CN111065747B

CN111065747B - 突变细胞游离基因分离试剂盒及利用其的突变细胞游离基因分离方法

Info

Publication number: CN111065747B
Application number: CN201980004080.9A
Authority: CN
Inventors: 芮晟赫
Original assignee: Jinxike Co ltd
Current assignee: Jinxike Co ltd
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2019-02-07
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2039-02-07
Also published as: EP3653730B1; KR20190095160A; JP2020534863A; US11613776B2; US20200283841A1; EP3653730A1; ES2962531T3; KR102086689B1; CN111065747A; EP3653730A4; EP3653730C0; JP7006873B2

Abstract

本发明涉及一种利用CRISPR‑Cas系统及核酸外切酶的突变细胞游离基因分离用试剂盒及突变细胞游离基因分析方法。

Description

突变细胞游离基因分离试剂盒及利用其的突变细胞游离基因分离方法

技术领域

本发明涉及突变细胞游离基因(mutant cell free DNA)分离试剂盒及利用其的突变细胞游离基因分离方法。更具体而言，本发明涉及包含CRISPR-Cas系统及核酸外切酶的突变细胞游离基因分离试剂盒及分离方法，用于在微量的细胞游离基因试料内检测突变基因。

背景技术

最近，癌症早期诊断的重要性在全世界范围内大幅突显，因此，对癌早期诊断方法的研究比重正在增加。但是，迄今为止，癌诊断方法以采集组织样本及内视镜检查等侵入性方法为主。原有方法以取出疑似疾病部位的一部分并利用显微镜观察的方式进行，因而患者感受的不便不少，留下伤痕，恢复也需要时间。

作为这种原有侵入性诊断及检查方法的替代方案，利用液体活检(LiquidBiopsy)的分子诊断法倍受瞩目。液体活检使用非侵入性(non-invasive)方法，因而检查结果导出速度快，不同于曾只能够分析疾病的一部分的组织样本，液体即液体活体样本可以针对疾病进行多角度分析。特别是液体活检，预测将对癌的诊断发挥卓越的效用性，预计仅通过血液、尿液等体液检查，便可以分析身体各部位的血液内存在的癌细胞来源DNA，实现对癌发生及转移等的详细观察。

最近，与液体-活检相关联，正在活跃地进行着对从肿瘤释放到血流并在体内血液内存在的细胞游离DNA(cell-free DNA，cf DNA)的研究。随着对来源于血液、血浆或尿液等多样生物学试料的cfDNA进行分离并检测的技术的发展，液体活检在癌危险群患者的监控方面将成为更有效或可以信赖的工具。在75％以上的进展期胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胃食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈癌患者中，以及在50％以上的癌、前列腺癌或甲状腺癌患者中，确认了cf DNA状的癌来源基因。在以转移性结肠直肠癌患者为对象的基因临床诊断中，cf DNA对KRAS基因变异检测的敏感度为87.2％，特异度为99.2％。

这些研究展现了通过cf DNA分析的癌诊断可能性，从而cf DNA内癌来源基因作为新一代生物标志物而倍受瞩目。正在通过从癌患者来源的cf DNA确认肿瘤特异性基因突变，尝试初期阶段肿瘤的诊断。但是，在分析血液、尿液等液体试料内cfDNA而发现在基因中发生的变异来早期诊断癌的方法中，现在的技术存在许多界限(专利文献1)。特别是在尿液、脑脊液、血浆、血液或体液试料内，cfDNA以极小浓度存在，cfDNA在老化过程中会发生自然的基因变异，患者血浆内存在的cf DNA大部分为正常体细胞来源的野生型(wild type：wt)基因，因而作为现有测序技术而言，准确诊断cf DNA中有无癌细胞来源基因近乎不可能。因此，为了利用微量cf DNA来诊断初期阶段癌，需要去除正常基因，使癌细胞来源基因特异性地扩增。因此，迫切要求一种用于提高检测敏感度及准确的癌早期诊断的方法。

另一方面，最近开发的基于基因剪刀(RNA-guided CRISPR)(clusteredregularly interspaced short palindrome repeats：成簇规律间隔短回文重复序列)-相关核酸酶Cas(半胱氨酸蛋白酶)蛋白质的基因组编辑(genome editing)，提供利用了靶向敲除、转录激活及single guide RNA(sgRNA：单导向RNA)(即，crRNA-tracrRNA融合转录本)的针对稀缺的突破性技术，该技术通过靶向大量基因位置而证明了拓展性。CRISPR-Cas系统由对靶向基因或核酸具有互补序列的导向RNA(gRNA)、能够切割靶向基因或核酸的作为核酸酶的CRISPR酶构成，gRNA和CRISPR酶形成CRISPR复合体，借助于形成的CRISPR复合体而使靶向基因或核酸切割或修饰。CRISPR系统作为原核生物和古细菌的免疫系统，最近作为基因剪刀之一，对其实用性的研究正在急剧增加(非专利文献1、非专利文献2)，但没有要将其用于在基因组测序中使用的碱基序列捕获方法及疾病诊断的尝试。

因此，本发明人为了找到从cfDNA上分离突变基因的方法，锐意努力的结果，利用以CRISPR/Cas系统来特异性地切割微量cfDNA正常基因的技术和使未切割的突变基因特异性地扩增的技术，完成了本发明。

(专利文献1)韩国公开专利10-2016-0129523

(非专利文献1)Jinek et al.Science,2012,337,816-821

(非专利文献2)Zalatan et al.Cell,2015,160,339-350

(非专利文献3)Tian J,Ma K,Saaem I.,Mol Biosyst,2009,5(7),714-722

(非专利文献4Michael,L..Metzker,Nature Reviews Genetics,2010,11,31-46

发明内容

技术问题

本发明目的旨在提供一种突变细胞游离基因分离用试剂盒。

本发明另一目的旨在提供一种突变基因型分析方法。

技术方案

本发明提供一种突变细胞来源基因分离用试剂盒，包括：

包含5’末端被保护的引物的野生型细胞游离基因(wt cell free DNA；wild typecell free DNA)及突变细胞游离基因(mutant cell free DNA)扩增用组合物；

所述野生型细胞游离基因特异性导向RNA；

用于切割所述野生型细胞游离基因的Cas蛋白质；及

用于去除所述野生型细胞游离基因的核酸外切酶。

所述突变细胞游离基因可以为包含癌特异性突变的DNA。

在本发明中，术语“细胞游离基因(cell-free DNA；cfDNA)”意味着起源于肿瘤细胞并可在来源于癌患者的血液、血浆或尿液等生物学试料中发现的癌细胞来源基因，在坏死、细胞凋亡或泌尿器官的正常细胞及/或癌细胞中激活，通过多样细胞生理学过程，释放到尿液、血液等。尿液、脑脊液(cerebrospinal fluid：CSF)、血浆、血液或体液是容易获得的试料，因而可以通过反复的采样而收集大量的单纯的非侵入性标本。

在本发明中，术语“CRISPR-Cas系统”由具有对基因或核酸的互补序列的导向RNA(gRNA)和能够切割靶向基因或核酸的作为核酸酶的CRISPR酶构成，gRNA和CRISPR酶形成CRISPR复合体，借助于形成的CRISPR复合体而使靶向基因或核酸切割或修饰。

Cas蛋白质意味着CRISPR/Cas系统必需的蛋白质要素，当与被称为CRISPR RNA(crRNA)及反式激活crRNA(trans-activating crRNA：tracrRNA)两种RNA形成复合体时，形成活性核酸内切酶。Cas蛋白质基因及蛋白质的信息可以从美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information：NCBI)的基因库取得，但不限于此。

