CN103589785A - Notch3和jag2基因snp位点的用途 - Google Patents

Notch3和jag2基因snp位点的用途 Download PDF

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谢小冬
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NOTCH3和JAG2基因SNP位点的用途及其试剂盒和检查方法。NOTCH3和JAG2基因SNP位点在制备诊断类唇腭裂易感性的检测试剂盒中的用途。本发明首次发现位于NOTCH3基因SNP位点rs12082和JAG2基因上的两个SNP位点(rs741859，rs2238286)与非综合征性唇腭裂相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测非综合征性唇腭裂易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的检测试剂盒可对正常人群进行唇腭裂易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。

Description

NOTCH3和JAG2基因SNP位点的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NOTCH3和JAG2基因SNP位点的用途及相关试剂盒。 
背景技术
唇腭裂(Cleft Lip and/or Palate，CL/P)是主要的颅面发育畸形之一，代表了一类普遍的不致命的具有复杂病因和遗传异质性的出生缺陷。根据已有的数据表明，唇腭裂在全世界的发病率约为3.4-22.9/10000。在中国的发病率大约为：1.82/1000。不仅严重影响患者的面部美观，还因口、鼻腔相通，直接影响发育，经常招致患者上呼吸道感染，并能诱发中耳炎，对患者的身心健康有着严重的影响，会给那些患病儿童的家庭带来财政危机以及随之而来的社会负担，患儿可能会遇到一些在喂食，说话，听力及社会交往中的各种问题，虽经包括手术的一系列序列治疗，也很难达到完全正常的程度。国际上，唇腭裂根据是否涉及到其他明显或可认知的机构畸形常分为非综合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip and or palate，NSCL/P)和综合征性唇腭裂(syndromic cleft lip and or palate，SCL/P)。目前部分SCL/P的病因已明确，多为染色体异常或单基因病变，而NSCL/P作为一种复杂的多基因遗传病，是遗传因素和环境因素综合作用的结果。 
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指存在于某一(些)群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，并且在人群中的分布频率至少要在1％以上(Brookes AJ.Gene，1999，234(2)：177-186)，人类遗传基因的多态性在遗传信息上的本质表现，90％以上是由SNP所引起的。因为其多态信息量大，目前已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重复(STR)标志后的第三代遗传标志。 
从基础医学到临床医学的各个领域，SNP都存在巨大的应用价值。SNP的研究为基因诊断，尤其是疾病的早期诊断提供更多依据有重要意义。SNP由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的研究中起重要作用，这些复杂疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病原因复杂，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学研究的重点。目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断，例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异，即肺癌的基因易感性，研究较多的是代谢酶基因多态性，如人细胞色素P450-CYP450和髓过氧化酶MPO等。法国研究者证实，MPO基因启动子(463G/A)多态性导致该基因较低的表达，可以降低肺癌患病的危险性(ChewierI，Stucker l，Houllier AM，et al.pharmacogenetics，2003，13(2)：729-739)。日本学者发现了HER-2基因编码区的一个SNP与胃癌的发展及恶性程度有关(Kuraoka K，Matsumura S，Hamai Y，et al.Int J Cancer，2003，107(4)：593-596)。 
发明内容
本发明的目的是为早期诊断非综合征性唇腭裂易感性提供相应的解决方案。 
方案之一是：NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点在制备非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用； 
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。 
方案之一中，所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。 
方案之一中，针对非综合征性唇腭裂易感性：当所述NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型中携带A时，非综合征性唇腭裂易感性增加；当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG、GG或携带G时，非综合征性唇腭裂易感性增加。 
方案之一中，针对唇裂伴或不伴腭裂易感性：当所述NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型中携带A时，唇裂伴或不伴腭裂易感性降低；当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG或携带G时，唇裂伴或不伴腭裂易感性降低。 
方案之一中，针对单纯性腭裂易感性：当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG或携带G时，单纯性腭裂易感性降低；当所述JAG2基因SNP位点rs741859的基因型为CC或携带C时，单纯性腭裂易感性降低。 
方案之二是：NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点在制备男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用； 
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。 
方案之二中，所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。 
方案之二中，针对非综合征性唇腭裂易感性：当所述NOTCH3基因SNP位点rs12082的基因型中携带A时，非综合征性唇腭裂易感性增加；当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG或携带G时，非综合征性唇腭裂易感性增加。 
方案之二中，针对单纯性腭裂易感性：当所述JAG2基因SNP位点rs741859的基因型为CC或携带C时，单纯性腭裂易感性降低。 
方案之三是：JAG2基因SNP位点在制备女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用； 
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。 
方案之三中，所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。 
方案之三中，针对非综合征性唇腭裂易感性：当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的 基因型为GG或携带G时，非综合征性唇腭裂易感性增加；当所述JAG2基因SNP位点rs741859的基因型为TC时，非综合征性唇腭裂易感性降低。 
方案之三中，针对唇裂伴或不伴腭裂易感性：当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG或携带G时，唇裂伴或不伴腭裂易感性降低；当所述JAG2基因SNP位点rs741859的基因型为TC时，唇裂伴或不伴腭裂易感性降低。 
方案之三中，针对单纯性腭裂易感性：当所述JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG或携带G时，单纯性腭裂易感性降低；当所述JAG2基因SNP位点rs741859的基因型为TC时，单纯性腭裂易感性降低。 
方案之四是：一种非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒、一种男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒、或一种女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒，包括检测NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的物质； 
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。 
