KR20190095160A

KR20190095160A - 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법

Info

Publication number: KR20190095160A
Application number: KR1020190013912A
Authority: KR
Inventors: 예성혁
Original assignee: 주식회사 진씨커
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2019-08-14
Also published as: EP3653730B1; JP2020534863A; ES2962531T3; CN111065747B; US20200283841A1; US11613776B2; EP3653730A1; KR102086689B1; EP3653730A4; EP3653730C0; CN111065747A; JP7006873B2

Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas 시스템 및 엑소뉴클라아제를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트 및 돌연변이 세포 유리 유전자 분석방법에 대한 것이다.

Description

돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법{Kit for isolation of mutant cell free DNA and method for isolation of mutant cell free DNA using the same}

본 발명은 돌연변이 세포 유리 유전자(mutant cell free DNA) 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법에 대한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 CRISPR/Cas 시스템 및 엑소뉴클레아제를 포함하는 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 분리 방법에 관한 것으로, 미량의 세포 유리 유전자 시료 내에서 돌연변이 유전자를 검출하기 위한 것이다.

최근 전 세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있으며, 따라서 암 조기 진단 방법에 대한 연구 비중이 증가하고 있는 추세이다. 그러나, 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사 등의 침습적인 방법이 주를 이루고 있다. 기존 방법은 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이뤄지기 때문에, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않고, 흉터가 남으며, 회복에도 시간이 걸린다.

이러한 기존의 침습적인 진단 및 검사 방법의 대안으로 액체 생체 검사(Liquid Biopsy)를 이용한 분자진단법이 주목을 받고 있다. 액체 생체 검사는 비침습적인(non-invasive) 방법을 사용하기 때문에, 검사 결과 도출 속도가 빠르며, 질병의 일부분만 분석할 수 있었던 조직 샘플과 달리, 체액 즉 액체 생체 샘플은 질병에 대해 다각적 분석을 수행할 수 있다. 특히, 액체 생체 검사는 암의 진단에 탁월한 효용성을 발휘할 것으로 전망되며, 혈액, 소변 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액 내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능할 것으로 예측된다.

최근에 액체-생체검사와 관련하여 종양으로부터 혈류로 방출되어, 체내 혈액 내 존재하는 세포 유리 DNA(cell-free DNA, cf DNA)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 혈액, 혈장 또는 소변 등의 다양한 생물학적 시료에서 유래된 cfDNA를 분리하고 검출하는 기술이 발전함에 따라, 액체 생체 검사가 암 위험군 환자의 모니터링에 있어서 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 도구가 될 것이다. 진행성 췌장암, 난소 암, 대장 암, 방광암, 위 식도암, 유방암, 흑색종, 간세포 암, 두경부 암을 가진 환자의 75%이상 그리고 신장, 전립선 암 또는 갑상선 암 환자의 50% 이상에서 cf DNA상의 암 유래 유전자가 확인되었다. 전이성 대장암 환자를 대상으로 한 유전자 임상진단에서 KRAS 유전자 변이 검출에 대한 cf DNA의 민감도는 87.2%였고 특이도는 99.2%였다.

이와 같은 연구들은 cf DNA 분석을 통한 암 진단의 가능성을 보여줌으로써, cf DNA 내 암 유래 유전자는 차세대 바이오 마커로 각광받고 있다. 암 환자 유래의 cf DNA로부터 종양 특이적인 유전자 돌연변이를 확인함으로, 초기 단계 종양의 진단을 시도하고 있다. 그러나, 혈액, 소변 등 액체 시료 내 cfDNA를 분석하고 유전자에서 발생하는 변이를 발견하여 암을 조기 진단하는 방법에는 현재의 기술로는 많은 한계가 있다(특허문헌 1). 특히, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 또는 체액의 시료 내에 cfDNA가 매우 적은 농도로 존재하며, cfDNA는 노화 과정에서 자연스러운 유전자 변이가 발생할 수 있는데, 환자 혈장 내에 존재하는 cf DNA의 대부분은 정상 체세포 유래의 야생형(wild type, wt)의 유전자이므로, 현재의 시퀀싱 기술로는 cf DNA에서 암세포 유래 유전자의 유무를 정확하게 진단하는 것은 불가능에 가깝다. 그러므로 초기단계의 암을 미량의 cf DNA로 진단하기 위해서는, 정상 유전자를 제거하고 암세포 유래 유전자를 특이적으로 증폭시킬 필요가 있다. 이에, 검출 민감도의 향상 및 정확한 암 조기 진단을 위한 방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

한편, 최근에 개발된 유전자가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas 단백질에 기반된 유전체 교정(genome editing)은 표적 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 표적함으로써 확장성을 입증하였다. CRISPR-Cas 시스템은 표적하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 guide RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다. CRISPR 시스템은 원핵 생물, 고세균의 면역 시스템으로서 최근 유전자 가위의 하나로 그 활용성에 대한 연구가 급증하고 있으나(비특허문헌 1, 비특허문헌 2), 이를 게놈 시퀀싱에 있어서 사용되는 염기서열 포획 방법 및 질병 진단에 활용하고자 하는 시도는 없었다.

이에, 본 발명자들은 cfDNA 상에서 돌연변이 유전자를 분리하는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, CRISPR/Cas system으로 미량의 cfDNA의 정상 유전자를 특이적으로 절단시키는 기술과 절단되지 않은 돌연변이 유전자를 특이적으로 증폭시키는 기술을 이용하여 본 발명을 완성하였다.

1. 한국 공개 특허 10-2016-0129523

1. Jinek et al. Science, 2012, 337, 816-821 2. Zalatan et al. Cell, 2015, 160, 339-350 3. Tian J, Ma K, Saaem I., Mol Biosyst, 2009, 5(7), 714-722 4. Michael, L.. Metzker, Nature Reviews Genetics, 2010, 11, 31-46

본 발명의 목적은 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 돌연변이 유전자형 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 다음을 포함하는 돌연변이 세포 유래 유전자 분리용 키트를 제공한다:

5' 말단이 보호된 프라이머를 포함하는, 야생형 세포 유리 유전자(wt cell free DNA) 및 돌연변이 세포 유리 유전자(mutant cell free DNA) 증폭용 조성물;

상기 야생형 세포 유리 유전자 특이적 가이드 RNA;

상기 야생형 세포 유리 유전자를 절단하기 위한 Cas 단백질; 및

상기 야생형 세포 유리 유전자를 제거하기 위한 엑소뉴클라아제.

상기 돌연변이 세포 유리 유전자는 암 특이적인 돌연변이를 포함하는 DNA일 수 있다.

본 발명에서 용어, “세포 유리 유전자(cell-free DNA; cfDNA)”는 종양 세포에서 기인하여 암 환자로부터 유래된 혈액, 혈장 또는 소변 등의 생물학적 시료에서 발견될 수 있는 암 세포 유래 유전자를 의미하며, 괴사, 세포 사멸 또는 비뇨기관의 정상세포 및/또는 암세포에서 활성화되어, 다양한 세포 생리학적 과정을 통해 소변, 혈액 등으로 방출된다. 소변, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid; CSF), 혈장, 혈액, 또는 체액은 쉽게 얻을 수 있는 시료이므로, 반복적인 샘플링을 통해 대량의 단순하고 비-침습적인 검체의 수집이 가능하다.

