KR20100100529A

KR20100100529A - 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법

Info

Publication number: KR20100100529A
Application number: KR1020090019486A
Authority: KR
Inventors: 강창원; 주형석
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2010-09-15
Also published as: KR101187317B1

Abstract

본 발명은 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커, 일배체형 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 산재성 위암 발생과 관련성을 갖는 RPS6KB2, PTPRCAP, CORO1B 및 GPR152 유전자 내의 다형성 및 일배체형을 확인함으로써 산재성 위암의 위험성을 예측 및 분석하는 방법에 관한 것이다.

RPS6KB2, PTPRCAP, CD45-AP, CORO1B, GPR152, 단일염기다형성(SNP), 일배체(haplotype), 위암, 감수성(susceptibility), 유전적 관련성(genetic association)

Description

산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법{Polymorphic markers predicting susceptibility to diffuse-type gastric cancer and the prediction method thereof using the same}

본 발명은 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커, 일배체형 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법에 관한 것이다.

위암은 유전적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생한다. 헬리코박터 파일로리균의 감염, 흡연, 음주 및 건강하지 못한 식습관 등은 위암의 발생 가능성을 높이는 대표적인 위험요소로 알려져 있다(Correa P, Cancer Res . 52:6735-6740, 1992; Peek RM et al., Nat Rev Cancer. 2002, 2, 28-37; Tsugane S et al ., Br J Cancer. 90:128-134, 2004; Palli D, J Gastroenterol . 35:84-89, 2000). 또한 IL1B, IL1R2, IL10, TLR4, TNF 및 PSCA 유전자의 유전변이가 위암의 감수성과 유의한 관련성이 있음이 보고된바 있다(El-Omar EM et al., Nature . 404:398-402, 2000; El-Omar EM, Gut . 48:743-747, 2001; Hold GL et al., Gastroenterol ogy . 132:905-912, 2007; Sakamoto H et al., Nat Genet . 40:730-740, 2008). 특히 IL1B, IL1R2, IL10, TLR4 및 TNF는 면역반응을 활성화하는 세포신호로 장관성 위암(intestinal-type)의 발생 전 단계에서 발견되는 순차적인 변화, 즉, 염증반응, 만성위염 및 위산부족증의 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 한편 PSCA는 광범위 유전체 관련 연구(genome-wide association study)를 통해 발견된 산재성(diffuse-type) 위암 유전자로 위상피세포의 분열과 증식에 영향을 미치는 것으로 보인다. 하지만 지금까지 밝혀진 유전자만으로는 위암 감수성을 모두 설명할 수 없어, 아직까지 알려지지 않은 위암 유전자가 더 존재할 것으로 생각된다.

단백질 타이로신 인산화효소(Protein tyrosine kinase)와 단백질 타이로신 탈인산화효소(Protein tyrosine phosphatase)에 의해 조절되는 타이로신(tyrosine) 잔기의 인산화 및 탈인산화는 역동적인 균형을 유지하며 세포신호전달의 스위치 역할을 수행한다(Hunter T & Cooper JA, Annu Rev Biochem . 54:897-930, 1985). 타이로신의 인산화 및 탈인산화는 세포의 분열, 부착 및 이동 등을 조절하며, 인산화 및 탈인산화의 불균형은 암 발생과 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Ostman A et al., Nat Rev Cancer. 6:307-320, 2006).

SFK(Src family kinase)는 세포의 분열, 이동, 침투 및 혈관생성을 촉진하고 사멸을 억제하며 암세포 주위의 혈관생성을 유도하는 암 유전자이다(Summy JM & Gallick GE, Cancer Metastasis Rev . 22:337-358. 2003). SFK 단백질의 카르복실 말단에 위치한 타이로신 잔기가 인산화되면, SFK는 활성을 잃게 된다. CD45로 더 잘 알려진 PTPRC(protein tyrosine phosphatase C)는 SFK의 활성을 억제하는 타이로신 인산기를 제거함으로써 SFK를 활성화하는 것으로 알려져 있다(Mustelin T et al., Proc Natl Acad Sci USA. 86:6302-6306, 1989; Mustelin T et al., Eur J Immunol. 22:1173-1178, 1992; Trowbridge IS & Thomas ML, Annu Rev Immunol . 12:85-116, 1994). 이 과정에서 PTPRCAP(CD45-AP)는 PTPRC와 결합하여 PTPRC의 작용을 도와 SFK의 활성을 높이는 역할을 한다(Matsuda A et al., J Exp Med . 187:1863-1870, 1998; Takeda A et al., J Biol Chem . 269:2357-2360, 1994; Takeda A et al., Blood . 103:3340-3447, 2004).

비정상적으로 활성화된 SFK는 E-카드헤린(E-cadherin) 단백질이 세포막에 위치하는 것을 방해하여 세포와 세포 사이의 결합을 파괴하고(Owen DW et al., Mol Biol Cell . 11:51-64, 2000; Irby RB & Yeatman TJ. Cancer Res. 62:2669-2674, 2002; Avizienyte E et al., Nat Cell Biol . 4:632-638, 2002), 세포가 주변 조직으로 침투하도록 세포의 성질을 변화시킨다(Behrens J et al., J Cell Biol . 120:757-766, 1993). 실제로 많은 상피세포암에서 SFK의 과발현이나 활성화가 관찰되었다(Summy JM & Gallick GE, 2003). 특히 산재성 위암의 대표적인 유전자인 E-카드헤린이 SFK에 의해 조절된다는 것은 주목할 만한 점이다(Boussioutas A et al., Cancer Res . 63:2569-2577, 2003; Guilford P, Nature . 392:402-405, 1998). 따라서, PTPRCAP는 PTPRC과 결합하여 SFK를 활성화하고, SFK가 암 발생과 관련된 여러 가지 신호를 세포에 전달하도록 돕는 역할을 할 가능성이 있다.

이에 본 발명자들은 환자-대조군 연구를 통해 PTPRCAP 유전자의 위암 감수성과의 관련성을 분석하였다. 그 결과 PTPRCAP 유전자 및 인접한 RPS6KB2 , CORO1B , GPR152 유전자에 존재하는 10개의 단일염기다형성(SNP)가 산재성 위암의 감수성과 유의하게 관련되어 있음을 발견하였고, 특히, PTPRCAP 프로모터에 위치하는 다형성이 유전자의 발현량과 산재성 위암의 유전적 소인을 예측하는데 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상기 산재성 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커를 이용한 산재성 위암 감수성 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 산재성 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커가 집적된 산재성 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 산재성 위암 감수성 예측용 단일염기다형성 마커를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 산재성 위암 관련성 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 산재성 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 산재성 위암 관련성 단일염기다형성 마커가 집적된 산재성 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 C이고; ② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ③ rs1790753(서 열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 T이고; ⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 A이고; ⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 G이고; 및, ⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 G인 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 T이고; ② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ③ rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G이고; ④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 G이고; ⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 G이고; ⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G이고; ⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 A이고; 및, ⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 A인 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

