KR100665975B1 - 티지에프베타3 유전자 돌연변이를 이용한 구순구개열 질환의 진단 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TGF-B3 유전자의 돌연변이를 이용한 구순구개열 질환의 진단방법에 관한 것으로 본 발명의 내용인 TGF-B3 유전자의 한국인 돌연변이는 지금까지 알려져 있지 않았으며, 한국인 특이적인 유전자 염기서열 상의 변이이다. 구순구개열 환자조직과 정상인의 조직에서 TGF-B3의 돌연변이를 조사한 결과 정상인에 비해서 구순구개열 환자조직에서 같은 위치에서 발현되는 돌연변이를 발견하여 TGF-B3 유전자 돌연변이가 구순구개열의 유발인자라는 것이 밝혀졌기 때문에, 이러한 TGF-B3 유전자 돌연변이 방법을 통해 구순구개열 질환 소인을 진단하는데 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 구순구개열 소인을 진단하는 효율적인 방법에 관한 것이다.

구순구개열(Nonsyndromic cleft lip and palate), TGF-B3, SNPs

Description

티지에프베타3 유전자 돌연변이를 이용한 구순구개열 질환의 진단 {The diagnosis of use in TGF-B3 gene mutant of Nonsyndromic cleft lip and palate}

도 1은 TGF-B3 유전자의 단일염기다형성의 위치를 나타낸 것이고,

도 2는 TGF-B3유전자의 18141번째 뉴클레오티드(엑손 인트론 접경 5에 위치)인 A가 G로 치환된 돌연변이의 염기서열분석 그래프이고,

도 3은 구순구개열 환자의 혈액에서 분리된 DNA에 SfaN1 제한효소를 처리한 후 아가로스 전기영동사진을 나타낸 그림이고,

도 4는 구순구개열 환자의 혈액에서 분리된 DNA에 PCR을 수행한 후 단일염기다형서의 유전자타입을 나타내었다.

본 발명은 인체 유전학 분야로서 구순구개열의 발병 유전자로 알려진 TGF-B3 유전자에 관한 것이다. 구체적으로는, 구순구개열 소인 진단시 사용될 수 있는 한국인 특이적인 유전자 돌연변이 및 이들을 TGF-B3 유전자로부터 검출하는 방법 및 진단할 수 있는 효율적인 방법에 관한 것이다.

일명 언청이라고도 하는 구순열과 구개열은 두경부에 발생하는 기형중 가장 많은 것이며 전반적인 선천성 기형중 네 번째로 많은 것이다. 구순구개열의 발병 원인은 유전적요인, 환경적요인, 등으로 나눌 수 있으며, 어느 하나가 독립적으로 작용하여 발생하기 보다는 서로 여러가지 요인이 복합적으로 결합되어 발생하게 된다. 특히 전체 구순구개열 발생은 신생아 두경부 기형에서 첫번째로 가장 흔하며, 발생빈도는 나라에 따라 또 학자에 따라 다소 차이가 있지만 대체로 1,000:1전후로 보고되고 있다. 미국 내에서 태어나는 신생아의 700-1000명중에 한 명꼴로 빈도가 높은 것으로 알려져 있다. 아시아에서는 그 보다 더욱 많이 발생하거나 같은 것으로 알려져 있다. 구순열과 구개열은 일차성구개(primary palate)나 이차성구개(secondary palate)의 형성과정에 장애가 있어서 생기게 되는데 구순열은 태생 4-7주에 상구순이 만들어지는 과정에 장애가 있어서 발생되며, 구개열은 태생 7주-12주경 이차성 구개의 유합과정에 장애가 있을때 발생하게 된다. 구순구개열을 가지고 태어난 신생아중에서 10명중 6명의 신생아가 여자이며, 나머지 4명이 남자이다. 구순구개열 없이 태어난 신생아보다는 구순구개열을 갖고 태어난 신생아에서 보다 많은 질병에 연관되어 있다. 만약 정상 부모에게서 언청이 아이가 태어났다면 다음 아이에게 언청이가 생길 위험률은 4%이다. 마찬가지로 부모 중 하나가 언청이면 그 자녀에게 생길 확률 역시 4%이다. 부모와 한 아이가 언청이면 다른 자녀에게 생길 확률은 약 17%이다. 통계적으로 우측보다 좌측에 더 많이 생기고 좌측이 더 심하다. 남자에게는 구순열이 더 많고 여자에게는 구개열이 더 많다. 유전성 구순구개열이 속하는 발생 유전학(Development Genetics)은 매우 복잡한 현상으로서 유전적 요인, 환경적 요인 및 35세 임신부의 출산 및 가족 중에 구순구개열의 병력 등에 의한 복합적인 상호 작용에 의해 발생한다. 구순구개열 발생 유전자는 주로 우성이고 지금까지 39 여가지 이상이 발견되었으며 (University of Texas Medical School at Houston 77225, USA) 구순구개열 억제 유전자는 아직 까지 발견되지 않았다. Dr. Stelnicki 가설에 의하면 태아 내에서 손상된 부위의 세포주변에 존재하는 DNA 전사 물질(Transcription factor)BCL3와 같은 DNA 전사 물질이 존재하며, 이와 같은 유전자 및 근처에 존재하는 구조적 형태 및 기능이 유사한 유전자를 이용하여 태아 내에서 손상 없이 치료가 가능하다는 최근의 보고가 되고있다. TGF-B3의 염색체상의 위치는 14번째에 위치하고 있으며, TGF-B3의 중요한 조절작용중의 하나는 단백질의 신호전달을 통한 단백질간의 상호작용을 돕는 것이다. 마우스 실험에 의한 연구보고에서 TGF-B3 유전자 결여된 마우스에서는 구순구개열에 관여하는 유전자들이 발현이 되지 않았으며, 세포실험의 경우에는 TGF-B3 단백질의 첨가로서 발현을 유도할 수 있었다.(Developmental Biology 250, 393-405, 2002).TGF-β3(The EMBO Journal Vol 7, pp.3737-3743, 1988)는 구순구개열을 발병시키는 유전자로서의 위험성을 증가시키는 유전자로는 처음으로 검증된 유전자이며(Nat. Genet. 11 (4), 415-421,1995), TGF-B1과 같은 7개의 엑손(Exon)으로 구성되어있다.TGF-B3는 구순구개열 뿐만 아니라 치아의 발생 및 분화에도 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(Connect. Tissue Res. 43 (2-3), 381-386, 2002). TGF-B3와 같은 유전물질이 구순구개열을 발병시키는 후보 물질로서 질병과 연관된 유전자변이를 찾기에는 매우 어려운 건 사실이다. 그러나 유전적 변이의 다양성에 근거한 연구결과로 볼 때 유전후보물질의 특정한 돌연변이 부위가 결정적인 역할을 한다는 것은 증명되었다(Lander, 1994). 유전자 변이를 통한 접근으로 질환 유전후보물질의 특정한 돌연변이 위치를 발견하게 되었다. 돌연변이가 일어난 TGF-B3 유전자는 모계뿐만 아니라 부계로부터 유전될 수도 있으며, 여성뿐 아니라 남성도 돌연변이 유전자를 가진 경우, 구순구개열의 발병율은 높아지게 된다