方案之四中，所述检测NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的物质为检测所述NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的引物对。 
方案之四中，试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和HRM荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和所述引物对。 
在一些实施例中，所述Taq DNA聚合酶优选为热启动PCR聚合酶，其中最优选为realstart酶。 
方案之四中，所述引物对如下： 
检测NOTCH3基因SNP位点rs12082的引物对：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示； 
检测JAG2基因SNP位点rs2238286的引物对：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示； 
检测JAG2基因SNP位点rs741859的引物对：如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。 
方案之五是：上述任一所述的试剂盒在制备非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用、或在制备男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用、或在制备女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用。 
方案之五中，所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。 
本领域技术人员可通过现有技术中任何能够检测SNP位点的技术来检测个体中上述SNP。例如，Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-RFLP或联合应用上述方法。 
本发明的优点为：本发明首次发现位于NOTCH3基因上的rs12082位点和JAG2基因上的两个SNP(rs741859，rs2238286)与非综合征性唇腭裂相关。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测非综合征性唇腭裂易感风险性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法 具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对正常人群进行非综合征性唇腭裂易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断的作用。 
附图说明
图1为NOTCH3基因rs12082位点的PCR产物电泳结果(418bp)。泳道1-5：不同样本的PCR产物；M(Marker1)：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp(Dongsheng Biotech LTD)。 
图2为NOTCH3基因rs12082位点的基因型电泳图。G/G(第3，4，6道)，G/A(第1，5道)，A/A(第2道)。M(dl2000Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp(Dongsheng Biotech LTD)。 
图3为JAG2基因rs2238286位点的PCR产物电泳结果(255bp)。不同样本的PCR产物(第1-5道)。M(Marker1)：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp(Dongsheng Biotech LTD)。 
图4为JAG2基因rs2238286位点的基因型电泳图。A/A(第3道)，A/G(第4道)，G/G(第1，2，5道)。M(Marker1)：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp(Dongsheng Biotech LTD)。 
图5为JAG2基因rs741859位点的PCR产物电泳结果(377bp)。不同样本的PCR产物(第1-5道)。M(Marker1)：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp(Dongsheng Biotech LTD)。
图6为JAG2基因rs741859位点的基因型电泳图。T/T(第5，6道)，T/C(第4道)，C/C(第1-3道)。M(dl2000Marker)：100bp，250bp，500bp，750bp(Dongsheng Biotech LTD。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 
本实施例中使用的材料和相关试剂如下： 
1、实验材料 
1.1所用仪器 
Figure BSA0000094775150000041
Figure BSA0000094775150000051
1.2所用试剂 
苯酚(phenol，pH＞7.8)；氯仿(chloroform)；异戊醇(isoamyl alcohol)；无水乙醇(absolute ethanol)；十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulphate SDS)；溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)；蛋白酶K(Merck KgaA，Germany)；Taq DNA聚合酶(北京鹏成技术发展中心)；10Mm dNTP mixture(北京鹏成技术发展中心)；琼脂糖(西班牙BIOWEST)；白细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCL(pH＝8.0)、0.1mmol/L NaCL、1mmol/L EDTA(pH＝8.0)；红细胞裂解液：10mmol/L Tris-HCL(pH＝8.0)、10mmol/L NaCL、5mmol/L MgCL2、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL(pH＝8.0)、1mmol/L EDTA(pH＝8.0)； 
Figure BSA0000094775150000052
2、所用样本 
本发明是在获得兰州大学伦理委员会的批准后进行的，并告知了所有受试对象，保证了他们的知情同意。本实验研究自2008年3月至2010年5月于兰州大学第二医院及甘肃省人民医院收集到434例NSCLP病人血样，其中唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)315例，单纯性腭裂(CPO)119例；与此同时，我们收集了457例年龄性别均匹配的，与NSCLP疾病不相关的健康个体的血样作为对照样本，其中来自于甘肃省人民医院体检中心254份和兰州大学校医院203份。 
参与实验的病例组和对照组个体均为晨起空腹抽取外周静脉血2ml，采用EDTA抗凝，-20℃冻存，病例组和对照组的性别经卡方检验，P＞0.05，(见表1)两组之间年龄比较无显著性统计学意义。 
表1被研究人群中NSCLP组与对照组的性别的比较 
Figure BSA0000094775150000061
3、实验方法 
3.1基因组DNA的提取 
方法一：传统的苯酚-氯仿方法提取 
用新鲜的EDTA或肝素钠抗凝全血充分颠倒混匀，取全血400ul转移到2ml离心管中。 
在2ml离心管中加入5～6倍体积的红细胞裂解液至满，轻轻颠倒混匀，冰浴2～3分钟(或直接放入冰箱内)可见褐白色清凉溶液，用移液枪轻轻吹打，轻柔颠倒混匀。0～4℃，12000rpm，离心10分钟。 
见管底白色沉淀，倒去上清，尽可能倒尽红细胞裂解液，可用滤纸吸管口 
重复操作步骤2-3。 
加入白细胞裂解液STE0.8ml，用移液枪轻轻冲打(打均匀，一定不能有团粒) 
加入蛋白酶K5ul(20mg/ml)至管底，轻轻吹打均匀，不能有团粒，让蛋白酶K均匀混合充分消化。 
加入10％的SDS溶液30ul，终浓度为0.5％～1.0％，之后稍加吹打。 
管口加盖，37℃水浴过夜。 
加入等体积(1ml)的饱和酚，颠倒混匀5分钟。 
0～4℃，12000rpm，离心10分钟，转移上清至新管中，弃下层。 
重复步骤9-10.注意不要将中间蛋白吸入枪尖。 
新转移液应等于1ml，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒混匀5分钟。 
0～4℃，12000rpm，10分钟离心，转移上清至新小烧杯中，弃下层。 
加入NaAc(3M)100ul(反应体积的1/10)，摇动混匀。 
加入2.7ml冰无水乙醇(2～2.5倍反应体积)，摇动后放于冰箱中静置一会，10000rpm，0～4℃，10分钟离心。 
用移液枪小心吸取凝结的DNA团块至新离心管中，用75％的乙醇溶液清洗两遍，离心7500rpm，5分钟。小心弃去上层清液，晾干DNA。 
将DNA材料保存于100ul的TE缓冲溶液中备用。 
方法二：DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司) 
1在2ml离心管中加入1ml的灭菌去离子水和400ul全血，轻轻颠倒混匀，并放入37℃水浴锅中静置一会儿。 
2将上述离心管放入离心机中离心10分钟，转速为：12000rpm。 
3弃去上层清液，吸干，再加入1ml的灭菌去离子水，颠倒混匀，20℃水浴10分钟。 
4再次放入离心机中离心10分钟，转速为：12000rpm。 
