KR101309887B1 - 위암 감수성 진단용 ｌｏｘ 유전자 ｓｎｐ 및 이를 이용한 위암 감수성 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 위암 감수성 진단용 SNP, 상기 SNP 검출용 마이크로어레이 및 키트, 및 이를 이용한 위암 감수성 진단방법에 관한 것이다. 구체적으로 상기 SNP는 LOX 유전자의 프로펩티드 도메인(LOX-PP)내에 위치하며, 상기 도메인의 473번째에 해당하는 SNP 부위가 G/A 및 A/A 유전형은 한국인의 위암, 특히 미만형(diffuse-type) 위암의 발달과 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 SNP 부위의 유전형을 결정하는 방법으로, 위암에 대한 감수성을 쉽고 빠르게 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

위암 감수성 진단용 ＬＯＸ 유전자 ＳＮＰ 및 이를 이용한 위암 감수성 진단방법{SNP for diagnosing susceptibility to gastric cancer and method for diagnosing susceptibility to gastric cancer using the LOX gene SNP}

본 발명은 위암 감수성을 진단하기 위한 LOX 유전자의 SNP, 상기 LOX 유전자 SNP 검출용 마이크로어레이 및 키트, 및 이를 이용한 위암 감수성 진단방법에 관한 것이다.

위암은 특히 아시아에서 높은 발생빈도를 보이며 암 관련 사망의 주된 원인이 되고 있다(Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 2010; 127: 2893917). 우리나라에서는 암 환자의 16.2% (남성 암 환자의 20.3% 및 여성 암 환자의 11.2%)가 위암 환자인 것으로 추정된다. 위암의 연간 연령표준화(age-standardized) 발병률은 남성의 경우 61.2/100,000이며 여성의 경우 23.9/100,000이다(Jung, KW, Park S, Kong HJ, Won YJ, Boo YK, Shin HR, et al. Cancer Statistics in Korea: Incidence, Mortality and Survival in 2006-2007. J Korean Med Sci 2010; 25: 1113-21).

헬리코박터 파일로리균(H. pylori)에의 만성적 감염은 만성 위염을 진전시켜서 점막손상(mucosal atrophy), 장상피화생(intestinal metaplasia), 이형성증(dysplasia), 및 암을 일으킨다(Yuasa Y. Control of gut differentiation and intestinal-type gastric carcinogenesis. Nat Rev Cancer 2003; 3: 592-600). 하지만, 감염자의 3%만이 위암으로 진전되며, 이것은 위암의 발병에 다른 요인들이 관여함을 보여준다(Yuasa Y., 2003). 따라서, H. pylori 감염은, 인터루킨(interleukin (IL)) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factors (TNF))와 같은 전(pro-) 및 항(anti-)염증 사이토카인(inflammatory cytokines)의 변이를 포함한 숙주 인자들의 유전적 다형성(genetic polymorphism)을 통하여 위암발병의 위험에 영향을 미칠 가능성이 높다(Hamajima N, Naito M, Kondo T, Goto Y. Genetic factors involved in the development of Helicobacter pylori-related gastric cancer. Cancer Sci 2006; 97: 1129-38).

다수의 흔한 질병들, 특히 암은 하나의 유전자 내의 하나의 유전적 변이에 의해 발생하지는 않으며, 환경 및 생활습관과 함께 다양한 유전자들 사이의 복잡한 상호작용들이 관여한다. 사람 유전체 내의 다형성(polymorphism)들은 잠재적으로 정상적인 생리기작 및 암 발병에 영향을 미치는 광범위한 유전적 변이를 제공한다. 이러한 다형성 변이들은 생물학적 시스템의 다른 수준에서 다양한 조절 및 대사 경로들을 통하여 작동한다(Lokotionov A. Common gene polymorphisms, cancer progression and prognosis. Cancer Lett 2004; 208: 1-33).