在本发明中，术语“导向RNA”作为对靶DNA的特异性RNA，通过传递到细胞内的线性双链DNA的转录而表达，可以识别靶基因序列，与Cas蛋白质形成复合体，是将Cas蛋白质带入靶DNA的RNA。所述“靶基因序列”作为靶基因或核酸内存在的核苷酸序列，具体而言，是靶基因或核酸内靶区域的一部分核苷酸序列，此时，“靶区域”是靶基因或核酸内可被导向核酸-编辑蛋白质修饰的部位。

在本发明中，术语“PAM序列(sequence)”作为位于目标序列旁的3bp～6bp左右大小的序列，意味着CRISPR-Cas复合体识别的靶序列，CRISPR-Cas复合体识别PAM序列后，切割特定位置。

所述试剂盒可以用于从分离自癌疑似个体的液体试料(血液、血浆或尿液试料等)包含的野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因，分离突变细胞游离基因。

所述Cas蛋白质可以为酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌Cas9(StCas9)、巴氏链球菌(SpaCas9)、空肠弯曲菌Cas9(CjCas9)、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、新凶手弗朗西斯菌Cas9(FnCas9)、灰色奈瑟球菌Cas9(NcCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)普氏菌或弗郎西丝菌1(Cpf1)，但并非必须限于此。

所述Cas蛋白质或基因信息可以从诸如NCBI(National Center forBiotechnology Information)的基因库的公知的数据库获得，但不限于此。

所述导向RNA可以为包含crRNA(CRISPR RNA)及tracrRNA(trans-activatingcrRNA)的双重RNA(dualRNA)或sgRNA(single-chain RNA：单链RNA)。

所述导向RNA可以包含多个野生型细胞游离基因特异性2种类以上的导向RNA。即，本发明的试剂盒是可以多样本测序的试剂盒。

所述导向RNA制作方法在该技术领域广为所知。

所述5'末端被保护的引物可以是所述引物的5'末端被用硫代磷酸酯键(phosphothioate bond)保护的。

所述基因扩增用组合物可以为PCR组合物。

在本发明中，术语“扩增反应”意味着扩增靶核酸序列的反应，可以借助于PCR(polymerase chain reaction：聚合酶链式反应)而实施。所述PCR包括逆转录(reversetranscription)聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重(multiplex)PCR、实时(real-time)PCR、组装(Assembly)PCR、融合(Fusion)PCR、连接酶链式反应(Ligase chain reaction：LCR)，但不限于此。

在本说明书中，术语“引物(primer)”作为单链寡核苷酸之一，也可以包括核糖核苷酸，优选地，可以为脱氧核苷酸。所述引物在模板(template)的一个部位杂交或退火，形成双链结构。在本发明中，引物可以在NGS测序衔接子序列杂交(hybridization)或退火(annealing)。退火意味着在模板核酸并置(apposition)寡核苷酸或者核酸，就所述并置而言，通过聚合酶(polymerase)对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。“杂交(hybridization)”意味着互补的2个单链核酸借助于互补的碱基序列的配对(pairing)而形成双链结构(duplex structure)。所述引物可以在诱导合成与模板互补的引物延伸产物的条件下用作合成的起点。

所述PCR组合物除对野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因分别具有特异性的5’末端被保护的引物之外，可以包含该技术领域周知的成分。具体而言，可以包含PCR缓冲液(PCR buffer)、dNTP、DNA聚合酶(DNA Polymerase)等。

在本发明中，术语“核酸外切酶(exonuclease)”是在DNA序列中，从多核苷酸链的3′-末端或5′-末端依次降解核苷酸的酶。3′-5′核酸外切酶是在3′-末端降解磷酸二酯(phospho-diester)键的酶，5′-3′核酸外切酶是在5′-末端降解磷酸二酯(phospho-diester)键的酶。

所述核酸外切酶只要是该技术领域所知的核酸外切酶，则均可使用。具体而言，核酸外切酶可以包括3′→5′核酸外切酶及/或5′→3′核酸外切酶。具体而言，可以包括核酸外切酶III、核酸外切酶I、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶T、核酸外切酶V、Lambda核酸外切酶及核酸外切酶VII等。优选地，可以为核酸外切酶T7及核酸外切酶T(单链特异性核酸酶)，但并非必须限定于此。

如果利用包含5′末端被保护的引物的基因扩增用组合物，使包含野生型细胞游离基及突变细胞游离基因的试料反应，则野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因末端用硫代磷酸酯保护。该被保护的DNA即使进行核酸外切酶处理，也因硫代磷酸酯键而不降解。

借助于野生型细胞游离基因特异性导向RNA及Cas蛋白质，相应DNA被野生型细胞游离DNA切割，未被保护的核酸末端暴露于核酸外切酶，因此，野生型细胞游离基因DNA被降解、去除，只分离突变细胞游离基因(图1)。

在本发明一个实施例中，当使用以KRAS基因为目标的导向RNA时，选择性地借助于Cas9而只切割满足5’-NGG-3’PAM序列的wt KRAS。此时，进行核酸外切酶T7和核酸外切酶T处理，从而可以通过电泳确认被Cas9切割的wt KRAS DNA完全去除。

另一方面，本发明提供一种突变基因型分析方法，包括如下步骤：

i)利用5'末端被保护的引物，将包括至少一个野生型细胞游离基因(wild typecell free DNA)及至少一个突变细胞游离基因(mutant cell free DNA)的分离试料内的所述野生型细胞游离基因与突变细胞游离基因扩增的步骤；

ii)进行特异性地结合于所述野生型细胞游离基因的导向RNA及Cas蛋白质处理，只切割所述扩增的野生型细胞游离基因的步骤；

iii)对所述突变细胞游离基因、所述切割的细胞游离基因存在的试料进行核酸外切酶处理，只去除所述切割的野生型细胞游离基因的步骤；

iv)扩增所述试料内留下的突变细胞游离基因的步骤；及

v)分析所述扩增的突变细胞游离基因的步骤。

所述i)包含至少一个野生型细胞游离基因及至少一个突变细胞游离基因的分离试料，可以是从癌疑似个体分离的液体试料(血液、血浆或尿液试料)。

所述突变细胞游离基因可以是包含癌特异性突变的DNA。

所述突变细胞游离基因分析，可以用于提供癌诊断所需的信息。

在本发明中，术语“诊断”包括：判定一个客体对特定疾病或疾患的易感性(susceptibility)，判定一个客体当前是否患有特定疾病或疾患，判定患有特定疾病或疾患的一个客体的预后(prognosis)，或检测(therametrics)(例如，为了提供关于治疗效能的信息而监视客体的状态)。

在本发明中，所述诊断可以包括确认是否癌发病及/或确认癌的预后。

所述癌可以为早期癌。

所述癌例如可以为选自由鳞状细胞癌(squamous cell cancer，例如，上皮鳞状细胞癌)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、腹膜癌、结肠癌、胆道肿瘤、鼻咽癌、喉癌、支气管癌、口腔癌、骨肉瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、膀胱癌、黑色素瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑瘤、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、骨髓癌、食道癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌和直肠癌构成的组的1种以上，但并非限定于此。

所述5'末端被保护的引物可以是所述引物的5'末端被用硫代磷酸酯键保护的。

所述Cas蛋白质可以为酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌Cas9(StCas9)、巴氏链球菌(SpaCas9)、空肠弯曲菌Cas9(CjCas9)、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、新凶手弗朗西斯菌Cas9(FnCas9)、灰色奈瑟球菌Cas9(NcCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)普氏菌或弗郎西丝菌1(Cpf1)，但并非必须限定于此。