5弃去上层清液，吸干，加入1200ul红细胞裂解液，混匀，37℃水浴一个小时。 
6水浴完毕取出并离心10分钟，转速为：12000rpm。 
7弃去上层清液，吸干，一个一个漩涡混匀。 
8加入400ul细胞核裂解液，对准离心管内团块物进行用力吹打，当吹出粘稠感即可。 
965℃水浴20分钟，看其消化情况，时间可加长，取出放置室温冷却后加入2ulRNA酶37℃水浴20分钟。消化后加入蛋白沉淀液150ul并混匀。 
10放入离心机中离心10分钟，转速为：12000rpm。 
11将上清液450ul移入新的1.5离心管中，注意不要吸入沉淀物。 
12加入500ul的异丙醇溶液，颠倒混匀，直至出现絮状DNA为止。 
13放入离心机中离心5分钟，转速为：10000rpm。 
14弃去上层清液，加入70％的乙醇500ul，混匀并弹匀。 
15再次放入离心机中离心5分钟，转速为：10000rpm。 
16弃去上层清液，吸干，加入60ulDNA溶解液，于25℃水浴过夜即可。 
3.2不同位点等位基因分型 
3.2.1、NOTCH3基因rs12082位点等位基因分型(PCR-RFLP) 
PCR引物为： 
F：5’-GACATGTTCCATAGCCTTGC-3’    (SEQ ID NO.1) 
R：5’-GAGATAGAAGTCCCACTGCC-3’    (SEQ ID NO.2) 
该引物利用Primer5进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司负责合成。PCR扩增体系为： 
Figure BSA0000094775150000071
Figure BSA0000094775150000081
PCR反应条件： 
预变性95℃4min→35个循环的变性95℃45sec，复性60℃45sec，延伸72℃45sec，→后延伸72℃7min 
PCR产物的检测：PCR产物利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)的方法进行鉴定，凝胶成像系统进行显示，最终测定rs12082位点PCR产物片段大小为418bp(见图1)。 
限制性内切酶酶切条件及体系： 
Figure BSA0000094775150000082
酶切反应后，等位基因将产生两个片段，用2.5％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)分型，凝胶成像系统进行显示并记录基因型。 
基因型：AA＝418BP 
AG＝418BP+250BP+168BP 
GG＝250BP+168BP 
3.2.2、JAG2基因rs2238286位点等位基因分型(PCR-RFLP) 
PCR引物为： 
F：5’-GTGCCTCCAAAGCTCTCTTC-3’    (SEQ ID NO.3) 
R：5’-CACCTTCCTCTCCTCCAGTG-3’    (SEQ ID NO.4) 
该引物利用Primer5进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司负责合成。 
PCR扩增体系为： 
Figure BSA0000094775150000083
PCR反应条件： 
预变性95℃4min→33个循环的变性95℃45sec，复性56℃45sec，延伸72℃45sec，→后延伸72℃7min 
PCR产物的检测： 
PCR产物利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)的方法进行鉴定，凝胶成像系统进行显示，最终测定rs2238286位点PCR产物片段大小为255bp(见图3)。 
限制性内切酶酶切条件及体系： 
Figure BSA0000094775150000091
酶切反应后，等位基因将产生两个片段，用3％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)分型，凝胶成像系统进行显示并记录基因型。 
基因型：GG＝255BP 
GA＝255BP+183BP+72BP 
AA＝183BP+72BP 
3.2.3、JAG2基因rs741859位点等位基因分型(PCR-RFLP) 
PCR引物为： 
F：5’-GATACGTATTCGTGGGTAAG-3’    (SEQ ID NO.5) 
R：5’-GGAAGCACTCTGTATATTTG-3’    (SEQ ID NO.6) 
该引物利用Primer5进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司负责合成。 
PCR扩增体系为： 
Figure BSA0000094775150000092
PCR扩增条件：预变性94℃4min→35个循环的变性94℃40sec，复性52℃40sec，延伸72℃40sec，→后延伸72℃7min 
PCR产物的检测：PCR产物利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)的方法进行鉴 定，凝胶成像系统进行显示，最终测定rs741859位点PCR产物片段大小为255bp。 
限制性内切酶酶切条件及体系： 
Figure BSA0000094775150000101
酶切反应后，等位基因将产生两个片段，用2.5％的琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)分型，凝胶成像系统进行显示并记录基因型。 
基因型：TT＝243BP+134BP 
CT＝377BP+243BP+134BP 
CC＝377BP 
3.3、酶切准确性控制措施 
每次实验均设立了阳性、阴性对照，所有标本均在盲法下测定其基因型，操作者不知道该标本的临床资料和分组情况。随机抽取10％以上的样本仍在盲法下重复检测其基因型。最后随机抽取PCR反应产物进行测序分析。测序分析由北京华大基因研究中心负责完成。测序结果用Chromas和DNA man软件进行分析核对。 
3.4、统计学分析 
利用在线Hardy-Weinberg平衡对各个位点等位基因频率实施在线检测，根据x2值确定其差异无显著性统计学差异。并运用SPSS(version17.0；SPSS Inc，Illinois，USA)计算各位点基因型频率和等位基因频率，用优势比(odds ratio，OR)及其95％置信区间(95％confidence interval，95％CI)表示各位点的基因型和等位基因频率的相对风险度分析，病例组和对照组在性别间的差异用x2检验来确定无显著性统计学意义。 
结果如下： 
1不同位点基因型和等位基因频率检测结果 
结果如表2-4所示。 
1.1NOTCH3基因rs12082位点多态性 
在非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中，rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：77.4％、20.3％和2.3％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：82.3％、16.6％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.135，OR＝1.234(0.936～1.628)，而且AA基因型在病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.191，OR＝2.202(0.760～6.380)。 
G，A等位基因频率在NSCLP病例组中分别为87.6％和12.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.6％和9.4％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.040，OR＝1.322(1.012～1.728)。 
在不同性别间进行比较发现，男性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：75.6％、21.9％和2.5％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.0％、16.9％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.120，OR＝1.311(0.930～1.849)，而同样AA基因型在男性病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.214，OR＝2.419(0.634～9.235)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为86.6％和13.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.4％和9.6％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在男性病例组和对照组之间有统计学意义，P＝0.044，OR＝1.406(1.007～1.963)。 
女性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：80.6％、17.4％和1.9％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.7％、16.2％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.740，OR＝1.084(0.675～1.739)，而同样AA基因型在女性病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.661，OR＝1.816(0.308～10.705)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为89.4％和10.6％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.8％和9.2％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在女性病例组和对照组之间无统计学意义，P＝0.526，OR＝1.158(0.735～1.825)。 