본 발명에서 용어, “CRISPR/Cas 시스템”은 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 가이드 RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.

Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas 단백질 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “가이드 RNA”는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, 세포 내로 전달된 선형 이중가닥 DNA의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자 서열을 인식하고 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA이다. 상기 “표적 유전자서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이 때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단 백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.

본 발명에서 용어, “PAM 서열(sequence)”은 목표 서열 옆에 위치하는 3bp~6bp 정도 크기의 서열로서 CRISPR-Cas 복합체가 인식하는 타겟 서열을 의미하며, CRISPR-Cas 복합체는 PAM 서열을 인식한 후 특정 위치를 절단하게 된다.

상기 키트는 암 의심 개체로부터 분리된 액체 시료(혈액, 혈장 또는 소변 시료 등)에 포함된 야생형 세포 유리 유전자 및 돌연변이 세포 유리 유전자로부터 돌연변이 세포 유리 유전자를 분리하기 위한 것일 수 있다.

상기 Cas단백질은, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 또는 Francisella 1(Cpf1)일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA) 또는 sgRNA (single-chain RNA)일 수 있다.

상기 가이드 RNA는, 복수개의 야생형 세포 유리 유전자 특이적인 2 종류 이상의 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 키트는 멀티플렉싱이 가능한 키트이다.

상기 가이드 RNA 제작 방법은 이 기술분야에 널리 알려져 있다.

상기 5' 말단이 보호된 프라이머는 상기 프라이머의 5' 말단이 포스포티오에이트 결합(phosphothioate bond)으로 보호된 것일 수 있다.

상기 유전자 증폭용 조성물은 PCR 조성물일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "증폭 반응"은 타겟 핵산 서열을 증폭하는 반응을 의미하며, PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)에 의하여 실시될 수 있다. 상기 PCR은 역전사(reverse transcription) 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스(multiplex) PCR, 실시간(real-time) PCR, 어셈블리(Assembly) PCR, 퓨전(Fusion) PCR, 리가아제 연쇄 반응(Ligase chain reaction; LCR)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드 중 하나로, 리보뉴클레오티드도 포함할 수 있으며 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드 일 수 있다. 상기 프라이머는 주형(template)의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중가닥 구조를 형성한다. 본 발명에서 프라이머는 NGS 시퀀싱 아답터 서열에 혼성화(hybridization) 또는 어닐링(annealing)될 수 있다. 어닐링(annealing)은 주형 핵산에 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소(polymerase)가 뉴클레오티드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 혼성화(hybridization)는 2개의 단일가닥 핵산이 상보적인 염기서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 상기 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.

상기 PCR 조성물은 야생형 세포 유리 유전자 및 돌연변이 세포 유리 유전자 각각에 특이적인 5‘ 말단이 보호된 프라이머 이외에, 이 기술분야에 널리 알려진 성분을 포함할 수 있다. 구체적으로, PCR 버퍼(PCR buffer), dNTP, DNA 폴리머라아제(DNA Polymerase) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, “엑소뉴클레아제(exonuclease)”는 DNA 시퀀스에서 폴리뉴클레오티드 체인의 3´-말단 또는 5´-말단으로부터 뉴클레오티드를 순차적으로 분해하는 효소이다. 3´- 5´ 엑소뉴클레아제는 3´-말단에서 포스포디에스테르(phospho- diester) 결합을 분해하는 효소이고, 5´- 3´ 엑소뉴클레아제는 5´-말단에서 포스포디에스테르(phospho- diester) 결합을 분해하는 효소이다.

상기 엑소뉴클라아제는 이 기술분야에 알려진 엑소뉴클라아제라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로 엑소뉴클레아제는 3’→5’ 엑소뉴클레아제 및/또는 5’→3’ 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 엑소뉴클라아제 III, 엑소뉴클라아제 I, T5 엑소뉴클라아제, T7 엑소뉴클라아제, 엑소뉴클라아제 T, 엑소뉴클라아제 V, Lambda 엑소뉴클라아제, 및 엑소뉴클라아제 VII 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 엑소뉴클라아제 T7 및 엑소뉴클라아제 T(단일가닥 특이적 뉴클라아제)를 일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

5‘ 말단이 보호되고 있는 프라이머를 포함하는 유전자 증폭용 조성물로 야생형 세포 유리 유전자 및 돌연변이 세포 유리 유전자가 포함된 시료를 반응시키면, 야생형 세포 유리 유전자 및 돌연변이 세포 유리 유전자 말단이 포스포티오에이트로 보호된다. 이 보호되고 있는 DNA들은 엑소뉴클라아제를 처리하더라도 포스포티오에이트 결합 때문에 분해가 되지 않는다.

야생형 세포 유리 유전자 특이적 가이드 RNA 및 Cas 단백질에 의해 야생형 세포 유리 DNA지에 의해 의해서 해당 DNA가 절단되면, 보호되지 않은 핵산 말단이 엑소뉴클라아제에 노출되고, 이로 인해 야생형 세포 유리 유전자 DNA는 분해되어 제거되고, 돌연변이 세포 유리 유전자만 분리된다(도 1).

본 발명의 일 실시예에서는 KRAS 유전자를 목표로 하는 가이드RNA를 사용하였을 때, 5’-NGG-3’ PAM 시퀀스를 만족하는 wt KRAS만 선택적으로 Cas9에 의해서 잘려졌다. 이때 T7 Exonuclease 과 Exonuclease T를 처리함으로써 Cas9에 의해 잘려진 wt KRAS DNA가 완전히 제거되는 것을 전기영동을 통해서 확인 할 수 있었다.

다른 측면에서 본 발명은, 다음 단계를 포함하는 돌연변이 유전자형 분석 방법을 제공한다:

i) 적어도 하나의 야생형 세포-유리 유전자(wt cell free DNA) 및 적어도 하나의 돌연변이 세포 유리 유전자(mutant cell free DNA)가 포함된 분리된 시료 내의, 상기 야생형 세포 유리 유전자와 돌연변이 세포 유리 유전자를 5' 말단이 보호된 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;

ii) 상기 야생형 세포 유리 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 처리하여 상기 증폭된 야생형 세포 유리 유전자만을 절단하는 단계;

iii) 상기 돌연변이 세포 유리 유전자와, 상기 절단된 세포 유리 유전자가 존재하는 시료에 엑소뉴클라아제를 처리하여 상기 절단된 야생형 세포 유리 유전자만을 제거하는 단계;

iv) 상기 시료 내에 남아있는 돌연변이 세포 유리 유전자를 증폭하는 단계; 및

v) 상기 증폭된 돌연변이 세포 유리 유전자를 분석하는 단계.