유전체 관련 연구(Genome-wide association studies (GWAS))는, 전체 지놈을 대상으로 고농도로 다수의 표지된 다형성(tagged polymorphisms)을 측정하기 위한 고속대량 지노타이핑 기술(high-throughput genotyping technology)을 사용함으로써, 암에 대한 신규한 감수성 유전자좌(loci) 또는 유전자들을 동정해왔다(Carlson CS, Eberle MA, Kruglyak L, Nickerson DA. Mapping complex disease loci in whole-genome association studies. Nature 2004; 429: 446-52). 지금까지, GWAS는 50가지 이상의 암에 대해 수행되었으며, 적어도 15가지의 다른 악성종양(malignant tumor)들을 포함한다(Stadler ZK, Thom P, Robson ME, Weitzel JN, Kauff ND, Hurley KE, et al. Genome-wide association studies of cancer. J Clin Oncol 2010; 28: 4255-67). 최근에, 미만형(diffuse-type) 위암을 측정하는 GWAS는 전립선 줄기세포 항원(prostate stem cell antigen) (PSCA) 유전자의 첫 번째 엑손(exon)에 위치하는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)이 미만형 위암과 상당히 관련성이 높다는 것을 발견하였다(Sakamoto H, Yoshimura K, Saeki N, Katai H, Shimoda T, Matsuno Y, et al. Genetic variation in PSCA is associated with susceptibility to diffuse-type gastric cancer. Nat Genet 2008 40:730-40). 위암에 대한 유전적 감수성(susceptibility)에 관한 연구들이 증가하고 있기는 하지만, 위암에 대한 감수성의 근본적인 정확한 유전적 기작은 아직 완전히 규명되지 않았다.

LOX는 콜라겐의 성숙에 필요하며 기능적 세포외 기질(extracellular matrix)의 생합성 과정에서 엘라스틴의 전구물질(elastic precursors)이 된다(Kagan HM, Trackman PC. Properties and function of lysyl oxidase. Am J Respir Cell Mol Biol 1991; 5: 206-10). LOX 유전자는 NIH 3T3 섬유아세포(fibroblasts)에서 Ras 발암유전자(oncogene)의 변형을 억제하여, "Ras 폐기(recision)" 유전자로 명명되었다(Contente S, Kenyon K, Rimoldi D, Friedman RM. expression of gene rrg is associated with reversion of NIH 3T3 transformed by LTR-cH-ras. Science 1990; 249: 796-8, Kenyon K, Contente S, Trackman PC, Tang J, Kagan HM, Friedman RM. Lysyl oxidase and rrg messenger RNA. Science 1991; 253: 802). 다른 종류의 암세포주 및 원발성 종양 (primary tumors)에서 LOX의 상향(up-) 및 하향(down-)조절이 모두 검출되었다(Payne SL, Hendrix MJ, Kirschmann DA. Paradoxical roles for lysyl oxidases in cancer a prospect. J Cell Biochem 2007; 101: 1338-54). LOX 발현은 대장암 및 유방암 조직에서 상당히 증가하였으며, 침습(invasiveness) 및 전이(metastasis)와 양의 상관관계를 갖는다(Baker AM, Cox TR, Bird D, Lang G, Murray GI, Sun XF, et al. The role of lysyl oxidase in SRC-dependent proliferation and metastasis of colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 2011; 103: 407-24., Nagaraja GM, Othman M, Fox BP, Alsaber R, Pellegrino CM, Zeng Y, et al. Gene expression signatures and biomarkers of noninvasive and invasive breast cancer cells: comprehensive profiles by representational difference analysis, microarrays and proteomics. Oncogene 2006; 25: 2328-38).

흥미롭게도, LOX는 세포외부의 환경으로 분비되는 50 kDa의 불활성 전구효소(proenzyme) (Pro-LOX)로 합성되나, 거기에서 단백질 절단(proteolytic cleavage) 과정을 거쳐 기능적인 32 kDa 효소 (LOX) 및 18 kDa 프로펩티드(propeptide) (LOX-PP)가 된다(Bedell-Hogan D, Trackman P, Abrams W, Rosenbloom J, Kagan H. Oxidation, cross-linking, and insolubilization of recombinant tropoelastin by purified lysyl oxidase. J Biol Chem 1993; 268: 10345-50). LOX-PP는 LOX의 종양 억제 기능을 유지하고 nuclear factor-kB의 활성을 유도하는 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), Akt, 및 MEK 키나아제(kinase)의 활성을 억제한다(Jeay S, Pianetti S, Kagan HM, Sonenshein GE. Lysyl oxidase inhibits ras-mediated transformation by preventing activation of NF-kappa B. Mol Cell Biol 2003; 23: 2251-63). 추가로, LOX가 사람 위암에서 메틸화(methylation) 및 대립유전자 손실(allelic loss)에 의해 불활성화된다는 사실이 보고되었다(Kaneda A, Wakazono K, Tsukamoto T, Watanabe N, Yagi Y, Tatematsu M, et al. Lysyl oxidase is a tumor suppressor gene inactivated by methylation and loss of heterozygosity in human gastric cancers. Cancer Res. 2004; 64: 6410-5). 또한, 단일염기다형성 G473A/Arg158Gln (rs1800449)는 LOX-PP 내의 매우 보존적인 영역에서 발견되었다. A 대립유전자(allele)에 의해 암호화된(encoded) Gln 변이체(variant) 역시 G 대립유전자에 의해 암호화된 LOX-PP 야생형(wild-type)과 비교하여 손상된 종양 억제 능력을 갖고 있는 것으로 보인다(Min C, Yu Z, Kirsch KH, Zhao Y, Vora SR, Trackman PC, et al. A loss-of-function polymorphism in the propeptide domain of the LOX gene and breast cancer. Cancer Res 2009; 69: 6685-93). 따라서, 본 발명자들은 다형성에 의한 LOX의 다른 기능들이 위암의 발달 및/또는 진전과 관련이 있을 것이라는 가설을 세우게 되었다.

