KR101213173B1 - 유방암과 연관된 단일염기다형성 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388) 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위(GenBank SNP 데이터베이스, (rs 1801132))가 유방암의 발병 위험도와 밀접한 관계가 있다는 발견에 근거하여 유방암의 진단용 키트 및 유방암의 진단방법을 제공한다. 본 발명은 한국인 여성에게서 빈번히 발병하는 유방암에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

유방암과 연관된 단일염기다형성 및 그의 용도{Single Nucleotide Polyrmorphisms Implicated in Breast Cancer and Use Thereof}

본 발명은 유방암과 연관된 단일염기다형성 및 이를 이용한 유방암의 진단 키트 및 진단방법에 관한 것이다.

유방암은 한국 여성에게서 두 번째로 빈번하게 발생하는 암이다(Korean Statistical Information Service, 2005). 많은 위험인자들이 유방암의 발병 증가에 기여한다. 유방암을 진단하는 종래의 기술은 X-레이, 초음파/CT/MRI 진단, 생화학적 진단 및 분자생물학적 진단방법이 주를 이루고 있으며, 유전자 진단방법은 그 신뢰성의 검증 부족으로 인해 현재까지 상용화된 진단방법은 거의 없다.

에스트로겐 수용체(ESR1)는 리간드 활성 전사(ligand-activated transcription)를 시작하며(3, 4), 사이클린 패밀리의 일종인 사이클린 D1(CCND1) 및 CDK-활성 카이네이즈(CDK-activating kinase 7 : CDK7)는 세포주기 진행과 세포 발달의 핵심 조절자이다(5-7). 정지세포(quiescent cell)가 세포주기로 진입할 때, CCND1의 발현이 에스트로겐과 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)와의 결합에 의하여 유도되며, CCND1이 CDK4 및 CDK6와 결합하여 세포 핵으로 유입된 후 CDK7에 의하여 인산화됨으로서 단백질 기질이 인산화된다(8, 9). CDK7은 사이클린 H와 복합체를 이루어 CDK 활성 카이네이즈(CDK-activating kinase, CAK)로서 기능하며, 이들은 다양한 CDK의 활성 인산화를 유도하여 세포주기를 조절하게 된다.