상기 i) 적어도 하나의 야생형 세포-유리 유전자 및 적어도 하나의 돌연변이 세포 유리 유전자가 포함된 분리된 시료는, 암 의심 개체로부터 분리된 액체 시료(혈액, 혈장 또는 소변 시료)일 수 있다.

상기 돌연변이 세포 유리 유전자 분석은, 암의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에 있어서 상기 진단은 암의 발병 여부를 확인하는 것 및/또는 암의 예후를 확인하는 것을 포함할 수 있다.

상기 암은 초기 암일 수 있다.

상기 암은 예컨대 편평세포 암(squamous cell cancer, 예를 들어, 상피의 편평세포 암), 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 5'말단이 보호된 프라이머는 상기 프라이머의 5' 말단이 포스포티오에이트 결합으로 보호된 것일 수 있다.

상기 가이드 RNA 는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA) 또는 sgRNA (single-chain RNA)일 수 있다.

상기 증폭은 PCR로 수행될 수 있으며, PCR 조건은 이 기술분야에 널리 알려진 방법을 기초로 설정할 수 있다.

본 발명의 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트 및 돌연변이 세포 유리 유전자 분리방법은 CRISPR/Cas 시스템 및 엑소뉴클라에제를 이용한 것으로, 혈액 내의 cfDNA에서 대부분을 차지하는 정상체세포 유래 유전자(>99.9%)를 선택적으로 제거할 수 있다. 그 결과 cfDNA 상에서 돌연변이 세포 유리 유전자(암 세포 유래 유전자)만을 분석할 수 있어, 초기 암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트 및 돌연변이 세포 유리 유전자 분리방법은, 시료 내 정상세포 유래의 유전자를 제거하여 cfDNA에 존재하는 돌연변이 세포 유리 유전자(암 세포 유래 유전자) 비율에 상응하는 극미량의 유전자를 분석할 수 있는 효과를 제공한다.

더욱이 본 발명은 복수 개의 정상 유래 유전자 특이적인 가이드RNA를 이용할 수 있으므로 다중화 시스템(multiplexing system)에 의해 동시에 2가지 이상의 발암 유전자에 대한 동시 검출이 가능하다.

도 1은 본 발명에서 시료 내 wtDNA(wild type cell free DNA)를 선택적으로 제거함으로 mtDNA(mutant cell free DNA)만을 증폭시키는 과정의 모식도에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템을 이용하여 시료 내 wtDNA만을 선택적으로 절단한 결과에 관한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 CRISPR-Cas 시스템에 의해서 절단된 DNA가 선택적으로 엑소뉴클라아제에 의해 분해되는 결과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 Cas 단백질 및 엑소뉴클라아제를 처리하여 KRAS wtDNA를 제거한 샘플을 차세대 염기서열분석을 통해 분석한 결과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 Cas 단백질 및 엑소뉴클라아제를 처리하여 KRAS wtDNA를 제거한 샘플을 생거 시퀀싱을 통해 분석한 결과에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 Cas 단백질 및 엑소뉴클라아제를 처리하여 여러 목표 유전자를 멀티플렉싱 방법으로 제거함으로써, 여러 암 유래 유전자를 한번에 증폭시키는 과정을 나타내는 구체적인 모식도에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 Cas 단백질 및 엑소뉴클라아제를 처리하고 멀티플렉싱 시스템을 이용하여 목포 유전자(wt DNA)만 선택적으로 제거할 수 있음을 아가로스 겔 전기영동을 통해 입증한 결과에 관한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 Cas 단백질 및 엑소뉴클라아제를 처리하고 멀티플렉싱 시스템을 이용하여 KRAS wtDNA와 EGFR wtDNA를 제거한 샘플을 차세대염기서열 분석을 통해 분석한 결과에 관한 것이다.
도 9는 본 발명에서 Cas9 오르토로그(othologue)를 활용한 멀티플렉싱 시스템이 접목된 유전자 제거방법을 나타내는 모식도에 관한 것이다.

목표유전자를 선택적으로 절단시킬 수 있는 CRISPR/Cas시스템은 매우 높은 정확도를 가진 엔도뉴클레아제(endonuclease)로서, Cas9 오르토로그(othologue)들은 각기 다른 PAM 영역 서열을 가지고 있다. PAM 시퀀스는 Cas9 단백질이 목표유전자를 인식할 때 필수적인 유전자 시퀀스로, 목표유전자와 완벽하게 상보적인 가이드 RNA(guide RNA)와 결합하고 있더라도 PAM 서열이 만족되지 않으면, CRISPR Cas 시스템은 작동하지 않는다. 또한 가이드 RNA가 표적 유전자와 비상보적인 유전자 서열이 많으면, CRISPR/Cas는 표적 유전자를 정상적으로 인식하지 못하게 된다. 뉴클레오타이드 치환(nucleotide substitution)에 위해 발생한 암 유전자를 확인하기 위해서, 야생형 유전자에 상보적인 가이드 RNA를 디자인하였다. 가이드 RNA의 목표를 선정할 때 크게 두 가지 기준으로 디자인하였다. 치환이 일어나기 전의 염기서열이 PAM 사이트에 해당할 경우, PAM 사이트를 기준으로 가이드 RNA를 설계하였고, PAM 사이트에 해당하지 않는 경우에는 시드 영역(seed region)에 미스매치(mismatch)를 추가하여 가이드 RNA를 설계하였다. Cas9의 시드 영역은 표적 유전자를 인식할 때 가이드 RNA와 표적 유전자 간의 미스매치에 민감하게 반응하는 위치로, 시드 영역에 1~2nt 미스매치가 있는 경우에는 목표유전자를 명확하게 인지하지 못하게 된다.

본 발명에서 사용되는 가이드 RNA는 야생형의 유전자를 선택적으로 인식할 수 있게 설계되어 있다.

본 발명에서, Cas9으로 표적유전자를 절단한 후 PCR 증폭을 하면, Cas9에 의해서 잘려진 야생형 세포 유리 DNA는 돌연변이 세포 유리 DNA보다 증폭된 양이 적었다. 그러나 Cas9으로 야생형 DNA를 자르고 돌연변이 DNA에 대한 PCR을 하는 단순한 방식으로는 극미량의 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 검출한계에 도달하지 못하였다. 이는 Cas9에 의해서 절단되는 야생형 DNA 조각이 PCR되는 과정에서 프라이머 역할을 할 수 있기 때문에, 최종적으로 증폭된 PCR 산물에 야생형 유래의 유전자 서열이 포함될 수 있다. Cas9의 정확도를 빌려 야생형 유전자를 선택적으로 절단시키더라도, 잘려진 DNA 조각들이 배경 신호를 상승시켜, 극미량 존재하는 암 유래 유전자를 검출할 수 있는 검출 한계에 도달할 수 없게 하였다(도 1의 하단 왼쪽 박스 그림 참고).