아울러, 본 발명은 산재성 위암 예측을 위해, 상기 산재성 위암 관련성 단일 염기다형성 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)은 인간 게놈에 약 0.1%(약 1000 염기에 1 염기)의 비율로 존재하는 가장 빈도가 높은 다형이다. 즉, 이 단일염기다형성이란, 게놈 유전자의 하나의 염기가 다른 염기로 치환하는 것에 의해, 예컨대 야생형이 G-C 염기 쌍인 데 대하여, 다형성에서는 A-T 염기 쌍으로 되어 있는 상태를 의미한다. 또한 이중가닥 염색체의 각각의 대립 유전자가 다형 형태인 경우(동형 접합 다형성)와, 한쪽이 야생형, 다른 쪽이 다형성인 경우(이형 접합형 다형성)가 존재한다. 이러한 하나의 염기의 변이는, 코돈 변이에 의한 변이 아미노산의 합성(미스센스 변이)이나 종지 코돈의 생성에 의한 불완전 단백질의 합성(넌센스 변이)을 발생시키는 경우가 있다. 따라서 단일염기다형성의 유무가 여러 가지 질병에도 관련되는 것이 명백해지고 있으며(예컨대 폐암에 관한 p 53 유전자의 SNP: Biros et al., Neoplasma 48(5):407-11, 2001), 진단이나 유전적 치료법 등을 목적으로서 단일염기다형성의 유무를 정확히 판정하는 것(SNP 타이핑)의 중요성이 강하게 인식되고 있다. 또한, 이 단일염기다형성은 질환이 쉽게 걸리는 성질이나 약제 반응성에 관련되는 유전자를 탐색할 때의 유용한 다형성 마커이기도 하고, 테일러 메이드(tailor-made) 의료를 위한 중요한 유전자 정보로서도 주목받고 있다.

일배체형은 하나의 집단 내에서 발견된 여러 부위의 단일염기다형성을 통계학적인 개연성에 근거해 조합한 것으로, 각각의 단일염기다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전정보를 제공하는 것으로 알려져 있다.

11q13은 염색체 11번 염색체의, 동원체(centromere)의 아래인 장완부(long arm; q)의 13번째 밴드를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 산재성 위암 관련성 단일염기다형성 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는 산재성 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다.

CD45로 더 잘 알려진 PTPRC(protein tyrosine phosphatase C)는 암 유전자인 SFK(Src family kinase)의 활성을 억제하는 타이로신 인산기를 제거함으로써 SFK를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 이때, PTPRCAP(CD45-AP)는 PTPRC와 결합하여 SFK의 활성을 높이는 역할을 한다. 비정상적으로 활성화된 SFK는 산재성(diffuse-type) 위암의 대표적인 유전자인 E-카드헤린(E-cadherin) 단백질이 세포막에 위치하는 것을 방해하도록 조절한다.

본 발명자들은 이에 주목하여 PTPRCAP이 존재하는 인간 유전체 11q13 지역의 430 kb에 달하는 영역에서 23개의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 선정하고 위암과의 관련성을 환자-대조군 연구를 통하여 분 석하였다. 그 결과, RPS6KB2, PTPRCAP, CORO1B 및 GPR152 유전자로 이루어진 26 kb 지역에 존재하는 10개의 단일염기다형성이 산재성 위암 감수성과 유의하게 관련되어 있었다[rs1476792(+112T>C; 서열번호 82), rs4930427(+401C>T; 서열번호 83), rs1790753(+301G>A; 서열번호 84), rs1790752(+401C>T; 서열번호 85), rs13859(+401C>T; 서열번호 86), rs869736(+417G>T; 서열번호 87), rs872375(+101G>A; 서열번호 88), rs2302264(+301G>A; 서열번호 89), rs1808279(+220A>G; 서열번호 90), rs1790761(+218A>G; 서열번호 91) (도 1 참조). 또한, 각 다형성의 소수 대립형질(minor allele)은 산재성 위암의 감수성을 다수 대립형질(major allele)에 비해 40% 이상 높이는 것으로 나타났다(표 2 참조). 10개의 다형성은 서로 강하게 연관되어 있었고(R² = 0.97), 일배체형(haplotype) 및 이배체형(diplotype) 분석에서도 매우 유의한 위암 관련성을 확인할 수 있었다(표 3 참조). 하지만 장관성 위암(intestinal-type)과는 유의한 관련성이 발견되지 않았다(표 4 참조).

특히, PTPRCAP 프로모터에 위치하는 rs869736(-309G>T) 다형성은 산재성 위암의 감수성과 유의하게 관련되어 있을 뿐 아니라(표 4 참조), 프로모터 활성을 조절하는 기능이 있음을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 즉, 위암 세포주(MKN28)에서 루시퍼라아제 검사와 EMSA(eletrophoretic mobility shift assay) 실험기법을 사용하여 분석한 결과, rs869736 다형성의 T 대립형질은 G 대립형질과 비교하여 프로모터 활성과 DNA-단백질 결합력이 더욱 강한 것으로 나타났다. 또한 B 세포주를 사용한 생체내(in vivo) mRNA 발현량 실험에서도 T 대립형질은 PTPRCAP의 발현량 증가와 유의하게 관련되어 있었다(도 4 참조).

이에, 본 발명의 단일염기다형성 및 일배체는 산재성 위암의 감수성 예측에 유용하게 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의, 산재성 위암 관련성 다형성 부위를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 산재성 위암 감수성 예측용 키트를 제공한다:

1) rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 +112번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

2) rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

3) rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

4) rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

5) rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

6) rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +417번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

7) rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +101번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

8) rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

9) rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 +220번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드; 및,

10) rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 +218번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드.

상기 키트의 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하도록 제작된 것이 바람직하며, 상기 다형성 부위를 포함하는 연 속적인 15 내지 50개의 염기를 포함하도록 상기 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 것은 모두 사용 가능하다.

상기 특이적 결합은 비특이적인 혼성체가 형성되지 않고, 특이적인 혼성체가 형성되는 것을 의미하고, 상기 엄격한 혼성화 조건은 통상적인 방법에 따라 혼성체를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm) 등에 기초하여 결정할 수 있다. 구체적인 혼성화 상태를 유지할 수 있는 세정 조건으로는 통상 「1×SSC, 0.1%SDS, 37℃」정도의 조건, 더욱 엄격하게는 「0.5×SSC, 0.1%SDS, 42℃」정도의 조건, 더욱더 엄격하게는 「0.1×SSC, 0.1%SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.

상기 프로브는 임의의 고형 기질에 고정화해 이용할 수도 있다. 상기 고형기질로는 유전자 팁, cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이, 멤브레인 필터(membrane filter) 등도 포함된다.

상기 키트의 프라이머 쌍은 하기 프라이머 쌍 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 15 내지 50머 길이, 바람직하게는 15 내지 30머의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25머의 길이의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 모두 사용 가능하다.

또는 상기 프라이머 쌍은 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 15 내지 50개의 염기로 구성되며, 상기 다형성 부위의 염기를 3'말단으로 갖는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 가질 수 있다. 상기 3' 말단에 다형성 부위를 가짐으로써, 상기 단일 핵산 분자의 변이에 의해, 상기 다형성 부위가 변이되지 않은 개체로부 터 수득한 게놈 DNA 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않는 것은 당업자에게 자명하다.