CCND1 Ex4-1G>A의 과발현은 인간 유방암 세포에서 정상적인 세포주기 조절을 방해할 수 있으나(10), 이에 대한 증거는 일관되지 않는다(11-13). CDK7 Ex2-28C>T가 다양한 세포주기 전이(cell-cycle transitions)시 핵심 CDK를 활성화시킨다는 사실을 통해 CDK7의 과발현 또한 유방암의 증식에 기여할 수 있다고 예상할 수 있다(6). 나아가, ESR1 P325P Ex4-122G>C 및 ESR1 T594T Ex8+229G>A의 유전자 다형성은 유방암 위험도와 관련되어 있다고 보고되어 왔으나 그 증거는 역시 일관되지 않는다(3, 14-16). 이에, 본 발명자들은 CCND1 또는 CDK7 및 ESR1 간의 상호작용 효과를 연구하였으며, 이제까지 유방암 환자에서 이들 유전자의 유전적 다형성 간의 상호 관련성(epistatic association)이 연구된 바는 없다. 따라서, 본 발명의 목적은 CCND1 Ex4-1G>A, CDK7 Ex2-28C>T, ESR1 P325P Ex4-122G>C 및 ESR1 T594T Ex8+229G>A 에서의 유전적 다형성이 한국 여성의 유방암 발병 위험도와 연관되어있는지를 연구하고 이를 통해 신뢰도 높은 유방암 진단시스템을 구축하는 데에 있다. 나아가 CCND1, CDK7 및 ESR1에서의 복합 유전자형과 유방암의 위험도 간의 잠재적 관련성도 연구되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 유방암에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자상의 특정 SNP(rs 2972388) 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자상의 특정 SNP(rs 1801132)가 유방암의 발병 빈도와 밀접하게 연관되어 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 유방암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유전자 다형성을 이용한 유방암의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 유방암에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 CDK7 유전자상의 특정 SNP(rs 2972388)가 유방암의 발병 빈도와 밀접하게 연관된 유전자형을 가진다는 사실을 발견하였다. CDK7은 세포주기 진행과 세포 발달의 핵심 조절자로서, 사이클린 H와 복합체를 이룸으로서 다양한 CDK의 활성 인산화를 유도하여 세포주기를 조절하게 된다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어“단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이성은 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 반응하는 가에 영향을 미칠 수 있다. 또한, SNP는 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 도구(key enabler)로 생각된다. 무엇보다도, 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNP는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 또한, SNP 연구는 곡식 및 가축 육성 프로그램에서도 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS , USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl . Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 질환의 위험도를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 SNP를 마커로 하여 이의 존재가 상술한 방법을 통해 확인되면 유방암의 발병 위험도가 높은 것으로 판단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)이다. 본 발명에 따르면, CDK7 TT 유전자형은 CDK7 CC 유전자형에 비하여 유방암 위험도의 증가와 크게 연관되어 있다(OR, 1.5; 95% CI, 1.1-2.0)(표 2).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제2서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, (rs 1801132))를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, CDK7 Ex2-28C>T 및 ESR1 P325P Ex4-122G>C 유전자형을 통합하였을 때, CDK7 Ex2-28 TT 및 ESR1 P325P Ex4-122 CC 유전자형을 모두 가지는 대상자는 CDK7 Ex2-28 CC/CT 및 ESR1 P325P Ex4-122 GG/GC 유전자형을 가지는 대상자에 비하여 유방암의 위험도가 증가하였다(OR, 1.7; 95% CI, 1.09-2.52) (표3). 따라서, CDK7 Ex2-28 TT 및 ESR1 P325P Ex4-122 CC 유전자형을 복합 마커로 사용할 경우, 신뢰도 높은 유방암의 진단이 가능하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)이고, 본 발명의 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 C 대립인자는 CC 동형접합체이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 부위를 가진 인간은 증가된 유방암 발병 위험도를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 아시아인에게 적용된다.

본 발명에서 용어“아시아”는 한국, 중국 및 일본 등을 비롯한 몽골계 인종이 거주하는 극동 지역을 의미한다. “아시아인”이란 조상이 아시아인인 개체군을 의미하며, 바람직하게는 적어도 10대 이상의 조상이 아시아인인 개체군을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아시아인은 한국인이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유방암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 검출하는 단계를 포함하는 유방암의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유방암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388) 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제2서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, (rs 1801132))를 검출하는 단계를 포함하는 유방암의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 프라이머 또는 프로브를 필수 구성요소로 하는 바, 이들에 대한 상세한 설명은 본 발명의 방법에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작되어 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마커가 검출된 경우 상기 인간은 증가된 유방암 발병 위험도를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계는 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시된다.

본 발명이 유전자 증폭 방식으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(r반응air chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(9)anscription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기전사 복제(self sustained sequtice r반응lication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리)ans티ip염기전사의 선택적 증폭(selective amplification of tar 복t(1olynucleotide sequtices)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스9,1 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(constisus sequtice primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,ap5호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbi9)arily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,a09호 및 제5,861,245호), 핵산 염기전사 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 진단한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 게놈 DNA)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 조사하여 질환의 위험도을 결정할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법이 마이크로어레이 방식에 의하는 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 프로브는 상기 나열한 본 발명의 SNP들을 포함하는 각 유전자상의 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커인 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 A를 가지는 단일염기다형성 부위는 GenBank SNP 데이터베이스 rs 1051931에 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translat 바이오 방법, 무작위 프라이밍 방법(Mult prime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatecN-l), TMB(tetra methyl benzidine), ABTS(2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfate]), o-페닐렌디아민(OPD미노에틸나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphtN-l-AS-B1-pN-spNate)노에틸ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 비만, 당뇨 또는 심혈관 질환 합병증의 위험도를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 유방암의 발병 위험도가 높은 것으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 아시아인에게 적용된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 유방암의 진단용 키트 및 유방암의 진단방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 한국인 여성에게서 빈번히 발병하는 유방암에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험대상