1.2JAG2基因rs2238286位点多态性 
在非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中，rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：58.8％、34.3％和6.9％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：69.4％、26.7％和3.9％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在病例组和对照组之间有较强的显著性差异，P＝0.005，OR＝1.327(1.089～1.617)，同时GG基因型在病例组和对照组之间也有显著性差异，P＝0.017，OR＝1.959(1.116～3.439)。 
A，G等位基因频率在病例组中分别为75.9％和24.1％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.7％和17.3％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在病例组和对照组之间有较强的显著性差异，P＝0.000，OR＝1.393(1.158～1.675)。 
男性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：59.1％、35.1％和5.7％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：68.4％、27.2％和4.4％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在男性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.032，OR＝1.309(1.021～1.678)，而GG基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.302，OR＝1.459(0.709～2.999)。 
A，G等位基因频率在男性病例组中分别为76.7％和23.3％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.0％和18.0％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在男性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.030，OR＝1.293(1.023～1.634)。 
女性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：58.1％、32.9％和9.0％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：70.8％、25.9％和3.2％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在女性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.072，OR＝1.349(0.973～1.870)，而GG基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.011，OR＝3.074(1.223～7.726)。 
A，G等位基因频率在女性病例组中分别为74.5％和25.5％；其在对照组中的等位基因频率分别为83.8％和16.2％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在女性病例组和对照组之间有显著的统计学意义，P＝0.003，OR＝1.572(1.164～2.121)。 
1.3JAG2基因rs741859位点多态性 
在非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中，rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：40.1％、39.9％和20.0％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：40.0％、46.4％和13.6％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.299，OR＝0.929(0.808～1.068)，而CC基因型在病例组和对照组之间差异并不显著，P＝0.048，OR＝1.317(1.000～1.734)。 
T，C等位基因频率在病例组中分别为60.0％和40.0％；其在对照组中的等位基因频率分别为63.2％和36.8％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在病例组和对照组之间没有显著性差异，P＝0.163，OR＝1.087(0.967～1.223)。 
男性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：36.9％、44.1％和19.0％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：44.5％、41.5％和14.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.188，OR＝1.127(0.943～1.347)，而CC基因型在男性病例组和对照组之间差异并不显著，P＝0.049，OR＝1.422(0.999～2.024)。 
T，C等位基因频率在男性病例组中分别为59.0％和41.0％；其在对照组中的等位基因频率分别为65.3％和34.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在男性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.031，OR＝1.181(1.015～1.375)。 
女性组中，非综合征性唇腭裂(NSCLP)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：45.8％、32.3％和21.9％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：33.5％、53.5％和13.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.001，OR＝0.672(0.526～0.859)，而CC基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.504，OR＝1.160(0.749～1.798)。 
T，C等位基因频率在女性病例组中分别为61.9％和38.1％；其在对照组中的等位基因频率分别为60.3％和39.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在女性病例组和对照组之间差异有显著的统计学意义，P＝0.027，OR＝0.958(0.793～1.158)。 
表2NSCLP病例组和对照组的基因型及等位基因频率 
*P值由Fisher确切概率法计算得出。 
Figure BSA0000094775150000141
表3NSCLP男性患者组与男性对照组的基因型频率及等位基因频率 
SNP s Genotype/allele Case N(％) Control N(％) χ2 P value OR(95％CI)
rs12082 GG 211(75.6) 223(82.0)   1.000  
  GA 61(21.9) 46(16.9) 2.418 0.120 1.311(0.930～1.849)
  AA 7(2.5) 3(1.1) 1.788 0.214* 2.419(0.634～9.235)
  G 483(86.6) 492(90.4)   1.000  
  A 75(13.4) 52(9.6) 4.071 0.044 1.406(1.007～1.963)
[0193] 
rs2238286 AA 165(59.1) 186(68.4)   1.000  
  AG 998(35.1) 74(27.2) 4.588 0.032 1.309(1.021～1.678)
  GG 116(5.7) 12(4.4) 1.067 0.302 1.459(0.709～2.999)
  A 4428(76.7) 446(82.0)   1.000  
  G 1130(23.3) 98(18.0) 4.685 0.030 1.293(1.023～1.634)
rs741859 TT 103(36.9) 121(44.5)   1.000  
  TC 123(44.1) 113(41.5) 1.732 0.188 1.127(0.943～1.347)
  CC 553(19.0) 38(14.0) 3.891 0.049 1.422(0.999～2.024)
  T 329(59.0) 355(65.3)   1.000  