프라이머 쌍 1: 서열번호 22로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 23으로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 2: 서열번호 29로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 28로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 3: 서열번호 32로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 33으로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 4: 서열번호 35로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 36으로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 5: 서열번호 38로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 39로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 6: 서열번호 44로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 452로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 7: 서열번호 47로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 48로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 8: 서열번호 50으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 51로 기재되는 역방향 프라이머;

프라이머 쌍 9: 서열번호 53으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 54로 기재되는 역방향 프라이머; 및,

프라이머 쌍 10: 서열번호 56으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 57로 기재되는 역방향 프라이머.

이때, 상기 키트는 PCR 반응의 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, NED 또는 HEX 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 집적된 산재성 위암 감수성 예측용 마이크로어레이를 제공한다:

1) rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

2) rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

3) rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

4) rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

5) rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

6) rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

7) rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

8) rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

9) rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드; 및,

10) rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관 련성 올리고뉴클레오티드.

상기 올리고뉴클레오티드는 시료에 포함된 DNA를 증폭하면서 형광물질로 표지된 증폭산물과 미스매치가 있는 경우 혼성화되지 않고, 매치되는 경우 혼성화되어 형광을 나타내어, 상기 형광을 검출함으로써 시료의 산재성 위암 감수성을 예측할 수 있다. 이때, 상기 올리고뉴클레오티드 상의 단일 핵산 분자의 미스매치로도 혼성화가 되지 않는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 마이크로어레이는 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이를 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 올리고뉴클레오티드를 탐침 DNA 분자로 이용하여 마이크로어레이의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로파이펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 C이고; ② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ③ rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 T이고; ⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 A이고; ⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 G이고; 및, ⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 G인 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커를 제공한다.

아울러, 본 발명은 산재성 위암 발명이 개체(실험군) 및 대조군의 혈액 시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

1) 상기 DNA를 대상으로, 하기 산재성 위암 관련성 다형성 부위를 검출하는 단계; 및

3) 단계 2)의 검출 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 산재성 위암을 예측하기 위해 제 1항의 산재성 위암 관련성 단일염기다형성 마커를 검출하는 방법을 제공한다:

① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 +112번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

③ rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C 또는 T이고, 상기 +401번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 +417번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +101번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 +301번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 +220번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드; 및,

⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 +218번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드.

단계 1)의 검출방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(micoarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, 제한효소절편길이분석(restriction fragment length polymorphisms, RFLP), 질량분석법 (MALDI-TOF mass spectrometry) 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 "TaqMan™" 프로브로 통상적으로 지칭되는 이중으로 표지된 형광원성(fluorogenic) 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 PCR 검출 및 정량이 또한 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 이러한 프로브는 2개의 상이한 형광 염료로 표지된 짧은 (예를 들어, 20-25개의 염기) 올리고데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 각각의 프로브의 5' 말단에는 리포터 염료가 있고, 3' 말단에는 켄칭(quenching) 염료가 표지된다. 올리고뉴클레오티드 프로브 서열은 PCR 앰플리콘 내에 존재하는 내부 표적 서열에 상보적이다. 프로브가 손상되지 않으면, 2개의 형광단 간에 에너지 전달이 발생하고 리포터로부터의 방출이 FRET에 의해 켄칭된다. PCR의 신장 단계동안, 프로브가 반응에서 사용된 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단됨으로써, 리포터가 올리고뉴클레오티드-켄쳐로부터 유리되고 리포터 방출 강도에서의 증가가 일어난다. 따라서, TaqMan™ 프로브는 표지 및 켄쳐가 있는 올리고뉴클레오티드이고, 이때 표지가 증폭 동안 증폭에서 사용된 중합효소의 엑소뉴클레아제 작용에 의해 방출된다. 이는 합성 동안 증폭의 실시간 측정을 제공한다. 다양한 TaqMan™ 시약을 Applied Biosystems(USA) 뿐만 아니라 다양한 전문 판매자 예컨대 Biosearch Technologies(예를 들어, 블랙 홀(black hole) 켄쳐 프로브)로부터 시판된다. 이중-표지 프로브 전략에 관한 추가적인 상세사항은 WO92/02638에 기재되어 있다.

상기와 같이 RPS6KB2 , PTPRCAP , CORO1B 및 GPR152 유전자의 rs1476792, rs4930427, rs1790753, rs1790752, rs13859, rs869736, rs872375, rs2302264, rs1808279 및 rs1790761 다형성 마커 및 일배체형 마커는 산재성 위암 감수성과 밀접한 관련이 있으므로, 이를 측정함으로써 미리 산재성 위암 발생의 감수성을 인지하여 이를 예방하는데 유용하게 이용될 수 있고, 산재성 위암의 유전적 소인을 분석하는데 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험대상의 선정

본 발명은 430명의 위암환자와 406명의 정상인 유전체 DNA를 이용하였다. 위암환자와 정상인의 혈액 및 조직시료는 서울대학교병원, 한양대학교 구리병원, 인제대학교 백병원, 충남대학교병원, 을지대학교병원에서 각 기관의 내부윤리위원회의 승인 하에 수집되었다. 대조군에는 위내시경이나 위장조영술을 포함하는 건강검진결과 정상으로 판명된 사람만을 포함시켰다.

위암환자의 진단 시 연령은 57.3 ± 12.9세 (평균 ± 표준편차)이고, 정상인은 52.1 ± 8.4세이었다. 남성의 비율은 환자군이 66.5%, 정상인이 69.5%로 두 그룹 모두에서 남성의 비율이 더 높았다.

위암 환자군을 로렌 분류법(Lauren's classification)에 근거하여 분류하면, 장관성 위암환자가 178명, 산재성 위암환자가 252명이었으며, 혼합형은 분석에 포함되지 않았다. 또한 위암의 병기에 따라 분류하면 1A기 42명, IB기 66명, II기 86명, IIIA기 106명, IIIB기 58명, IV기 72명으로 구성되어 있었다.

< 실시예 2> 다형성의 분석

<2-1> DNA 추출

연구대상으로부터 획득한 냉동된 위조직이나 혈액시료에서 Puregene^TM DNA 정제 키트(Gentra, 미국), 혹은 DNeasy^® tissue 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 유전체 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 이중나선 DNA만을 특이적으로 정량하는 PicoGreen^®(Molecular Probes, Eugene, OR) 형광염료를 사용하여 농도를 측정한 후, 유전자형 검사(genotyping)에 적합한 2.5 - 10 ng/㎕의 농도로 보관하였다.

<2-2> 다형성 분석을 위한 영역의 선정 및 프라이머 설계

International HapMap 데이터베이스(/www.hapmap.org/)에 근거하여, PTPRCAP이 존재하는 인간 유전체 11q13 지역의 430 kb에 달하는 영역에서 23개의 단일염기다형성을 선정한 후, 유전자형 분석을 위한 PCR용 정방향 및 역방향 프라이 머(primer)와 염기연장반응용(extension reaction; Ext) 프라이머 서열을 표 1에 제공하였다. 유전자형 분석에 사용된 프라이머는 Assay Design 3.1(Sequenom, 미국) 프로그램을 사용하여 설계하였다.

