下式表示：
。
如請求項44之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
如請求項44之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。
如請求項44之方法，其中該人源化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50之重鏈及輕鏈。
如請求項44之方法，其中該抗ADAM9免疫結合物為IMGC936。
一種鑑別可能對於抗ADAM9免疫結合物治療作出反應之癌症的方法，該方法包含： (a) 使包含來自該癌症之細胞之生物樣品與結合該生物樣品之ADAM9蛋白之劑接觸； (b) 偵測結合(a)之該生物樣品之ADAM9蛋白的該劑的結合； (c) 給步驟(b)之該結合指派評分，其中該評分基於與一或多個參考樣品之比較來指派；及 (d) 將步驟(c)中之該評分與參考組織或細胞之評分相比較，其中該癌症ADAM9水準之評分大於表現正常或低ADAM9之參考樣品之評分或該癌症ADAM9水準之評分等於或大於表現高ADAM9之參考樣品之評分將該癌症鑑別為可能對於抗ADAM9免疫結合物作出反應。
如請求項49之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食管癌、乳癌、頭頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑素瘤及淋巴癌。
如請求項50之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、胃癌、乳癌或胰臟癌。
如請求項50之方法，其中該癌症為腺癌NSCLC、三陰性乳癌(TNBC)、胰臟癌、胃癌或結腸直腸癌(CRC)。
一種鑑別對於用抗ADAM9免疫結合物治療敏感之腫瘤的方法，該方法包含： (a) 量測自該腫瘤獲得之腫瘤組織樣品中之ADAM9表現水準，其中該量測包含使用一偵測方法，該偵測方法區分與一或多個參考樣品中之染色強度或染色均勻性相比，表現ADAM9癌症樣品中之染色強度或染色均勻性； (b) 確定該腫瘤組織樣品之ADAM9染色強度評分；及 (c) 將步驟(b)中確定之ADAM9染色強度評分與藉由量測至少一個參考樣品中之ADAM9蛋白表現來確定之相對值相比較，其中該至少一個參考樣品為對於用抗ADAM9免疫結合物治療不敏感的組織、細胞或細胞球團樣品，且其中步驟(b)中確定之該樣品之ADAM9染色強度評分高於該相對值將該腫瘤鑑別為對於該治療敏感。
如請求項49至53中任一項之方法，其中該偵測方法手動執行或使用自動化系統來執行。
如請求項49至54中任一項之方法，其中該偵測方法為IHC。
如請求項49至55中任一項之方法，其中該樣品為經福馬林固定石蠟包埋樣品。
如請求項55或56之方法，其中在該等腫瘤細胞或癌細胞之僅細胞質、僅膜或細胞質與膜之組合(細胞-膜)中，針對ADAM9表現來確定染色強度及/或染色均勻性。
如請求項57之方法，其中僅對於該等腫瘤細胞或癌細胞之膜，確定染色強度及/或染色均勻性。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該樣品具有50與300之間之H評分。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該樣品具有100與300之間之H評分。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該樣品具有H評分在201與300之間的高ADAM9表現水準。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該樣品具有H評分在101與200之間的中等ADAM9表現水準。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該樣品具有H評分在1與100之間的低ADAM9表現水準。
如請求項55至63中任一項之方法，其中該樣品具有針對ADAM9表現水準的2或更大之IHC染色強度評分。
如請求項55至63中任一項之方法，其中該樣品具有針對ADAM9表現水準的3或更大之IHC染色強度評分。
如請求項55至65中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%或更大PS1之染色。
如請求項66之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS1之染色。
如請求項66之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS1之染色。
如請求項55至65中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS1之染色。
如請求項55至69中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%或更大PS2之染色。
如請求項70之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS2之染色。
如請求項70之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS2之染色。
如請求項70之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS2之染色。
如請求項55至73中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有25%或更大PS3之染色。
如請求項74之方法，其中該腫瘤樣品具有50%或更大PS3之染色。
如請求項74之方法，其中該腫瘤樣品具有75%或更大PS3之染色。
如請求項74之方法，其中該腫瘤樣品具有25%-49%、50%-74%或75%-100% PS3之染色。
如請求項49至77中任一項之方法，其進一步包含向患有該癌症或腫瘤之個體投與治療有效量之抗ADAM9免疫結合物。
如請求項49至78中任一項之方法，其中該抗ADAM9免疫結合物如請求項32至48中任一項所定義。
如請求項1至7、27至58、78及79中任一項之方法，其中該腫瘤樣品具有大於或等於1%、大於或等於5%、大於或等於10%、大於或等於20%、大於或等於25%、大於或等於30%、大於或等於40%、大於或等於50%、大於或等於60%、大於或等於70%、大於或等於75%、大於或等於80%、大於或等於90%或大於或等於95%之腫瘤比例評分(TPS)。
如請求項80之方法，其中該腫瘤樣品具有大於或等於25%之TPS。
如請求項80之方法，其中該腫瘤樣品具有大於或等於50%之TPS。
如請求項80之方法，其中該腫瘤樣品具有大於或等於75%之TPS。