CN102816836A

CN102816836A - 一种黄牛fbxo32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法

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Publication number: CN102816836A
Application number: CN2012101422529A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 王爱兰; 蓝贤勇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-05-09
Also published as: CN102816836B

Abstract

本发明公开了一种黄牛FBXO32(F-boxprotein 32)基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法。以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(P1、P2、P3)为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因；用限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。本发明提供的检测方法为FBXO32基因的单核苷酸多态性与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。然而随着科学的发展，很多研究表明位于基因内含子中的SNP会影响基因的转录效率从而间接的影响基因的功能，所以内含子的多态性也引起了关注。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本又较高。因此，把构建DNA池进行测序和PCR-RFLP结合在一起的方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了SSCP费用昂贵、繁琐操作、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

FBXO32蛋白是F-box蛋白家族的成员，是泛素蛋白连接酶复合体组成之一。目前，对于FBXO32基因的研究多在人类和小鼠上，主要在肌肉的代谢过程以及相关疾病发生机理等方面做了大量研究。国内外尚未见关于牛FBXO32基因遗传变异的研究。中国黄牛FBXO32基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：体斜长和日增重等性状)关联的研究仍是空白。由于FBXO32基因功能涉及日增重等生长性状，本发明提供的检测方法为FBXO32基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法检测黄牛FBXO32基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性及作为生长性状分子标记的检测方法，以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因部分片段；用限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。

所述的引物对P1为：

上游引物：5′CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3′

下游引物：5′GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3′

所述的引物对P2为：

上游引物：5′GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3′

下游引物：5′TTCCATCCACTCACATTCCCT 3′

所述的引物对P3为：

上游引物：5′CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3′

下游引物：5′AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3′

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；

34个循环：94℃变性30s，T_m(分别为66℃，58.5℃，64.7℃)退火30s，72℃延伸30s；

72℃延伸10min。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因第22830位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、110bp和21bp的三条带；GG基因型表现为长度分别为110bp和21bp的两条带。第44675位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。第53423位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。

本发明根据FBXO32基因的序列设计引物，分别以6种黄牛品种构建的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛FBXO32基因的部分序列，与NCBI公布的序列进行比较发现在第22830位、第44675位、第53423位存在单核苷酸多态性。

针对上述三处SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物进行PCR扩增，并用特定的限制性内切酶酶切PCR产物鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对6个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与南阳牛部分生长性状(体重和日增重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

附图说明

图1为黄牛FBXO32基因酶切电泳结果图，其中图1a、1b、1c、分别为黄牛FBXO32基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点PCR产物的酶切电泳结果。

图2为黄牛FBXO32基因SNP多态性测序结果图，其中图2a、2b、2c分别为黄牛FBXO32基因包含第22830位、第44675位、第53423位多态位点的测序结果图，不同颜色的曲线代表不同的碱基(蓝线表示C碱基的测序峰，红线代表T碱基的测序峰；黑线代表G碱基的测序峰；绿线代表A碱基的测序峰)。

图3为黄牛FBXO32基因部分DNA序列图，其中图3a、3b、3c分别为黄牛FBXO32基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点的DNA片段图。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法对黄牛FBXO32

基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性进行检

测和关联分析，下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明

的解释而不是限定。

a、黄牛FBXO32基因含第3外显子、第8内含子和第10内含子PCR

引物的设计

以NCBI所公布的牛序列(NC_007312.4)为参考，利用Primer 5.0

设计能够扩增分别包含黄牛FBXO32基因第3外显子、第8内含子和

第10内含子的PCR引物。

扩增第3外显子的引物为：

上游引物：5′CGACCCTCTACCGTGCGTTCC 3′

下游引物：5′GGGCTCCCTCCTCACCCTGTT 3′

扩增第8内含子的引物为：

上游引物：5′GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3′

下游引物：5′TTCCATCCACTCACATTCCCT 3′

扩增第10内含子的引物为：

上游引物：5′CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3′

下游引物：5′AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3′

以上述引物对黄牛基因组扩增，分别扩增包含黄牛FBXO32基因(NC_007312.4)第3外显子、第8内含子和第10内含子的DNA片段，对扩增的片段进行测序鉴定后发现在第3外显子存在一处SNP(NC_007312.4：22830A＞G)，在第8内含子存在一处SNP(NC_007312.4：44675T＞C)，在第10内含子存在一处SNP(NC_007312.4：53463G＞A)。