본 발명을 위한 연구는 1995년부터 2002년 사이에 세 개의 서울소재 대학병원에 입원한 유방암 환자들을 연구대상으로 하였다. 대조군은 암에 걸리지 않은 동일한 병원의 입원환자들로 구성되었다(17, 18). 요약하자면, 현재 암 또는 무월경증(amenorrhea)에 걸렸거나 과거에 이러한 병력이 있는 환자, 또는 자궁 적출술, 난소절제술을 받았거나 갑상선 질환과 같은 호르몬 관련 질병의 병력이 있는 환자들은 조사대상에서 제외하였다. 양성 유방 종양이 있거나 기타 유방 질환(예를 들어, 유선염(mastitis), 양성 석회화 등) 및 그 밖의 전신성 질환(예를 들어 만성 간질환)을 가진 환자들도 조사대상에서 제외하였다. 최종적으로, 864명의 유방암 발병 환자들과 723명의 대조군 환자들이 통계적 분석의 대상이 되었다. 본 연구는 서울대학교 병원의 인간 임상시험 심사위원회(Institutional Review Board for human research)의 승인을 받았으며, 조사에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었다.

지노타이핑

DNA를 10mL 헤파린-처리 튜브에 넣은 혈액으로부터 표준적인 방법을 통해 분리하고 지노타이핑 시까지 20℃에서 저장하였다. 유방암 관련 유전자에서 선정된 유전적 다형성(CCND1 Ex4-1G>A (rs9344), CDK7 Ex2-28C>T (rs2972388), ESR1 P325P Ex4-122G>C (rs1801132) and ESR1 T594T Ex8+229G>A (rs2228480))은 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분광법을 이용하여 공지된 바대로 제조자의 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 지노타이핑 하였다(17). 멀티플렉스 PCR 프라이머 및 최적화된 프라이머 농도는 표 4에 기재하였다

지노타이핑 시의 질 관리를 위하여 50개의 무작위 선택 시료를 지노타이핑하고 올리고뉴클레오타이드 시퀀싱 방법으로 다시 시퀀싱하였다. 지노타이핑 과정과 시퀀싱 방법에서의 모순된 결과는 없었다.

통계적 분석

유전자형의 빈도를 카이제곱 검정(chi-square test)을 이용하여 Hardy-Weinberg 평형에 대하여 조사하였다. ESR1 유전자 내의 단일염기다형성(SNP) 간 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD)을 지노타입 데이터를 이용하여 조사하였다. 각각의 SNP와 유방암 위험도 간의 관계는 교차비(odd ratios, ORs)로 95% 신뢰구간(CI)에서 무조건 지수회귀 분석(unconditional logistic regression analysis)을 통하여 측정하였고, 연령, 학력(중졸 이하, 고졸, 대졸 이상), 최초 만삭임신 연령(< 30, 30 이상 또는 불임) 및 친족의 유방암 병력(예; 아니오)을 보정하였다. 통합 지노타입의 발병 위험도 역시 교차비로 95% 신뢰구간에서 무조건 지수회귀 분석을 통하여 측정하였으며, 상기의 요인들을 보정하였다. 경향을 분석하기 위하여, 통합 지노타입은 모델 내에서 연속 변수(예를 들어 1, 2, 3 및 4)로 취급하였다.

