KR102006446B1 - 세포-유리형 dna의 간암 진단 용도 - Google Patents

세포-유리형 dna의 간암 진단 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 간암 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 간암 진단용 바이오 마커이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 간암 진단, 간암 진행의 평가, 간암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포-유리형 DNA의 간암 진단 용도{Use of Cell-Free DNA for Diagnosing Liver Cancer}
본 발명은 세포-유리형 DNA의 간암 진단 용도에 관한 것이다.
세계 암 진단 시장이 연평균 9.4% 성장하고 있으며 국내 암 진단 시장은 초기 단계이나 2004-2009년 연평균 40.5%로 빠르게 성장하고 있다. 암 진단 시장은 유전자 진단 시장, 면역 진단 시장, 조직 검사용 시장으로 분류될 수 있으며 CT, 초음파 등의 영상 진단과 조직 검사를 통해 진단됐기 때문에 조직 검사용 진단 소재 시장이 가장 오래됐으며, 조기 진단의 중요성으로 혈액을 통한 면역 진단 시장이 성장하고 있다.
면역 진단 시장은 비교적 중기에 해당되며 FDA에서 승인된 9개의 바이오 표지자를 중심으로 제품이 생산되고 있으며, 애보트 래버러터리, 벡맨, Diagnostic Products Corporation이 시장을 점유하고 있다. 국내에서는 자궁암 진단, 대장암 진단 제품이 있으나 순수 국내 기술을 활용해 제품화에 성공한 사례는 아직 없다. 국내 기술을 활용해 시장에 판매 중인 암 진단 제품은 자궁경부암 진단을 위한 제품 위주이며, 씨젠이 약 7억원의 매출을(2009년) 달성해 국내 암 진단 기업의 선두를 달리고 있다.
암 진단 소재 기술은 암에 특이적으로 결합하는 특성을 기반으로 의료기기, 치료제 등에 결합돼 폭넓게 확대 적용이 가능하다는 점에서 진단 제품뿐만 아니라 표적 치료제 및 영상 진단제와의 결합을 통해 고부가가치를 생산할 수 있는 원천기술에 해당돼 정책적으로 지원 받고 있다. 현재 FDA 승인을 받은 암 진단 표지자는 전립선암 진단을 위한 PSA, 대장암 진단을 위한 CEA, 고환암 및 간암 진단을 위한 AFP, AFP-L3, DCP 등 9개가 있으며 위암 표지자는 없다. 면역 진단시장의 경우 이미 9개의 바이오 표지자에 대한 특허는 거의 등록됐고 새로운 제품에 대한 승인 규제가 까다로워 기존 제품에 대한 장벽을 깨기 어려운 것으로 분석되고 있다.
우리나라가 신약 시장에서 경쟁력을 갖추기 위해서는 질환에 대한 새로운 표적 유전자 및 단백질을 발굴하는 기초 연구, 진단 바이오 마커 발굴, 이를 이용한 치료제 개발, 약물 반응 예측 시스템 개발 등이 필수적이다. 고부가가치 신약 산업 창출 및 첨단 바이오 산업으로의 도약에 중요한 기반 기술을 확보하기 위해 BT/IT/NT기술이 융합하여 진단제 개발이 이루어져야 하며 이를 위해 학제간의 통합과 융화가 절실히 요구된다. 신약의 치료 효과를 높이고 부작용을 최소화할 수 있는 맞춤형 의료에 대한 수요 증가로 분자 진단 시장 성장이 촉진되고 있다.
분자 진단 검사는 DNA, RNA, 단백질을 기반으로 유전자와 대사 기능, 의약품 대사, 질병 유발 관계를 평가하는 검사로 면역조직 진단검사, 유전자 진단검사 등을 포함한다. BCC research 분석에 따르면 2007년부터 2014년까지 바이오의약 및 진단 기기 분야의 연평균 성장률은 16.8%로 헬스케어의 분야의 13.5%보다 높게 나타났다. 분자진단 시장의 지속적 성장을 위해서는 신뢰성과 정확성, 신속성, 편의성을 제고할 수 있는 기술적 발전이 필요하다.