하지만, 본 발명에서는 PCR과정에서 배경 신호를 생성하는, 야생형 DNA의 잘려진 조각들을 제거함으로써, 미량의 표적 유전자에 대해서도 충분한 검출능을 가지게 하였다. 미량의 cf DNA 유전자 분석의 최종 과정에서 분석 대상 유전자를 PCR을 통해 증폭할 때 5‘ 말단이 포스포티오에이트 결합( phosphothioate bond)으로 보호된 프라이머를 사용해서 증폭을 하거나, 이미 증폭된 PCR 앰플리콘의 양 말단에 포스포티오에이트 결합을 포함하고 있는 어댑터(adatpor)를 라이게이션(ligation)시켜준다. 뉴클레오티드를 연결하는 포스포다이에스테르 결합(phophodiester bond)을 포스포티오에이트 결합으로 교체하면, 뉴클라아제는 해당 결합이 존재하는 뉴클레오타이드 사이를 절단할 수 없게 된다.

표적유전자가 양 말단이 포스포티오에이트 결합으로 보호되고 있을 때, 엑소뉴클라아제를 저리하게 되면 해당 표적유전자는 엑소뉴클라아제에 의해 분해되지 않는다. 하지만 Cas9에 의해서 목표유전자가 절단되면, 포스포티오에이트로 보호되지 않은 새로운 DNA 말단들이 엑소뉴클라아제에 노출되어, Cas9에 의해 잘려진 DNA는 엑소뉴클라아제에 의해 제거된다.

따라서, 본 발명의 기반이 되는 유전자 절단과 제거 기술은 상호보완적인 역할을 하여, 기존에는 불가능했던 미량의 cf DNA 내 암 유래 유전자의 명확한 검출이 가능하였다.

본 발명의 일 양태에서는, 분리 정제된 SpCas9 단백질과 가이드 RNA 복합체는 5’-NGG-3’의 PAM 시퀀스를 만족한 유전자 목표 지점만을 정확하게 절단을 일으키는 것을 확인하였다.

본 발명에서, KRAS 유전자의 변이는 암 유전자의 주요변이 중 하나로, cfDNA상에서 중요한 바이오 마커이다. 특히 KRAS의 변이는 cDNA 상의 35번째 핵산이 G가 T로 치환되어 단백질 상에서 12번째 아미노산이 아스파르트산( asparatate)에서 발린(valine)으로 교체되는 변이가 주로 발생한다. 이렇게 35번째의 구아노신(guanosine)이 티민(thymidine)으로 치환된 mtDNA는 타겟 유전자 상에서 Cas9의 PAM에 해당하는 염기서열이 NGT로 바뀌게 된다. PAM 시퀀스로 NGG를 특이적으로 인식하는 SpCas9은 wt KRAS와 mt KRAS(35G>T) 중 wt KRAS만을 특이적으로 인식하여 DNA를 절단하였다(도 2).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: SpCas9의 분리 및 정제

N 말단에 His x 6 표지(tag)을 포함하고 있는 재조합 화농성 연쇄상구균 Cas9(streptococcus pyogenes Cas9, spCas9)의 단백질 발현을 위해 spCas9 유전정보 ((His x 6를 포함한 단백질의 전체 서열, 서열번호 1)를 가지고 있는 플라스미드(plasmid)를 감응세포(Competent cell)인 BL21-DE3 종에 형질전환을 실시하였다. 상기 형질전환된 BL21-DE3가 증식하고 있는 액체배지에 IPTG(Isopropyl b-D-ThioGalactoside)를 처리한 후 18℃에서 16시간 동안 배양하였다. 세포들을 5000xg에서 15분 동안 원심분리 한 후 NaH₂PO₄ 50mM (pH 8), NaCl 400mM, imidazole 10mM, PMSF 1mM, DTT 1mM, Triton X-100 1%, 라이소자임(lysozyme) 1mg/ml를 포함한 용해 완충액(lysis buffer)으로 세포를 융해시켰다. 초음파분쇄기를 이용하여 세포를 분쇄한 후, 15000xg 30분 동안 원심 분리하여 상등액과 세포찌꺼기를 분리하였다. 상등액에 니켈-나이트릴로트라이아세트산 레진(Ni-NTA resin, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 첨가하여 4℃에서 1시간동안 반응시킨 후, NaH₂PO₄ 50mM (pH 8), NaCl 400mM, imidazole 20mM의 세척 완충액(wash buffer)으로 Ni-NTA 레진을 2번 반복하여 세척하였다. 마지막으로 해당 레진에 NaH₂PO₄ 50mM (pH 8), NaCl 400mM, imidazole 250mM의 용출 완충액(elution buffer)을 첨가해줌으로써, spCas9을 Ni-NTA 레진으로부터 분리하였다. spCas9이 포함된 완충액을 amicon ultra centrifugal filter를 이용하여 HEPES 20mM (pH 7.5), NaCl 400mM, DTT 1mM, glycerol 40%를 포함하는 완충액으로 교체하였다.

실시예 2. 인-비트로 전사에 의한 가이드 RNA의 합성

T7 프로모터 및 가이드 RNA 정보가 포함되어 있는 DNA 주형과 T7 RNA 중합효소를 40mM Tris-HCl(pH 7.9), 6mM MgCl₂, 10mM DTT, 10mM NaCl, 2mM spermidine, NTP 그리고 Rnase 저해제가 포함된 완충액에서 37℃에서 18시간 동안 반응시킴으로, in vitro에서 가이드 RNA를 합성하였다(서열번호 2 및 3). 합성된 가이드 RNA는 RNA 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

실시예 3. 인 비트로 절단(In vitro Cleavage)

상기 실시예 1에 따라 분리정제된 500ng SpCas9(이하 Cas9으로 표시)과 상기 실시예 2에 따라 제조된 100ng 가이드 RNA를 37℃에서 5분 동안 결합시키고, Potassum acetate 50mM (pH 7.9), Tris-acetate 20mM, Magnesium acetate 10mM, DTT 1mM로 구성된 완충액에서 150ng 이중가닥 DNA (dsDNA)인 야생형 KRAS 유전자(서열번호 4) 및 돌연변이 KRAS 유전자(KRAS G12V, 서열번호 6)와 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. KRAS 유전자 및 아미노산 서열 정보는 다음 표 1과 같다.

[표 1]

Cas9에 의해 절단된 DNA 조각은 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동을 한 후, EtBr로 염색하여 확인하였다. 실험 결과, 분리 정제된 Cas9 단백질과 가이드 RNA 복합체는 5’-NGG-3’의 PAM 시퀀스를 만족한 유전자 목표 지점만을 정확하게 절단을 일으키는 것을 확인하였다(도 2 참조).

암 유전자의 주요 변이 중 하나인 KRAS 유전자의 변이는 cfDNA상에서 검출할 수 있는 중요한 바이오 마커이다. 특히 KRAS의 변이는 cDNA 상의 35번째 핵산이 G가 T로 치환되어 KRAS 단백질 내 12번째 아미노산이 글라이신(glycine, G)에서 발린(valine, V)으로 교체되는 변이가 중요하다(서열번호 5 및 서열번호 7). 이렇게 35번째의 구아노신(guanosine)이 티미딘(thymidine)으로 치환된 mtDNA는 타겟 유전자 상에서 Cas9의 PAM에 해당하는 염기서열이 NGT로 바뀌게 된다. PAM 시퀀스로서 NGG를 특이적으로 인식하는 Cas9은 wt KRAS와 mt KRAS(35G>T) 중 wt KRAS만을 특이적으로 인식하여 DNA를 절단한다(서열번호 8).