所述导向RNA可以为包含crRNA(CRISPR RNA)及tracrRNA(trans-activatingcrRNA)的双重RNA(dualRNA)或sgRNA(single-chain RNA)。

所述扩增可以利用PCR而执行，PCR条件可以以该技术领域周知的方法为基础设置。

有益效果

本发明的突变细胞游离基因分离用试剂盒及突变细胞游离基因分离方法利用了CRISPR/Cas系统及核酸外切酶，可以选择性地去除在血液内的cfDNA中占大部分的正常体细胞来源基因(>99.9％)。其结果，可以在cfDNA上只分析突变细胞游离基因(癌细胞来源基因)，可以有用地用于早期癌诊断。

另外，本发明的突变细胞游离基因分离用试剂盒及突变细胞游离基因分离方法，提供可以去除试料内正常细胞来源基因，分析与cfDNA中存在的突变细胞游离基因(癌细胞来源基因)比率相应的极微量基因的效果。

而且，本发明可以利用多个正常来源基因特性性导向RNA，因而可以借助于多样本测序系统(multiplexing system)而同时对2种以上致癌基因进行检测。

附图说明

图1是本发明选择性地去除试料内wtDNA(wild type cell free DNA)而只使mtDNA(mutant cell free DNA)扩增的过程的模式图。

图2是利用本发明的CRISPR-Cas系统而只选择性地切割试料内wtDNA的结果。

图3是利用本发明CRISPR-Cas系统而切割的DNA选择性地被核酸外切酶降解的结果。

图4是进行本发明的Cas蛋白质及核酸外切酶处理，通过新一代碱基序列分析，对去除KRAS wtDNA的样本进行分析的结果。

图5是进行本发明的Cas蛋白质及核酸外切酶处理，通过桑格测序，对去除KRASwtDNA的样本进行分析的结果。

图6是显示进行本发明的Cas蛋白质及核酸外切酶处理，以多样本测序方法去除各种靶基因，从而一次使癌来源基因扩增的过程的具体模式图。

图7是通过琼脂糖凝胶电泳来证明进行本发明的Cas蛋白质及核酸外切酶处理，利用多样本测序系统而可以只选择性地去除靶基因(wt DNA)的结果。

图8是通过新一代碱基序列分析来分析进行本发明的Cas蛋白质及核酸外切酶处理，利用多样本测序系统去除KRAS wtDNA和EGFR wtDNA的样本的结果。

图9是显示移植了利用本发明中Cas9直向同源物(othologue)的多样本测序系统的基因去除方法的模式图。

具体实施方式

可以使靶基因选择性地切割的CRISPR-Cas系统，作为具有极高准确度的核酸内切酶(endonuclease)，Cas9直向同源物(othologue)具有各不相同的PAM区域序列。PAM序列是Cas9蛋白质识别靶基因时必需的基因序列，即使已与靶基因完美互补的导向RNA(guideRNA)结合，如果PAM序列不满足，则CRISPR Cas系统不工作。另外，如果导向RNA与靶基因非互补的基因序列较多，则CRISPR/Cas无法正常识别靶基因。为了确认因核苷酸替代(nucleotide substitution)而发生的癌基因，设计了与野生型基因互补的导向RNA。在选定导向RNA的靶时，大致按两种基准设计。当发生替代前的碱基序列与PAM位点相应时，以PAM位点为基准设计导向RNA，在不与PAM位点相应的情况下，在种子区(seed region)添加错配(mismatch)而设计了导向RNA。Cas9的种子区是在识别靶基因时，对导向RNA与靶基因间的错配敏感地进行反应的位置，当在种子区有1～2nt错配的时，则无法明确认知靶基因。

本发明使用的导向RNA设计得可以选择性地识别野生型的基因。

在本发明中，如果在利用Cas9切割靶基因后进行PCR扩增，则被Cas9切割的野生型细胞游离DNA扩增的量小于突变细胞游离DNA。但是，仅凭借利用Cas9切割野生型DNA后对突变DNA进行PCR的单纯方式，无法达到确认极微量突变基因所需的检测界限。这是因为，被Cas9切割的野生型DNA片段在PCR过程中可以发挥引物作用，因此，在最终扩增的PCR产物中会包含野生型来源的基因序列。即使借用Cas9的准确度来选择性地切割野生型基因，被切割的DNA片段使背景信号升高，导致无法达到可以检测极微量存在的癌来源基因的检测界限(参考图1的下端左侧框图)。

但是，在本发明中，去除在PCR过程中生成背景信号的野生型DNA被切割的片段，从而针对微量的靶基因也具有充分的检测能力。在微量的cf DNA基因分析的最终过程中，当通过PCR来扩增分析对象基因时，使用5’末端被硫代磷酸酯键(phosphothioate bond)保护的引物进行扩增，或使在已扩增的PCR扩增子两末端包含硫代磷酸酯键的衔接子(adatpor)进行连接(ligation)。连接核苷酸的磷酸二酯键(phophodiester bond)被硫代磷酸酯键取代，核酸酶无法将相应键所存在的苷酸之间进行切割。

在靶基因两末端被硫代磷酸酯键保护时，如果进行核酸外切酶处理，则相应靶基因不被核酸外切酶降解。但是，如果靶基因被Cas9切割，则未用硫代磷酸酯保护的新DNA末端暴露于核酸外切酶，被Cas9切割的DNA被核酸外切酶去除。

因此，成为本发明基础的基因切割与去除技术发挥互补作用，可以实现原来曾不可能的微量cf DNA内癌来源基因明确检测。

在本发明的一种形态中，确认了分离提纯的SpCas9蛋白质与导向RNA复合体只准确地切割满足5’-NGG-3’的PAM序列的基因靶地点。

在本发明中，KRAS基因的变异作为癌基因的主要变异之一，是cfDNA上重要的生物标志物。特别是KRAS的变异，cDNA上的35号核酸的G被T替代，在蛋白质上主要发生12号氨基酸从天门冬氨酸(asparatate)替代为缬氨酸(valine)的变异。35号鸟苷(guanosine)如此被替代为胸苷(thymidine)的mtDNA，在靶基因上与Cas9的PAM相应的碱基序列变更为NGT。利用PAM序列特异性地识别NGG的SpCas9，只特异性地识别wt KRAS与mt KRAS(35G>T)中的wt KRAS并切割DNA(图2)。

下面通过实施例，更详细地说明本发明。这些实施例只用于对本发明举例，不得解释为本发明的范围由这些实施例所限定，这是本行业的技术人员不言而喻的。

实施例1：SpCas9的分离及提纯

为了表达在N末端包含6X组氨酸标记(tag)的重组化脓性链球菌Cas9(酿脓链球菌Cas9：spCas9)的蛋白质，将具有spCas9遗传信息((包含6X组氨酸的蛋白质全体序列，序列号1)的质粒(plasmid)转化到作为感受态细胞(Competent cell)的BL21-DE3种。对所述转化的BL21-DE3增殖的液体培养基进行IPTG(Isopropyl b-D-ThioGalactoside：异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)处理后，在18℃下培养16小时时间。将细胞在5000xg下离心分离15分钟时间后，利用包含NaH₂PO₄ 50mM(pH 8)、NaCl 400mM、咪唑基(imidazole)10mM、PMSF(苯甲基磺酰氟)1mM、DTT(二硫苏糖醇)1mM、曲通X-100 1％、溶菌酶(lysozyme)1mg/ml的溶解缓冲液(lysis buffer)使细胞溶解。利用超声波粉碎机将细胞粉碎后，在15000xg下进行30分钟离心分离，分离上清液与细胞碎片。在上清液中添加镍-氨基三乙酸树脂(Ni-NTA resin，英杰生命技术有限公司(Invitrogen)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市)，在4℃下反应1小时时间后，利用NaH₂PO₄ 50mM(pH 8)、NaCl 400mM、咪唑基20mM的清洗缓冲液(wash buffer)，将Ni-NTA树脂反复清洗2次。最后，在相应树脂中添加NaH₂PO₄50mM(pH 8)、NaCl 400mM、咪唑基250mM的洗脱缓冲液(elution buffer)，从而将spCas9从Ni-NTA树脂分离。将包含spCas9的缓冲液，利用阿米康超离心过滤器(amicon ultra centrifugal filter)，更换为包含HEPES 20mM(pH 7.5)、NaCl 400mM、DTT 1mM、甘油40％的缓冲液。