최근 유전자 검사 비용 등이 저렴해 지면서 면역진단에 비해 효율성이 높은 핵산(NAT, 분자 진단에서 가장 급속히 발전하고 있는 시장으로, 맞춤형 의료 발전에 기여하는 분야) 시장의 큰 성장에 주목하고 있다. 유전자 진단 시장은 아직 초기 단계로 최근에는 비교적 높은 암 진단 효율성을 보이는 유전자 진단 시장으로 전환되고 있다.
최근에는 Affymetrix, Agilent 및 Illumina 등의 글로벌 바이오 기업이 Cancer Cytogenomics Microarray 협의체를 구성하여 암 진단에 적합한 마이크로어레이 디자인, 마이크로어레이 결과 공유 및 대중적인 암 진단 칩 생산에 필요한 데이터베이스 구축 등을 수행하고 있으며 인간 질병 유전체 정보 독식이 우려된다. BioFire, Qiagen, Bio-RAD 및 ABI 사 등의 외국계 기업에서만 질병 유전자 그룹에 대한 HRM(high resolution melting) PCR 분석 키트가 시판되고 있어서 국내 바이오산업의 국제적 경쟁력이 약화가 예상된다.
분자 진단 시장은 전세계적으로 약 50여 개 기업이 진입해 있으며, 시장 지배자인 9개의 세계적 대기업 Roche, Chiron, Gen-Probe, Abbott, Digene, Bayer, Myriad genetics, Becton Dickinson, bioMerieux가 전체 시장의 75%를 장악하고 있다. 국내 시장은 세계 시장의 0.2% 정도로 추정되며, 수출입 효과는 세계 시장의 3 ~ 4% 로 추정된다(생명공학정책연구센터 제공, 2006).
세포-유리형 DNA(Cell-Free DNA, cfDNA)는 RNA과 microRNA에 비해 상온 보관이 가능하며 진단 검사에 적합하다고 보고되었다(Wong 등, 2013). cfDNA는 소아림프종(paediatric lymphomas)의 진단(Mussolin 등, 2013), 산전검사(Casadio, 2013; Gahan, 2013), 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome)의 검사(Cui, 2013), 혈액 투석환자의 사망률 측정 및 염증, 철분대사 및 rhEPO 연관성 분석(Tovbin, 2012; Kohlova et al., 2013), 유방암 진단 및 모니터링(Dawson, 2013; Kirk, 2013), 간암 진단(Zhou, 2012) 및 HPV(human paillomavirus mutational insertion) 진단(Campitelli, 2012)에 응용된 사례가 보고되었다. 또한, 세포-유리형 DNA에서 점돌연변이(point mutations), 미소부수체 변형(microsatelite alteration), DNA 메틸화(DNA methylation) 및 이형접합성 상실(LOH, Loss of heterozygosity)를 확인하여 바이오마커로 응용한 보고가 있다(Ghorbian, 2012).
또한, 정상인에 비해 유방암 환자에서 세포-유리형 DNA 수준이 높게 관찰되었고, 악성 종양(malignant tumor) 크기와의 높은 연관성도 관찰되었다(Hashad, 2012). 비소세포폐암(Non-small-cell lung carcinoma) 환자에서 세포-유리형 DNA가 증가하였다는 보고도 있다(Catarino, 2012; Szpechcinski, 2012). 암 사망률이 높은 환자에서 세포-유리형 DNA 수준이 높게 관찰되었다(Perkins, 2012). 전립선암 환자의 세포-유리형 DNA를 분석하여 10번 염색체에서 DNA 결손을 관찰하였으며 치료에 대한 예후를 측정할 수 있었다(Cortese, 2012; Delgado, 2012). 유방암 환자에서 세포-유리형 DNA의 이형접합성 상실(LOH, Loss of heterozygosity)을 관찰하여 암 발생 단계, 암 크기, 림프절 전이(lymph node metastasis), 양성 프로게스테론(positive progesterone) 및 HER2 수용체(receptor)와의 연관성을 보여주었다. (Schwarzenbach, 2012). 난소암 환자의 세포-유리형 DNA을 분석하여 6q와 10q 염색체의 LOH가 암 세포 전이와 생존과 연관성을 예측하였다(Kuhlmann, 2012). 신경교종(glial tumor) 환자에서 세포-유리형 DNA의 고메틸화가 관찰되었다(Majchrzak-Celiska, 2013). 직장암 환자의 세포-유리형 DNA에서는 히스톤 메틸화 마커(histone methylation marker)인 H3K9me3 수준이 낮게 관찰되며 암 발생과 연관성을 보여주었다(Gezer, 2013). Biofluid에서 메틸화 DNA와 microRNA을 분석하여 암 발생에 대한 후성적 바이오마커(epigenetic biomarkers)로 이용하였다(Ma et al., 2013).