한국인에게 있어서 LOX G473A 다형성과 위암의 감수성과의 관계를 밝히기 위하여, 본 발명자들은 458명의 위암 환자와 282명의 건강한 사람으로부터 수집한 조직 시료를 대상으로 PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)를 수행하여 LOX 유전자의 G473A 다형성의 유전형 및 대립유전자 발생빈도를 분석하였다. 그 결과, LOX 유전자의 G473A 다형성이 한국인의 위암의 발달 및 분화에 대한 감수성과 매우 연관성이 높다는 사실을 밝히고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 위암 감수성 진단용 LOX 유전자의 SNP를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP를 검출할 수 있는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 LOX 유전자의 SNP를 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP를 이용하여 위암에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LOX 유전자 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 473번째 염기를 포함하는 10~300개의 연속적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 위암 감수성(susceptibility) 진단용 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 위암 감수성 진단용 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 서열번호 1의 473번째 염기 G가 A로 치환되어 상기 473번째의 유전자형이 G/A 또는 A/A인 경우 위암 발병 위험도 또는 위암 세포의 분화가 증가할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 부위에 대립유전자 특이적(allele-specific)으로 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 암호화되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭(amplification)하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 진단을 위한 LOX 유전자의 SNP 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 감수성 진단을 위한 SNP 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 제5항의 프라이머 세트이며, NotI 제한효소를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은,

검사 대상으로부터 핵산 시료를 얻는 단계;

상기 핵산 시료로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위인 473번째 염기의 유전형을 결정하는 단계; 및

상기 결정된 유전자형이 G/A 또는 A/A인 경우 위암에 대한 감수성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 위암 감수성 진단방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전형의 결정 단계는, 상기 검사 대상으로부터 얻은 핵산 시료를 주형으로 하고, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 473번째 염기를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing) 및 제한효소 절단방법으로 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 제5항의 프라이머 세트이며, 상기 제한효소는 NotI일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전형의 결정 단계는, 상기 검사 대상으로부터 얻은 핵산 시료를 제3항의 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 LOX 유전자 단일염기다형성(SNP) 부위의 G/A 및 A/A 유전형은 한국인의 위암, 특히 미만형(diffuse-type) 위암의 발달과 관련이 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 LOX 유전자 SNP 부위의 유전형을 결정하는 방법으로, 위암에 대한 감수성을 쉽고 빠르게 진단할 수 있을 것으로 기대되며, 특히, 마이크로어레이나 키트 등의 형태로 대량생산될 경우 산업적 이용가치도 높을 것으로 보인다.

도 1은 LOX 유전자의 G473A 부위에서 3개의 유전형을 나타내는 시퀀싱 데이터이다. G/G 동형접합체(homozygote) (상단 패널), A/A 동형접합체 (하단 패널), G/A 이형접합체(heterozygote) (중간 패널).
도 2는 PCR-RFLP에 의한 LOX G473A 다형성의 유전형을 보여준다. Not1 제한효소는 G-형 대립유전자의 PCR 산물을 인식하여 2개의 단편으로 절단한다. 따라서 214 bp의 밴드만 보이는 경우는 A/A 동형접합체로, 214 bp 밴드 및 섞인 밴드(114 bp 및 100 bp)가 보이는 경우는 이형접합체로, 섞인 밴드만 보이는 경우에는 G/G 동형접합체로 볼 수 있다. 레인(Lane) 1: A/G, 레인 2: G/G, 레인 3: A/A. 레인 M: 50-bp 래더(ladder).