상술한 공변인(covariate)을 보정하기 위한 다항회귀모델(polychotomous regression model)을 이용하여, 수용체 상태(예를 들어 에스트로겐 수용체, 양성;음성/ 프로게스테론 수용체, 양성;음성/양쪽 수용체 양성; 기타), T 단계(TX, Tis 및 T1; T2-T4) 및 림프절(예;아니오)와 같은 임상병리학적 특성에 따른 대상집단의 하위 그룹들에 대하여 유방암의 위험도를 비교하였다.

통합 지노타입의 주된 영향이 알려진 위험인자들에 의하여 변형되는지를 조사하기 위하여, 최초 만삭임신 연령(< 30; 30 이상 또는 불임), 음주력(빈도 : 비음주자 또는 < 1회/월; ≥1 회/월 및 ≤ 3회/월) 및 체질량지수(body mass index, BMI)(< 23.0; ≥23.0)의 수준에 의해 층화분석(stratified analysis)을 수행하였다. 유의도의 수준은 P < 0.05로 설정하였으며, 모든 통계적 분석은 SAS 통계 소프트웨어(version 9.1.3; SAS Institute, Cary, NC)를 이용하여 수행하였다

실험결과

유방암 환자 및 대조군의 선정된 특성 및 임상병리학적인 데이터는 표 1에 기재하였다. 최초 만삭임신 연령(OR, 1.0; 95% CI, 0.8-1.4; ≥ 30y또는 불임 vs. < 30y), 음주력(OR, 1.0; 95% CI, 0.7-1.4; ≥ 1회/주 vs. < 1회/월), 흡연력(OR, 1.3; 95% CI, 0.9-1.9; 흡연자 (≥400 개피/일생) vs. 비흡연자(<400 개피/일생)) 및 체질량지수(BMI, kg/m²)(OR, 1.1; 95% CI, 0.9-1.5; 25.0 초과 vs. 23.0 미만)는 유방암 환자와 대조군 간에 유사한 값을 보였다. 유방암 환자의 경우 가족들(first- and second-degree relatives)에게서 병력이 있는 경우(OR, 2.8; 95% CI, 1.6-5.1; 예 vs. 아니오) 및 고학력인 경우(OR, 1.8; 95% CI, 1.4-2.4; 대졸 이상 vs. 중졸 이하)가 많았다. 대조군에서 변형 대립형질(variant allele)(CCND1 Ex4-1 A, CDK7 Ex2-28 T, ESR1 P325P Ex4-122 C 및 ESR1 T594T Ex8+229 A)의 빈도는 각각 50%, 49.3%, 45.1% 및 17.3% 였다. ESR1 P325P Ex4-122G>C(rs1801132)(P<0.01)를 제외한 모든 유전자형은 Hardy-Weinberg 평형을 벗어나지 않았다. ESR1 P325P 및 ESR1 T594T 간의 LD를 측정하였으며, 통계적으로 유의한 연관성은 관찰되지 않았다.