经过分析，以上第3外显子处SNP不存在天然酶切位点，因此，通过设计引物P1对该处SNP引入HaeIII酶切位点。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的FBXO32基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以7个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1黄牛样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)37℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，根据DNA的量，加入500～1000μLTE-缓冲液，保存于4℃过夜，使其完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL EppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含FBXO32基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对7黄牛品种的1345个样本的基因组DNA进行PCR扩增，分别获得1345个个体的黄牛FBXO32基因中包含SNP位点的DNA片段。

c、用限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别酶切消化PCR扩增的FBXO32基因片段

1、酶切反应消化体系(10μL)：4μLPCR产物，10×Buffer 1μL，限制性内切酶0.2μL(3U)，灭菌纯水(H₂O)4.8μL；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化～10h。

d、限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.5％/2.0％/2.0％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳70分钟/45分钟/45分钟，EB染色检测酶切结果；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

FBXO32基因第22830位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、110bp和21bp的三条带；GG基因型表现为长度分别为110bp和21bp两条带。第44675位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。第53423位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。

e、黄牛FBXO32基因SNP位点的基因和基因型频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种FBXO32基因的SNP中，等位基因频率变化幅度如表3所示。

表3黄牛FBXO32基因SNP基因频率分布表

F、黄牛FBXO32基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：g.22830位点的基因型(GG、AG和AA)、g.44675位点的基因型(CC、TC和TT)、g.53423位点的基因型(AA、AG和GG)。

生产数据：南阳牛6月、12月、18月和24月的体重、体高、体长、胸围和日增重数据。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定数据是否符合正态性和方差齐性，根据数据特性决定用单因素方差分析(ANOVA)或者非参数方法分析；根据数据特征，应用SPSS(16.0)软件分析基因型对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了简化了的固定模型：

Y_ij＝μ+G_i+e_ij，

其中：Y_ij为性状观察值，μ为总体均值，G_i为第i个单SNP标记基因型的固定效应，e_ij为随机误差。

结果表明(见表4)：在第44675位，24月龄CC基因型的个体体长、胸围、坐骨端宽和日增重均高于TT基因型和TC基因型个体且差异显著(P＜0.05)；在第53423位，24月龄AA基因型的个体体长高于GG基因型个体且差异显著(P＜0.05)。而其他位点基因型与生长性状关系差异不显著。说明第44675位的CC基因型可以作做为一个提高黄牛体长、胸围、坐骨端宽和日增重的候选分子遗传标记以及第53423位的AA基因型可以作为提高黄牛体长的候选分子遗传标记。

表4FBXO32基因第44675位和第53423位多态位点与南阳牛24月龄体重和日增重之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.一种黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因部分片段，

所述的引物对P1为：

上游引物：5′CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3′

下游引物：5′GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3′

所述的引物对P2为：

上游引物：5′GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3′

下游引物：5′TTCCATCCACTCACATTCCCT 3′

所述的引物对P3为：

上游引物：5′CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3′

下游引物：5′AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3′

上述引物对在FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)中的位置如下：

P1：上游引物：322bp～341bp；下游引物：431bp～452bp；

P2：上游引物：738bp～758bp；下游引物：1049bp～1069bp；

P3：上游引物：53299bp～53319bp；下游引物：53855bp～53875bp；

(2)以限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后；

(3)对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因(NCBI参考序列号：NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。

2.根据权利要求1所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度分别为3.5％、2.0％、2.0％。

4.根据权利要求1所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因第22830位的单核苷酸多态性为：AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、110bp和21bp的三条带；GG基因型表现为长度分别为110bp和21bp的两条带。

5.根据权利要求1所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法，第44675位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。

6.根据权利要求1所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法，第53423位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。

7.根据权利要求1至6中任意一项权利要求所述的检测黄牛FBXO32基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的诊断应用。

8.根据权利要求7所述的诊断应用，其特征在于，鉴定不同黄牛多态性，黄牛FBXO32基因第22830位和第53423位的SNP作为在黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，第44675位的CC基因型为提高黄牛体斜长、胸围、坐骨端宽和日增重的候选分子遗传标记。