TGF-B3 유전자의 돌연변이 발생빈도는 민족별로 차이가 있는데, 세계적으로 TGF-B3 유전자의 뉴클레오티드 변이양상은 매우 다양하게 나타나는데, 지금까지 많은 종의 돌연변이가 보고되어져 있다 국내의 경우 한국인을 대상으로 한 뉴클레오티드 돌연변이는 알려진 바가 거의 전무한 실정이다. 미국을 중심으로 한 인간 게놈프로젝트가 종료되었는데, 앞으로 질병을 유발하는 유전자를 밝히고 관련 유전자의 변이양상을 찾아 이를 분자수준에서 진단에 응용하고자 하는 노력이 다양하게 시도되고 응용되리라고 보고 있다. 이러한 국제적인 게놈 산업의 경향을 고려할 때 한국인을 대상으로 한 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism)을 포함하는 뉴클레오티드 변이양상에 대한 정보의 획득은 구순구개열의 발병원인을 밝히고 소인을 진단하는데 있어 매우 중요하다. 지금까지 국제적으로 밝혀진 TGF-B3 유전자의 뉴클레오티드 상의 돌연변이를 포함하는 변이양상은 데이터베이스화되어 인터넷상에서 접근 가능하다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

TGF-B3 유전자의 돌연변이 유무를 분석하는 것은 구순구개열 발병 위험성을 조기에 진단함으로써, 좀 더 적극적인 예방 프로그램을 수행하여 발병 위험성을 최소화 할 수 있는 장점이 있다. 그러나 TGF-B3의 돌연변이 형태는 매우 다양하고, 전체 엑손 및 엑손/인트론 경계부위를 모두 분석하여야 하는 어려움이 있다.

따라서, 많은 수의 구순구개열 환자 샘플을 분석함으로써, TGF-B3 유전자상에 존재하는 돌연변이 형태를 파악하게 되면, 향후 샘플 분석시 모든 엑손을 분석하지 않고 돌연변이가 존재할 것으로 예상되는 TGF-B3 절편만 분석하여도 전체 엑손을 분석하는 것과 동일한 효과를 도출할 수 있게 된다. 그러므로, 많은 관련 제약 회사 및 연구기관에서는 TGF-B3 및 이와 관련된 유전자를 분석하여 유용한 단일염기다형성 및 돌연변이를 발굴하고자 하고 있으며, 이는 향후 진단마커로 활용될 수 있을 뿐 아니라, 더 나아가 DNA 칩(Chip) 개발에 필수적인 칩 컨텐츠(Chip Contents)로도 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 지금까지 밝혀지지 않았던, 한국인 구순구개열 환자의 TGF-B3 유전자의 돌연변이 및 단일염기다형성(SNP)을 발굴함으로써, 구순구개열 발병 소인을 진단하는데 이용하고자 하는바 발명의 목적을 두고 있다.

본 발명에서 돌연변이〔Mutation〕 및 다형성〔Polymorphism〕을 표현하는데 사용된 용어들의 정의는 다음과 같다.

IVS는 Intervening Sequence, 즉 인트론을 의미한다. 돌연변이의 정의에 있어 표시되는 숫자는 TGF-B3 유전자의 염기서열상에서 돌연변이가 시작된 위치를 의미하며, IVS 문자가 표시되지 않은 돌연변이의 숫자는 인트론(Intron) 염기서열을 제외한 mRNA의 염기서열상의 위치를 의미한다. 본 발명에서 염기서열상의 위치를 설명하는 숫자는 GenBank Accession AY208161(TGF-B3)상의 염기서열을 참조하여 표시하였다. GenBank Accession 번호에 따라 TGF-B3 돌연변이의 표기가 달라질 수 있다.

본 발명은 모든 정상 TGF-B3 유전자의 염기서열에 적용된다. 삽입(insertion) 돌연변이는 'ins'으로 표시하고, 결손(deletion) 돌연변이는 'del'로 표시하였다. 'ins'과 'del' 다음의 문자는 실제 삽입 또는 결손된 뉴클레오티드(nucleotide)들을 의미한다. 뉴클레오티드가 치환(substitute)된 돌연변이를 표시할 때 기호 ')'를 사용하였는데, ')'앞의 문자는 정상 TGF-B3 유전자의 뉴클레오티드이며, ')' 뒤의 문자는 돌연변이 TGF-B3 유전자의 뉴클레오티드이다. 그리고, ')' 뒷의 X는 ')' 앞의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되어 종결코돈(stop codon)이 생겨, 숫자 뒤의 염기서열이 코딩하는 아미노산이 결손되었음을 의미한다.