实施例2.基于体外转录的导向RNA合成

使包含T7启动子及导向RNA信息的DNA模板与T7 RNA聚合酶，在包含40mM Tris-HCl(pH 7.9)、6mM MgCl2、10mM DTT、10mM NaCl、2mM亚精胺、NTP及核糖核酸酶抑制剂的缓冲液中，在37℃下反应18小时时间，体外合成了导向RNA(序列号2及3)。合成的导向RNA使用RNA提纯试剂盒进行提纯。

实施例3.体外切割(In vitro Cleavage)

将根据所述实施例1分离提纯的500ng SpCas9(以下标记为Cas9)和根据所述实施例2制备的100ng导向RNA，在37℃下结合5分钟时间，在由乙酸钾50mM(pH 7.9)、三羟基氨甲烷乙酸盐20mM、乙酸镁10mM、DTT 1mM构成的缓冲液中，与150ng作为双链DNA(dsDNA)的野生型KRAS基因(序列号4)及突变KRAS基因(KRAS D12V，序列号6)在37℃下反应60分钟时间。KRAS基因及氨基酸序列信息如下表1所示。

[表1]

被Cas9切割的DNA片段在1.5％琼脂糖胶(agarose gel)中进行电泳后，用EtBr染色并进行确认。实验结果，确认了分离提纯的Cas9蛋白质与导向RNA复合体只准确地切割满足5’-NGG-3’的PAM序列的基因靶地点(参照图2)。

作为癌基因主要变异之一的KRAS基因变异，是可以在cfDNA上检测的重要生物标志物。特别是就KRAS变异而言，cDNA上的35号核酸由于G被T替代，KRAS蛋白质内12号氨基酸从甘氨酸(glycine,G)替换为缬氨酸(valine,V)的变异很重要(序列号5及序列号7)。35号的鸟苷(guanosine)如此替代为胸苷(thymidine)的mtDNA，在靶基因上与Cas9的PAM相应的碱基序列变换为NGT。利用PAM序列特异性地识别NGG的SpCas9，只特异性地识别wt KRAS与mt KRAS(35G>T)中的wt KRAS并切割DNA(序列号8)。

导向RNA在包含野生型KRAS基因(序列号4)的2787nt的DNA上具有与1572nt位置相应的靶序列。在电泳结果中，确认了与导向RNA结合的Cas9在2787nt的DNA上切割KRAS基因，形成1572nt的长切片和1215nt的短切片(参照图2b上端及图3b上端)。但确认了即使使用相应导向RNA，PAM序列变换成5’-NGT-3’的mtKRAS基因未被Cas9切割(参照图2b下端及图3b下端)。

实施例4.仅选择性去除野生型细胞游离DNA

野生型细胞游离基因被选择性地切割后，实施了旨在确认这种选择性切割借助于核酸外切酶而选择性地进行的实验。

使用5’末端被用硫代磷酸酯键保护的引物(表2)和phusion聚合酶，对靶基因(从癌患者血液中分离的野生型细胞游离DNA及癌特异性细胞来源DNA)进行PCR扩增。使用PCR提纯试剂盒(Quiagen Cat ID：28104)，将野生型DNA(wtDNA)和突变DNA(mtDNA)分离提纯后，将wtDNA与mtDNA按90：10(wtDNA比率90％；mtDNA比率10％)、99：1(wtDNA比率99％；mtDNA比率1％)、99.9：0.1(wtDNA比率99.9％；mtDNA比率0.1％)、99.99：0.01(wtDNA比率99.99％；mtDNA比率0.01％)、99.999：0.001(wtDNA比率99.999％；mtDNA比率0.001％)比率混合，准备了DNA试料(sample)。使500ng SpCas9与100ng导向RNA在37℃下结合5分钟时间，在由乙酸钾(Potassium acetate)50mM(pH 7.9)、三羟基氨甲烷乙酸盐(Tris-acetate)20mM、乙酸镁(Magnesium acetate)10mM、DTT(二硫苏糖醇，还原剂)1mM构成的缓冲液中，与提纯的100ng双链DNA(dsDNA)在37℃下反应60分钟时间。

[表2]

在反应后，添加核酸外切酶T7、核酸外切酶T，在37℃下追加实施反应60分钟时间。经Cas9和核酸外切酶处理的DNA片段在1.5％琼脂糖胶中通过电泳进行确认，或进行PCR扩增，利用桑格测序(sanger sequencing)和新一代测序(next generation sequencing)，确认碱基序列。

包含KRAS基因的2787nt DNA的两末端被用硫代磷酸酯键保护(参照图3a步骤1)。两末端被硫代磷酸酯键保护的DNA，即使进行核酸外切酶处理也不降解。但是，如果相应DNA被cas9切割，则未保护的核酸末端暴露于核酸外切酶，因此，DNA降解(参照图3a步骤2及步骤3)。当使用以KRAS基因为靶的导向RNA时，只有满足5’-NGG-3’PAM序列的wt KRAS基因选择性地被Cas9切割。此时，通过电泳,确认了经核酸外切酶T7和核酸外切酶T处理，从而被Cas9切割的wt KRAS DNA被完全去除(参照图3b上端最右侧线)。但是，确认了未被Cas9切割的mt KRAS DNA尽管进行核酸外切酶处理，但因被两末端的硫代磷酸酯键保护而未降解(参照图3b下端最右侧线)。

实施例5.确认对靶DNA的检测界限

当只选择性地去除靶DNA时，通过测序结构确认了以微量存在的基因。此时，为了确认对微量基因的检测界限，将wt DNA和mt DNA按互不相同比率混合并进行实验。将两末端被硫代磷酸酯键保护的wt KRAS DNA和mt KRAS DNA按90：10(wtDNA比率90％；mtDNA比率10％)、99：1(wtDNA比率99％；mtDNA比率1％)、99.9：0.1(wtDNA比率99.9％；mtDNA比率0.1％)、99.99：0.01(wtDNA比率99.99％；mtDNA比率0.01％)、99.999：0.001(wtDNA比率99.999％；mtDNA比率0.001％)比率混合，进行Cas和核酸外切酶处理后，对最终获得的样本实施测序(参照图4)。

如图4所示，在NGS测序结果中可以确认，在只进行Cas9处理的样本中，mt DNA的比率也上升。但是，当最初分析样本中的mtDNA比率下降至1％以下时，最终检测的mtDNA比率显著降低。一般而言，当考虑到cfDNA中的mt DNA比率为0.01％以下时，在用Cas9只切割靶基因的情况下，并不容易确认关于mtDNA是否存在的结果。因此，本发明人如下实施了对靶基因检测界限的确认。