본 발명자들은 혈액 내에 존재하는 생물학적 물질로부터 간암의 조기 진단에 유용한 새로운 바이오 마커를 발굴하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 혈액 내에 존재하는 특정의 세포-유리형(cell-free) DNA가 간암 환자에게서 유의적으로 높은 수준으로 나타난다는 것을 실험적으로 확인하고 이의 간암 진단용 바이오마커로서의 사용 가능성을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 20번 염색체에 위치한 CDK5RAP1 (CDK5 regulatory subunit associated protein 1) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 15번 염색체에 위치한 IDH3A (isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 5번 염색체에 위치한 TRIM36 (tripartite motif containing 36) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 14번 염색체에 위치한 RCOR1 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 3번 염색체에 위치한 QTRTD1 (queuine tRNA-ribosyltransferase domain containing 1) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 11번 염색체에 위치한 UEVLD (UEV and lactate/malate dehyrogenase domains) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 6번 염색체에 위치한 MLLT4 (myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 4) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 1번 염색체에 위치한 RASAL2 (RAS protein activator like 2) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 X 염색체에 위치한 DMD 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포-유리형 DNA는 인간 4번 염색체에 위치한 USP38 (ubiquitin specific peptidase 38) 유전자로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세포-유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 프라이머(primer) 및/또는 프로브(probe)이다.
본 명세서에서 용어 “세포-유리형 DNA (cell-free DNA, cfDNA)”는 인간의 체액에서 순환하는 단편(fragment) DNA를 의미한다.
상기 세포-유리형 DNA는 이중가닥 DNA인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포-유리형 DNA는 핵단백질 복합체의 상태로 존재하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포-유리형 DNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 관찰되므로 질병의 진단 및 예후 예측 목적의 유용한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상보적 (complementary)"은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서, 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어 "상보적"은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 상기 서열번호 1 내지 10에 개시된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
상기 프로브는 바람직하게는 단일쇄인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 바람직하게는 상기 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로브는 당 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로브는 뉴클레오타이드 변형을 갖는 뉴클레오타이드, 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로브는 추가적으로 방사선 표지, 형광표지, 효소표지, 서열 택 및/또는 바이오틴에 의해 표지된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
상기 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변형될 수 있다.
또한, 상기 프라이머 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
따라서, 본 발명의 프라이머는 주형인 상기 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
본 발명의 프라이머는 추가적으로 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reaction)에 사용된다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미하며, 예를 들어, 중합효소연쇄반응(ploymerase chain reaction), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 뉴클레오타이드 서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction), 핵산뉴클레오타이드 서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및/또는 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 프로브는 마이크로어레이 칩(microarray chip)에 사용될 수 있다.
상기 프로브는 마이크로어레이칩에서 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있다.
상기 프로프는 지지체(substrate) 상에 배열 및/또는 고정화된 것일 수 있다.
상기 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드, 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및/또는 모세관을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다.
또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민을 통해 지지체에 결합되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 간암 진단용 키트는 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)용 키트 또는 마이크로어레이 칩(microarray chip)일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응용 키트는 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.
상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 포함하는 간암 진단용 바이오 마커에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출하는 검출 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 시료로부터 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 19의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 23의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 27의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 29의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 증폭 단계.
상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 설명한다.
생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)를 분리하는 단계
먼저 세포-유리형 DNA의 분리를 위한 생물학적 시료를 준비한다. 상기 생물학적 시료는 체액이며, 상기 세포-유리형 DNA는 상기 체액 내에 단독으로 존재할 수 있으며 분비체(exosome)에 포함되어 존재할 수도 있다. 상기 분비체는 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 30 nm-100 nm 크기의 소포(vesicle)로서 세포에서 기원하여 체액으로 방출된다.