본 발명은 서열목록 제1서열의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 18141번째 염기가 G로 치환된 염기를 포함하는 20-100개의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 정상(normal) 또는 돌연변이(mutant) TGF-B3 유전자에 결합(hybridize)하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)에 관한 것이다:

(1) TGF-B3 유전자의 인트론 5상의 18141번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되어 있는 것을 검출할 수 있는, TGF-B3 유전자의 18141번째 뉴클레오티드를 포함하는 영역에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드;

상기 첫 번째 돌연변이는 TGF-B3에 나타난 IVS5+18141 A)G로서, IVS5+18141위치의 뉴클레오티드인 A가 G로 치환된 것이며, 엑손(Exon)이 아닌 엑손과 인트론(Intron) 접경 부위에 나타난 돌연변이이다. 아미노산을 코딩하는 부위가 아니므로 아미노산 서열에는 변화가 없으나, mRNA의 이차구조에 변형을 초래하거나 스플라이싱의 변화로 인한 RNA 생성차이 때문에 TGF-B3 발현양상의 변화를 초래 할 수 있다. 또한 조절 단백질의 유전자에 대한 결합 친화도에 변화가 올 수도 있다고 보인다.

본 발명은 또한 정상 또는 돌연변이 TGF-B3 유전자에 결합하는 하기 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다:

본 발명에 따르면, 상기 돌연변이의 TGF-B3 유전자에 포함하고 있는 사람은 구순구개열의 발생가능성이 높은 것으로 나타났다.

그러한 돌연변이 여부의 확인하기 위해서는, 예를 들어, 혈액과 같은 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide)를 포함하고 있는 생물학적 샘플로부터 상기 TGF-B3가 상기 돌연변이들을 포함하고 있는지를 확인함으로써 실행될 수 있다. TGF-B3 유전자를 증폭하기 위하여, 예를 들어, 엑손의 단부나 엑손에 붙어있는 인트론의 단부에 결합(hybridize)하는 프라이머(primer)를 사용하는 PCR법(Polymerase Chain Reaction)을 사용할 수 있다. 인트론에서의 돌연변이를 검출하기 위하여, 특히 엑손에 인접한 부분의 인트론을 증폭하는 프라이머를 사용할 수도 있다.

한편, PCR법 등에 의해 증폭된 유전자에서 돌연변이를 검색할 수 있는 분자생물학 기법은 많은데, 그 중 가장 대표적인 것이 형질특이적 올리고뉴클레오티드(ASO: Allele Specific Oligonucleotide)를 이용하는 방법이다. ASO는 돌연변이 및 그 주변 염기서열을 포함하거나 또는 이에 상보적인 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드로서, 인간 게놈 DNA에 특이적으로 결합시켜 그 결합 양상을 분석함으로써, 알려진 돌연변이 유무를 탐지해낼 수 있다. 이러한 ASO는 보통 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성되어 있고, 방사선 표지(radio label), 형광 표지(fluorescent label), 효소 표지(enzymatic label), 시퀀스 택(sequence tag), 바이오틴(biotin), 기타 리간드 등과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 표지 될 수 있다.

따라서, 본 발명은 하나의 예로서 본 명세서상의 서열목록 제3서열 및 서열목록 제2서열로 구성된 군에서 선택된 형질특이적 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

서열목록 제3서열과 서열목록 제2서열은 TGF-B3 유전자의 18141 A)G 돌연변이를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 형질특이적 올리고뉴클레오티드로서, 전자는 정상인 서열에 우선적으로 결합하는 서열로서 대조 서열(control)이고, 후자는 상기 돌연변이 서열에 우선적으로 결합한다.

상기 형질특이적 뉴클레오티드는 구순구개열의 위험성이 높은 사람을 진단하는데 유용하다. 이들 형질특이적 올리고뉴클레오티드는 상기 특정 돌연변이 유전자를 포함하는 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합한다.
한편, 표 1에 기재된 서열목록 제4서열과 서열목록 제5서열은 TGF-B3 유전자의 증폭에 이용되는 역방향 프라이머이다.

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또한, 본 발명은 또 다른 예로서 본 명세서상의 서열목록 제3서열과 서열목록 제2서열로 구성된 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer)를 제공한다. 이들 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 타겟 폴리뉴클레오티드의 증폭에 유용하며, 그로부터 얻어진 서열 정보로부터 상기 돌연변이의 확인을 위한 상기 탐침(probe)들이 제작될 수 있다.

서열목록 제2서열 내지 제5서열은 TGF 유전자를 증폭할 때 사용되는 전방향(forward) 프라이머와 역방향(reverse) 프라이머로서, 서열목록 제2서열은 제5서열과, 서열목록 제3서열은 제4서열과 쌍을 이룬다.

제3서열	5’ ggtccctgat actattcaca 3’	20mer
제2서열	5’ ggtccctgat gctattcaca 3’	20mer
제4서열	5’ gagcaggagattgtcactttc 3’	21mer
제5서열	5’ tgaccaagcatctccaatc 3’	19mer

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본 발명은 또한 상기와 같은 돌연변이 유전자가 배열되어 있는 DNA 칩에 관한 것으로서, 그러한 DNA 칩은, 고상 칩과, n개의 다른 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있으며,

상기 'n'은 1 이상의 정수이고, 상기 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 효과적으로 결합할 수 있게 고상 칩에 고정되어 있으며,

다른 뉴클레오티드 서열을 가진 상기 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 위치로서 상기 고상 칩에 고정되어 있어서, 상기 고상 칩상의 특정 위치가 특정한 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 독점적으로 결합하고,

상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 앞서 설명한 돌연변이 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드인 것으로 되어있다.

본 발명은 또한 앞서 설명한 돌연변이 유전자를 이용하여 사람에 있어서 구순구개열의 소인(predisposition) 또는 높은 감수성(susceptibility)을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 구순구개열의 발병 위험성을 진단하는데 있어 유용하게 사용될 수 있는 TGF-B3 유전자의 돌연변이의 존재유무를 확인하는 방법은 이하의 실시예에 상세히 설명되어있는 DHPLC를 수행한 후 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하는 기술이외에 하기와 같이 여러 가지 방법들이 있다.