본 발명은 위암에 대한 감수성(susceptibility)을 진단할 수 있는 SNP에 관한 것으로서, 상기 SNP는 LOX 유전자의 프로펩티드 도메인(LOX-PP)(서열번호 1) 내에 위치한다. 구체적으로, 본 발명자들은 LOX 유전자의 프로펩티드 도메인(LOX-PP)(서열번호 1)의 473번째 염기에 위치하는 단일염기다형성(SNP) 부위가 한국인의 위암 발병과 관련이 있을 것이라는 가설을 세우고, 본 발명의 일실시예에서, 이 위치에만 제한효소 부위를 갖도록 이 부위를 포함하는 214bp의 PCR 산물(서열번호 2)을 제작하여 실험을 통해 위암과의 관련성을 입증하였다(표 1 및 표 2).

헬리코박터 파일로리 균의 감염 이외에 위암 발달의 위험 증가를 설명하는 분자적 기작은 아직 명확하지 않지만, 암 발생과 관련된 유전자의 다형성을 포함하는 유전적 요인들이 위암에 대한 개인적 감수성의 변화를 설명할 수 있을 것이다. LOX는 콜라겐(collagen) 및 엘라스틴(elastin)의 정상적인 생합성에 필수적인 세포외(extracellular) 효소이다(Kagan HM, Li W. Lysyl oxidase; Properties, specificity, and biological roles inside and outside of the cell. J Cell biochem 2003; 88: 660-72). 최근에, Pro-LOX로부터 방출된 LOX의 프로펩티드 도메인(LOX-PP)이 Ras 신호전달, 유방암, 췌장암, 폐암 및 전립선암 세포들의 변형; 및 Her-2/neu-유도(driven) 유방암 세포에 의한 종양 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Min C, Zhao Y, Romagnoli M, Trackman PC, Sonenshein GE, Kirsch KH. Lysyl oxidase propeptide sensitizes pancreatic and breast cancer cells to doxorubicin-induced apoptosis. J Cell Biochem, 2010; 111: 1160-8). 사람 위암 세포에서 LOX는 종양 억제 기능을 갖고 있지만, 최근에 활성적인 LOX 효소는 성숙한 LOX 효소를 이소성으로(ectopically) 발현시켜 MDA-MB-231 및 MCF-7 유방암 세포들의 침입을 증진시키는 것으로 알려졌다(Erler JT, Bennewith KL, Nicolau M, Dornh?fer N, Kong C, Le QT, et al. Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced metastasis. Nature 2006; 440: 1222-6). 따라서, LOX 및 LOX-PP는 암 세포의 이동에 서로 다른 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이종이식 마우스 모델(mouse xenograft models)에서, LOX-PP는 췌장암 세포의 성장을 감소시키고, 췌장암 및 유방암 세포에서 독소루비신(doxorubicin)의 세포독성 효과를 증가시켰다(Min C, Zhao Y, Romagnoli M, Trackman PC, Sonenshein GE, Kirsch KH. Lysyl oxidase propeptide sensitizes pancreatic and breast cancer cells to doxorubicin-induced apoptosis. J Cell Biochem, 2010; 111: 1160-8).

이에 본 발명자들은 한국인을 대상으로 LOX-PP의 특정 유전자 다형성이 위암 발병 위험성과 관련성이 있는지 분석하고자, LOX G473A 다형성과 위암과의 잠재적인 관련성을 조사하였다. 이를 위해 본 발명의 일실시예에 있어서, 한국인 위암 환자들의 LOX 유전자의 G473A 부위에서 유전형 발생빈도는 G/G에 대해 54.4%, G/A에 대해 34.3%, 그리고 A/A에 대해 11.3%였다(표 1). 위암 환자 및 정상인 간에 LOX-PP의 G473A 다형성의 유전형 및 대립유전자 발생빈도에 있어서 유의적인 차이가 관찰되었다(각각, P = 0.0294 및 P = 0.0339; 표 1). 이러한 결과들은 LOX의 A 대립유전자가 한국인의 위암 감수성에 있어서 유전적 취약 요인이 될 수 있다는 것을 의미한다. 인구 계층화(stratification)를 위한 대조군이 없었기 때문에, 선택편향(selection bias)의 가능성을 완전히 배제할 수는 없지만, 대조군과 암 환자들이 동일한 인구에 속했기 때문에 인구계층화가 상기 결과에 미칠 가능성은 낮은 것으로 보인다.