단일염기다형성 분석을 위한 프라이머 서열

SNP_ID	정방향 PCR 프라이머	역방향 PCR 프라이머	Ext 프라이머
rs2282502	ACGTTGGATGTGGTGACATCGAAGCAAAGC: 서열번호 1	ACGTTGGATGAGGGCAAGATGACTATGACC: 서열번호 2	CGGCCCCTGTTCTACCCTGA: 서열번호 3
rs10791899	ACGTTGGATGAGTGTCCAGTGGTCTGTAAC: 서열번호 4	ACGTTGGATGGGAAGGCTATCTGATCACTC: 서열번호 5	GAGTCAGTGACAGGGCTGG: 서열번호 6
rs3927807	ACGTTGGATGTCCAACCCATTTGTCCACTG: 서열번호 7	ACGTTGGATGTTACCTAGGTGTCCTCCTAG: 서열번호 8	TCCTAGGTCAGGATCCTGTT: 서열번호 9
rs1790740	ACGTTGGATGAGCTCCCAGGTAATACATGG: 서열번호 10	ACGTTGGATGTATATGAGTAGCCTCGCTCC: 서열번호 11	ACTTCCAAACAAGCTCTCAAG: 서열번호 12
rs7480390	ACGTTGGATGTGTTCACAACACCTTCCACC: 서열번호 13	ACGTTGGATGCGGAAGGACTGTGGAAGTTG: 서열번호 14	GTTGTTTTTCTCTTTCAAAAGCC: 서열번호 15
rs10896172	ACGTTGGATGTAGCCCAAACTCACACTGTG: 서열번호 16	ACGTTGGATGAAGATCCTAGGCAGAACTGC: 서열번호 17	TCTTCCCTAAGCCAGGAGC: 서열번호 18
rs1790733	ACGTTGGATGCTGCCCTTTCTGTAGAAGGG: 서열번호 19	ACGTTGGATGTTTCTGCCTGTGCTGCTGGAG: 서열번호 20	GTCCAGAGCCCGGGTGAGTGT: 서열번호 21
rs1476792	ACGTTGGATGACCCAGATCCTTCTCAGATC: 서열번호 22	ACGTTGGATGAGAATCGGGAGAAAAGGCTG: 서열번호 23	GGGTGAGGGTGGGATCAGA: 서열번호 24
rs917570	ACGTTGGATGAGTGAGTGAGGGTCGTGTTG: 서열번호 25	ACGTTGGATGTAATGAGGACAAGGCTCCAG: 서열번호 26	GACAAGGCTCCAGTGCTCCCCA: 서열번호 27
rs55987642	ACGTTGGATGTGCCCCTGATGATCTTATCC: 서열번호 28	ACGTTGGATGACAAGGCTCCTCTCACCTTC: 서열번호 29	CTTCCTCCTCCTCCAGC: 서열번호 30
rs4930427	ACGTTGGATGACAAGGCTCCTCTCACCTTC: 서열번호 29	ACGTTGGATGTGCCCCTGATGATCTTATCC: 서열번호 28	TTCCGGTTCTCTGCGGT: 서열번호 31
rs1790753	ACGTTGGATGTCATTCCCAGAGGCAAACTG: 서열번호 32	ACGTTGGATGATTCTGCACGTGTTCCTGAG: 서열번호 33	CAAACTGCACAGGCCGGG: 서열번호 34
rs1790752	ACGTTGGATGTTGATGCTGTCCAGGACAGA: 서열번호 35	ACGTTGGATGATCGTGACTAAGGATGGCAG: 서열번호 36	GTCGCATGGCCCTGCCTCC: 서열번호 37
rs13859	ACGTTGGATGTTCTCCTTCCAGCCCAAGC: 서열번호 38	ACGTTGGATGTCCCTAACCCAGCCACACAC: 서열번호 39	CCTCAGTACCTGACGGGG: 서열번호 40
rs10274	ACGTTGGATGTGAAAGTGTGTGTCTGCTGG: 서열번호 41	ACGTTGGATGTTAATCTTCCACGGGAGCAG: 서열번호 42	GGGAGCAGTTGAGCGCGGGG: 서열번호 43
rs869736	ACGTTGGATGTTCTGCACATGTGTGACTCC: 서열번호 44	ACGTTGGATGTTCTAAAAGCCAGGCTGACC: 서열번호 45	GGAAACCTGGAGACAGA: 서열번호 46
rs872375	ACGTTGGATGTGCATCACCTCCTCCAGCTTC: 서열번호 47	ACGTTGGATGTTGGGAGGGCTATGGCTTAG: 서열번호 48	CTACCCCTGCTTCATGTCC: 서열번호 49
rs2302264	ACGTTGGATGATCCTCCACTTCCAGTCCTC: 서열번호 50	ACGTTGGATGTGAGAACTGTCACGAGGCAG: 서열번호 51	GTCTAGCCACCTTAGGGGT: 서열번호 52
rs1808279	ACGTTGGATGGGGAAATCGAGACCATCCT: 서열번호 53	ACGTTGGATGCAAGAAATTCACCCCAGTAGC: 서열번호 54	GTAGCTGGGACTACAGGCT: 서열번호 55
rs1790761	ACGTTGGATGCTGGGGCTCTGATCCAATAG: 서열번호 56	ACGTTGGATGGCCACTTGGCCTTTAGTTTG: 서열번호 57	TTTGGTGCCCTCCGTACCC: 서열번호 58
rs17501521	ACGTTGGATGTTTCTTCCTAGGTGCAGAGC: 서열번호 59	ACGTTGGATGTGAGGGCATAAGGTCTGAAG: 서열번호 60	GGCATAAGGTCTGAAGCCCAAG: 서열번호 61
rs4084113	ACGTTGGATGATCCGCAGGTGGACTGCTG: 서열번호 62	ACGTTGGATGAAAGGAGACCCAGGGTACTG: 서열번호 63	ACAGGTTTTCTTGTCTCTGTCC: 서열번호 64
rs2276120	ACGTTGGATGTGCGCAAAACTGTGATGCCC: 서열번호 65	ACGTTGGATGAAGGAAGGGGCAGACAGAGAC: 서열번호 66	CAGACAGAGACTAGAGGCG: 서열번호 67

<2-3> 유전자형 분석

다형성의 유전자형은 MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 MassARRAY^TM 시스템(Sequenom, 미국)을 이용하였다.