(가) 엑손 및 인트론 경계부분을 포함하는 타겟 절편들을 각각 한 쌍의 프라이머로 증폭하여 DHPLC를 수행하지 않고, 바로 다이디옥시 반응을 통한 시퀀싱으로 돌연변이의 존재유무를 확인 할 수 있다. 이 경우 본 발명의 상기 돌연변이가 일어난 부위 및 이를 포함하는 염기서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 탐침을 쓰지 않고, 바로 돌연변이의 존재유무를 확인할 수 있다. 또는 TGF-B3를 클로닝하여 벡터에 삽입한후 시퀀싱을 수행 할 수도 있다. 이 경우 정상 TGF-B3 유전자의 염기서열과 시퀀싱 결과를 서로 비교하여 돌연변이의 존재유무를 알 수 있다.

(나) 또다른 방법으로서 SSCP(Single Strand Conformation Sensitive Polymorphsim)는 유전자의 절편 중 단쇄(Single Strand)를 분석하여 돌연변이 유무를 분석할 수 있다. 이는 돌연변이의 유무에 따라서 단쇄의 이중구조가 다르다는 점에 착안하여 전기영동 또는 이와 유사한 결과를 도출할 수 있는 시스템을 이용하여 진단에 이용할 수 있다.

(다) F-CSGE는 유전자 염기서열상에 존재하는 유전자변이를 검색하는데 이용되는 방법이다. 유전자 상에 돌연변이가 존재할 경우, 돌연변이 대립형질과 정상 대립형질을 이형이중가닥(heteroduplex)화시킬 수 있다. 그 결과, DNA 이중쇄(double strand)의 3차 구조모양을 서로 다르게 만듦으로써 전기영동시 이동속도의 차이가 생기는 점을 이용하여, 본 발명의 돌연변이들의 존재유무를 확인하는데 이용될 수 있다.

중합효소연쇄반응 산물은 0.2㎜ 두께의 12% 폴리아크릴아마이드 겔(99:1 ratio of acrylamide (BioRad) to 1,4bis-(acryloyl)piperazine(BAP, Fluka, Deisenhofen, Germany), 15% 포름아마이드(v/v))에서 1 X TBE 버퍼상에서 전기영동을 실시한다. 전기영동은 40℃, 2,000V에서 5시간 실시하며, 각 레인마다 한가지 종류의 다중 중합효소 연쇄반응 산물을 분석한다.(Loading Mixture의 성분 : TAMRA가 부착된 Size Standard, 0.5㎕, 이온이 제거된 포름아마이드, 0.5㎕). 데이타 분석은 진스켄 및 제노타이퍼(PE Biosystems) 소프트웨어를 이용한다.

(라) 또다른 방법으로서 프라이머 연장(Primer Extension) 분석법은 돌연변이의 유무를 확인하고자 할 때, 돌연변이가 일어날 수 있는 유전자상의 염기위치의 5' 방향에 선택적으로 결합하는 프라이머를 제작하여 부착시킨 후, 중합효소를 이용하여 프라이머를 연장시켜 돌연변이의 유무를 확인하는 방법이다.

본 발명은 또한 상기 TGF-B3 돌연변이에 기인한 구순구개열 키드(kit)에 관한 것으로서, 하나 이상의 컨테이터 수단(container means)과, 그러한 하나 이상의 컨테이너 수단을 밀폐된 공간내에 수용하도록 구획(compartment)되어 있는 캐리어 수단(carrier means)으로 구성되어 있으며, 적어도 하나의 컨테이너 수단에는 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 내포하고 있다.

이하 실시예를 참조하여 본 발명의 구체적인 내용을 설명하지만 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

(1) 게놈 DNA의 분리

구순구개열 환자 및 정상인의 게놈 DNA는 200 ㎕ EDTA-말초혈액으로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Cat. No. 13323)을 이용하여 분리하였다. 4㎍의 게놈 DNA를 추출할 수 있었다.
실험에 참가한 구순구개열 환자의 통계 자료

Sex	Male	17 11
	Female
CLP CPO		26 2
Cleft lip	Uni-Rt Uni-Lt Bilateral	1 17 8

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(2) 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 TGF-B3 유전자의 증폭

중합효소연쇄반응은 다중(multiplex) 방법으로 실행하였다. 이는 각 PCR 단위 튜브에 동일한 템플레이트(template)를 넣고, 프라이머 쌍을 한 가지가 아닌 이중(duplex) 또는 삼중(triplex) 로 조합을 만들어 수행하는 방법이다. 이는 중합효소연쇄반응에 소요되는 비용을 1/3 수준으로 절감하는 효과가 있다. TGF-B3는 엑손의 개수가 7개를 가진 유전자이다. 특히 TGF-B3의 엑손들은 엑손 한 개에 한 쌍의 프라이머로 가지고 중합효소연쇄반응을 사용할여 증폭할 수 있었다. 그 결과, TGF-B3는 총 7개의 절편으로 증폭하였으며, 표 3에 기재된 바와 같이 3개의 다중 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하였다. 각 중합효소연쇄반응 산물은 20bp의 전방향 및 역방향 프라이머(올리고뉴클레오티드) 염기서열과 최소 40bp의 5'-, 3'-flanking region을 포함하도록 디자인하였다. 다중 PCR 구성조합은 표 3에 표시한 바와 같다.

No	Multiplex	Exon
1	Duplex	1, 2
2	Duplex	3, 4
3	Triplex	5, 6, 7

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10X Taq-buffer(ul)	5
25mM MgCl2	4
Primer Mix(ul)	4
dNTPs (1mM each)	1
Taq DNA Polymerase(2.5uit/ul)	1
Genomic DNA (ug)	1
DDW(ul)	34
Total volume	50

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(3) DHPLC(D-High Performance Liquid Chromatography)

이형이중가닥(Heteroduplex) 분석법은 이형이중가닥을 생성시켜 이를 ABI377 같은 장비를 이용하여 분석하는 방법이다. 이와 유사한 방법으로 생성된 이형이중가닥을 이용하여 돌연변이를 검색할 수 있었다.