분자적, 조직학적, 및 역학적 연구들은 위 선암이 장형(intestinal-) 및 미만형(diffuse-type)의 두 개의 주요한 조직학적 서브타입을 갖는 이종(heterogeneous) 질병이라는 증거를 보여준다(Solcia E, Klersy C, Mastracci L, Alberizzi P, Candusso ME, Diegoli M, et al. A combined histologic and molecular approach identifies three groups of gastric cancer with different prognosis. Virchows Arch 2009; 455: 197-211, 및 Tajima Y, Yamazaki K, Makino R, Nishino N, Aoki S, Kato M, et al. Gastric and intestinal phenotypic marker expression in early differentiated-type tumors of the stomach: clinicopathologic significance and genetic background.Clin Cancer Res 2006; 12: 6469-79). 양 서브타입 모두 H. pylori-관련 만성 위염에서 기인한 것으로 보이지만, 역학적 및 조직병리학적 증거는 위 선암이 유전적 다형성, 암 발생 나이, 및 성별에 의해 영향을 받았을 가능성을 보여준다(Yuasa Y. Control of gut differentiation and intestinal-type gastric carcinogenesis. Nat Rev Cancer 2003; 3: 592-600). 본 발명에서, 위암 조직 유형에 따라 계층화시켰을 때, A 대립유전자 및 AA 동형접합체의 발생빈도는 장형 위암 환자들보다 미만형 위암 환자들 사이에서 더 높았고, 이러한 다형성들의 유전형 및 대립유전자 발생빈도에서는 유의적인 차이가 없었다(P <0.05, 표 2). 흥미롭게도, LOX는 HIF-1의 직접적인 표적인 것으로 보이며, 이것은 기능적으로 저산소증-유도 전이(hypoxia-induced metastasis)에 필요하다(Schietke R, Warnecke C, Wacker I, Schodel J, Mole DR, Campean V, et al. The lysyl oxidases LOX and LOXL2 are necessary and sufficient to repress E-cadherin in hypoxia. J Biol Chem 2010; 285: 6658-69). 또한, 저산소증 동안에 E-cadherin 발현을 억제하고, 상피배엽간 전이(epithelial-mesenchymal transition)의 표지자로 역할하기 위해 LOX의 유도가 필요하다는 것도 보고되었다(Schietke R, et al., 2010). 따라서, 본 발명자들의 발견은 한국인의 LOX - PP 다형성이 위암의 분화에 영향을 미칠 가능성을 보여준다. 또한, 위 결과들은 다형성의 A 대립유전자가 암세포의 침입을 역행하는 손상된 능력을 가진다는 증거를 제공할 수 있다.

결론적으로, 본 발명의 실시예를 통하여, 위암 환자와 정상인 간에 LOX G473A 다형성의 유전형 및 대립유전자 발생빈도에 있어서의 유의적 차이를 관찰할 수 있었다(각각, P = 0.0294 및 P = 0.0339; 표 1). LOX 유전자의 다형성은 환자를 위암의 조직학적 서브타입에 따라 분류하였을 때 상당히 다를 수 있다. 따라서, 이러한 결과들은 LOX 유전자의 프로펩티드에 있어서 G473A 다형성이 위암 발달 및 분화에 대한 감수성과 긴밀히 관련될 수 있다는 점을 보여준다.

따라서 본 발명은 상기 SNP 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 위암에 대한 감수성 진단용 폴리뉴클레오티드, 즉 위암에 대한 감수성 진단용 마커를 제공할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 이에 제한되는 것은 아니나, 10개 이상의 연속 염기인 것이 바람직하고, 10 내지 300개의 연속 염기인 것이 보다 바람직하다. 그러나 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 이용형태, 사용되는 제한효소의 종류, PCR 프라이머의 선정 및 PCR 반응의 효율 등의 여러 요소를 고려하여 다양한 길이로 결정될 수 있으며, 그 길이에 제한은 없다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 특히 본 발명의 SNP 부위와 대립유전자(allele) 특이적으로 혼성화 될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 상기 대립유전자 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화되는 것을 말한다.