  C 229(41.0) 189(34.7) 4.639 0.0.031 1.181(1.015～1.375)
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表4NSCLP女性患者组与女性对照组的基因型频率及等位基因频率 
SNP s Genotype/allele Case N(％) Control N(％) χ2 P value OR(95％CI)
rs12082 GG 125(80.6) 153(82.7)   1.000  
  GA 227(17.4) 30(16.2) 0.110 0.740 1.084(0.675～1.739)
  AA 3(1.9) 2(1.1) 0.448 0.661* 1.816(0.308～10.705)
  G 277(89.4) 336(90.8)   1.000  
  A 33(10.6) 34(9.2) 0.403 0.526 1.158(0.735～1.825)
rs2238286 AA 90(58.1) 131(70.8)   1.000  
  AG 51(32.9) 48(25.9) 3.230 0.072 1.349(0.973～1.870)
  GG 14(9.0) 6(3.2) 6.408 0.011 3.074(1.223～7.726)
  A 231(74.5) 310(83.8)   1.000  
  G 79(25.5) 60(16.2) 8.908 0.003 1.572(1.164～2.121)
rs741859 TT 71(45.8) 62(33.5)   1.000  
  TC 50(32.3) 99(53.5) 11.276 0.001 0.672(0.526～0.859)
  CC 34(21.9) 24(13.0) 0.448 0.504 1.160(0.749～1.798)
[0197] 
  T 192(61.9) 223(60.3)   1.000  
  C 118(38.1) 147(39.7) 0.197 0.027 0.958(0.793～1.158)
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
2、不同位点多态性在不同病例分型中的分布情况 
2.1、不同位点基因型在CL/P患者中的分布 
结果如表5-7所示。 
2.1.1NOTCH3基因rs12082位点多态性 
在唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中，rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：76.8％、21.0％和2.2％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：82.3％、16.6％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.109，OR＝1.274(0.948～1.714)，而且AA基因型在病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.234，OR＝2.142(0.688～6.674)。 
G，A等位基因频率在病例组中分别为87.3％和12.7％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.6％和9.4％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.040，OR＝1.350(1.013～1.798)。 
在不同性别间进行比较发现，男性组中，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：75.5％、22.2％和2.3％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.0％、16.9％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.122，OR＝1.330(0.926～1.911)，而同样AA基因型在男性病例组和对照组之间也无显著性差异，，P＝0.294，OR＝2.242(0.543～9.251)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为86.6％和13.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.4％和9.6％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在男性病例组和对照组之间无统计学意义，P＝0.058，OR＝1.405(0.987～1.998)。 
女性组中，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：79.8％、18.2％和2.0％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.7％、16.2％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.648，OR＝1.132(0.666～1.923)，而同样AA基因型在女性病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.609，OR＝1.914(0.275～13.336)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为88.9％和11.1％；其在对照组中的等位基因频 率分别为90.8％和9.2％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在女性病例组和对照组之间无统计学意义，P＝0.464，OR＝1.209(0.728～2.009)。 
2.1.2JAG2基因rs2238286位点多态性 
在唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中，rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：59.0％、34.6％和6.3％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：69.4％、26.7％和3.9％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在病例组和对照组之间有较强的显著性差异，P＝0.009，OR＝1.330(1.076～1.644)，而GG基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.055，OR＝1.807(0.979～3.334)。 
A，G等位基因频率在病例组中分别为76.3％和23.7％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.7％和17.3％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在病例组和对照组之间有较强的显著性差异，P＝0.002，OR＝1.368(1.121～1.670)。 
男性组中，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：60.2％、34.3％和5.5％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：68.4％、27.2％和4.4％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.073，OR＝1.275(0.978～1.661)，而GG基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.396，OR＝1.394(0.645～3.013)。 
A，G等位基因频率在男性病例组中分别为77.3％和22.7％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.0％和18.0％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.070，OR＝1.259(0.981～1.617)。(如表6所示) 
女性组中，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：56.6％、35.3％和8.1％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：70.8％、25.9％和3.2％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在女性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.050，OR＝1.434(1.006～2.046)，而GG基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.035，OR＝2.854(1.033～7.884)。 
A，G等位基因频率在女性病例组中分别为74.2％和25.8％；其在对照组中的等位基因频率分别为83.8％和16.2％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在女性病例组和对照组之间有显著的统计学意义，P＝0.006，OR＝1.588(1.141～2.212)。 
2.1.3JAG2基因rs741859位点多态性 
在唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中，rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：41.9％、40.0％和18.1％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：40.0％、46.4％和13.6％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.227，OR＝0.910(0.779～1.062)，而CC基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.261，OR＝1.192(0.878～1.618)。 
T，C等位基因频率在病例组中分别为61.9％和38.1％；其在对照组中的等位基因频率分别为63.2％和36.8％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在病例组和对照组之间没有显著性差异，P＝0.594，OR＝1.036(0.909～1.181)。 
男性组中，在唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：39.4％、43.5％和17.1％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：44.5％、41.5％和14.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.395，OR＝1.087(0.897～1.318)，而CC基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.227，OR＝1.269(0.862～1.867)。 
T，C等位基因频率在男性病例组中分别为61.1％和38.9％；其在对照组中的等位基因频率分别为65.3％和34.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.182，OR＝1.119(0.949～1.320)。 
女性组中，在唇裂伴或不伴腭裂(CL/P)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：47.5％、32.3％和20.2％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：33.5％、53.5％和13.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.002，OR＝0.659(0.491～0.884)，而CC基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.792，OR＝1.070(0.649～1.764)。 
T，C等位基因频率在女性病例组中分别为63.6％和36.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为60.3％和39.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在女性病例组和对照组之间差异无显著的统计学意义，P＝0.432，OR＝0.915(0.732～1.144)。 
2.2不同位点基因型在CPO患者中的分布 
结果如8-10所示。 
2.2.1NOTCH3基因rs12082位点多态性 
在单纯性腭裂(CPO)病例组中，rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：79.0％、18.5％和2.5％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：82.3％、16.6％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.584，OR＝1.128(0.735～1.731)，而且AA基因型在病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.208，OR＝2.357(0.573～9.691)。 
G，A等位基因频率在病例组中分别为88.2％和11.8％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.6％和9.4％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.278，OR＝1.250(0.837～1.869)。 
在不同性别间进行比较发现，男性单纯性腭裂(CPO)病例组中，rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：76.2％、20.6％和3.2％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.0％、16.9％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.438，OR＝1.246(0.720～2.159)，而同样AA基因型在男性病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.224，OR＝3.013(0.517～17.564)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为86.5％和13.5％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.4％和9.6％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在男性病例组和对照组之间无统计学意义，P＝0.191，OR＝1.411(0.846～2.356)。 
女性组中，单纯性腭裂(CPO)病例组中rs12082位点GG、GA和AA基因型频率分别是：82.1％、16.1％和1.8％；相应的对照组中基因型频率分别为：82.7％、16.2％和1.1％。 
与野生型GG相比较，GA基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.996，OR＝0.998(0.505～1.973)，而同样AA基因型在女性病例组和对照组之间也无显著性差异，P＝0.550，OR＝1.649(0.153～17.784)。 
G，A等位基因频率在男性病例组中分别为90.2％和9.8％；其在对照组中的等位基因频率分别为90.8％和9.2％。 
与野生型等位基因G相比较，A等位基因在女性病例组和对照组之间无统计学意义，P＝0.840，OR＝1.069(0.560～2.039)。 
2.2.2JAG2基因rs2238286位点多态性 
在单纯性腭裂(CPO)病例组中，rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：58.0％、33.6％和8.4％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：69.4％、26.7％和3.9％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.068，OR＝1.320(0.989～1.763)，而GG基因型在病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.020，OR＝2.356 (1.132～4.904)。 
A，G等位基因频率在病例组中分别为74.8％和25.2％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.7％和17.3％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在病例组和对照组之间有较强的显著性差异，P＝0.005，OR＝1.458(1.124～1.893)。 
男性组中，单纯性腭裂(CPO)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：55.6％、38.1％和6.3％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：68.4％、27.2％和4.4％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.066，OR＝1.429(0.994～2.056)，而GG基因型在男性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.309，OR＝1.692(0.576～4.975)。 
A，G等位基因频率在男性病例组中分别为74.6％和25.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为82.0％和18.0％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.059，OR＝1.410(0.995～1.998)。 
女性组中，单纯性腭裂(CPO)病例组中rs2238286位点AA、AG和GG基因型频率分别是：60.7％、28.6％和10.7％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：70.8％、25.9％和3.2％。 
与野生型AA相比较，AG基因型在女性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.470，OR＝1.193(0.745～1.911)，而GG基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.019，OR＝3.425(1.169～10.039)。 