(4) Sfa N1(제한효소절단법)

돌연변이 존재 유무를 확인하기 위하여 제한효소절단법을 사용하였다. 이는 TGF-B3 유전자의 정상유전자와 돌연변이 유전자의 염기서열이 서로 다르다는 점에 착안하여, 적당한 제한효소 또는 제한효소와 동일한 결과를 도출하는 화합물을 이용하여 정상유전자는 절단되고, 돌연변이 유전자는 절단되지 않거나, 역으로 정상유전자는 절단되지 않고, 돌연변이 유전자는 절단되는 원리를 이용하는 방법이다. 도 3에 개시되어 있는 바와 같이, 돌연변이가 있는 유전자와 돌연변이가 없는 유전자는 제한효소절단법을 통해 나타난 분석결과가 상이한 양상을 보이므로, 아가로스젤 상에서의 분석결과가 다른 DNA는 (DNA sequencing machine)시퀀싱을 통해 그 변이 유무를 최종 분석할 수 있다.

(5) DNA 염기서열분석

DHPLC분석을 통해 나타난 돌연변이 및 SNP의 존재가 예상되는 중합효소연쇄반응 산물은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 다시 증폭하였으며, ABI3700 시퀀서(Sequencer)에서 POP6 겔을 이용하여 분석하였다. 그 결과 DHPLC를 통해 돌연변이가 존재하는 것으로 파악된 DNA 절편상의 구체적인 돌연변이 양상을 분석하였다.

도 2는 TGF-B3 유전자의 인트론 5를 분석한 결과를 설명하는 도면으로서, DHPLC 결과 확연한 그래프 모양의 차이를 보였으며, 시퀀싱 결과 18141번째 뉴클레오티드인 A가 G로 치환되었음을 알 수 있었다.