본 발명에 있어서 상기 대립유전자 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립유전자 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트일 수 있다. 상기 프라이머 세트는 사용목적에 따라 제작될 수 있는데, 제한효소를 이용하여 유전형을 확인하는 경우에는 프라이머를 이용한 PCR 산물 내에 포함되는 제한효소 부위의 수 및 제한효소에 의해 절단되는 단편의 크기 등을 고려하여야 한다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터

유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 특히 본 발명의 SNP 부위와 대립유전자(allele) 특이적으로 혼성화 될 수 있는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 위암 감수성 진단용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 SNP를 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 위암 감수성 진단 관련 SNP 검출용 키트를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 진단 대상로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 상술한 바와 같으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에서 사용된 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예컨대 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SNP를 이용하여 위암에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은 검사 대상으로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 상기 핵산 시료로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위인 473번째 염기의 유전형을 결정하는 단계; 및 상기 결정된 유전형이 G/A 또는 A/A인 경우 위암에 대한 감수성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함한다.

상기 검사 대상으로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산 또는 DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 진단 대상으로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

시료 DNA 의 준비

<1-1> 실험대상

가톨릭대학교 의과대학에서 2000년과 2003년 사이에 부분적위절제술 또는 위전적출술(total gastrectomy)을 받은 458명의 위암 환자로부터 채취한 위 점막 표본들을 본 발명의 실시예에서 사용하였다. 모든 위암 표본들은 병리학적으로 위 선암종(adenocarcinoma)인 것으로 확인되었다. 458명 중 남성이 330명 (68.6%), 여성이 128명 (31.4%) 이었으며, 평균 60세 (22-91세의 범위) 의 나이였고, 초기 진단(initial diagnosis) 상태였다. 조직학적으로, 250개의 샘플은 장형(intestinal-type)이었고(54.6%), 208개의 샘플은 미만형(diffuse-type)이었다(45.4%).

대조군으로 사용된 샘플은 같은 지역에 살고 암이나 주요 질병들에 대한 병력이나 가족력이 없는 건강한 사람들로부터 채취하였다. 건강한 대조군 그룹은 154명의 남성과 128명의 여성으로 구성되었고, 평균 나이가 44세였다. 민족 집단(ethnicity)에 의한 가능한 영향을 배제시키기 위해, 한국 사람들만 포함시켰다. 모든 참여자들로부터 사전 고지된 동의를 얻었고, 본 실험은 가톨릭대학교 임상시험심사위원회의 승인을 받았다.

<1-2> DNA 추출

위암 환자의 표본 중 암이 없는 위 점막 부위로부터 정상적인 세포들을 얻었다. DNA 추출은 공지되어 있는 변형된 single-step DNA 추출법을 사용하여 수행하였다(Lee JY, Dong SM, Kim SY, Yoo NJ, Lee SH, Park WS. A simple, precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections. Virchows Arch 1998; 433: 305-9). 건강한 대조군 그룹에 대해서는, 2mL의 전혈(whole blood)을 원심분리하여, 버피코트(buffy coat)로부터 각각의 혈액 시료의 백혈구 세포 펠렛(pellet)을 얻었다. 이어서, Qiagen DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 생산자의 매뉴얼에 따라 사용하여 백혈구로부터 지놈(genomic) DNA를 추출하였다. DNA 순도 및 농도를 Nanodrop　 ND-1000 분광광도계(spectrophotometer)(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA)로 측정하였다.

< 실시예 2>

LOX 유전자의 G473A 다형성 검사

<2-1> PCR - RFLP ( Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism )

LOX 유전자의 프로펩티드(LOX-PP) 지역 내의 R158Q 다형성 부위를 커버하는 프라이머를 사용하여 지놈(genomic) DNA 증폭을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:

센스 프라이머(sense) 5'-TTCCAAGCTGGCTACTCGAC-3' (서열번호 3); 및

안티센스 프라이머(antisense) 5'-CAGGTCTGGGCCTTTCATAA-3' (서열번호 4)