상기 체액은 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid), 복수, 흉막 삼출액, 양수, 융모막 융모 샘플, 태반샘플, 기관 세척액(lavage), 간질액 또는 안구액(ocular fluid)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈장 또는 혈청이다.
상기 생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA를 분리한다. 상기 세포-유리형 DNA의 분리는 체액으로부터 분비체(exosome)을 분리하고, 분리된 분비체로부터 핵산을 추출, 분리 및 정제하는 방법을 통해 행할 수 있다.
세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법
세포-유리형 DNA를 분리 정제한 후 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출한다.
본 발명에서 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있다.
세포-유리형 DNA의 검출이 유전자 증폭 방식으로 행해지는 경우 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하여, 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 17의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 19의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 23의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 27의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 29의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행한다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한 이후에 상기 PCR의 산물에 대하여 추가적으로 서열분석을 수행할 수 있다.
본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 간암 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 간암 진단용 마커이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 간암 진단, 간암 진행의 평가, 간암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 간암 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 간암 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 간암 진단, 간암 진행의 평가, 간암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 혈청에서 추출한 세포-유리형 DNA에 대한 전기영동 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 세포-유리형 DNA 바이오마커에 대한 qPCR 검증결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(CDK5RAP1) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(IDH3A) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(TRIM36) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(RCOR1) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(QTRTD1) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(UEVLD) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(MLLT4) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(RASAL2) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(DMD) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암 환자의 시기별 세포-유리형 DNA(USP38) HRM qPCR 분석결과이다. (a) 정상군, (b) 1기, (c) 3기.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험 방법
1. 시료
세브란스병원 유전자은행에서 간암 환자(50 case) 시료를 분양받았다.
간암 1기 환자의 성별은 모두 남성이고 나이 분포도는 41-78세이며 선행원인은 HBV 간염, 알코올성 질환, 비만 및 당뇨 질환에 의한 합병증으로 확인되었다. 간암 3기 환자의 성별은 남성 21 case, 여성 4 case이고 나이 분포도는 40-71세이며 선행원인은 HBV 간염, 알코올성 질환, 비만 및 당뇨 질환에 의한 합병증으로 확인되었다.
2. 세포-유리형 DNA(Cell-free DNA) 추출
miRCURYTM RNA Isolation Kits-Exosome Isolation(Exiqon, Denmark)을 이용하여 100 ㎕ 혈청으로부터 세포-유리형 DNA을 침전시켰다. 침전시킨 exosome은 Resuspension buffer으로 현탁하고 phenol:chroform:isoamyl alcohol(25:24:1)를 이용하여 세포-유리형 DNA 추출하였다. 추출한 세포-유리형 DNA은 NanoDrop spec과 Qubit을 이용하여 정성 및 정량하였다.
3. CGH array
SurePrintG3 Human Genome CGH microarray(1x1M, Agilent)의 특징은 다음과 같다. Biological Features는963,029개, Replicates of Biological Probes(X5)는 1,000개, Internal Quality Control Features는 6,685개, genome source는 UCSC hg18(NCBI Build 36, March 2006)이며 Probe Spacing는 2.1 KB(1.8 KB in Refseq genes)으로 구성된다.
2 ㎍ amplified-purified DNA에 random primer, 5x reaction buffer, 10x dNTPs, Cyanine 3-dUTP 또는 Cyanine 5-dUTP 및 Exo(-) Klenow을 첨가하고 37℃(2시간) → 65℃(10분) → 4℃(hold)으로 labeling 반응을 수행하였다. labeled cfDNA은 정제하고 NanoDrop ND-1000를 이용하여 정량하였다. labeled cfDNA에 Cot-1 DNA(1.0 mg/ml), 10x aCGH Blocking agent, 2x HI-RPM Hybridization buffer를 첨가하고 95℃(3분) → 37℃(30분) → 4℃(hold)을 수행하였다. 100 ㎕ labeled cfDNA을 array gasket에 주입하고 65℃, 24시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 혼성화 반응된 chip은 Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-Chip Wash Buffer 1와 Buffer 2를 사용하여 세척하였다. Agilent DNA scanner 및 Feature extraction software를 이용하여 칩 이미지와 signal density를 얻었다. Agilent Genomic Workbench에서 그룹 사이의 cfDNA 비교를 수행하였다.