구체적으로, 1차 PCR 반응은 2.5 ng의 유전체 DNA, 1× 완충용액, 1 mM MgCl₂, 200 μM dNTP 혼합물, 0.1 유닛 HotStart Taq 중합효소(솔젠트, 한국) 혼합물에 200 nM의 상기 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 첨가한 5 ㎕ 용액에서 수행하였다. 반응조건은 94℃ 15분 초기 변성화 후, 94℃ 20초, 56℃ 30초, 72℃ 1분의 주기를 45회 반복하였고, 72℃ 3 분의 최종 연장단계로 이루어졌다. 1차 PCR 반응 후, 0.3 유닛의 SAP(shrimp alkaline phosphatase; Sequenom, 미국)을 첨가하였고, 37℃ 20분, 85℃ 5분간 배양하여 잔여 dNTP를 제거하였다. 2차 PCR 반응인 hME 연장반응은 위의 반응결과물에 50 μM d/ddNTP 종결자 혼합물(terminator mix)과 600 nM Ext 프라이머, 0.576 유닛 thermo sequenase™ 효소(Sequenom, 미국)를 첨가하여 실행하였다. 94℃에서 2 분간 초기 변성화를 실행한 후, 94℃ 5초, 52℃ 5초, 72℃ 5초의 짧은 주기를 40회 반복하였다. 16 ㎕의 증류수와 3 ㎎의 Clean Resin(Sequenom, 미국)을 첨가한 후, 최종 반응산물을 SpectroChip(Sequenom, 미국)에 옮겨 Analyzer Compact(Sequenom, 미국) 질량분석기로 유전자형을 결정하였다.

<2-4> 통계분석

카이제곱 독립검정을 사용하여 Hardy-Weinberg 평형(HWE: Hardy-Weinberg equilibrium)과 위암 감수성 간의 관련성을 분석하였다. 23개 다형성 모두 대조군에서 유전자형의 예측빈도와 관찰빈도 사이의 유의한 차이는 발견되지 않았다(HWE P > 0.05). 환자군과 대조군 사이의 성별, 연령의 차이를 보정하기 위해 로지스틱(logistic) 회귀분석을 사용하였다. 모든 통계분석에는 SPSS 11.5 프로그램을 이용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 RPS6KB2, PTPRCAP, CORO1B 및 GPR152 유전자로 이루어진 26 kb 지역에 존재하는 10개의 단일염기다형성이 산재성 위암 감수성과 유의하게 관련되어 있었다[rs1476792(+112T>C; 서열번호 82), rs4930427(+401C>T; 서열번호 83), rs1790753(+301G>A; 서열번호 84), rs1790752(+401C>T; 서열번호 85), rs13859(+401C>T; 서열번호 86), rs869736(+417G>T; 서열번호 87), rs872375(+101G>A; 서열번호 88), rs2302264(+301G>A; 서열번호 89), rs1808279(+220A>G; 서열번호 90), rs1790761(+218A>G; 서열번호 91)]. 또한, 표 2에 나타난 바와 같이 각 다형성의 소수 대립형질(minor allele)은 산재성 위암의 감수성을 다수 대립형질(major allele)에 비해 40% 이상 높이는 것으로 나타났다. 이때, 통계적 유의수준은 다중비교 (multiple testing)로 인한 오류의 증가를 보정하기 위해 EDF (effective degree of freedom) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 분배불균형을 고려한 23개 단일염기다형성의 EDF는 13.86이고, 보정된 유의수준 α는 1- (1-0.05)^1/13.86= 0.0037이었다. 통계적으로 유의한 값(P < 0.037)은 밑줄로 표시하였다.

단일염기다형성의 산재성 위암 관련성

유전자	다형성	기능	대립형질	형질빈도	OR (95% CI)	P
RHOD	rs2282502	Asp88	C>T	0.42	0.95 (0.75-1.18)	0.62
	rs10791899	Intergenic	A>C	0.22	1.28 (0.99-1.66)	0.060
FBXL11	rs3927807	Intron	G>A	0.23	1.29 (1.00-1.67)	0.050
	rs1790740	Intergenic	T>C	0.23	1.28 (0.99-1.65)	0.056
	rs7480390	Intergenic	C>G	0.23	1.33 (1.03-1.71)	0.030
TBC1D10C	rs10896172	Intron	T>C	0.18	1.13 (0.85-1.5)	0.39
KIAA1394	rs1790733	Intron	T>C	0.25	1.34 (1.05-1.72)	0.020
RPS6KB2	rs1476792	Intron	T>C	0.29	1.44 (1.13-1.82)	0.0026
RPS6KB2	rs917570	Intron	C>G	0.18	1.16 (0.87-1.54)	0.32
RPS6KB2	rs55987642	Pro267Leu	C>T	0.07	1.08 (0.7-1.67)	0.74
RPS6KB2	rs4930427	Phe269	C>T	0.29	1.43 (1.12-1.81)	0.0033
RPS6KB2	rs1790753	Intron	G>A	0.29	1.46 (1.15-1.85)	0.0017
RPS6KB2	rs1790752	Intron	C>T	0.29	1.46 (1.15-1.85)	0.0017
RPS6KB2	rs13859	Ala420Val	C>T	0.29	1.44 (1.13-1.82)	0.0026
RPS6KB2	rs10274	3' UTR	G>A	0.25	1.36 (1.06-1.75)	0.014
PTPRCAP	rs869736	Promoter	G>T	0.29	1.45 (1.14-1.83)	0.0020
CORO1B	rs872375	Intron	G>A	0.29	1.42 (1.12-1.8)	0.0036
CORO1B	rs2302264	Intron	G>A	0.29	1.43 (1.13-1.81)	0.0028
CORO1B	rs1808279	Promoter	A>G	0.29	1.47 (1.16-1.86)	0.0013
GPR152	rs1790761	Promoter	A>G	0.29	1.44 (1.14-1.82)	0.0024
CABP4	rs17501521	Intron	C>T	0.11	1.22 (0.87-1.72)	0.25
AIP	rs4084113	Intron	G>A	0.18	1.24 (0.94-1.64)	0.12
PITPNM1	rs2276120	Intron	C>T	0.18	1.23 (0.93-1.62)	0.15

* OR(Odds ratio): 유의확률(산재성 위암의 감수성을 의미)

ex) 1.0: 다형성과 암 발생률에 차이가 없다.

2.0: 다형성 변이가 있는 경우 암 발생률이 2배이다.

0.5: 다형성 변이가 있는 경우 암 발생률이 0.5배이다.

* 95% CI(confidence interval): 95% 신뢰구간

< 실시예 3> 일배체형 ( haplotype ) 및 이배체형 ( diplotype ) 분석

상기 10개의 다형성 사이의 분배불균형(linkage disequilibrim)을 Haploview 4.1 프로그램(/www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)을 이용하여 분석한 결과, 산재성 위암과 유의한 관련성을 보인 10개의 다형성 사이에서 강한 연관관계가 나타났다(R² = 0.97).

이에 본 발명자들은 PHASE 2.1 프로그램(/www.stat.washington.edu/stephens /phase/download.html)을 사용하여 일배체형 및 이배체형을 재구성한 후, 위암감수성과의 관련성을 분석하였다.

구체적으로, 일배체형은 rs1476792, rs4930427, rs1790753, rs1790752, rs13859, rs869736, rs872375, rs2302264, rs1808279 및 rs1790761의 순으로 나타내었고, 즉, H1(T-C-G-C-C-G-G-G-A-A) 및 H2(C-T-A-T-T-T-A-A-G-G)로 명명하였다. 10개 다형성 사이의 강한 연관성 때문에 H1과 H2 단 두 개의 일배체형만이 1% 이상의 빈도로 관찰되었다. H1과 H2 일배체는 정상인의 전체 일배체의 70.3%와 28.3%를 차지하였으며, 산재성 위암 환자군의 일배체에서는 61.7%, 35.5%의 비율을 차지하는 것으로 분석되었다. 이배체형과 위암감수성의 관련성은 나이와 성별을 보정한 후 분석하였다.