PCR 반응은 다음과 같은 표준 조건에서 수행되었다. 1㎕의 주형 DNA, 각각의 프라이머 0.5uM, 각각의 디옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트(deoxynucleotide triphosphate) 0.2uM, 1.5 mM MgCl₂, 0.4 유닛(unit)의 중합효소(Ampli Taq gold polymerase), 및 1㎕의 10X 버퍼(Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)를 포함하는 10㎕의 반응 혼합물을 만들고, 94℃에서 12분간 DNA 변성(denatured)을 시키고, 40 사이클(94℃에서 30초간 변성(denaturing), 57℃에서 30초간 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초간 합성(extension))로 증폭시켰다. 마지막 합성(extension) 단계는 72℃에서 5분간 이루어졌다. 증폭 후에, PCR 산물을 5U의 NotI (NEB, Ipswich, MA, USA)으로 37℃에서 4시간 동안 절단하였다. 그 후 DNA 단편들을 2% 아가로오스 젤에서 전기영동으로 분리시켰다. RFLP 결과의 신뢰성을 보장하기 위해, ABI 3730XL Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 생산자의 매뉴얼에 따라 사용하여 fluorescent dideoxy chain termination 법으로 PCR 산물들을 시퀀싱하였다.

<2-2> 통계분석

정상적인 건강한 대조군과 위암 환자들 사이에, 그리고 두 조직학적 유형들 사이에서, 위암의 발달과 유전형 및 대립유전자 발생빈도의 관련성을 평가하기 위해 양방향 피셔 테스트(two-sided Fisher's exact test)를 수행하였다. P-값 <0.05 를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

<2-3> LOX 유전자의 G473A 다형성

LOX NotI 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 214bp의 PCR 단편(서열번호 2)을 증폭하였다. A 대립유전자(allele)는 제한효소 부위가 없는 반면, G 대립유전자는 제한효소 부위를 한 군데 갖고 있다. NotI으로 절단한 뒤, 3개의 유전형이 동정되었다: 114bp 및 100bp 단편들을 만드는 G/G 동형접합체(homozygote); 214bp, 114bp, 및 100bp 단편들을 만드는 G/A 이형접합체(heterozygote); 및 214bp 단편인 A/A 동형접합체(homozygote)(도 2).

한국인 위암 환자 및 대조군들에서 LOX 유전자에 대한 G473A의 유전형 및 대립유전자 발생빈도를 표 1 및 표 2에 요약하였다.

위암 환자 및 건강한 대조군에서 LOX - PP(G473A) 유전자 다형성의 유전형 및 대립유전자 분포

	위암 환자 (N=458)		대조군 (N=282)		Crude OR (95% CI)	Adjusteda OR (95% CI)
	수	비율(%)	수	비율(%)
LOX-PP
AA	52	11.3	16	5.7	1.472 (1.094-1.981)	1.583 (1.078-2.325)
AG	157	34.3	100	35.5	1.047 (0.761-1.439)	1.089 (0.722-1.643)
GG	249	54.4	166	58.9	1.00	1.00
G:A대립유전자 발생빈도b	655:261 (71.5%:28.5%)		432:132 (76.6%:23.4%)
Trend testc					1.272 (1.009-1.602)	1.339 (0.993-1.806)

a. 나이(년) 및 성별에 따른 조정

b. 양방향 피셔 테스트(two-sided Fisher's exact test): 유전형 분포에 대해 P=0.0294, 대립유전자 발생빈도에 대해 P=0.0339

c. 연속변량(continuous variable)으로 유전형에서 A 대립유전자의 수를 사용한 회귀분석 모델에서의 계산(Calculated in the logistic regression model using the number of A alleles in the genotypes as a continuous variable)

위암 환자 및 건강한 대조군에서 LOX - PP(G473A) 유전형 발생빈도의 서브그룹(subgroup) 분석

변수	LOX - PP						Adjusteda OR (95% CI)	Adjusteda OR (95% CI)
	환자의 수			대조군의 수			GG versus GA	GG versus AA
	AA	AG	GG	AA	AG	GG
나이
=50	9	32	44	14	81	135	1.210 (0.710-2.062)	1.409 (0.895-2.218)
>50	43	125	205	2	19	31	0.963 (0.520-1.784)	1.775 (0.851-3.705)
성별
남성	35	107	169	8	55	91	1.008 (0.585-1.737)	1.479 (0.879-2.489)
여성	17	50	80	8	45	75	1.163 (0.617-2.192)	1.671 (0.953-2.932)
조직 유형
대조군				16	100	166
미만형b	107	60	36				1.115 (0.688-1.807)	3.657 (1.614-8.283)
장형c	142	97	16				0.872 (0.512 -1.486)	1.513 (0.532-4.305)