通过桑格测序分析经Cas9和核酸外切酶处理的样本时，确认了与KRAS c.35鸟苷相应的部分被读成胸苷。在只进行Cas9处理的情况下，确认了在最初mtDNA比率为1％的样本(NGS result mtDNA：44％)中，在与35号核酸相应的部分，同时观测到鸟苷与胸苷的柱状图，在mtDNA比率为1％以下的样本中，无法观测到mtDNA序列(参照图5左侧，Cas_treatment)。但是，在进行Cas9、核酸外切酶T、核酸外切酶T7处理的情况下，在mtDNA比率为0.01％的样本中，在桑格测序结果上也确认了突变序列(参照图5右侧，Cas+ExoT+ExoT7_treatment)。

正如在图5中确认的那样，就在本发明中一同进行Cas9和核酸外切酶T7、核酸外切酶T处理的样本而言，即使在最初mtDNA比率0.01％以下的样本中，在NGS结果中也明确确认了mtDNA是否存在(只使用Cas9便可检测的试料的mtDNA比率为1％)。因此，本发明与只利用Cas9系统来切割靶基因的方法相比，至少将检测界限扩张100倍以上。

实施例6.利用多重系统去除多样的靶DNA

根据下述方法，确认了利用多重系统去除多样的靶DNA。EGFR序列如下述表3所示。

[表3]

/>

使用5’末端被用硫代磷酸酯键保护的引物(表2)和phusion聚合酶，对多个靶基因实施了PCR扩增。将使用PCR提纯试剂盒而分离提纯的KRAS DNA与EGFR DNA按1：1混合，准备了靶DNA试料。将500ng Cas9与靶向KRAS和EGFR的导向RNA(序列号3)分别混合50ng，结合5分钟时间。然后，在由乙酸钾50mM(pH7.9)、三羟基氨甲烷乙酸盐20mM、乙酸镁10mM、DTT 1mM构成的缓冲液中，与提纯的100ng靶DNA样本在37℃下反应60分钟时间。

与Cas9反应后，添加核酸外切酶T7、核酸外切酶T，在37℃下追加反应60分钟时间。经Cas9和核酸外切酶处理的DNA片段在1.5％琼脂糖胶中通过电泳进行确认，或进行PCR扩增，通过桑格测序和新一代测序，确认了碱基序列。

将靶向KRAS DNA的导向RNA和靶向EGFR DNA的导向RNA混合，与Cas9结合后，当对按1：1混合了wt KRAS DNA(2787nt)与wt EGFR DNA(2813nt)的DNA进行切割时，确认了各个靶基因被相应导向RNA切割，通过电泳验证了只有切割的基因被核酸外切酶完全降解(参照图7b中段)。与此相反，确认了由mt KRAS和mt EGFR按1：1混合的DNA样本未被Cas9切割，未被核酸外切酶降解(参照图7b下端)。

如上所述，通过电泳确认了应用一同使用靶向各不相同基因的导向RNA的多样本测序系统，可以同时去除多个靶基因。另外，通过同时去除多个基因，从而在NGS结果上一次确认了多个种类的极微量基因。

实施例7.确认利用多样本测序系统的多样靶DNA检测界限

利用将与KRAS基因和EGFR基因相应的wt DNA和mt DNA按互不相同比率混合的DNA样本，通过NGS分析，确认了多样本测序系统的检测界限。将两末端用硫代磷酸酯键保护的wt KRAS DNA、wt EGFR DNA和mt KRAS DNA、mt EGFR DNA，按90：10(KRAS mtDNA比率：10％、EGFR mtDNA比率：10％、wt KRAS DNA ratio及wt EGFR DNA ratio各90％)、99：1(KRASmtDNA比率：1％、EGFR mtDNA比率：1％、wt KRAS DNA ratio及wt EGFR DNA ratio各99％)、99.9：0.1(KRAS mtDNA比率：0.1％、EGFR mtDNA ration：0.1％、wt KRAS DNA ratio及wtEGFR DNA ratio各99.9％)、99.99：0.01(KRAS mtDNA比率：0.01％、EGFR mtDNA比率：0.01％、wt KRAS DNA ratio及wt EGFR DNA ratio各99.99％)、99.999：0.001(KRAS mtDNA比率：0.001％、EGFR mtDNA比率：0.001％、wt KRAS DNA比率及wt EGFR DNA比率各99.999％)比率混合，进行Cas9和核酸外切酶处理后，对最终获得的样本进行了测序。

像只利用与KRAS相应的导向RNA的实验(对单独靶DNA的实验)那样，在导入多样本测序系统时，在只使用Cas9的情况下，在1％以下的mt DNA所存在的样本中，会无法正常检测突变序列。但是，在Cas9与核酸外切酶一同处理的情况下，可以确认，在多样本测序系统中也可以有效检测出mtDNA(参照图8及图9)。

对图9说明如下。Cas9直向同源物识别互不相同序列的PAM。就spCas9而言，可以只切割在靶基因3’邻接部分拥有5’-NGG-3’序列的基因，将基因上的相应NGG碱基序列部分称为sp Cas9的PAM序列。nmCas9、saCas9、cjCas9、AsCpf1、FnCpf1的PAM序列分别认知为5’-NNNGMTT-3’、5’-NNGRRT-3’、5’-NNNVRYAC-3’、5’-TTTN-3’、5’-KYTV-3’。如此不同种类的Cas9直向同源物拥有PAM序列，需满足PAM序列，但可以正常启动。在将Cas9直向同源物用作多样本测序的情况下，可以超越因PAM序列限制导致的可靶向基因的多样性界限。如相应图示所示，如果使用多样Cas9直向同源物进行基因诊断，则可以用spCsa9超越可靶向基因的界限，检测多样种类的癌突变。

以上详细描述了本发明内容的特定的部分，该技术领域的技术人员明白，这种具体描述只是优选实施形态，本发明的范围并非由此限定。因此，本发明的实质范围由附带的权利要求项及其等价物所定义。

<110> 株式会社金希科

<120> 突变细胞游离基因分离试剂盒及利用其的突变细胞游离基因分离方法

<130> OPP19-0101PCT

<150> KR 2018/0014478

<151> 2018-02-06

<150> KR 19/013,912

<151> 2019-02-01

<160> 19

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1383

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有6His 的spCas9

<400> 1

Met Gly His His His His His His Ala Glu Leu Pro Gly Ile Arg Pro

1 5 10 15

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

20 25 30

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

35 40 45

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

50 55 60

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

65 70 75 80

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

85 90 95

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

100 105 110

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

115 120 125

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

130 135 140

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

145 150 155 160

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

165 170 175

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

180 185 190

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

195 200 205

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

210 215 220

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

245 250 255

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

260 265 270

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

275 280 285

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

290 295 300

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

305 310 315 320

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

325 330 335

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

340 345 350

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

355 360 365

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

370 375 380

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

385 390 395 400

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

405 410 415

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

420 425 430

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

435 440 445

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

450 455 460

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

465 470 475 480

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

485 490 495

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

500 505 510

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

515 520 525

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

530 535 540

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

545 550 555 560

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

565 570 575

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

580 585 590

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

595 600 605

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

610 615 620

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

625 630 635 640

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

645 650 655

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

660 665 670

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

675 680 685

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

690 695 700

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

705 710 715 720

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

725 730 735

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

740 745 750

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

755 760 765

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

770 775 780

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

785 790 795 800

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

805 810 815

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

820 825 830

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

835 840 845

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

850 855 860

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

865 870 875 880

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

885 890 895

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

900 905 910

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

915 920 925

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

930 935 940

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

945 950 955 960

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

965 970 975

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

980 985 990

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

995 1000 1005

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

1010 1015 1020

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn

1045 1050 1055

Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val

1075 1080 1085

Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met

1090 1095 1100

Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe

1105 1110 1115 1120

Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala

1125 1130 1135

Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro

1140 1145 1150

Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys

1155 1160 1165

Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met

1170 1175 1180

Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys

1185 1190 1195 1200

Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr

1205 1210 1215

Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala

1220 1225 1230

Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1235 1240 1245

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1250 1255 1260

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr

1265 1270 1275 1280

Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile

1285 1290 1295

Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His

1300 1305 1310

Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe

1315 1320 1325

Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr

1330 1335 1340

Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala

1345 1350 1355 1360

Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp

1365 1370 1375

Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1380

<210> 2

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KRAS G12V定位sgRNA

<400> 2

aaacuugugg uaguuggagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

<210> 3

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EGFR Del746-750定位sgRNA

<400> 3

ucuuaauucc uugauagcga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

<210> 4

<211> 2786

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2786)