4. Bioinformatic 분석
세포-유리형 DNA 영역에 대해 Gene Ontolgy, KEGG pathway 분석을 수행하여 기능을 예측하였다.
5. HRM qPCR 최적화
성별, 시료 및 암 진행별로 구분하여 melting curve 분석을 수행하였다. 50 ng cfDNA, 2x HRM PCR master mix 및 10 μM primer을 혼합하여 95℃(5분) → 45사이클[95℃(10초) → 55℃(30초) → 72℃(30초)] → HRM detection step(70℃-85℃, 0.1 increments) 반응 조건으로 Rotorgene Q 장비에서 수행하였다. Ct = 30 이하이며 melt curve = 1 peak, dF/dT(first derivative of the change in fluorescence) = 1 이상으로 검출되는 시료가 정상적으로 증폭된 것으로 간주하였다.
실험결과
1. 세포-유리형 DNA 정량 및 정성 분석
혈청(Biofluid)에서 세포-유리형 DNA를 추출하여 정량 및 정성 분석을 수행한 결과, 간암 1기 환자 시료는 450 ng(16.1 ng/㎕), 간암 3기 환자 시료는 326 ng(32.6 ng/㎕)으로 정량되었다.
세포-유리형 DNA 정량 및 정성 결과
시료 종류
(환자 혈청) 		시료농도
(ng/㎕) 		시료총량
(㎍) 		Purity
260/280 260/230
간암 1기 16.1 0.450 1.37 0.72
간암 3기 32.6 0.326 1.30 0.42
모든 시료는 1% agarose 전기영동 상에서 ladder band 및 smear band가 관찰되었다. 동량 DNA을 사용하여 라이브러리 제작을 수행하였다.
2. 간암 환자 특이적 세포-유리형 DNA 선별
1) CGH array
① DNA labeling 효율 측정
정상군 세포-유리형 DNA는 Cyanine 3 라벨링하고, 간암 환자 세포-유리형 DNA는 Cyanine 5 라벨링을 수행하였다. Cy3 또는 Cy5 labeled DNA의 specific activity(pmol/㎍)가 10 pmol/㎍ 이상이 되도록 혼성화 반응을 수행하였다. 정상군과 간암 환자의 labeled DNA를 혼합하여 24시간 혼성화 반응을 수행하였다.
정상군, 간암 DNA labeling 효율 측정 결과
시료명
(Labeled dye) 		정상군
( Cy3 ) 		간암 1기
( Cy5 ) 		정상군
( Cy3 ) 		간암 3기
( Cy5 )
input DNA(㎍) 2.0 2.0 2.0 2.0
Labeled DNA 농도(ng/㎕) 99.0 109.7 99.0 114.7
Labeled dye 농도 (pmol/㎕) 1.1 1.6 1.1 1.4
Labeled sample 양(㎍) 4.9 5.4 4.9 5.7
specific activity(pmol/㎍) 11.1 14.5 11.1 12.2
② 암 진행시기별 특이적 세포-유리형 DNA 유전자 영역 분류
정상군 값을 기준으로 하여 간암 환자군의 변화값을 제시하였다. 정상군과 간암 환자군의 변화가 2배 이상을 기준으로 하였다. T1 시기 또는 T3 시기에서만 특이적으로 관찰되며 exon 영역에 해당되는 유전자만을 우선 선별하였다. 간암 환자의 시기 특이적 30개 바이오마커를 확보하였으며 그 중에 4개 유전자 영역이 T1 시기, 26개 유전자 영역이 T3 시기에서만 관찰되었다.