지금까지 한국인을 대상으로 한 구순구개열을 유발하는 유전자인TGF-B3 유전자의 염기서열상에 존재하는 돌연변이에 대한 검색은 전무한 실정이었으며, TGF-B3 전체를 시퀀싱하여 돌연변이의 유무를 검색하는 것은 많은 시간과 비용이 소요되는 단점이 있으나, 본 발명을 통해 한국인에 특이적인 돌연변이 형태를 밝힘으로써, 향후 저비용, 고효율적으로 구순구개열의 소인을 진단하는데 있어 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> The diagnosis of use in TGF-B3 gene mutant of Nonsyndromic cleft lip and palate <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23990 <212> DNA <213> Human <400> 1 catggtcctt ctgcttcttc tttaaaatac ccactttctc cccatcgcca agcggcgttt 60 ggcaatatca gatatccact ctatttattt ttacctaagg aaaaactcca gctcccttcc 120 cactcccagc tgccttgcca cccctcccag ccctctgctt gccctccacc tggcctgctg 180 ggagtcagag cccagcaaaa cctgtttaga cacatggaca agaatcccag cgctacaagg 240 cacacagtcc gcttcttcgt cctcagggtt gccagcgctt cctggaagtc ctgaagctct 300 cgcagtgcag tgagttcatg caccttcttg ccaagcctca gtctttggga tctggggagg 360 ccgcctggtt ttcctccctc cttctgcacg tctgctgggg tctcttcctc tccaggcctt 420 gccgtccccc tggcctctct tcccagctca cacatgaaga tgcacttgca aagggctctg 480 gtggtcctgg ccctgctgaa ctttgccacg gtcagcctct ctctgtccac ttgcaccacc 540 ttggacttcg gccacatcaa gaagaagagg gtggaagcca ttaggggaca gatcttgagc 600 aagctcaggc tcaccagccc ccctgagcca acggtgatga cccacgtccc 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ttctgggtcg cagagtgggt tggagtccac 13260 aagggccgct ggggacccag gtctcatacc cttgtgctat tgctcatata gtctgcagca 13320 cctagctagg cagggccagg cctcccctag taggctgggg agggagcctc tcagcatcat 13380 ggctcaggaa aggtgggaca ctgggaaaca accatcttgc atgttggtga atgtgtgggc 13440 atcttccttg gtggtctctg ttgccccctc tttacccctc cttgtctcta acaagagttt 13500 gggatctggc atcaagctgt cagtgcttga atcctggcac tactatccac tggttggata 13560 tcttgggcaa gctgtttaat ctccctaagc ctcagtgttc ttatctgtac aatgggggat 13620 aatagttctt gctctatggg attattatag agatagaata agttagtgat tgttgtcatc 13680 atctctaagt cctctatctg gatacagcct gttggccaag ccaggccacc ctcttgtgct 13740 tacatcctgg accctcactc tccccaacac agctgtctgc accttgactt tctaactcac 13800 agaatcatgg aactcactca ctccaggtct cttccagcct gccttgaacc agcttgacca 13860 ggaggtacac tgtgttgtta ggtagcccat ttcagctact ttggctcctc cttccagctg 13920 ccttaaccca gggagagggc aatcctcata cctccctctc cattcacttc tcctccagct 13980 gggtctcagc tgccttgttt tattggtctg ccttccctca ctgagcgaac ctgctggaac 14040 agagatcttc aagctcagca ggcgcagtgt gcctcagagg ttgccctgac ttagggtaga 14100 gcagatctgg ttaggctctg gagtttatgg aagaaaggag ctgggtttta accagtagga 14160 ctgggatgtc caagccaacc taatgttgat gggaatctcc agtcttgtag gcttgtatcc 14220 ttctgtctat gagaaggttg ctgggccagg ttggactttt tggggtttgc cctgatggca 14280 caatttcagg aagactccag gttgtctcca aggccagatg ctcacacaca tggtgtgtgg 14340 cctcagggag cagcaaatca atcaactcat cgagaggctg accctgaatc cagagaggtc 14400 catcccccat gacctctcct acacctggcc acaactggct gctatcccag gatcaacaga 14460 gcttcccaaa ttaagtctta cccaccagaa ttgacatgat accagatcct acctggtttt 14520 ctgtgtaaaa ctacttgtct cagtgcagac ttttcatttt ctttcttttt ccttcacttc 14580 actcaacctc atttactgag ttcctgcttc cttgattttg gttgccaaaa catgtgatcc 14640 cacaactact aggcgaatgg gctggagttg cccttcacgc accagaatgt caggcaccaa 14700 accctggcac ctccaggctt catcatgctc actgtctccg tgctcaagtc atctggaccc 14760 tcagccatag ttctctatca tctcctctgt gctgttttct aagttcacaa ctgtcttccc 14820 aagctgttca tcttggtgag caatccacat tccaacttcc catcatggtg aacaaggatt 14880 cccaaagaag aaatgtccaa gtaattttta cctcgttgtg tccttgttcc ttaggaaaaa 14940 tatggcccag tgtaaccgtg atcttcatct tatctcttct agaatctgcc actttgtcta 15000 ggcccacagt catggccctg gtagaaatgc ttgcatcttc cactgagacg gattctgctt 15060 cctgtttgca agtgaccttg cctctagcat tggttcctga cttgaatctt tttgccagca 15120 ttacatcctg tggctttttg aatttgtggc cttttgaatc acagtctctg tgctcggaga 15180 ctctttagtt actccctgtc cgtagtctct tccagtccct ctgcctcttg ccctgatcct 15240 tctgcagtag attggctcaa cgatcccctc tcccaaaaac catgtagatg gcatgagttt 15300 ttgctttcct tactgtatct gtgtactttt gcctccaagt aggtaggtga caattttctc 15360 ttaataccat cctttcaaag ggaatgatta ttccacttct gtttcatgat ggccactagt 15420 gtatgccccc atttggtgat tcataataca acaggaatac ctggaatgtg gcaacgtgcg 15480 cttgaaggtc cactctgagc tctggaggca ctttctgtct cctgtgaccc tcaatagaac 15540 tcagttccta tgagtccctg taggagcaga ggccctggct cacccttgca tgggtggtgg 15600 gcacacttcc ccatcacaca gaggtgcttt tctcactaat tctgtcttat tttgcagagt 15660 ccaacttagg tctagaaatc agcattcact gtccatgtca cacctttcag cccaatggag 15720 atatcctgga aaacattcac gaggtgatgg aaatcaaatt caaaggtaac aaaatgaatg 15780 tgtatggtag gatgggtgag tgggggggaa gttaatggga caggatagtg caggagaccc 15840 ttaccagacc tcaagaaaag aaaccaagct ccttcagaga gatagccgac tattttgtac 15900 ttgagtaatt ctgctttgcc ccaaaagcaa tgagtgtaac tttcagttta tagcttagag 15960 aatgcattag cctctggaag acaacacgta ctggtaagtg gtgaaactgt gtaggcaagc 16020 cgtctagcct ctggtcctag tgaaatggga tgagagttcc tctttcacag tgttgtcagg 16080 caattaaatg agataatgaa taaggaacac agtgccagaa atgctcaaca gataggactt 16140 gtcttcctcc tccctaaaag aaattaagtt tggctgtcct gaacatgagt gcccagacaa 16200 ctgagctttc cagatgtgca gggcctacct gaccttgccc aggggtcctc tgggtttgga 16260 tgattgcttc gagcctcagg gtgtttgtcc ccggggtgtt tgggtagaga tggcgaagtc 16320 gttgagagtc atttctggtt ttccattatg tttgcaagga actcagcctt gatgatctct 16380 ggagttcagg gaagttctct tttcctttca tattcccatt ttgggtaact gcggaacgcc 16440 tgaggtcaga ggcttgtctg ggaaaaggtg caggcctctt ttggctcagc gctggacagt 16500 gatcttaccc cacatgggct ctattttaca gccttttctt aaagccaaag atttgacact 16560 gtaaccacag aaccttagag cccagaggac ctttggagtc cttacctaca ggccagctta 16620 ggatgaaacc ttcccatttc agtgaatact tatcttgttc ataaagattt tcagaaaaag 16680 ggatttgtga tccaggtctc tcatttatct tacagatctg gtgccccttc ctgagacccg 16740 agccactcct gtagctatgt aaattaattc ctcatgttcc tgtcctcagt gaggatggac 16800 aacagttggc agctgtcctt cgcaaaatcg atctccattt agttgagact ctttctaagt 16860 cagtctccag tcttttcctt ttttttcaga tgaaacgggt tgatgaattt agattttctt 16920 tccagagctt atttgctatt tatcatatgc ttcattatct catctgaatt ttatagtgaa 16980 aacacttcaa agactctaag tgcaatgtga atgttaacaa ttatacagtc ttgtttcttt 17040 ggctcccatt caggctatct taagttgtga caccttaaat ttttggtagg acttctgcgt 17100 tatcttggtc cattcacatt ttaagaggaa actcacaccc caagattcta agtctagaat 17160 ctaaagtgac aatccagggc tgggtgcagt ggctcacacc tgtaatctta gcactctggg 17220 aggccgaggt gggcggatca cttgaggtca ggagttcgag accagcctgg ccaacatggt 17280 gaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaaa tagctgggca tggtggcatg cacctgtaat 17340 cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atctcttgaa ccccggaggc agaggttgca 17400 gtgagccaag atggggccac tgcactccag cctggccaac agagcgagac tctgtctcaa 17460 aacaaacaaa caaacaaata aacaagccga caacccggag atatgtgtta ggtacccact 17520 tagtaacagg gatgcttcat aggtccatga agattcctag gaatctcagc aagggctttc 17580 tgccccttgg aagatttcta tacaagggta tggggatctg aacacggggc atctttcagt 17640 gggcatcctt acaataataa tgagttcttt tgatactggc ttctccatct gctcttcccc 17700 tttctgcacc tggacatcag aattaagctg cacttgtccc ccacacctcc ctcgcagact 17760 gcactgcccc tcctcctggg cagtgatggg gcgtgtggag gaggcagcct ccaagggctc 17820 tgctctcttc agacaggaga ttgtcacttt ccttcccttc ttcaggcgtg gacaatgagg 17880 atgaccatgg ccgtggagat ctggggcgcc tcaagaagca gaaggatcac cacaaccctc 17940 atctaatcct catgatgatt cccccacacc ggctcgacaa cccgggccag gggggtcaga 18000 ggaagaagcg ggctttggac accaattact gcttccggtg agactgggcc cacatgggaa 18060 ccaacatcta ctgcctgcct actgcccaat ggctaggtca ggccccagag ccaagccaca 18120 ctcaacagag ggtccctgat actattcaca aacatctcca ggaagaagac tgaaaatctc 18180 tcacagagat tttctctgtg aaatctcttt ctgttttcct gggagtccca ctgtttttcc 18240 ataggctaac tctggaagga