대상체들(824명의 유방암 환자 및 723명의 대조군)의 선정된 특성

	환자 (%)	대조군 (%)	OR (95% CI)a
연령 (yrs)	47.0 ± 9.95	46.6 ± 12.58	1.2 (1.07-1.33)b
기족(first and second relatives) 병력
아니오	813 (94.1)	708 (97.9)	1.0 (ref.)
예	51 (5.9)	15 (2.1)	2.8(1.57-5.10)
학력
≤중학교	276 (32.0)	296 (41.1)	1.0 (ref.)
고등학교	311 (36.1)	235 (32.6)	1.6 (1.23-2.07)
≥대학교	275 (31.9)	189 (26.3)	1.8 (1.38-2.44)
최초 만삭임신 연령
< 30	719 (83.5)	610 (84.5)	1.0 (ref.)
≥30 or 불임	142 (16.5)	112 (15.5)	1.0 (0.78-1.36)
음주력
비음주자 또는 < 1회/ 월	619 (71.6)	520 (71.7)	1.0 (ref.)
≤ 3회/ 월	148 (17.1)	116 (17.9)	1.1 (0.81-1.41)
≥ 1회/ 주	97 (11.2)	87 (10.5)	1.0 (0.72-1.37)
흡연
비흡연자(< 400 개피/일생)	795 (92.1)	676 (93.5)	1.0 (ref.)
흡연자(≥ 400 개피/일생)	68 (7.9)	42 (6.5)	1.3 (0.85-1.87)
BMI, kg/m2
< 23.0	462 (53.9)	377 (53.0)	1.0 (ref.)
23.0~25.0	214 (25.0)	193 (27.1)	0.9 (0.72-1.17)
> 25.0	181 (21.1)	141 (19.8)	1.1 (0.85-1.45)
TNM stage
stage 0 & I	202 (26.7)
stage II	511 (67.5)
stage III & IV	44 (5.8)
T stage
TX/Tis	26 (3.4)
T1	372 (49.1)
T2	327 (43.1)
T3	20 (2.6)
T4	13 (1.7)
림프절 전이 여부
아니오	327 (43.0)
예	434 (57.0)
전이
아니오	749 (98.4)
예	12 (1.6)
에스트로겐 수용체 상태
양성	297 (48.8)
음성	312 (51.2)
프로게스테론 수용체 상태
양성	231 (37.9)
음성	379 (62.1)
호르몬 수용체 치료
아니오	270 (55.1)
예	220 (44.9)

^a 연령, 학력, 최초 만삭임신 연령 및 가족(first and second relatives) 유방암 병력 보정

^b 10년 단위

표 2에서 보는 바와 같이, CDK7 TT 유전자형은 CDK7 CC 유전자형에 비하여 유방암 위험도의 증가와 크게 연관되어 있다(OR, 1.5; 95% CI, 1.1-2.0). 그러나, 그 밖의 다른 유전자형과 유방암 위험도 간에는 유의한 연관성이 없었다.

CCND1 Ex4-1G>A, CDK7 Ex2-28C>T, ESR1 P325P Ex4-122G>C 및 ESR1 T594T Ex8+229G>A의 유전적 다형성과 유방암 위험도와의 관계

	환자 (%)	대조군 (%)	OR (95% CI) a
CCND1 (rs9344)
GG	178 (23.2)	171 (24.6)	1.0 (ref.)
GA	361 (46.9)	325 (46.8)	1.1 (0.82-1.38)
AA	230 (29.9)	199 (28.6)	1.1 (0.83-1.48)
P for trend			0.47
GG/GA	539 (70.1)	496 (71.4)	1.0 (ref.)
AA	230 (29.9)	199 (28.6)	1.1 (0.85-1.35)
CDK7 (rs2972388)
CC	123 (16.5)	131 (21.2)	1.0 (ref.)
CT	345 (46.3)	315 (48.0)	1.1 (0.84-1.52)
TT	277 (37.2)	199 (30.8)	1.5 (1.08-2.02)
P for trend			0.01
CC/CT	468 (62.8)	446 (69.2)	1.0 (ref.)
TT	277 (37.2)	199 (30.9)	1.4 (1.08-1.70)
ESR1 P325P (rs1801132)
GG	217 (29.1)	185 (28.2)	1.0 (ref.)
GC	311 (41.7)	288 (44.0)	0.9 (0.71-1.19)
CC	218 (29.2)	182 (27.8)	1.0 (0.76-1.34)
P for trend			0.42
GG/GC	528 (70.8)	473 (72.2)	1.0 (ref.)
CC	218 (29.2)	182 (27.8)	1.1 (0.84-1.34)
ESR1 T594T (rs2228480)
GG	507 (65.5)	446 (66.1)	1.0 (ref.)
GA	234 (30.2)	208 (30.8)	1.0 (0.78-1.24)
AA	33 (4.3)	21 (3.1)	1.4 (0.81-2.52)
P for trend			0.20
GG/GA	741 (95.7)	654 (96.9)	1.0 (ref.)
AA	33 (4.3)	21 (3.1)	1.4 (0.82-2.52)