간암 환자 세포-유리형 DNA 바이오마커 목록
ProbeName Chr Description Gene symbol 간암T1 간암T3
A_16_P21432006 X Unknown DMD 2.71 0
A_14_P120272 4 solute carrier family 9, subfamily B (NHA1, cation proton antiporter 1), member 1 SLC9B1 2.34 0
A_14_P123759 4 ubiquitin specific peptidase 38 USP38 2.17 0
A_14_P109308 2 potassium channel, voltage gated modifier subfamily G, member 3 KCNG3 2.06 0
A_14_P133011 3 developmental pluripotency associated 4 DPPA4 0 2.54
A_14_P107167 20 CDK5 regulatory subunit associated protein 1 CDK5RAP1 0 2.5
A_14_P111259 7 family with sequence similarity 185, member A FAM185A 0 2.14
A_14_P105860 1 RAS protein activator like 2 RASAL2 -0.05 2.25
A_16_P36061872 2 erb-b2 receptor tyrosine kinase 4 ERBB4 0.21 2.35
A_14_P106260 3 queuine tRNA-ribosyltransferase domain containing 1 QTRTD1 -0.2 2.13
A_16_P36195989 3 ubiquitin-conjugating enzyme E2E 2 UBE2E2 -0.13 3.34
A_14_P120787 4 Unknown PAICS 0.16 2.09
A_14_P138056 4 tRNA methyltransferase 10 homolog A (S. cerevisiae) TRMT10A -0.22 2.28
A_14_P127483 5 tripartite motif containing 36 TRIM36 0.13 2.16
A_14_P106211 5 SMAD family member 5 SMAD5 0.2 2.35
A_14_P112560 6 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 4 MLLT4 -0.11 2.2
A_14_P200232 7 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 2, 8kDa NDUFB2 0.2 2.71
A_18_P25385201 7 diacylglycerol kinase, beta 90kDa DGKB 0.23 2.43
A_14_P133691 9 ring finger and CCCH-type domains 2 RC3H2 0.13 2.57
A_16_P19079472 10 coiled-coil domain containing 172 CCDC172 -0.09 2.11
A_14_P131574 11 glutamate receptor, ionotropic, AMPA 4 GRIA4 -0.21 2.14
A_14_P130230 11 UEV and lactate/malate dehyrogenase domains UEVLD -0.18 2.11
A_14_P124885 12 BRCA1 associated protein BRAP 0.09 2.12
A_14_P104815 14 Unknown RCOR1 0.18 2.51
A_16_P02944844 14 lin-52 DREAM MuvB core complex component LIN52 -0.02 2.27
A_14_P127327 15 isocitrate dehydrogenase 3 (NAD+) alpha IDH3A 0.11 2.29
A_14_P123083 16 vesicle amine transport 1-like VAT1L 0.25 2.72
A_14_P120988 16 CCCTC-binding factor (zinc finger protein) CTCF -0.06 2.03
A_18_P12929919 18 coiled-coil domain containing 102B CCDC102B 0.11 2
A_14_P130426 X lipoma HMGIC fusion partner-like 1 LHFPL1 -0.19 2
·ProbeName: Agilent probe ID
·Chr: 염색체번호
·Description: 유전자명
·Gene symbol: 유전자 약어
·간암T1: 정상군 대비 간암 1기 환자의 변화값
·간암T3: 정상군 대비 간암 3기 환자의 변화값
③ 세포-유리형 DNA 영역의 기능분석
정상군에 비해 간암 환자에서는 embryonic pattern specification, tRNA modification, cardiac muscle contraction 관련된 DNA 영역이 세포 밖으로 방출되는 것으로 관찰되었다. 관찰된 세포-유리형 DNA 영역은 Ras signaling pathway에 관여하는 것으로 분석된다.
간암 환자 세포-유리형 DNA에 대한 biological function 분석결과
Term P Value Genes ID
GO:0009880~embryonic pattern specification 0.032 2066, 4090
GO:0006400~tRNA modification 0.038 79691, 51654
GO:0000165~MAPK cascade 0.053 2066, 9462, 8315
GO:0060048~cardiac muscle contraction 0.062 1756, 4090
hsa04014:Ras signaling pathway 0.057 4301, 9462, 8315
3. 세포-유리형 DNA 검증 평가
1) 검증 평가 프라이머 디자인
선별된 유전자 영역을 검증하기 위해 Tm = 50℃ 이상 조정하여 프라이머 디자인을 수행하였다. qPCR 증폭효율이 향상시키기 위해 증폭산물의 크기를 100 bp 이하로 조정하였다.