<223> KRAS 野生型靶，人类

<400> 4

tttgtttgtt ttgagatgga gtcttactcc gtcacccaat ctggagtgca gtggcgtgat 60

ctgggctcac tgcaacctct gcctcccggg ttcaagtgat tctccttcct cagcctcccc 120

agtagctagg actacaggag agcgccacca cgcctgatta atttttgtat ttttagtaga 180

gagagggttt caccatattg gccaggctgg tcttgaactc ctggcctcag gtgatccacc 240

cgccttggcc tctgaaagtg ctgggattac aggcatgagc cgccgcaccc ggctttctaa 300

tctttatctt tttttgtgca gcggtgatac aggattatgt attgtactga acagttaatt 360

cggagttctc ttggttttta gctttatttt ccccagagat tttttttttt tttttttttt 420

ttgagacgga gtcttgctct atcgccaggc tggagtgcag tggcgccatc tcggctcatt 480

gcaacctcgg actcctattt tccccagaga tatttcacac attaaaatgt cgtcaaatat 540

tgttcttctt tgcctcagtg tttaaatttt tatttcccca tgacacaatc cagctttatt 600

tgacactcat tctctcaact ctcatctgat tcttactgtt aatatttatc caagagaact 660

actgccatga tgctttaaaa gtttttctgt agctgttgca tattgacttc taacacttag 720

aggtgggggt ccactaggaa aactgtaaca ataagagtgg agatagctgt cagcaacttt 780

tgtgagggtg tgctacaggg tgtagagcac tgtgaagtct ctacatgagt gaagtcatga 840

tatgatcctt tgagagcctt tagccgccgc agaacagcag tctggctatt tagatagaac 900

aacttgattt taagataaaa gaactgtcta tgtagcattt atgcattttt cttaagcgtc 960

gatggaggag tttgtaaatg aagtacagtt cattacgata cacgtctgca gtcaactgga 1020

attttcatga ttgaattttg taaggtattt tgaaataatt tttcatataa aggtgagttt 1080

gtattaaaag gtactggtgg agtatttgat agtgtattaa ccttatgtgt gacatgttct 1140

aatatagtca cattttcatt atttttatta taaggcctgc tgaaaatgac tgaatataaa 1200

cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc aagagtgcct tgacgataca gctaattcag 1260

aatcattttg tggacgaata tgatccaaca atagaggtaa atcttgtttt aatatgcata 1320

ttactggtgc aggaccattc tttgatacag ataaaggttt ctctgaccat tttcatgagt 1380

acttattaca agataattat gctgaaagtt aagttatctg aaatgtacct tgggtttcaa 1440

gttatatgta accattaata tgggaacttt actttccttg ggagtatgtc agggtccatg 1500

atgttcactc tctgtgcatt ttgattggaa gtgtatttca gagtttcgtg agagggtaga 1560

aatttgtatc ctatctggac ctaaaagaca atctttttat tgtaactttt atttttatgg 1620

gtttcttggt attgtgacat catatgtaaa ggttagattt aattgtacta gtgaaatata 1680

attgtttgat ggttgatttt tttaaacttc atcagcagta ttttcctatc ttcttctcaa 1740

cattagagaa cctacaacta ccggataaat tttacaaaat gaattatttg cctaaggtgt 1800

ggtttatata aaggtactat taccaacttt acctttgctt tgttgtcatt tttaaattta 1860

ctcaaggaaa tactaggatt taaaaaaaaa ttccttgagt aaatttaaat tgttatcatg 1920

tttttgagga ttattttcag atttttttag tttaatgaaa atttaccaaa gtaaagacca 1980

gcagcagaat gataagtaaa gacctgtaag acaccttgaa ggtcatggag tagaacttcc 2040

atcccaagca gatgaggatt tatttaatct caaagacctc caggagggga cattccccaa 2100

ctgtccttgt taactcattt tcagaacata tttattagca tattttacat gtaatttgga 2160

tcttcatgtt aaatttaaca tcagtggaga tggaaaataa gcatatcgcc ttgtctttga 2220

aatagcccta tattgttaga ttgtttctta ggcttcttta ccctgggtta agcagtccta 2280

atactttagc atttattcta catctagtgt actaatttaa aaaaatcagt tctgaaaaat 2340

ttctaagaac tttcttcaag ttccaagctg tgaaatctag aacaggtcaa agtgccttat 2400

taacgtactg tactgtgtag tgtcttgaag agacactttg cgctgaggca agttctgagg 2460

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actaatcata aggaaacgtc acatattttt ggtactataa aaaagtggag aaataatgcc 2580

tatttgcaaa gatttgattt aaacatagaa acaactttat ttggcttcca attttaagaa 2640

tttacagcag taaaggggaa cagtctaatt gaagtagact gcctatgcaa tagtctctgt 2700

atatttactt ttgacaagtt aattcaatgt gtactatagt tttgtttctt tgaagaggtt 2760

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<210> 5

<211> 186

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(186)

<223> 野生型KRAS氨基酸

<400> 5

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

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Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys

165 170 175

Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys

180 185

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<211> 2787

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<220>

<221> gene

<222> (1)..(2787)

<223> KRAS突变G12V靶，人类

<400> 6

gtttgtttgt tttgagatgg agtcttactc cgtcacccaa tctggagtgc agtggcgtga 60

tctgggctca ctgcaacctc tgcctcccgg gttcaagtga ttctccttcc tcagcctccc 120

cagtagctag gactacagga gagcgccacc acgcctgatt aatttttgta tttttagtag 180

agagagggtt tcaccatatt ggccaggctg gtcttgaact cctggcctca ggtgatccac 240

ccgccttggc ctctgaaagt gctgggatta caggcatgag ccgccgcacc cggctttcta 300

atctttatct ttttttgtgc agcggtgata caggattatg tattgtactg aacagttaat 360

tcggagttct cttggttttt agctttattt tccccagaga tttttttttt tttttttttt 420

tttgagacgg agtcttgctc tatcgccagg ctggagtgca gtggcgccat ctcggctcat 480

tgcaacctcg gactcctatt ttccccagag atatttcaca cattaaaatg tcgtcaaata 540

ttgttcttct ttgcctcagt gtttaaattt ttatttcccc atgacacaat ccagctttat 600

ttgacactca ttctctcaac tctcatctga ttcttactgt taatatttat ccaagagaac 660

tactgccatg atgctttaaa agtttttctg tagctgttgc atattgactt ctaacactta 720

gaggtggggg tccactagga aaactgtaac aataagagtg gagatagctg tcagcaactt 780

ttgtgagggt gtgctacagg gtgtagagca ctgtgaagtc tctacatgag tgaagtcatg 840

atatgatcct ttgagagcct ttagccgccg cagaacagca gtctggctat ttagatagaa 900

caacttgatt ttaagataaa agaactgtct atgtagcatt tatgcatttt tcttaagcgt 960

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 1020

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 1080

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 1140

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 1200

acttgtggta gttggagctg ttggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 1260