gctggctgaa gtaaatgagg aaaactctgt gaggaggagt 18300 gttgctaaaa tagtttggat tggagatgct tggtcaaagc ctctccatga tttccatgtt 18360 ttaagcactt gtagagtgta tgtgtgagat taatgtagga gtttccatta aagaagtgct 18420 cagttagttc cctatgaagg gtccaaggat gctactggat ggaggcaaat agaatggtct 18480 ccatttgaac ggaaagttgg agctagagaa attaacaaat gaattcagaa attactgggt 18540 agccacaata gagagataga aaagacccag cttctcttac tcaggagcag tttcactgct 18600 catttataaa gggaggataa agtatgcatg ccaactacta aaagggagaa gatgatcacc 18660 cccatgagag ggtccgaagg attaagtgct ttaactggga gcaatgagtt cacctatgga 18720 cacaggaaag gcttcagaag ggtgtggaat ttgagcagag gcttcaagga tgaggtttgg 18780 ggatgaaggg atccaggagg ggaagcactg caggtaaagg aaggagcatg agtgagtgag 18840 tccatctggc ctcagaggat gccgaaatga agctggggag aacgaattgg gaaatattta 18900 gatctggaaa ccatgtctta tgaggatggt tgggcttggg aaactaggga tgttcagttg 18960 ggggaacagc tcaacagcaa ggtataggag aggcaaggta gttgccacaa aggctggcat 19020 gtagatttat ttattccatc agttaggaac aaatcagtta ggaacgaatc agttatcagt 19080 taggaacgaa tcagttagga acgaatgatc ttggccagtg actttaatca tagtgatttc 19140 ttgttcacaa gaggcctgta gcagcagggt tagggtgggc tggctgctta atgatgccac 19200 cgaagactca ggctttctct ctttccagtc tgccatgctt agtatgttgg cttttcatcc 19260 ttttccttat ggtcacaagt gattgctagg gcttcaggca ccttgtccac atttaagaca 19320 agaaggaatg agggaagggg aagagccaga agctttcttc ttccatctgt cacttttata 19380 aataatcgaa tatctttgcc agaacttgcc cttaccccct gcatacttct ccttgtctga 19440 tgggtcatta ctgggtcaca tgaccaccgc tactctcaag ggaggacagg aaaaggagca 19500 tctggtgttt tcgactctgt aatgggatgt cacaagggag aagggagtta ggaatggtta 19560 ttgaatagat aaccaatggt gtctgccatg gttcaccctt ggaacccaca agaagccaga 19620 ttttggctaa tagctgcctt tggaagtagc aagttctaag tctcagcaga tattaaagca 19680 gaggctagct gtccacttgg caagcggtat tattgccaaa tgatctctgt aggcaacaga 19740 attgaagggg cctgataatc acatttgggt gatctgttga accacggttc taatagaagg 19800 atatgcctta tttggctaaa tggcctttgg attgagtctc agcagtcacc tactatagta 19860 gtcaagctgc ataaacttag aattgatttc tgtctgggtg cacattagga gggtataaat 19920 aaaaccaacc tcaacaaagc tgagttggct aataacattc agtgcttggt tttatgtgga 19980 gcgcttcata gcactgcttt gtattgtgat agaaaagggt gcagggccac ctttgcctct 20040 ttactcttcc tcatgcagca tttatctctg tttcttacat ccttgggatc ctggtcttta 20100 acacatgaat gtgcctttct ggtttcttct gccccatgcc cttgaacctg ggattccatt 20160 gatcagagcc acctatgatg gcatgaaagg actccaaggg agaatatgag agcattcatg 20220 aagtttcttt tattggtggt tttaagttga ttttctataa atgttttttg ttgtagcaac 20280 ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc tacattgact tccgacagga tctgggctgg 20340 aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac 20400 ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg gtatggagca ggctcatgcc atctgaggca 20460 ctggggctga ccgaccagac cacttgttaa aaagaatgag tgaaggattg aatgttgagt 20520 gagcaaatga tggtctgggg tgagtaaaat tcctctggtg aaggttctga tcttggcacc 20580 ctgactcagt tctactcagt cacattctgc ccttttaaat tcctaccata gtttcaacca 20640 gctttttaat ttgctttgtc caaagctctc tgtaccgtag aaattaatta actgccacgt 20700 gttaccctat gtcagagata tgtgcatgtg gctggcaagg aacactgaag tagaaaggct 20760 tctatcagaa ctctgatcat tccagcctct cgaatgtaga aaacttactc tgaaagacaa 20820 caacaaggat ggacaagaag ctaatttgaa atgctaggaa cagaaagtga gatagccgag 20880 agtccacaac ccctgaaact agtctgtctt tcccttgagg ggaatcaaaa atagggcagt 20940 aatttgtgaa gcatgtttcc ttctagctca ttatttctgc atcctgtctg gggccctgca 21000 cgctgcactt actaaatggc tcaaggcaat gttttgtgag aacatttctc accgaagtga 21060 tcagttccag ctaggaagag caatgtaagt gttttcttaa aagccaagat aggccgggca 21120 cggtggctca cgcctgtaat cccagcactc tgggaggcca aggcgggtgg atcacaaggt 21180 caggagttcg agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct gtctctacca aaaatgtaaa 21240 aaattagccg ggtgtggtgg cacgcgcttg taatcccagc tacttgggag gctgaggcag 21300 gagaatcgct tgaacccagg aggcggaagt tgcagtgagc caagattgca ccactgcact 21360 tcagcctggg tgaaagagtg agactctgac tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 21420 agccaagata attcgttatc agtgtagtaa ctgtcatatg cttcaactca tcaccccaaa 21480 caagtgcagt tgttctgctt ctgtcattgt ggatgaacag caactacaca actactcact 21540 cacccaaacc aggttccaac agtttttttt tttttctttt ttttgagaca gactcactct 21600 gtggctcagg ctggagtgcg gtggcactat ttctgcttac tgcaacctct gcttcctgga 21660 ttcaggtgat cctcccacct cagcctccca agtagctggg attacaggcg cctgccacca 21720 cagccagcta atttttttgt atttttagta gagatggggt ttcaccatgc tggccaggct 21780 ggtctcaaac tcctgacctg aagtgatctg cctgcctctg cctcccaagt cctgggacta 21840 cagctgtgag ccactgcacc cggcccccaa cagttcctct taaagagcac ccgtggccat 21900 tctagcactt gctcagcttc tgggactgcc cctggaactg ggcgacttcc tgggttccag 21960 gcctgagact tggccttcca acctctcact gacatgtccc ttcccaggtg ctgggactgt 22020 acaacactct gaaccctgaa gcatctgcct cgccttgctg cgtgccccag gacctggagc 22080 ccctgaccat cctgtactat gttgggagga cccccaaagt ggagcagctc tccaacatgg 22140 tggtgaagtc ttgtaaatgt agctgagacc ccacgtgcga cagagagagg ggagagagaa 22200 ccaccactgc ctgactgccc gctcctcggg aaacacacaa gcaacaaacc tcactgagag 22260 gcctggagcc cacaaccttc ggctccgggc aaatggctga gatggaggtt tccttttgga 22320 acatttcttt cttgctggct ctgagaatca cggtggtaaa gaaagtgtgg gtttggttag 22380 aggaaggctg aactcttcag aacacacaga ctttctgtga cgcagacaga ggggatgggg 22440 atagaggaaa gggatggtaa gttgagatgt tgtgtggcaa tgggatttgg gctaccctaa 22500 agggagaagg aagggcagag aatggctggg tcagggccag actggaagac acttcagatc 22560 tgaggttgga tttgctcatt gctgtaccac atctgctcta gggaatctgg attatgttat 22620 acaaggcaag catttttttt ttttttttaa agacaggtta cgaagacaaa gtcccagaat 22680 tgtatctcat actgtctggg attaagggca aatctattac ttttgcaaac tgtcctctac 22740 atcaattaac atcgtgggtc actacaggga gaaaatccag gtcatgcagt tcctggccca 22800 tcaactgtat tgggcctttt ggatatgctg aacgcagaag aaagggtgga aatcaaccct 22860 ctcctgtctg ccctctgggt ccctcctctc acctctccct cgatcatatt tccccttgga 22920 cacttggtta gacgccttcc aggtcaggat gcacatttct ggattgtggt tccatgcagc 22980 cttggggcat tatgggttct tcccccactt cccctccaag accctgtgtt catttggtgt 23040 tcctggaagc aggtgctaca acatgtgagg cattcgggga agctgcacat gtgccacaca 23100 gtgacttggc cccagacgca tagactgagg tataaagaca agtatgaata ttactctcaa 23160 aatctttgta taaataaata tttttggggc atcctggatg atttcatctt ctggaatatt 23220 gtttctagaa cagtaaaagc cttattctaa ggtgtatgtc tgactcgata aatatccttc 23280 aattaccctt aattccatgt ccgcatctac taatcagagg taaccagaat ctggggcaga 23340 gaatctgtca atcaccaaac acattgctta gcgcaactcc ccttacacag ggggcacacc 23400 gtgctgactt ccgcctgcta agaagactgc actattgctt gtgcgtcttt ccttcttgca 23460 gagtatatta ttctcagaga cacagaggca gtggctcaga ttggcagaaa gcacatacga 23520 atttgacctc cagatacctg tgggcaggat cccctggtgt gaatccttgc atatggaaac 23580 atggtttatt tactaactat aaattaccaa catcactgtt ttcgaaaatc tccccccacc 23640 cgtatcagtt gagaatgaga gaaaatgtgt atggcaaatg gcctaaaaat atgaggctaa 23700 ttctgttctc aggctaagcc taaaagagct aaccaggaac cccttttcag attgtggccc 23760 tcttgtcagg gatctgggaa ccatagctct cttttgagtg aggccgtgga tcccactgtg 23820 gtatggacat ccacgtgggg cagccgtcca cagtgagcgg gcacagagcg acaggccatc 23880 tagcagctcc tgagaaacac attcttctag tgagatcact ttgcctctag taaaagaaaa 23940 gtctatctga agctaaagta tgcaggctga aggatgtgtc tgatgtgttc 23990 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for human transforming growth factor-beta 3 gene <400> 2 ggtccctgat gctattcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 3 ggtccctgat actattcaca 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 4 gagcaggaga ttgtcacttt c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 tgaccaagca tctccaatc 19