간암 후보 세포-유리형 DNA 검출 프라이머 디자인
Gene symbol 정방향 Tm값 역방향 Tm값
CDK5RAP1 CTGTAAAGGGTGCATGGC 56.0 ATTCTTTTGCAGACTGTGGG 56.3
IDH3A CGAAGTTGAAAAAGTTTGTTC 52.9 GAGAGACTTAAAGGAAACTGG 51.1
TRIM36 CTGCTTGACGATATCTTTCC 53.5 CAATGGTCTGTTTCGAAA 51.1
RCOR1 ATCATACTGGCTCAAAAGC 51.3 GCTTTGTAAGACTCAACTACCAG 53.8
QTRTD1 GAGAAGTATCTTGTAAGGAAGC 50.6 GGTCAACAGACTTTCTGACC 53.0
UEVLD TTAAGCAGAATAAACAGACCTT 51.6 CTTGAAATCTTCAACCTTCC 52.5
MLLT4 AGACGTTGGTAGTAATTGGG 52.8 TTACAATGTCCATTACACCTAC 50.5
RASAL2 GAAGTGGCAGAAATGTTCT 51.1 TTCTACTATAAAAGTTGGCTGC 52.2
DMD GAACTTGACATCAGATAGCC 50.6 GACCATTCTATCAATGCTCA 52.0
USP38 TTGTCTTATTTTGAAGGTTTTTA 51.8 GCACCAGGTCTCACAAGA 53.7
2) 간암에 대한 후보 세포-유리형 DNA 선별
환자 검체 pooling DNA 시료에서 qPCR를 수행한 후에 melting curve 결과와 3% 전기영동 결과를 비교하여 일치하는 유전자만 HRM qPCR를 수행하였다.
간암 세포-유리형 DNA 바이오마커는 CDK5RAP1, IDH3A, TRIM36, RCOR1, QTRTD1, UEVLD, MLLT4, RASAL2, DMD, USP38 가 확인되었다.
상기 제작한 프라이머로 검출한 세포-유리형 DNA의 염기 서열은 표 6에 나타냈다.
Gene symbol Gene Accession # 염색체 위치 Start Stop 서열
CDK5RAP1
 AL355392.7 20
 31984856 31984902 CTGTAAAGGGTGCATGGCACTAAACAGCCCACAGTCTGCAAAAGAAT
IDH3A
 NC_018926.2 15 78452342 78452401 CGAAGTTGAAAAAGTTTGTTCATCATTGCAGTATGAATGCCAGTTTCCTTTAAGTCTCTC
TRIM36
 XR_001742143.1 5 114482945 114483003 CTGCTTGACGATATCTTTCCACAATAGTTTCCAAAGTGAAGTTTCGAAACAGACCATTG
RCOR1
 NC_018925.2 14 103132217 103132276 ATCATACTGGCTCAAAAGCCATTAATAGTAGTTACTGCTGGTAGTTGAGTCTTACAAAGC
QTRTD1
 NM_024638.3 3 113789579 113789635 GAGAAGTATCTTGTAAGGAAGCAACTTCCATAAAAAGGGTCAGAAAGTCTGTTGACC
UEVLD NC_018922.2 11 18579756 18579814 TTAAGCAGAATAAACAGACCTTTGCTGATCTCCACATTAGGAAGGTTGAAGATTTCAAG
MLLT4 NC_018917.2 6 168312705 168312764 AGACGTTGGTAGTAATTGGGCTTTTTGATAGCACATGTGTAGGTGTAATGGACATTGTAA
RASAL2 NC_018912.2 1 178196939 178196998 GAAGTGGCAGAAATGTTCTTGTTCTGACATTTCAATGAGCAGCCAACTTTTATAGTAGAA
DMD NC_018934.2 14 74627348 74627407 GAACTTGACATCAGATAGCCATCACTTTCAAGTAAAGCATTGAGCATTGATAGAATGGTC
USP38 NC_018915.2 4 144118960 144119016 TTGTCTTATTTTGAAGGTTTTTAATCGACTTTGGTTTCCTCTTGTGAGACCTGGTGC
3) HRM qPCR
간암 세포-유리형 DNA 바이오마커 10개는 정상군에서는 검출되지 않았으며 T1과 T3 시기에서만 검출되었다. 간암 세포-유리형 DNA 바이오마커는 간암 초기 및 치료 진행과정에 사용할 수 있을 것으로 추정된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Use of Cell-Free DNA for Diagnosing Liver Cancer <130> PN170132 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> CDK5RAP1 <400> 1 ctgtaaaggg tgcatggcac taaacagccc acagtctgca aaagaat 47 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> IDH3A <400> 2 cgaagttgaa aaagtttgtt catcattgca gtatgaatgc cagtttcctt taagtctctc 60 60 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> TRIM36 <400> 3 ctgcttgacg atatctttcc acaatagttt ccaaagtgaa gtttcgaaac agaccattg 59 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> RCOR1 <400> 4 atcatactgg ctcaaaagcc attaatagta gttactgctg gtagttgagt cttacaaagc 60 60 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> QTRTD1 <400> 5 gagaagtatc ttgtaaggaa gcaacttcca taaaaagggt cagaaagtct gttgacc 57 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> UEVLD <400> 6 ttaagcagaa taaacagacc tttgctgatc tccacattag gaaggttgaa gatttcaag 59 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> MLLT4 <400> 7 agacgttggt agtaattggg ctttttgata gcacatgtgt aggtgtaatg gacattgtaa 60 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> RASAL2 <400> 8 gaagtggcag aaatgttctt gttctgacat ttcaatgagc agccaacttt tatagtagaa 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> DMD <400> 9 gaacttgaca tcagatagcc atcactttca agtaaagcat tgagcattga tagaatggtc 60 60 <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> USP38 <400> 10 ttgtcttatt ttgaaggttt ttaatcgact ttggtttcct cttgtgagac ctggtgc 57 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> CDK5RAP1 F <400> 11 ctgtaaaggg tgcatggc 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> CDK5RAP1 