^a 연령, 학력, 최초 만삭임신 연령 및 가족(first and second relatives) 유방암 병력 보정

CDK7 Ex2-28C>T 및 ESR1 P325P Ex4-122G>C 유전자형을 통합하였을 때, CDK7 Ex2-28 TT 및 ESR1 P325P Ex4-122 CC 유전자형을 모두 가지는 대상자는 CDK7 Ex2-28 CC/CT 및 ESR1 P325P Ex4-122 GG/GC 유전자형을 가지는 대상자에 비하여 유방암의 위험도가 증가하였다(OR, 1.7; 95% CI, 1.1-2.5 P for trend, <0.01)(표 3) 유방암 환자집단의 임상병리학적인 특징에 따라 분류된 하위그룹 간에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았으며, 하위그룹은 알려진 위험인자들에 의하여 층화(stratified)하였다.

CDK7 및 ESR1P325P 사이의 유전자-유전자 상호작용

유전자형		환자	대조군	OR (95% CI)a
CDK7	ESR1 P325P
CC/CT	GG/GC	309 (45.0)	288 (48.5)	1.0 (ref.)
CC/CT	CC	128 (18.7)	126 (21.2)	0.9 (0.68-1.24)
TT	GG/GC	177 (25.8)	139 (23.4)	1.2 (0.90-1.57)
TT	CC	72 (10.5)	41 (6.9)	1.7 (1.09-2.52)
P for trend		< 0.01

^a 연령, 학력, 최초 만삭임신 연령 및 가족(first and second relatives) 유방암 병력 보정

각각의 SNP에 대한 PCR 프라이머 및 연장 프라이머

SNP	PCR 프라이머	연장 프라이머
CCND1 Ex4-1 G>A,	(F) 5’-ACGTTGGATGCCTGTCCTACTACCGCCTCA	(F)5’-CCAGAGTGATCAAGTGTGACCC
	(R) 5’-ACGTTGGATGCTGGGACATCACCCTCACTT
CDK7 Ex2-28 C>T,	(F) 5’-ACGTTGGATGTAATGGCGACAATTTGGTTG	(F)5’-CCGTTTACAAGGCCAGAGATAAGAA
	(R) 5’-ACGTTGGATGCGCGAAATGTAAAAATGCAA
ESR1 P325P Ex4-122 G>C	(F) 5’-ACGTTGGATGACATGAGAGCTGCCAACCTT	(F)5’-TTGGATGCTGAGCCCCC
	(R) 5’-ACGTTGGATGAGTAAGCCCATCATCGAAGC
ESR1 T594T Ex8+229 G>A	(F) 5’-ACGTTGGATGATCGCATTCCTTGCAAAAGT	(F)5’-TAGCCAGGGAGCTCTCAGAC
	(R) 5’-ACGTTGGATGTGGTGCATGATGAGGGTAAA

F, 정방향 PCR 프라이머; R, 역방향 PCR 프라이머

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 진단용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
3. CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제2서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, (rs 1801132))를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 유방암 진단용 키트.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)이고, 상기 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위의 C 대립인자는 CC 동형접합체인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위를 가진 인간은 증가된 유방암 발병 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 한국인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
7. 유방암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CDK7(CDK-activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388)를 검출하는 단계를 포함하는 유방암의 마커를 검출하는 방법.
   
8. 유방암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CDK7(CDK - activating kinase 7) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 2972388) 및 ESR1(Estrogen receptor 1) 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제2서열의 401번째 뉴클레오타이드 위치에 C를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, (rs 1801132))를 검출하는 단계를 포함하는 유방암의 마커를 검출하는 방법.
   
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 마커가 검출된 경우 상기 인간은 증가된 유방암 발병 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계는 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 한국인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.