A，G等位基因频率在女性病例组中分别为75.0％和25.0％；其在对照组中的等位基因频率分别为83.8％和16.2％。 
与野生型等位基因A相比较，G等位基因在女性病例组和对照组之间差异有显著的统计学意义，P＝0.035，OR＝1.542(1.038～2.290)。 
2.2.3JAG2基因rs741859位点多态性 
在单纯性腭裂(CPO)病例组中，rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：35.3％、39.5％和25.2％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：40.0％、46.4％和13.6％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.883，OR＝0.984(0.792～1.222)，而CC基因型在病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.007，OR＝1.647(1.163～2.331)。 
T，C等位基因频率在病例组中分别为55.0％和45.0％；其在对照组中的等位基因频率分别为63.2％和36.8％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.021，OR＝1.223(1.038～1.441)。 
男性组中，单纯性腭裂(CPO)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：28.6％、46.0％和25.4％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：44.5％、41.5％和14.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在男性病例组和对照组之间无显著性差异，P＝0.093，OR＝1.278(0.984～1.659)，而CC基因型在男性病例组和对照组之间并有显著性差异，P＝0.006，OR＝1.969(1.253～3.093)。 
T，C等位基因频率在男性病例组中分别为51.6％和48.4％；其在对照组中的等位基因频率分别为65.3％和34.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在男性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.004，OR＝1.393(1.125～1.726)。 
女性组中，在单纯性腭裂(CPO)病例组中rs741859位点TT、TC和CC基因型频率分别是：42.9％、32.1％和25.0％；健康对照组中其相应的基因型频率分别是：33.5％、53.5％和13.0％。 
与野生型TT相比较，TC基因型在女性病例组和对照组之间有显著性差异，P＝0.030，OR＝0.697(0.481～1.009)，而CC基因型在女性病例组和对照组之间并无显著性差异，P＝0.320，OR＝1.320(0.771～2.259)。 
T，C等位基因频率在女性病例组中分别为58.9％和41.1％；其在对照组中的等位基因频率分别为60.3％和39.7％。 
与野生型等位基因T相比较，C等位基因在女性病例组和对照组之间差异无显著的统计学意义，P＝0.800，OR＝1.034(0.801～1.334) 
表5CL/P患者组与对照组的基因型及等位基因频率 
Figure BSA0000094775150000211
Figure BSA0000094775150000221
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表6CL/P男性患者组与男性对照组的基因型及等位基因频率 
SNP s Genotype/allele Case N(％) Control N(％) χ2 P value OR(95％CI)
rs12082 GG 163(75.5) 223(82.0)   1.000  
  GA 48(22.2) 46(16.9) 2.396 0.122 1.330(0.926～1.911)
  AA 5(2.3) 3(1.1) 1.317 0.294* 2.242(0.543～9.251)
  G 374(86.6) 492(90.4)   1.000  
  A 58(13.4) 52(9.6) 3.601 0.058 1.405(0.987～1.998)
rs2238286 AA 130(60.2) 186(68.4)   1.000  
  AG 74(34.3) 74(27.2) 3.212 0.073 1.275(0.978～1.661)
  GG 12(5.5) 12(4.4) 0.720 0.396 1.394(0.645～3.013)
  A 334(77.3) 446(82.0)   1.000  
  G 98(22.7) 98(18.0) 3.273 0.070 1.259(0.981～1.617)
rs741859 TT 85(39.4) 121(44.5)   1.000  
  TC 94(43.5) 113(41.5) 0.724 0.395 1.087(0.897～1.318)
  CC 37(17.1) 38(14.0) 1.458 0.227 1.269(0.862～1.867)
  T 264(61.1) 355(65.3)   1.000  
  C 168(38.9) 189(34.7) 1.784 0.182 1.119(0.949～1.320)
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表7CL/P女性患者组与女性对照组的基因型及等位基因频率 
Figure BSA0000094775150000222
Figure BSA0000094775150000231
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表8CPO患者组与对照组的基因型和等位基因频率 
SNP s Genotype/allele Case N(％) control N(％) χ2 Pvalue OR(95％CI)
rs12082 GG 94(79.0) 376(82.3)   1.000  
  GA 22(18.5) 76(16.6) 0.299 0.584 1.128(0.735～1.731)
  AA 3(2.5) 5(1.1) 1.489 0.208* 2.357(0.573～9.691)
  G 210(88.2) 828(90.6)   1.000  
  A 28(11.8) 86(9.4) 1.175 0.278 1.250(0.837～1.869)
rs2238286 AA 69(58.0) 317(69.4)   1.000  
  AG 40(33.6) 122(26.7) 3.327 0.068 1.320(0.989～1.763)
[0295] 
  GG 10(8.4) 18(3.9) 5.380 0.020 2.356(1.132～4.904)
  A 178(74.8) 756(82.7)   1.000  
  G 60(25.2) 158(17.3) 7.727 0.005 1.458(1.124～1.893)
rs741859 TT 42(35.3) 183(40.0)   1.000  
  TC 47(39.5) 212(46.4) 0.022 0.883 0.984(0.792～1.222)
  CC 30(25.2) 62(13.6) 7.231 0.007 1.647(1.163～2.331
  T 131(55.0) 578(63.2)   1.000  
  C 107(45.0) 336(36.8) 5.360 0.021 1.223(1.038～1.441)
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表9CPO男性患者组与男性对照组的基因型和等位基因频率 
Figure BSA0000094775150000241
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
表10CPO女性患者组与女性对照组的基因型和等位基因频率 
SNP s Genotype/allele Case N(％) Control N(％) χ2 Pvalue OR(95％CI)
rs12082 GG 46(82.1) 153(82.7)   1.000  
  GA 9(16.1) 30(16.2) 0.000 0.996 0.998(0.505～1.973)
  AA 1(1.8) 2(1.1) 0.173 0.550* 1.649(0.153～17.784)
  G 101(90.2) 336(90.8)   1.000  
  A 11(9.8) 34(9.2) 0.041 0.840 1.069(0.560～2.039)
rs2238286 AA 34(60.7) 131(7)   1.000  
  AG 16(28.6) 48(25.9) 0.522 0.470 1.193(0.745～1.911)
  GG 6(10.7) 6(3.2) 5.526 0.019 3.425(1.169～10.039)
  A 84(75.0) 310(83.8)   1.000  
  G 28(25.0) 60(16.2) 4.445 0.035 1.542(1.038～2.290)
rs741859 TT 24(42.9) 62(33.5)   1.000  