R <400> 12 attcttttgc agactgtggg 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> IDH3A F <400> 13 cgaagttgaa aaagtttgtt c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> IDH3A R <400> 14 gagagactta aaggaaactg g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> TRIM36 F <400> 15 ctgcttgacg atatctttcc 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> TRIM36 R <400> 16 caatggtctg tttcgaaa 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> RCOR1 F <400> 17 atcatactgg ctcaaaagc 19 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> RCOR1 R <400> 18 gctttgtaag actcaactac cag 23 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> QTRTD1 F <400> 19 gagaagtatc ttgtaaggaa gc 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> QTRTD1 R <400> 20 ggtcaacaga ctttctgacc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> UEVLD F <400> 21 ttaagcagaa taaacagacc tt 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> UEVLD R <400> 22 cttgaaatct tcaaccttcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> MLLT4 F <400> 23 agacgttggt agtaattggg 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> MLLT4 R <400> 24 ttacaatgtc cattacacct ac 22 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> RASAL2 F <400> 25 gaagtggcag aaatgttct 19 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> RASAL2 R <400> 26 ttctactata aaagttggct gc 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> DMD F <400> 27 gaacttgaca tcagatagcc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> DMD R <400> 28 gaccattcta tcaatgctca 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> USP38 F <400> 29 ttgtcttatt ttgaaggttt tta 23 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> USP38 R <400> 30 gcaccaggtc tcacaaga 18

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것인, 간암 진단용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제제는 상기 염기서열에 대하여 상보적인 서열을 포함하는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것인, 간암 진단용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용되는 것인, 간암 진단용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이(microarray)에 사용되는 것인, 간암 진단용 조성물.
  6. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것인, 간암 진단용 키트.
  8. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 세포 유리형(cell-free) DNA를 검출하는 검출 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA, 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 세포 유리형 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포 유리형 DNA를 검출하는 검출 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 검출 단계는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 증폭 단계를 포함하는 것인, 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 검출 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법:
    서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 15의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 17의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 19의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 23의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 25의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 27의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 29의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 프라이머 세트;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 증폭 단계.
  12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 검출 단계는 생물학적 시료로부터 분리된 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 분리 단계를 포함하는 것인, 간암 진단에 필요한 정보 제공 방법.
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Title
Dis. Markers., Vol. 2016, Aricle ID. 1427849 (2016.06.15.)*
Gut and Liver, Vol. 11, No. 1, January 2017, pp. 112-120
NCBI GenBanK Accession No. AL355392 (2013.01.24.)*

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