그 결과, 표 3에서 나타난 바와 같이 H2가 H1보다 산재성 위암 감수성이 43% 높게 나타났다(OR = 1.43, 95% CI = 1.12-1.82, P = 0.0034). 또한, H1/H1 이배체형에 비해 H2/H2 이배체형 및 H1/H2 이배체형이 산재성 위암 감수성을 각각 150% 및 46% 높이는 것으로 분석되었다(OR = 2.50, 95% CI = 1.39-4.47, P = 0.0021; OR = 1.46, 95% CI = 1.04-2.07, P = 0.030). 즉, 일배체형과 이배체형의 위암관련성은 모두 통계적으로 유의하였다.

일배체 및 이배체 분석

구분	대조군	산재성위암군	OR (95% CI)	P
일배체	2n = 801	2n = 490
H1(TCGCCGGGAA)	571 (70.3%)	311 (61.7%)	1
H2(CTATTTAAGG)	230 (28.3%)	179 (35.5%)	1.43 (1.12-1.82)	0.0034
이배체	n = 399	n = 240
H1/H1	196 (49.1%)	92 (38.3%)	1
H1/H2	176 (44.1%)	118 (49.2%)	1.46 (1.04-2.07)	0.030
H2/H2	27 (6.8%)	30 (12.5%)	2.50 (1.39-4.47)	0.0021

< 실시예 4> PTPRCAP 다형성의 위암타입별 관련성

Lauren의 분류법에 따르면 위암은 장관성 위암(intestinal-type)과 산재성 위암(diffuse-type)으로 나뉘는데, 두 위암은 조직학적, 병리학적으로 매우 독특한 것으로 알려져 있다. rs1476792(+112T>C; 서열번호 82), rs4930427(+401C>T; 서열번호 83), rs1790753(+301G>A; 서열번호 84), rs1790752(+401C>T; 서열번호 85), rs13859(+401C>T; 서열번호 86), rs869736(+417G>T; 서열번호 87), rs872375(+101G>A; 서열번호 88), rs2302264(+301G>A; 서열번호 89), rs1808279(+220A>G; 서열번호 90), rs1790761(+218A>G; 서열번호 91) 다형성들은 서로 매우 강하게 연관되어 있었고 (R² = 0.97) H1과 H2 두 개의 일배체만이 관찰되었기 때문에 rs869736를 표지 단일염기다형성(tagSNP)으로 활용하면, rs869736 유전자형 분석만으로 기타 9개 다형성의 유전자형을 모두 파악할 수 있다.

이에 본 발명자들은 상기 단일염기다형성이 장관성 위암의 감수성과도 관련성이 있는지 확인하기 위하여 rs869736 다형성(G>T)의 유전자형을 분석하였다. 이때, 유전자형과 위암과의 관련성은 나이 및 성별로 보정한 값을 기재하였다. 통계적으로 유의한 결과는 밑줄로 표시하였다.

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 PTPRCAP의 프로모터 다형성인 rs869736은 산재성 위암의 감수성에 특이적인 관련성을 보였다. 즉, rs188703의 T 대립형질은 산재성 위암의 감수성을 유의하게 1.45배 증가시켰으나(OR = 1.45, 95% CI = 1.14-1.83, P = 0.0020), 장관성 위암의 감수성과는 유의한 관련성이 발견되지 않았다. 또한 나이와 성별을 보정한 로지스틱 회귀분석에서도 GT 유전자형과 TT 유전자형은 GG 유전자형과 비교했을 때, 산재성 위암감수성을 각각 1.45배, 2.47배 높이는 것으로 확인되었다.

장관성 위암 및 산재성 위암과 rs869736 다형성 사이의 관련성

	대조군	산재성 위암군			장관성 위암군
	2n=812	2n=504	OR (95% CI)	P	2n=356	OR (95% CI)	P
대립형질
G	577 (71.1%)	317 (62.9%)	1		236 (66.3%)	1
T	235 (28.9%)	187 (37.1%)	1.45 (1.14-1.83)	0.0020	120 (33.7%)	1.25 (0.96-1.63)	0.10
유전자형	n=406	n=252			n=178
GG	198 (48.8%)	96 (38.1%)	1		76 (42.7%)	1
GT	181 (44.6%)	125 (49.6%)	1.45 (1.04-2.03)	0.031	84 (47.2%)	1.03 (0.68-1.56)	0.87
TT	27 (6.7%)	31 (12.3%)	2.47 (1.39-4.40)	0.0021	18 (10.1%)	1.52 (0.72-3.20)	0.30

< 실시예 5> 프로모터 활성측정

상기 실시예 결과, PTPRCAP, CORO1B 및 GPR152 유전자의 프로모터에는 산재성 위암과의 유의한 관련성을 보인 다형성이 존재하는 것으로 나타났다. 이에, 단일염기다형성을 포함하는 프로모터 지역을 클로닝하여 위암세포주에 형질감염한 후, 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정함으로써, DNA 서열의 변화가 각 유전자의 프로모터 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로, PCR 반응은 10 ng 유전체 DNA, 1X 완충용액, 200 μM dNTP 혼합물, 1.25 유닛 Pfu DNA 중합효소(솔젠트, 한국) 혼합물에 400 μM의 PCR 프라이머 쌍(표 5)을 첨가한 50 ㎕ 용액에서 수행하였다. PCR 산물은 AccuPrep^®젤 정제 키트(바이오니아, 한국)를 이용하여 정제한 후, KpnI과 XhoI 제한효소로 절단하여 pGL3 basic 벡터(Promega, 미국)에 삽입하였다. 재조합 플라스미드는 염기서열 분석으로 확인하였다.

프로모터 클로닝에 사용된 PCR 프라이머 서열

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머	증폭크기
PTPRCAP	CAGCGGTACCGTCAGTTCCCACCCCCAC: 서열번호 68	GGGCCTCGAGCTCCAGCTCTGGCTGTGTC: 서열번호 69	610 bp
CORO1B	TTTAGGTACCGCATGGTGTCTCACGCCTG: 서열번호 70	GATCCTCGAGTCTGGGAAGCAGGAAGCAGG: 서열번호 71	800 bp
GPR152	GGCGGTACCGGTAAGCCAGGCCTCACTGGTC: 서열번호 72	GGCCTCGAGAGAGTCCTGCTGGACACGGAGTG: 서열번호 73	1772 bp

* KpnI과 XhoI 인지서열은 밑줄로 표시하였다.

또한, 1 × 10⁵ 개의 MKN28 세포(한국세포주은행)를 12-웰 조직배양접시에 12시간 동안 배양한 후, 대립형질별로 제조된 재조합 플라스미드 1 ㎍과 pRL-CMV 벡터(Promega, 미국) 50 ng을 Lipofectamine^TM LTX 시약(Invitrogen, 미국)과 혼합하여 MKN28 세포에 공동형질감염시켰고, 36시간 후에 Dual-luciferase^®리포터 검사 시스템(Promega, 미국)을 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 각 실험은 3번 반복하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 PTPRCAP의 경우 rs869736(-309G>T) 다형성의 T 대립형질이 G 대립형질에 비하여 1.55배 강한 프로모터 활성을 가지는 것으로 확인되었다(P = 0.00039, ANOVA).