가이드 RNA는 야생형 KRAS 유전자(서열번호 4)를 포함한 2787nt의 DNA상에서 1572nt 위치에 상응하는 목표시퀀스를 가지고 있다. 가이드 RNA와 결합한 Cas9은 2787nt의 DNA상에서 KRAS 유전자를 절단시켜, 1572nt의 긴 절편과, 1215nt의 짧은 절편을 만드는 것을 전기영동 결과에서 확인하였다(도 2b 상단 및 도 3b 상단 참조). 하지만 해당 가이드 RNA를 사용하더라도 PAM 시퀀스가 5‘-NGT-3’로 바뀐 mtKRAS유전자는 Cas9에 의해 절단이 되지 않는 것을 확인하였다(도 2b 하단 및 도 3b 하단 참조).

실시예 4. 야생형 세포 유리 DNA만의 선택적 제거

야생형 세포 유리 유전자가 선택적으로 절단되고, 이러한 선택적 절단이 엑소뉴클레아제에 의해 선택적으로 진행되는 것을 확인하기 위한 실험을 실시하였다.

포스포티오에이트 결합을 사용하여 5’ 말단이 보호된 프라이머(표 2)와 phusion 폴리머라아제를 사용하여, 표적 유전자(암 환자 혈액에서 분리한 야생형 세포 유리 DNA 및 암 특이적인 세포 유래 DNA)를 PCR 증폭시킨다. PCR 정제 키트(Quiagen Cat ID: 28104)를 사용하여 야생형 DNA(wtDNA)와 돌연변이 DNA(mtDNA)를 분리정제한 후, wtDNA와 mtDNA를 90:10 (wtDNA ratio 90%; mtDNA ratio 10%), 99:1 (wtDNA ratio 99%; mtDNA ratio 1%), 99.9:0.1 (wtDNA ratio 99.9%; mtDNA ratio 0.1%), 99.99:0.01 (wtDNA ratio 99.99%; mtDNA ratio 0.01%), 99.999:0.001 (wtDNA ratio 99.999%; mtDNA ratio 0.001%) 비율로 섞어서 DNA 시료(sample)를 준비하였다. 500ng SpCas9과 100ng guide RNA를 37℃에서 5분 동안 결합시키고, 아세트산 칼륨(Potassium acetate) 50mM(pH 7.9), 트리스-아세트산염(Tris-acetate) 20mM, 아세트산 마그네슘(Magnesium acetate) 10mM, DTT(DiThioThreitol, 환원제) 1mM로 구성된 완충액에서 정제된 100ng double strand DNA(dsDNA)와 37℃에서 60분 동안 반응시켰다.

[표 2]

반응 후에, 엑소뉴클라아제 T7, 엑소뉴클라아제 T를 첨가하여 37℃에서 60분 동안 추가적으로 반응을 실시하였다. Cas9과 엑소뉴클라아제가 처리된 DNA 조각은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하거나, PCR 증폭을 하여 생거 시퀀싱(sanger sequencing)과 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)으로 염기서열을 확인하였다.

KRAS 유전자를 포함하고 있는 2787nt DNA는 양 말단이 포스포티오에이트 결합으로 보호되어 있다(도 3a 단계 1 참조). 양 말단이 포스포티오에이트 결합에 의해 보호되고 있는 DNA는 엑소뉴클라아제를 처리하더라도 분해되지 않는다. 하지만 cas9에 의해서 해당 DNA가 절단되면, 보호되지 않은 핵산 말단이 엑소뉴클라아제에 노출되고, 이로 인해 DNA는 분해되었다(도 3a 단계 2 및 단계 3 참조). KRAS 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 사용하였을 때, 5’-NGG-3’ PAM 시퀀스를 만족하는 wt KRAS 유전자만이 선택적으로 Cas9에 의해서 잘려진다. 이 때, 소뉴클라아제 T7과 소뉴클라아제 T를 처리함으로써 Cas9에 의해 잘려진 wt KRAS DNA가 완전히 제거되는 것을 전기영동을 통해서 확인하였다(도 3b 상단 최우측 라인 참조). 하지만, Cas9에 의해서 잘려지지 않은 mt KRAS DNA는 소뉴클라아제가 처리가 되어 있음에도 불구하고, 양 말단의 스포티오에이트 결합 때문에 보호되어 분해되지 않는 것을 확인하였다(도 3b 하단 최우측 라인 참조).

실시예 5. 표적 DNA에 대한 검출한계의 확인

표적 DNA만을 선택적으로 제거하였을 때, 미량으로 존재하는 유전자를 시퀀싱 결과로 확인하였다. 이 때, 미량 유전자에 대한 검출한계를 확인하기 위해서 wt DNA와 mt DNA를 서로 다른 비율로 섞어서 실험을 진행하였다. 양 끝단이 phosphothioate bond로 보호된 wt KRAS DNA와 mt KRAS DNA를 90:10 (wtDNA ratio 90%; mtDNA ratio 10%), 99:1 (wtDNA ratio 99%; mtDNA ratio 1%), 99.9:0.1 (wtDNA ratio 99.9%; mtDNA ratio 0.1%), 99.99:0.01 (wtDNA ratio 99.99%; mtDNA ratio 0.01%), 99.999:0.001 (wtDNA ratio 99.999%; mtDNA ratio 0.001%) 비율로 섞고, Cas와 엑소뉴클라아제를 처리한 후 최종적으로 얻은 샘플에 대한 시퀀싱을 실시하였다(도 4 참조).

도 4에 나타낸 바와 같이, Cas9만 처리한 샘플에서도 mt DNA의 비율이 상승하는 것을 NGS 시퀀싱 결과에서 확인할 수 있었다. 하지만 최초 분석 샘플에서의 mtDNA의 비율이 1% 이하로 내려갈 경우, 최종적으로 검출되어지는 mtDNA 비율이 현저히 낮아진다. 일반적으로 cfDNA에서의 mt DNA의 비율은 0.01% 이하인 점을 고려하였을 때, Cas9으로 표적 유전자만 절단하는 경우 mtDNA의 존재유무에 대한 결과를 확인하는 것은 용이하지 않다. 이에 본 발명자들은 표적 유전자의 검출 한계에 대한 확인을 하기와 같이 실시하였다.