  TC 18(32.1) 99(53.5) 4.737 0.030 0.697(0.481～1.009)
  CC 14(25.0) 24(13.0) 0.990 0.320 1.320(0.771～2.259)
  T 66(58.9) 223(60.3)   1.000  
  C 46(41.1) 147(39.7) 0.064 0.800 1.034(0.801～1.334)
*P值由Fisher确切概率法计算所得。 
非综合征性唇腭裂(NSCLP)是一种复杂的异质性疾病，由基因和环境因素等因素引起，虽然截至到目前为止，其发病原理和致病机制尚不清楚，但是国内外已有大量研究结果表明非综合征性唇腭裂(NSCLP)的发病和一些易感基因和易感区域有关，这其中包括了一些候选基因。 
本实验研究采用了传统的限制性内切酶酶切分型的方法对所有样本进行基因分型，并随机抽取样本进行盲法直接测序。实验方法虽然传统，但都是经过严格的质量控制和验证的，这保证了结果的可靠性和准确性。当然，由于样本量有限，可能还需要更大的样本量进行验证。本实验研究发现NOTCH3和JAG2基因SNP多态性和非综合征性唇腭裂有一定的相关性。止目前为止，这是国内首次报道NOTCH3基因和JAG2基因SNP多态性与中国西北地区人群非综合征性唇腭裂的关联性的研究。该研究结果对于产前诊断和新生儿筛查都是十分有意义和价值的。 
NOTCH3、JAG2基因SNP多态性和NSCLP的相关性： 
本实验研究结果显示NOTCH3基因rs12082位点GA基因型、AA基因型和NSCLP的发病都无显著性相关，但是等位基因分析发现A等位基因与NSCLP的发病有一定的显著相关性，P＝0.040，OR＝1.322(1.012～1.728)。 
本实验研究结果发现JAG2基因rs2238286位点的AG基因型、GG基因型都与NSCLP的发病有显著相关性，P值分别是0.005，0.017，OR值分别是OR＝1.327(1.089～1.617)，OR＝1.959(1.116～3.439)，从OR值均大于1而且95％的置信区间也都大于1来看，AG基因型和GG基因型都可以增加罹患NSCLP的风险，因此可以认为G等位基因是NSCLP的易感性等位基因。 
本实验研究结果中JAG2基因rs741859位点TC基因型、CC基因型和NSCLP的发病均无显著性相关，但是值得注意的是在CC基因型中，P＝0.048，OR＝1.317(1.000～1.734)。这是一个临界相关值，需要进一步的验证。 
NOTCH3、JAG2基因SNP多态性与CL/P和CPO的相关性： 
根据临床分型NSCLP分为CL/P和CPO两组，在CL/P组中： 
NOTCH3基因rs12082位点GA基因型、AA基因型和CL/P的发病依然无显著性相关，但是等位基因分析发现A等位基因与CL/P的发病有一定的显著相关性，P＝0.040，OR＝1.350(1.013～1.798)。 
JAG2基因rs2238286位点的AG基因型和CL/P的发病有显著性相关，P＝0.009，OR＝1.330(1.076～1.644)。G等位基因和CL/P的发病有显著性相关，P＝0.002，OR＝1.368(1.121～1.670)，提示G等位基因是患CL/P的易感性等位基因。 
在CPO组中：JAG2基因rs2238286位点的GG基因型和CPO的发病有显著性相关，P＝0.020，OR＝2.356(1.132～4.904)。G等位基因和CPO的发病有显著性相关，P＝0.005，OR＝1.458(1.124～1.893)，提示G等位基因是罹患CPO的易感等位基因。 
JAG2基因rs741859位点CC基因型和CPO的发病有显著性相关，P＝0.007，OR＝1.647(1.163～2.331)。C等位基因和CPO的发病也有显著性相关，P＝0.021，OR＝1.223(1.038～1.441)。提示C等位基因可能增加CPO的发病风险。 
NOTCH3、JAG2基因SNP多态性在患者性别中的差异： 
未发现NOTCH3基因多态性在NSCLP病例男女中有显著差异，但是在CL/P组中，发现JAG2基因rs2238286位点的GG基因型和女性患者显著相关，P＝0.035，OR＝2.854(1.033～7.884)；而且JAG2基因rs741859位点TC基因型也与女性患者呈现显著相关，P＝0.002，OR＝0.659(0.491～0.884)。在CPO组中，JAG2基因rs741859位点CC基因型与男性患者呈显著性相关，P＝0.006，OR＝1.969(1.253～3.093)。这一结果可能提示，两个C等位基因同时作用时才导致了CPO的发病。 
NOTCH3、JAG2基因SNP的位置和疾病的关系： 
NOTCH3基因上的rs12082位点位于该基因的3’-UTR区，3’-UTR区可以参与调控基因的转录和翻译，影响micro RNA的稳定性，和疾病的发生也许有一定关系[105]。虽然本实验中rs12082位点多态性和非综合征性唇腭裂的相关性不是很显著，但是或许继续加大样本量或进行功能验证结果会有不同。 
JAG2基因上的rs2238286位点位于该基因的5’端附近，在本实验中表现出与非综合征性唇腭裂有显著性相关性，一方面是由于JAG2基因已被证实为非综合征性唇腭裂的候选基因，另一方面可能是因为该位点的位置，具体机制还有待验证。而JAG2基因rs741859位点则位于该基因的3’端附近，在本实验结果中，也表现出了一定的统计学意义。 
总之，本研究建立PCR-RFLP技术平台对唇腭裂患者的两个基因3个SNP位点进行了多态性检测，依据酶切条带的差异进行基因分型，并通过测序验证PCR-RFLP技术基因分型的可靠性。总共891例临床标本3个SNP位点检测应用，再次证实自主建立的PCR-RFLP技术平台能够用于临床常规化的SNP分型，而且该法具备操作简便、价格低廉、闭管无污染等优点使其成为临床科研推广潜力最大的技术之一。 
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。 
Figure ISA0000094775170000011
Figure ISA0000094775170000021

Claims (10)

1.NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点在制备非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用；
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。
2.NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点在制备男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用；
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。
3.JAG2基因SNP位点在制备女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用；
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。
5.一种非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒、一种男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒、或一种女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒，包括检测NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的物质；
所述NOTCH3基因SNP位点为rs12082；所述JAG2基因SNP位点为rs2238286和/或rs741859。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述检测NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的物质为检测所述NOTCH3基因SNP位点和/或JAG2基因SNP位点的引物对。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和HRM荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和所述引物对。
8.如权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对如下：
检测NOTCH3基因SNP位点rs12082的引物对：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
检测JAG2基因SNP位点rs2238286的引物对：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
检测JAG2基因SNP位点rs741859的引物对：如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
9.权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用、或在制备男性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用、或在制备女性非综合征性唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用。
10.如权利要9所述的应用，其特征在于：所述非综合征性唇腭裂为唇裂伴或不伴腭裂或单纯性腭裂。
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