반면, GPR152 프로모터가 삽입된 플라스미드에서는 루시퍼라아제 활성이 나타나지 않았고, CORO1B 프로모터는 루시퍼라아제를 강하게 발현하였으나, 대립형질 사이에 프로모터 활성의 차이는 없었다.

< 실시예 6> DNA -단백질 결합력 측정

PTPRCAP 프로모터 다형성인 rs869736 주변의 29 nt를 프로브로 사용하여 대립형질 사이에 DNA-단백질 결합력 차이를 조사하였다.

구체적으로, 표 6의 대립형질별로 합성된 상보적인 단일가닥의 DNA를 어닐링(anealing)하여 이중가닥의 DNA 프로브를 만들었고 5' 말단을 [g-³²P] dATP(PerkinElmer, 미국)로 표지하여 이중가닥 프로브를 만들었다. 8 ㎍의 MKN28 핵추출물(Schreiber E et al ., Nucleic Acids Res., 21:253-258, 1993)과 0.6 ㎍의 poly(dI-dC), 1X EMSA 반응용 완충용액(10 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 10 mM MgCl₂, 200mM dithiothreitol)을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시켰다. 혼합물에 80 fmole의 프로브를 넣고 20분간 더 반응시킨 후, 6% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였고 BAS-3000(Fujifilm LifeScience, 일본)으로 방사능이미지를 얻었다. 이때, 방사능으로 표지되지 않은 200배 과량의 DNA G 프로브 또는 T 프로브를 추가로 첨가함으로써 단백질 결합을 경쟁시켰다.

EMSA 프로브의 DNA 서열

대립형질	정방향	역방향
G	AACCTGGAGACAGAGGATGTCACAGGAGT: 서열번호 74	ACTCCTGTGACATCCTCTGTCTCCAGGTT: 서열번호 75
T	AACCTGGAGACAGATGATGTCACAGGAGT: 서열번호 76	ACTCCTGTGACATCATCTGTCTCCAGGTT: 서열번호 77

* rs869736 다형성의 위치는 밑줄로 표시하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 PTPRCAP 프로모터의 -309 위치에 존재하는 rs869736 다형성의 T 대립형질은 G 대립형질보다 월등히 강하게 MKN28 핵추출물과 결합하였다. 이때, 방사능으로 표지되지 않은 200배 과량의 DNA G 프로브와 경쟁하였을 때도 표지된 T 프로브는 단백질과의 결합력이 유지되었으나, 표지되지 않은 200배 과량의 T 프로브는 표지된 T 프로브와 단백질의 결합을 완벽히 억제하였다.

< 실시예 7> 생체내 ( in vivo ) 유전자 발현량의 측정

단일염기다형성 rs869736 대립형질에 따라 생체내 PTPRCAP mRNA 발현량의 변화를 실시간(realtime) PCR 기법으로 조사하였다.

구체적으로, 12개의 B 세포주(한양대 류마티스병원에서 수득)에서 DNA를 분리하여 rs869736 유전자형을 분석함으로써, GG, GT 및 TT의 세 그룹으로 분류하였다. 또한, 상기 분류된 세포주로부터 NucleoSpin^®(Macherey-Nagel GmbH & Co., 독일)을 사용하여 RNA를 분리하였고 Oligo(dT) 프라이머와 역전사 효소(Promega, Madison, WI)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PTPRCAP와 GAPDH의 mRNA 일부를 증폭하는 프라이머 쌍(표 6)을 준비하여 Bio-Rad iQ^TM SYBR^ㄾGreen Supermix(Bio-Rad. 미국)와 혼합한 후 iCycleriQ^TM 5 machine(Bio-Rad. 미국)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 95℃에서 1 분간 초기 변성화를 실행한 후, 95℃ 10초, 57℃ 20초, 72℃ 20초의 주기를 40회 반복하였다. GAPDH의 발현량을 기준하여 PTPRCAP의 상대적인 양을 측정하였다. 각 실험은 3번 반복하였다.

실시간 PCR 프라이머 서열

유전자	정방향	역방향	증폭크기
PTPRCAP	AGCTGGGGTCCACAGACAA: 서열번호 78	GACGCCTCTCCACATTGCT: 서열번호 79	127 bp
GAPDH	CAGCCTCAAGATCATCAGCA: 서열번호 80	TGTGGTCATGAGTCCTTCCA: 서열번호 81	106 bp

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 rs869736 다형성의 T 대립형질의 수가 늘어날수록 PTPRCAP 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다(P = 0.0060). GT와 TT 유전자형을 가질 경우, PTPRCAP 발현량은 GG 유전자형에 비하여 각각 35%와 18% 증가하였다.

결론적으로, 본 발명자들은 RPS6KB2 , PTPRCAP , CORO1B 및 GPR152 유전자의 rs1476792, rs4930427, rs1790753, rs1790752, rs13859, rs869736, rs872375, rs2302264, rs1808279 및 rs1790761 다형성, 일배체 및 이배체가 산재성 위암의 감수성과 유의하게 관련되어 있음을 확인하였다. 상기 다형성은 장관성 위암의 감수성과는 관련되어 있지 않았다. 특히 PTPRCAP 프로모터의 -309 위치에 존재하는 rs869736 다형성의 T 대립형질은 G 대립형질에 비하여 프로모터 활성 및 단백질과의 결합력이 더욱 강하게 나타났으며, 생체내 PTPRCAP 발현량과도 유의한 관련성이 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명의 다형성, 일배체 및 이배체는 산재성 위암의 감수성 예측에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 RPS6KB2, PTPRCAP, CORO1B 및 GPR152 유전자를 포함하는 26 kb 지역에 존재하는, 단일염기다형성의 위치 및 산재성 위암 감수성과의 관련성을 나타낸 도이다.

도 2는 PTPRCAP의 프로모터 다형성인 rs869736(-309G>T)가 프로모터 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

도 3은 rs869736 다형성의 대립형질별 DNA-단백질 결합력을 측정한 EMSA(eletrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 B 세포주의 생체내(in vivo) PTPRCAP 발현량을 측정한 실시간 PCR 결과이다.