Cas9과 엑소뉴클라아제를 처리한 샘플을 생거 시퀀싱을 통해 분석했을 때, KRAS c.35 구아노신에 해당하는 부분이 티민으로 읽히는 것을 확인하였다. Cas9만 처리한 경우 최초 mtDNA의 비율이 1%이였던 샘플(NGS result mtDNA : 44%)에서 35번째 핵산에 해당하는 부분에서 구아노신과 티민의 히스토그램이 동시에 관측되는 것을 확인하였고, mtDNA의 비율이 1%이하의 샘플에서는 mtDNA의 시퀀스를 관측할 수 없었다(도 5 좌측, Cas_treatment 참조). 하지만 Cas9, 엑소뉴클라아제 T, 엑소뉴클라아제 T7가 처리된 경우 mtDNA의 비율이 0.01%였던 샘플에서도, 돌연변이 시퀀스를 생거 시퀀싱 결과상에서 확인하였다(도 5 우측, Cas+ExoT+ExoT7_treatment 참조).

도 5에서 확인한 바와 같이, 본 발명에서 Cas9과 엑소뉴클라아제 T7, 엑소뉴클라아제 T를 같이 처리한 샘플의 경우, 최초의 mtDNA의 비율이 0.01% 이하의 샘플에서도 NGS 결과에서 mtDNA의 존재 유무를 명확하게 확인하였다(Cas9만을 사용하여 검출 가능한 시료의 mtDNA 비율은 1%). 따라서, 본 발명에서는 Cas9 시스템만을 이용하여 표적유전자를 절단하는 방법에 비하여, 최소 100배 이상으로 검출한계를 확장하였다.

실시예 6. 멀티플렉스 시스템을 이용한 다양한 표적 DNA의 제거

하기 방법에 따라, 멀티플렉스 시스템을 이용한 다양한 표적 DNA의 제거를 확인하였다. EGFR 서열은 다음 표 3과 같다.

[표 3]

포스포티오에이트 결합으로 5’ 말단이 보호된 프라이머(표 2)와 phusion 폴리머라아제를 사용하여, 여러 개의 표적 유전자에 대한 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 정제 키트를 사용하여 분리 정제된 KRAS DNA와 EGFR DNA를 1:1로 섞어서 표적 DNA 시료를 준비하였다. 500ng Cas9과 KRAS와 EGFR을 표적으로 하는 가이드 RNA(서열번호 3)를 각각 50ng씩 섞어서 5분 동안 결합시켰다. 이후에, Potassium acetate 50mM (pH 7.9), Tris-acetate 20mM, Magnesium acetate 10mM, DTT 1mM로 구성된 완충액에서 정제된 100ng 표적 DNA 샘플과 37℃에서 60분 동안 반응시켰다.

Cas9과 반응 시킨 후, 엑소뉴클라아제 T7, 엑소뉴클라아제 T를 첨가하여 37‘C, 60분 동안 추가적으로 반응시켰다. Cas9과 엑소뉴클라아제가 처리된 DNA 조각은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하거나, PCR 증폭을 하여 생거 시퀀싱과 차세대 시퀀싱으로 염기서열을 확인하였다.

KRAS DNA를 표적으로 하는 가이드 RNA와 EGFR DNA를 표적으로 하는 가이드 RNA를 혼합하여 Cas9과 결합시킨 후, wt KRAS DNA(2787nt)와 wt EGFR DNA(2813nt)가 1:1로 혼합된 DNA를 잘랐을 때, 각각의 표적 유전자는 해당 가이드 RNA에 의해서 잘리는 것을 확인하였고, 잘려진 유전자만 엑소뉴클라아제에 의해서 완전히 분해되는 것을 전기영동을 통해 검증하였다(도 7b 중단 참조). 이와 반대로 mt KRAS와 mt EGFR이 1:1로 섞인 DNA 샘플은 Cas9에 의해서 절단되지 않으며, 엑소뉴클라아제에 의해서 분해되지 않음을 확인하였다(도 7b 하단 참조).

상기와 같이, 각기 다른 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 함께 사용하는 멀티플렉싱 시스템을 적용하여, 여러 개의 표적 유전자를 동시에 제거할 수 있음을 전기영동을 통해 확인하였다. 또한 여러 유전자를 동시에 제거함으로써, 여러 종류의 극미량 유전자를 NGS 결과상에서 한 번에 확인하였다.

실시예 7. 멀티플렉싱 시스템을 이용한 다양한 표적 DNA에 대한 검출 한계의 확인

KRAS 유전자와 EGFR 유전자에 해당하는 wt DNA와 mt DNA를 서로 다른 비율로 섞은 DNA 샘플을 이용하여 멀티플렉싱 시스템의 검출한계를 NGS 분석을 통해 확인하였다. 양 끝단이 포스포티오에이트 결합으로 보호된 wt KRAS DNA, wt EGFR DNA와 mt KRAS DNA, mt EGFR DNA를 90:10 (KRAS mtDNA ratio : 10%, EGFR mtDNA ratio : 10%, wt KRAS DNA ratio 및 wt EGFR DNA ratio는 각각 90%), 99:1 (KRAS mtDNA ratio : 1%, EGFR mtDNA ratio : 1%, wt KRAS DNA ratio 및 wt EGFR DNA ratio는 각각 99%), 99.9:0.1 (KRAS mtDNA ratio : 0.1%, EGFR mtDNA ration : 0.1%, wt KRAS DNA ratio 및 wt EGFR DNA ratio는 각각 99.9%), 99.99:0.01 (KRAS mtDNA ratio : 0.01%, EGFR mtDNA ratio : 0.01%, wt KRAS DNA ratio 및 wt EGFR DNA ratio는 각각 99.99%), 99.999:0.001 (KRAS mtDNA ratio : 0.001%, EGFR mtDNA ratio : 0.001%, wt KRAS DNA ratio 및 wt EGFR DNA ratio는 각각 99.999%) 비율로 섞고, Cas9와 엑소뉴클라아제를 처리한 후 최종적으로 얻은 샘플을 시퀀싱하였다.

KRAS에 해당하는 가이드 RNA만을 이용한 실험(단독 표적 DNA에 대한 실험)과 같이, 멀티플렉싱 시스템을 도입했을 때 Cas9만을 사용한 경우 1%이하의 mt DNA가 존재하는 샘플에서 정상적으로 돌연변이 시퀀스를 검출할 수 없었다. 하지만 Cas9과 엑소뉴클라아제가 같이 처리된 경우 멀티플렉싱 시스템에서도 mtDNA를 효과적으로 검출해내는 것을 확인 할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).