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 1320

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 1380

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 1440

agttatatgt aaccattaat atgggaactt tactttcctt gggagtatgt cagggtccat 1500

gatgttcact ctctgtgcat tttgattgga agtgtatttc agagtttcgt gagagggtag 1560

aaatttgtat cctatctgga cctaaaagac aatcttttta ttgtaacttt tatttttatg 1620

ggtttcttgg tattgtgaca tcatatgtaa aggttagatt taattgtact agtgaaatat 1680

aattgtttga tggttgattt ttttaaactt catcagcagt attttcctat cttcttctca 1740

acattagaga acctacaact accggataaa ttttacaaaa tgaattattt gcctaaggtg 1800

tggtttatat aaaggtacta ttaccaactt tacctttgct ttgttgtcat ttttaaattt 1860

actcaaggaa atactaggat ttaaaaaaaa attccttgag taaatttaaa ttgttatcat 1920

gtttttgagg attattttca gattttttta gtttaatgaa aatttaccaa agtaaagacc 1980

agcagcagaa tgataagtaa agacctgtaa gacaccttga aggtcatgga gtagaacttc 2040

catcccaagc agatgaggat ttatttaatc tcaaagacct ccaggagggg acattcccca 2100

actgtccttg ttaactcatt ttcagaacat atttattagc atattttaca tgtaatttgg 2160

atcttcatgt taaatttaac atcagtggag atggaaaata agcatatcgc cttgtctttg 2220

aaatagccct atattgttag attgtttctt aggcttcttt accctgggtt aagcagtcct 2280

aatactttag catttattct acatctagtg tactaattta aaaaaatcag ttctgaaaaa 2340

tttctaagaa ctttcttcaa gttccaagct gtgaaatcta gaacaggtca aagtgcctta 2400

ttaacgtact gtactgtgta gtgtcttgaa gagacacttt gcgctgaggc aagttctgag 2460

ggcattgggt ggccttggga agatatttat gcagtttaga acctggagaa ttgattagat 2520

aactaatcat aaggaaacgt cacatatttt tggtactata aaaaagtgga gaaataatgc 2580

ctatttgcaa agatttgatt taaacataga aacaacttta tttggcttcc aattttaaga 2640

atttacagca gtaaagggga acagtctaat tgaagtagac tgcctatgca atagtctctg 2700

tatatttact tttgacaagt taattcaatg tgtactatag ttttgtttct ttgaagaggt 2760

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<210> 7

<211> 186

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(186)

<223> 突变KRAS氨基酸

<400> 7

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys

165 170 175

Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys

180 185

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有PAM的KRAS 靶位点

<400> 8

aaacttgtgg tagttggagc tgg 23

<210> 9

<211> 2813

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2813)

<223> EGFR 野生型靶序列，人类

<400> 9

ctcataagca taagcgcgtg tgatgtgccc caaccaaacg accgccatgc acaacttccc 60

taccggagtt ttcaatccag ttaataggcg tggaaacaga catagaaatt gtgtttgttg 120

aaaggtagct gttcagttaa agaacacctg tatcagagcc tgtgtttcta ccaacttctg 180

tcaagctctg tagagaaggc gtacatttgt ccttccaaat gagctggcaa gtgccgtgtc 240

ctggcaccca agcccatgcc gtggctgctg gtccccctgc tgggccatgt ctggcactgc 300

tttccagcat ggtgagggct gaggtgaccc ttgtctctgt gttcttgtcc cccccagctt 360

gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag 420

gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag 480

gtaaggtccc tggcacaggc ctctgggctg ggccgcaggg cctctcatgg tctggtgggg 540

agcccagagt ccttgcaagc tgtatatttc catcatctac tttactcttt gtttcactga 600

gtgtttggga aactccagtg tttttcccaa gttattgaga ggaaatcttt tataaccaca 660

gtaatcagtg gtcctgtgag accaattcac agaccaaagg catttttatg aaaggggcca 720

ttgaccttgc catggggtgc agcacagggc gggaggaggg ccgcctctca ccgcacggca 780

tcagaatgca gcccagctga aatgggctca tcttcgtttg cttcttctag atcctctttg 840

catgaaatct gatttcagtt aggcctagac gcagcatcat taaattctgg atgaaatgat 900

ccacacggac tttataacag gctttacaag cttgagattc ttttatctaa ataatcagtg 960

tgattcgtgg agcccaacag ctgcagggct gcgggggcgt cacagccccc agcaatatca 1020

gccttaggtg cggctccaca gccccagtgt ccctcacctt cggggtgcat cgctggtaac 1080

atccacccag atcactgggc agcatgtggc accatctcac aattgccagt taacgtcttc 1140

cttctctctc tgtcataggg actctggatc ccagaaggtg agaaagttaa aattcccgtc 1200

gctatcaagg aattaagaga agcaacatct ccgaaagcca acaaggaaat cctcgatgtg 1260

agtttctgct ttgctgtgtg ggggtccatg gctctgaacc tcaggcccac cttttctcat 1320

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atgtctttcc ctttctagct ctagtgggta taactccctc cccttagaga cagcactggc 1440

ctctcccatg ctggtatcca ccccaaaagg ctggaaacag gcaattactg gcatctaccc 1500

agcactagtt tcttgacacg catgatgagt gagtgctctt ggtgagcctg gagcatgggt 1560

attgtttttg gtattttttg gatgaagaaa tggaggcata aagaaattgg ctgaccctta 1620

tatggctggg atagggttta agccccttgt tatttctgac tctgaaactt gcattcaatt 1680

cactccacca agttatctca tctttgaaat ggcttttttt aaaggtgcct agaatatgat 1740

ggcgtgcagt ctataaactg ttgcccacct tctgtacttt ctctcagaat aattcacatt 1800

cttctccagt gtctgttgat tgttactttg tggaataagt tcttggaaaa ttccacaaga 1860

ttattgttat cttcttacta ccaattctat tgaactttct ccaccttctc tgggccttcc 1920

ccagccagtg gtgggaagat gctggctgga gtctgacaga gcctcttcta cactggcctg 1980

ggcttgctgt gagttggtgg aaacctttgc tcttgtccca acacagagca agtgaaagag 2040

gaggtcaagg ggctcaggca gcggactagg gaagcagaat cgaggaaaag gaaaaatggc 2100

tgacttatta cctcaaaact ctagagaatt tagttgatct tacagccaag aaggacaaaa 2160

gccagagagt aatatcctcc gcctcatgtc taacccacag aatacatagc aagtaaagag 2220

aacatgggcc tttataaaaa tgtcttaaga tacaattttt taattggagg aaatctacag 2280

tttaattttc tctgggcagc ttttcttcct tttattatag taggggaaat cccatgttga 2340

tatacttcta aatgaaagat gatgaattga tataatacaa taaaaaatct gtaaaattga 2400

tgatatactt atcaagaaaa attagctttc attttaacgg tttacaaatt gagtcaagtc 2460

ctagtaacaa aatgttaagt ctattaacat aaccacaaga aatacaggaa gacgggcaat 2520

ctgtgaagcc tttcacttac aatctctggc ccctcacctg tgctgtgtag gaaaatcttt 2580

gtgcacaatt tgcttcctta attcattttt tattcattca acacattcta ataaattata 2640

caaaatcatg ttgaaatgtg aatttcagtg gtatttataa atgcagtgtg aggagggttt 2700

ggatgtattc taagacaata gttgtgcttt gggaaggaag cagtgttcac tgaaaagtgc 2760

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<210> 10

<211> 1210

<212> PRT

<213> 人类

<400> 10

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

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Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