<110> Korea Advanced Instititue of Science and Technology <120> Polymorphic markers predicting susceptibility to diffuse-type gastric cancer and the prediction method thereof using the same <130> 9P-02-35 <160> 91 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2282502 Forward PCR Primer <400> 1 acgttggatg tggtgacatc gaagcaaagc 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2282502 Reverse PCR Primer <400> 2 acgttggatg agggcaagat gactatgacc 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs2282502 Ext Primer <400> 3 cggcccctgt tctaccctga 20 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10791899 Forward PCR Primer <400> 4 acgttggatg agtgtccagt ggtctgtaac 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10791899 Reverse PCR Primer <400> 5 acgttggatg ggaaggctat ctgatcactc 30 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10791899 Ext Primer <400> 6 gagtcagtga cagggctgg 19 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3927807 Forward PCR Primer <400> 7 acgttggatg tccaacccat ttgtccactg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3927807 Reverse PCR Primer <400> 8 acgttggatg ttacctaggt gtcctcctag 30 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs3927807 Ext Primer <400> 9 tcctaggtca ggatcctgtt 20 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790740 Forward PCR Primer <400> 10 acgttggatg agctcccagg taatacatgg 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790740 Reverse PCR Primer <400> 11 acgttggatg tatatgagta gcctcgctcc 30 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790740 Ext Primer <400> 12 acttccaaac aagctctcaa g 21 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs7480390 Forward PCR Primer <400> 13 acgttggatg tgttcacaac accttccacc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs7480390 Reverse PCR Primer <400> 14 acgttggatg cggaaggact gtggaagttg 30 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs7480390 Ext Primer <400> 15 gttgtttttc tctttcaaaa gcc 23 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10896172 Forward PCR Primer <400> 16 acgttggatg tagcccaaac tcacactgtg 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10896172 Reverse PCR Primer <400> 17 acgttggatg aagatcctag gcagaactgc 30 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs10896172 Ext Primer <400> 18 tcttccctaa gccaggagc 19 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790733 Forward PCR Primer <400> 19 acgttggatg ctgccctttc tgtagaaggg 30 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790733 Reverse PCR Primer <400> 20 acgttggatg tttctgcctg tgctgctgga g 31 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790733 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tgcccctgat gatcttatcc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4930427 Forward PCR Primer & rs55987642 Reverse PCR Primer <400> 29 acgttggatg acaaggctcc tctcaccttc 30 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs55987642 Ext Primer <400> 30 cttcctcctc ctccagc 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4930427 Ext Primer <400> 31 ttccggttct ctgcggt 17 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790753 Forward PCR Primer <400> 32 acgttggatg tcattcccag aggcaaactg 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790753 Reverse PCR Primer <400> 33 acgttggatg attctgcacg tgttcctgag 30 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790753 Ext Primer <400> 34 caaactgcac aggccggg 18 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790752 Forward PCR Primer <400> 35 acgttggatg ttgatgctgt ccaggacaga 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA 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ccctcaccgc cccccccacc 240 caccgccagc tctcctggca tcctccactt ccagtcctca ccccaggacc tccgcaggcc 300 racccctaag gtggctagac ccccacacgg gctgcctcgt gacagttctc atggcccgcc 360 gggcctccct ggcgcaaggt ttcctgctcc caagcagcct ccaatgacct gacctctcac 420 cttagatgcc cctatccccg agtggcctcg gtagccctct taccgggcga tctcgcactt 480 gctgacctcc aggccccgct tgggcatgct gcccatacc 519 <210> 90 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1808279 <220> <221> allele <222> (220) <223> [A/G] <220> <221> primer_bind <222> (138)..(156) <223> forward primer binding <220> <221> primer_bind <222> (235)..(255) <223> reverse primer binding <400> 90 aaaaaaaaaa ccaccccaac acctgctgtt gttttcttta cattgttaac caagagcatg 60 aaatttaggc cgggcatggt gtctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc 120 gggcggatca cgaggtcggg aaatcgagac catcctggct aacatggtga aaccccgtct 180 ctactaaaca tacaaaaaat tagccgggcg tggtagtatr agcctgtagt cccagctact 240 ggggtgaatt tcttgaacct gggagggcgg aggttgcagt gggccgagat cgcgccactg 300 cactccagcc tgggtgacaa aaactccgtc tcaaaaaaaa aaaaa 345 <210> 91 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1790761 <220> <221> allele <222> (218) <223> [A/G] <220> <221> primer_bind <222> (155)..(174) <223> forward primer binding <220> <221> primer_bind <222> (234)..(253) <223> reverse primer binding <400> 91 tgccgggtgc cacaaagcag gccccagtga gggccggggg gacagctgga gtgctgggca 60 ggcaggcacg ccctgctcct gctccttcca cccatcggcc tctgcctccc aggtaagcca 120 ggcctcactg gtcagggccc cagtctcggg gtgcctgggg ctctgatcca atagggaatg 180 gagacagcag agggggtcag cctgaggagg aaccctgrgg gtacggaggg caccaaacta 240 aaggccaagt ggctggagcc gtgggccgtg ggcaggggcc agcccttcag ggcatccgtt 300 ccctccccag actataccac cacctgggct ctcatcgccc tcaaa 345

Claims

10) rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 +218번째 염기를 포함하는 20 ~ 100개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 폴리뉴클레오티드;

상기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의, 산재성 위암 관련성 다형성 부위를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 산재성 위암 감수성 예측용 키트.

제 1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 15 내지 50개의 염기를 포함하도록 상기 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 15 내지 50머 길이인 것을 특징으로 하는 키트.

제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 15 내지 50머 길이인 것을 특징으로 하는 키트.

제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은

프라이머 쌍 10: 서열번호 56으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 57로 기재되는 역방향 프라이머;

상기 프라이머 쌍 1 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.

제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 상기 다형성 부위를 포함하는 연속적인 15 내지 50개의 염기로 구성되며, 상기 다형성 부위의 염기를 3'말단으로 갖는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 갖는 것을 특징으로 하는 키트.

10) rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기를 포함하는 5 ~ 25개의 연속적인 핵산분자 또는 이에 상보적인 핵산분자로 구성된 산재성 위암 관련성 올리고뉴클레오티드;

상기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 집적된 산재성 위암 감수성 예측용 마이크로어레이.

인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 C이고; ② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ③ rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 T이고; ⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 T이고; ⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 A이고; ⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 A이고; ⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 G이고; 및, ⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 G인 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커.

인간 게놈 11q13 지역에 존재하는 단일염기다형성 마커인 ① rs1476792(서열번호 82)의 다형성 부위인 +112번째 염기가 T이고; ② rs4930427(서열번호 83)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ③ rs1790753(서열번호 84)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G이고; ④ rs1790752(서열번호 85)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ⑤ rs13859(서열번호 86)의 다형성 부위인 +401번째 염기가 C이고; ⑥ rs869736(서열번호 87)의 다형성 부위인 +417번째 염기가 G이고; ⑦ rs872375(서열번호 88)의 다형성 부위인 +101번째 염기가 G이고; ⑧ rs2302264(서열번호 89)의 다형성 부위인 +301번째 염기가 G이고; ⑨ rs1808279(서열번호 90)의 다형성 부위인 +220번째 염기가 A이고; 및, ⑩ rs1790761(서열번호 91)의 다형성 부위인 +218번째 염기가 A인 산재성 위암 감수성 예측용 일배체형 마커.

산재성 위암 발명이 개체(실험군) 및 대조군의 혈액 시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

3) 단계 2)의 검출 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 산재성 위암을 예측하기 위해 제 1항의 산재성 위암 관련성 단일염기다형성 마커를 검출하는 방법:

제 9항에 있어서, 단계 1)의 검출방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(micoarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, 제한효소절편길이분석(restriction fragment length polymorphisms, RFLP), 질량분석법 (MALDI-TOF mass spectrometry) 및 TaqMan 기법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.