도 9에 대해 설명하면 다음과 같다. Cas9 오르토로그는 서로다른 서열의 PAM을 인식한다. spCas9의 경우 표적유전자 3‘ 인접부분에 5’-NGG-3‘의 시퀀스를 보유한 유전자만을 절단시킬 수 있으며, 유전자 상의 해당 NGG 염기서열부분을 sp Cas9의 PAM 서열이라 부른다. nmCas9, saCas9, cjCas9, AsCpf1, FnCpf1의 PAM 서열은 각각 5’-NNNGMTT-3’, 5’-NNGRRT-3’, 5’-NNNVRYAC-3’, 5’-TTTN-3’, 5’-KYTV-3’로 인지된다. 이처럼 다른 종류의 Cas9 오르토로그는 PAM 서열을 보유하고 있으며, PAM 서열을 만족하여야지만, 정상적으로 작동할 수 있다. Cas9의 오르토로그를 멀티플랙싱으로 사용할 경우, PAM 서열의 제약에서 비롯된 표적 가능 유전자의 다양성의 한계를 뛰어 넘을 수 있다. 해당 도식에 나타난 것처럼 다양한 Cas9 오르토로그를 사용하여 유전자 진단을 시도하면, spCsa9으로 표적 가능한 유전자의 한계를 벗어나서 다양한 종류의 암 돌연변이를 검출해낼 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GENECKER <120> Kit for isolation of mutant cell free DNA and method for isolation of mutant cell free DNA using the same <130> DHP18-152 <150> KR 2018/0014478 <151> 2018-02-06 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spCas9 with 6His <400> 1 Met Gly His His His His His His Ala Glu Leu Pro Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly 20 25 30 Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys 35 40 45 Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys 65 70 75 80 Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr 85 90 95 Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe 100 105 110 Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His 115 120 125 Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His 130 135 140 Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser 145 150 155 160 Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met 165 170 175 Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp 180 185 190 Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn 195 200 205 Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys 210 215 220 Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu 245 250 255 Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp 260 265 270 Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp 275 280 285 Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu 290 295 300 Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile 305 310 315 320 Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met 325 330 335 Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala 340 345 350 Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp 355 360 365 Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln 370 375 380 Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly 385 390 395 400 Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys 405 410 415 Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly 420 425 430 Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu 435 440 445 Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro 450 455 460 Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met 465 470 475 480 Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val 485 490 495 Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn 500 505 510 Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu 515 520 525 Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr 530 535 540 Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys 545 550 555 560 Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val 565 570 575 Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser 580 585 590 Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr 595 600 605 Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn 610 615 620 Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu 625 630 635 640 Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His 645 650 655 Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr 660 665 670 Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys 675 680 685 Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala 690 695 700 Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys 705 710 715 720 Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His 725 730 735 Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile 740 745 750 Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg 755 760 765 His Lys Pro Glu Asn Ile Val 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Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu 980 985 990 Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val 995 1000 1005 Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val 1010 1015 1020 Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser 1025 1030 1035 1040 Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn 1045 1050 1055 Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val 1075 1080 1085 Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met 1090 1095 1100 Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe 1105 1110 1115 1120 Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala 1125 1130 1135 Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro 1140 1145 1150 Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys 1155 1160 1165 Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met 1170 1175 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Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe 1010 1015 1020 Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala 1025 1030 1035 1040 Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055 Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp 1060 1065 1070 Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro 1075 1080 1085 Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100 Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135 Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp 1140 1145 1150 Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp 1155 1160 1165 Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180 Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1185 1190 1195 1200 Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 11 <211> 2798 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2798) <223> EGFR Deletion mutant. 746-750 <400> 11 ctcataagca taagcgcgtg tgatgtgccc caaccaaacg accgccatgc acaacttccc 60 taccggagtt ttcaatccag ttaataggcg tggaaacaga catagaaatt gtgtttgttg 120 aaaggtagct gttcagttaa agaacacctg tatcagagcc tgtgtttcta ccaacttctg 180 tcaagctctg tagagaaggc gtacatttgt ccttccaaat gagctggcaa gtgccgtgtc 240 ctggcaccca agcccatgcc gtggctgctg gtccccctgc tgggccatgt ctggcactgc 300 tttccagcat ggtgagggct gaggtgaccc ttgtctctgt gttcttgtcc cccccagctt 360 gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag 420 gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag 480 gtaaggtccc tggcacaggc ctctgggctg ggccgcaggg cctctcatgg tctggtgggg 540 agcccagagt ccttgcaagc tgtatatttc catcatctac tttactcttt gtttcactga 600 gtgtttggga aactccagtg tttttcccaa gttattgaga ggaaatcttt tataaccaca 660 gtaatcagtg gtcctgtgag accaattcac agaccaaagg catttttatg aaaggggcca 720 ttgaccttgc catggggtgc agcacagggc gggaggaggg ccgcctctca ccgcacggca 780 tcagaatgca gcccagctga aatgggctca tcttcgtttg cttcttctag atcctctttg 840 catgaaatct gatttcagtt aggcctagac gcagcatcat taaattctgg atgaaatgat 900 ccacacggac tttataacag gctttacaag cttgagattc ttttatctaa ataatcagtg 960 tgattcgtgg agcccaacag ctgcagggct gcgggggcgt cacagccccc agcaatatca 1020 gccttaggtg cggctccaca gccccagtgt ccctcacctt cggggtgcat cgctggtaac 1080 atccacccag atcactgggc agcatgtggc accatctcac aattgccagt taacgtcttc 1140 cttctctctc tgtcataggg actctggatc ccagaaggtg agaaagttaa aattcccgtc 1200 gctatcaaga catctccgaa agccaacaag gaaatcctcg atgtgagttt ctgctttgct 1260 gtgtgggggt ccatggctct gaacctcagg cccacctttt ctcatgtctg gcagctgctc 1320 tgctctagac cctgctcatc tccacatcct aaatgttcac tttctatgtc tttccctttc 1380 tagctctagt gggtataact ccctcccctt agagacagca ctggcctctc ccatgctggt 1440 atccacccca aaaggctgga aacaggcaat tactggcatc tacccagcac tagtttcttg 1500 acacgcatga tgagtgagtg ctcttggtga gcctggagca tgggtattgt ttttggtatt 1560 ttttggatga agaaatggag gcataaagaa attggctgac ccttatatgg ctgggatagg 1620 gtttaagccc cttgttattt ctgactctga aacttgcatt caattcactc caccaagtta 1680 tctcatcttt gaaatggctt tttttaaagg tgcctagaat atgatggcgt gcagtctata 1740 aactgttgcc caccttctgt actttctctc agaataattc acattcttct ccagtgtctg 1800 ttgattgtta ctttgtggaa taagttcttg gaaaattcca caagattatt gttatcttct 1860 tactaccaat tctattgaac tttctccacc ttctctgggc cttccccagc cagtggtggg 1920 aagatgctgg ctggagtctg acagagcctc ttctacactg gcctgggctt gctgtgagtt 1980 ggtggaaacc tttgctcttg tcccaacaca gagcaagtga aagaggaggt caaggggctc 2040 aggcagcgga ctagggaagc agaatcgagg aaaaggaaaa atggctgact tattacctca 2100 aaactctaga gaatttagtt gatcttacag ccaagaagga caaaagccag agagtaatat 2160 cctccgcctc atgtctaacc cacagaatac atagcaagta aagagaacat gggcctttat 2220 aaaaatgtct taagatacaa ttttttaatt ggaggaaatc tacagtttaa ttttctctgg 2280 gcagcttttc ttccttttat tatagtaggg gaaatcccat gttgatatac ttctaaatga 2340 aagatgatga attgatataa tacaataaaa aatctgtaaa attgatgata tacttatcaa 2400 gaaaaattag ctttcatttt aacggtttac aaattgagtc aagtcctagt aacaaaatgt 2460 taagtctatt aacataacca caagaaatac aggaagacgg gcaatctgtg aagcctttca 2520 cttacaatct ctggcccctc acctgtgctg tgtaggaaaa tctttgtgca caatttgctt 2580 ccttaattca ttttttattc attcaacaca ttctaataaa ttatacaaaa tcatgttgaa 2640 atgtgaattt cagtggtatt tataaatgca gtgtgaggag ggtttggatg tattctaaga 2700 caatagttgt gctttgggaa ggaagcagtg ttcactgaaa agtgccccca ggacctttta 2760 attggaggaa atatgcttct gtggagttgg aaatgggg 2798 <210> 12 <211> 1140 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1140) <223> EGFR Deletion mutant Amino Acids <400> 12 Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr 1 5 10 15 Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu 20 25 30 Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr 35 40 45 Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys 50 55 60 Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser 85 90 95 Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser 100 105 110 Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser 115 120 125 Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys 130 135 140 Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly 145 150 155 160 Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr 165 170 175 Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu 180 185 190 Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr 195 200 205 Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala 210 215 220 Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly 225 230 235 240 Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp 245 250 255 Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys 260 265 270 Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala 275 280 285 Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu 290 295 300 His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro 305 310 315 320 Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile 325 330 335 Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu 340 345 350 His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His 355 360 365 Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly 385 390 395 400 Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe 405 410 415 Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn 420 425 430 Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu 435 440 445 Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val 450 455 460 Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu 465 470 475 480 Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu 485 490 495 Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp 500 505 510 Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys 515 520 525 Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys 530 535 540 Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro 565 570 575 Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu 580 585 590 Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile 595 600 605 Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val 610 615 620 Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg 625 630 635 640 Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly 645 650 655 Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys 660 665 670 Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu 675 680 685 Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val 690 695 700 Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr 705 710 715 720 Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys 725 730 735 Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala 740 745 750 Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu 755 760 765 Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr 770 775 780 Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His 785 790 795 800 Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile 805 810 815 Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val 820 825 830 Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile 835 840 845 Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro 850 855 860 Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys 865 870 875 880 Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile 885 890 895 Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln 900 905 910 Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr 915 920 925 Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp 930 935 940 Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser 945 950 955 960 Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr 965 970 975 Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu 980 985 990 Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr 995 1000 1005 Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn 1010 1015 1020 Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr 1025 1030 1035 1040 His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln 1045 1050 1055 Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val 1060 1065 1070 Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1075 1080 1085 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln 1090 1095 1100 Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser 1105 1110 1115 1120 Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu 1125 1130 1135 Phe Ile Gly Ala 1140 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR target site including PAM <400> 13 tcttaattcc ttgatagcga cgg 23 <210> 14 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_F Primer <400> 14 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacatttt cattattttt attataaggc 60 ctgctgaaaa tga 73 <210> 15 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_R Primer <400> 15 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttaaaa caagatttac ctctattgtt 60 ggatcatatt cg 72 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_F Primer <400> 16 cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat gggactctgg atcccagaag g 51 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_R Primer <400> 17 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagctgcc agacatgaga aa 52 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphothioate primer_F <400> 18 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phosphothioate primer_R <400> 19 gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat c 31