a. 나이 및 성별에 대한 연속회귀 모델에서 이 표에 나타난 다른 공동변량(covariates)[연속변량으로 나이(년)]에 대해 조정; 조직 유형에 대한 연속회귀 모델에서 나이 및 성별 모두 조정

b. 양방향 피셔 테스트(two-sided Fisher's exact test): 유전형 분포에 대해 P=0.0001, 대립유전자 발생빈도에 대해 P=0.0021

c. 양방향 피셔 테스트(two-sided Fisher's exact test): 유전형 분포에 대해 P=0.7607, 대립유전자 발생빈도에 대해 P=0.4771

정상적인 건강한 사람(n = 282)의 G473A의 G/G, G/A, 및 A/A 유전형의 발생빈도는 각각 58.9%, 35.5%, 및 5.7%였다. 모든 그룹의 유전형 발생빈도는 이전에 보고된 코카시안 인구(Caucasian population)의 것과 일치하였다(Min C, Yu Z, Kirsch KH, Zhao Y, Vora SR, Trackman PC, et al. A loss-of-function polymorphism in the propeptide domain of the LOX gene and breast cancer. Cancer Res 2009; 69: 6685-93). 건강한 대조군 그룹에서 G 및 A 대립유전자의 발생빈도는 각각 76.6% 와 23.4%였다. 남성과 여성을 비교할 때 유전형(P = 0.9296) 또는 대립유전자 발생빈도(P = 0.8283)에 있어서 통계적인 차이는 없었다.

위암환자의 G473A의 유전형인, G/G, G/A, 및 A/A의 발생빈도는 각각 54.4%, 34.3%, 및 11.3%였다. 위암 환자에 있어서 G473A의 G 및 A 대립유전자의 발생빈도는 각각 71.5% 및 28.5% 였다. 남성과 여성 환자를 비교하였을 때, 유전형(P = 0.9935)이나 대립유전자 발생빈도(P = 0.9747)에 있어서 통계적 차이는 없었다.

그러나, 본 발명자들은 위암 환자들과 건강한 대조군 그룹 간에 유전형(P = 0.0294) 및 대립유전자 발생빈도(P = 0.0339)에 있어서 통계적으로 유의성 있는 차이를 관찰할 수 있었다(표 1). 미만형(diffuse-type) 암과 대조군 간에, 장형(intestinal-type) 암과 대조군 간에 유전형 차이를 비교하였을 때, A 대립유전자 (G/A 또는 A/A 유전형) 보유자의 미만형 위암에 대한 위험이 G/G 유전형 보유자에 비해 통계적으로 더 높았다(P=0.0001, 표 2). 또한, 미만형 위암과 건강한 대조군 간에 대립유전자 발생빈도에 있어서도 상당한 차이를 발견할 수 있었다(P = 0.0021). 하지만, 장형 위암 환자 및 대조군 간에는 대립유전자 및 유전형 발생빈도에 있어서 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(각각, P=0.4771 및 P=0.7607). 이러한 결과들을 종합하면, 상기 데이터는 LOX 유전자의 G473A가 위암의 발달 및 분화의 위험 증가와 관련이 있다는 사실을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 서열번호 1의 473번째 염기를 포함하는 10~300개의 연속적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 한국인의 위암 감수성 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 한국인의 위암 감수성 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   서열번호 1의 473번째 염기 G가 A로 치환되어 상기 473번째의 유전자형이 G/A 또는 A/A인 경우 위암 발병 위험도 또는 위암 세포의 분화가 증가하는 것을 특징으로 하는 한국인의 위암 감수성 진단용 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 서열번호 1의 473번째 염기를 포함하는 10~300개의 연속적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 및 NotI 제한효소를 포함하는 한국인의 위암 감수성 진단 키트.
8. 삭제
9. 검사 대상으로부터 수득한 핵산 시료로부터 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위인 473번째 염기의 유전형을 결정하는 단계; 및
   결정된 유전형이 G/A 또는 A/A인 경우, 위암에 대한 감수성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 한국인의 위암 감수성 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    유전형의 결정 단계는,
    상기 검사 대상으로부터 수득한 핵산 시료를 주형으로 하고, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 473번째 염기를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머인 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및
    상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing) 및 제한효소인 NotI으로 절단하는 방법으로 유전형을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 삭제
12. 삭제

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