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Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

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Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

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Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

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Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

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Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

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Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

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Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

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Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

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Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe

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Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> gene

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<400> 11

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tcaagctctg tagagaaggc gtacatttgt ccttccaaat gagctggcaa gtgccgtgtc 240

ctggcaccca agcccatgcc gtggctgctg gtccccctgc tgggccatgt ctggcactgc 300

tttccagcat ggtgagggct gaggtgaccc ttgtctctgt gttcttgtcc cccccagctt 360

gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag gatcttgaag 420

gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac ggtgtataag 480

gtaaggtccc tggcacaggc ctctgggctg ggccgcaggg cctctcatgg tctggtgggg 540

agcccagagt ccttgcaagc tgtatatttc catcatctac tttactcttt gtttcactga 600

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tcagaatgca gcccagctga aatgggctca tcttcgtttg cttcttctag atcctctttg 840

catgaaatct gatttcagtt aggcctagac gcagcatcat taaattctgg atgaaatgat 900

ccacacggac tttataacag gctttacaag cttgagattc ttttatctaa ataatcagtg 960

tgattcgtgg agcccaacag ctgcagggct gcgggggcgt cacagccccc agcaatatca 1020

gccttaggtg cggctccaca gccccagtgt ccctcacctt cggggtgcat cgctggtaac 1080

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ttttggatga agaaatggag gcataaagaa attggctgac ccttatatgg ctgggatagg 1620

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aactgttgcc caccttctgt actttctctc agaataattc acattcttct ccagtgtctg 1800

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gaaaaattag ctttcatttt aacggtttac aaattgagtc aagtcctagt aacaaaatgt 2460

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ccttaattca ttttttattc attcaacaca ttctaataaa ttatacaaaa tcatgttgaa 2640

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<210> 12

<211> 1140

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(1140)

<223> EGFR缺失突变体氨基酸

<400> 12

Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr

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Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu

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Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr

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145 150 155 160

Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr

165 170 175

Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu

180 185 190

Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr

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210 215 220

Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly

225 230 235 240

Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp

245 250 255

Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys

260 265 270

Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala

275 280 285

Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu

290 295 300

His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro

305 310 315 320

Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile

325 330 335

Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu

340 345 350

His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His

355 360 365

Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly

370 375 380

Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly

385 390 395 400

Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe

405 410 415

Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn

420 425 430

Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu

435 440 445

Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val

450 455 460

Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu

465 470 475 480

Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu

485 490 495

Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp

500 505 510

Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys

515 520 525

Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys

530 535 540

Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro

565 570 575

Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu

580 585 590

Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His Ile

595 600 605

Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Val

610 615 620

Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu Arg

625 630 635 640

Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser Gly

645 650 655

Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu Lys

660 665 670

Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu

675 680 685

Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val

690 695 700

Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr

705 710 715 720

Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys

725 730 735

Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala

740 745 750

Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu

755 760 765

Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr

770 775 780

Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His

785 790 795 800

Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile

805 810 815

Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val

820 825 830

Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile

835 840 845

Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro

850 855 860

Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys

865 870 875 880

Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile

885 890 895

Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln

900 905 910

Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr

915 920 925

Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp

930 935 940

Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser

945 950 955 960

Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr

965 970 975

Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu

980 985 990

Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr

995 1000 1005

Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn

1010 1015 1020

Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr

1025 1030 1035 1040

His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln

1045 1050 1055

Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val

1060 1065 1070

Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala

1075 1080 1085

Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln

1090 1095 1100

Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser

1105 1110 1115 1120

Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu

1125 1130 1135

Phe Ile Gly Ala

1140

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 具有PAM 的EGFR靶位点

<400> 13

tcttaattcc ttgatagcga cgg 23

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KRAS_F引物

<400> 14

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacatttt cattattttt attataaggc 60

ctgctgaaaa tga 73

<210> 15

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KRAS_R引物

<400> 15

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctttaaaa caagatttac ctctattgtt 60

ggatcatatt cg 72

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EGFR_F引物

<400> 16

cactctttcc ctacacgacg ctcttccgat gggactctgg atcccagaag g 51

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> EGFR_R引物

<400> 17

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagctgcc agacatgaga aa 52

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 硫代磷酸酯引物_F

<400> 18

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 硫代磷酸酯引物_R

<400> 19

gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat c 31

Claims

1.一种突变细胞游离基因分离用试剂盒，包括：

包含5’末端被保护的引物的野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因扩增用组合物，所述5’末端被保护的引物是所述引物的5’末端被用硫代磷酸酯键保护；

特异性针对所述野生型细胞游离基因的导向RNA；

用于切割所述野生型细胞游离基因的Cas蛋白质；及

用于去除所述野生型细胞游离基因的核酸外切酶T7和核酸外切酶T。

2.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中，

所述突变细胞游离基因为包含癌特异性突变的DNA，

所述试剂盒用于从分离自癌疑似个体的血液、血浆或尿液试料中包含的野生型细胞游离基因及突变细胞游离基因中分离突变细胞游离基因。

3.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，

所述Cas蛋白质为酿脓链球菌Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌Cas9(StCas9)、巴氏链球菌Cas9 (SpaCas9)、空肠弯曲菌Cas9(CjCas9)、金黄色葡萄球菌(SaCas9)、新凶手弗朗西斯菌Cas9(FnCas9)、灰色奈瑟球菌Cas9 (NcCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、或普氏菌和弗郎西丝菌1中的CRISPR相关核酸内切酶(Cpf1)。

4.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，

所述导向RNA为包括crRNA及tracrRNA的双重RNA或sgRNA。

5.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中，

所述导向RNA包含多个野生型细胞游离基因特异性2种类以上的导向RNA。

6.根据权利要求1所述的突变细胞游离基因分离用试剂盒，其中

所述基因扩增用组合物为PCR组合物。

7.权利要求1-6中任一项的试剂盒在制备用于突变基因型分析方法的产品中的用途，其中所述突变基因型分析方法包括：

i)利用5’末端被保护的引物，扩增分离试料内的野生型细胞游离基因和突变细胞游离基因的步骤，所述分离试料包含至少一个野生型细胞游离基因和至少一个突变细胞游离基因，所述5’末端被保护的引物是所述引物的5’末端被用硫代磷酸酯键保护；

iii)对所述突变细胞游离基因、所述切割的细胞游离基因存在的试料进行核酸外切酶处理，只去除所述切割的野生型细胞游离基因的步骤，所述核酸外切酶是核酸外切酶T7和核酸外切酶T；

iv)扩增所述试料内留下的突变细胞游离基因的步骤；及

v)分析所述扩增的突变细胞游离基因的步骤。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，

所述包含至少一个野生型细胞游离基因及至少一个突变细胞游离基因的分离试料，是从癌疑似个体分离的血液、血浆或尿液试料。

9.根据权利要求7所述的用途，其中，

所述突变细胞游离基因为包含癌特异性突变的DNA，

所述突变细胞游离基因的分析用于提供癌诊断所需的信息。

10.根据权利要求7所述的用途，其中，

11.根据权利要求7所述的用途，其中，

所述导向RNA为包含crRNA及tracrRNA的双重RNA或sgRNA。

12.根据权利要求7所述的用途，其中，

所述扩增利用PCR执行。