Claims

5' 말단이 보호된 프라이머를 포함하는, 야생형 세포 유리 유전자(wild type cell free DNA) 및 돌연변이 세포 유리 유전자(mutant cell free DNA) 증폭용 조성물;
상기 야생형 세포 유리 유전자 특이적 가이드 RNA;
상기 야생형 세포 유리 유전자를 절단하기 위한 Cas 단백질; 및
상기 야생형 세포 유리 유전자를 제거하기 위한 엑소뉴클라아제;
를 포함하는, 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이 세포 유리 유전자는 암 특이적인 돌연변이를 포함하는 DNA이고,
상기 키트는 암 의심 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 소변 시료에 포함된 야생형 세포 유리 유전자 및 돌연변이 세포 유리 유전자로부터 돌연변이 세포 유리 유전자를 분리하기 위한 것인,
돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
제1항에 있어서,
상기 Cas단백질은, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 또는 Francisella 1(Cpf1)인, 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
제1항에 있어서,
상기 가이드 RNA는 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA) 또는 sgRNA (single-chain RNA)인 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
제1항에 있어서,
상기 가이드 RNA는, 복수개의 야생형 세포 유리 유전자 특이적인 2 종류 이상의 가이드 RNA를 포함하는 것인, 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
제1항에 있어서,
상기 5' 말단이 보호된 프라이머는 상기 프라이머의 5' 말단이 포스포티오에이트 결합으로 보호된 것이고, 상기 유전자 증폭용 조성물은 PCR 조성물인, 돌연변이 세포 유리 유전자 분리용 키트.
i) 적어도 하나의 야생형 세포 유리 유전자(wild type cell free DNA) 및 적어도 하나의 돌연변이 세포 유리 유전자(mutant cell free DNA)가 포함된 분리된 시료 내의, 상기 야생형 세포 유리 유전자와 돌연변이 세포 유리 유전자를 5' 말단이 보호된 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계;
ii) 상기 야생형 세포 유리 유전자에 특이적으로 결합하는 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 처리하여 상기 증폭된 야생형 세포 유리 유전자만을 절단하는 단계;
iii) 상기 돌연변이 세포 유리 유전자와, 상기 절단된 세포 유리 유전자가 존재하는 시료에 엑소뉴클라아제를 처리하여 상기 절단된 야생형 세포 유리 유전자만을 제거하는 단계;
iv) 상기 시료 내에 남아있는 돌연변이 세포 유리 유전자를 증폭하는 단계; 및
v) 상기 증폭된 돌연변이 세포 유리 유전자를 분석하는 단계;
를 포함하는, 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 i) 적어도 하나의 야생형 세포 유리 유전자 및 적어도 하나의 돌연변이 세포 유리 유전자가 포함된 분리된 시료는, 암 의심 개체로부터 분리된 혈액, 혈장 또는 소변 시료인, 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 돌연변이 세포 유리 유전자는 암 특이적인 돌연변이를 포함하는 DNA이고,
상기 돌연변이 세포 유리 유전자 분석은, 암의 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 것인, 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 5'말단이 보호된 프라이머는 상기 프라이머의 5' 말단이 포스포티오에이트 결합으로 보호된 것인, 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 Cas단백질은, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), Streptococcus thermophilus Cas9 (StCas9), Streptococcus pasteurianus (SpaCas9), Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9), Staphylococcus aureus (SaCas9), Francisella novicida Cas9 (FnCas9), Neisseria cinerea Cas9 (NcCas9), Neisseria meningitis Cas9 (NmCas9) Prevotella 또는 Francisella 1(Cpf1)인, 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 가이드 RNA 는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함하는 이중 RNA (dualRNA) 또는 sgRNA (single-chain RNA)인 돌연변이 유전자형 분석 방법.
제7항에 있어서,
상기 증폭은 PCR로 수행되는 것인, 돌연변이 유전자형 분석 방법.