Claims (9)

1. 서열목록 제1서열에 기재된 TGF-B3 (transforming growth factor-beta 3) 유전자의 18141번째 뉴클레오티드가 A가 G로 치환된 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열목록 제2서열에 기재된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사선 표지(radiolabel), 형광 표지(fluorescent label), 효소 표지(enzymatic label), 시퀀스 택(sequence tag) 또는 바이오틴(biotin)에 의해 표지된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
6. 고상 칩과 n개의 다른 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 상기 n은 1 이상의 정수이고 상기 올리고뉴클레오티드는 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 효과적으로 결합할 수 있게 고상 칩에 고정되어 있으며, 다른 뉴클레오티드 서열을 가진 상기 올리고뉴클레오티드는 서로 다른 위치로서 상기 고상 칩에 고정되어 있는 DNA 칩에 있어서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 서열목록 제2서열에 기재된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
7. 삭제
8. 하나 이상의 컨테이터 수단(container means), 상기 하나 이상의 컨테이너 수단을 밀폐된 공간 내에 수용하도록 구획(compartment)되어 있는 캐리어 수단 (carrier means)으로 구성되어 있으며, 적어도 하나의 컨테이너 수단에는 서열목록 제2서열에 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 구순구개열 진단용 키트(kit).
9. 서열목록 제1서열의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에서, 18141번째 염기가 G로 치환된 염기를 포함하는 20-100개의 연속 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.

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