CN117363743B - 鉴定海南黄牛品种的snp标记组合、扩增引物组和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了鉴定海南黄牛品种的SNP标记组合、扩增引物组和方法，SNP标记组合包括：CM‑2、CM‑6、CM‑9、CM‑18、CM‑24和CM‑31位点，所述CM‑2表示牛2号染色体第7460001位点，CM‑6表示牛6号染色体第79260001位点，CM‑9表示牛9号染色体第34040001位点，CM‑18表示牛18号染色体第45020001位点，CM‑24表示牛24号染色体第8920001位点，CM‑31表示牛31号染色体第3720001位点。本发明能够将海南黄牛与其他牛品种(品系)相互鉴定区分，结果准确、操作简单、价格低廉。
Description
技术领域
本发明属于动物品种鉴定技术领域，涉及鉴定海南黄牛品种的SNP标记组合、扩增引物组和方法。
背景技术
海南黄牛又称高峰黄牛、雷琼牛，是海南省特有的黄牛品种，主要特征是肩峰隆起，外表略似印度瘤牛，其次是头长、额短、耳大、角短小、十字部高、体幅较广、四肢坚细、皮肤柔软而富有弹性、被毛短密、尾长，具有耐热、抗病和抗粗饲料的优点。但因为生长速度和体型与市场常见的牛种有一定差距，而且为了获取更高的利益市场上出现杂交牛肉冒充海南黄牛的现象。
为了有效地鉴别海南黄牛品种以开展保种和开发利用工作，急需一种快捷高效低成本的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供鉴定海南黄牛品种的SNP标记组合、扩增引物组和方法，具有结果准确、操作简单、价格低廉的技术优势。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了鉴定海南黄牛品种的SNP标记组合，包括：CM-2、CM-6、CM-9、CM-18、CM-24和CM-31位点，所述CM-2表示牛2号染色体第7460001位点，CM-6表示牛6号染色体第79260001位点，CM-9表示牛9号染色体第34040001位点，CM-18表示牛18号染色体第45020001位点，CM-24表示牛24号染色体第8920001位点，CM-31表示牛31号染色体第3720001位点。
本发明还提供了上述SNP标记组合的扩增引物组，包括：
CM-2-F：5’-GTAAACCCAGTAAAACAACATAAA-3’，
CM-2-R：5’-ATCTTCGGTATCAAAACAAAAT-3’；
CM-6-F：5’-TATGAGGAAGGAAGAAAAGCC-3’，
CM-6-R：5’-TTCCTCAATCGGAGTAAAACC-3’；
CM-9-F：5’-GCCCATTATTTTTGGTTAGTCTG-3’，
CM-9-R：5’-GATCTTGGTTTTATTTGTGCTCAC-3’；
CM-18-F：5’-ACTGTACCTCTTTTGTATACCCATG-3’，
CM-18-R：5’-CACACTTTTTAGTCTCAGAACTCCTT-3’；
CM-24-F：5’-GGGTGCCTGGAACTCTGA-3’，
CM-24-R：5’-ATTCTCCTCCAAAGCGTCAT-3’；
CM-31-F：5’-TGATAGTGACCAGGGTTTGT-3’，
CM-31-R：5’-AGTGACCTAATGCCCCTC-3’。
本发明又提供了基于上述SNP标记组合鉴定海南黄牛品种的方法，包括：首先提取待鉴定的牛的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合的任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为海南黄牛。
进一步地，所述PCR扩增的扩增引物组为：
CM-2-F：5’-GTAAACCCAGTAAAACAACATAAA-3’，
CM-2-R：5’-ATCTTCGGTATCAAAACAAAAT-3’；
CM-6-F：5’-TATGAGGAAGGAAGAAAAGCC-3’，
CM-6-R：5’-TTCCTCAATCGGAGTAAAACC-3’；
CM-9-F：5’-GCCCATTATTTTTGGTTAGTCTG-3’，
CM-9-R：5’-GATCTTGGTTTTATTTGTGCTCAC-3’；
CM-18-F：5’-ACTGTACCTCTTTTGTATACCCATG-3’，
CM-18-R：5’-CACACTTTTTAGTCTCAGAACTCCTT-3’；
CM-24-F：5’-GGGTGCCTGGAACTCTGA-3’，
CM-24-R：5’-ATTCTCCTCCAAAGCGTCAT-3’；
CM-31-F：5’-TGATAGTGACCAGGGTTTGT-3’，
CM-31-R：5’-AGTGACCTAATGCCCCTC-3’。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：模板DNA 5μL、上下游引物各1μL、H2O 18μL、2×Primer STAR Max Premix 25μL。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性7min，94℃预变性30s，56～60℃退火，72℃延伸30s，循环次数35次，72℃再延伸7min。
更进一步地，不同位点PCR扩增的退火温度为：CM-2：56℃，CM-6：56℃，CM-9：58℃，CM-18：60℃，CM-24：56℃，CM-31：60℃。
进一步地，不同位点PCR扩增的产物信息为：
其中，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置。
进一步地，测序产物检测位点对比信息如下表所示：
表中Ref代表参考基因型，Alt代表突变基因型。
进一步地，所述各个检测位点的信息为各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测牛检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测牛检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明以海南黄牛品种特有SNP位点为鉴定依据，从分子层面研究鉴别海南黄牛的方法，并以Sanger测序为主要分子鉴定方法，能够将海南黄牛与其他牛品种(品系)相互鉴定区分，并能将海南黄牛与常见北方牛种鉴定区分，例如：南阳牛、秦川牛和延边牛等，结果准确、操作简单、价格低廉。
附图说明
图1为本发明实施例中进行位点筛选的部分截图。
图2为本发明实施例中CM-9检测位点的电泳图。
图3为本发明实施例中CM-2和CM-6检测位点的电泳图(左CM-2，右CM-6)。
图4为本发明实施例中CM-18和CM-31检测位点的电泳图(左CM-18，右CM-31)。
图5为本发明实施例中CM-24检测位点的电泳图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
结合图1，首先将海南黄牛的全基因组测序数据与印度瘤牛、南阳牛、延边牛、秦川牛进行比较，筛选出90％以上海南黄牛拥有的且其他四种牛没有突变的位点：CM-2、CM-6、CM-9、CM-18、CM-24和CM-31位点，所述CM-2表示牛2号染色体第7460001位点，CM-6表示牛6号染色体第79260001位点，CM-9表示牛9号染色体第34040001位点，CM-18表示牛18号染色体第45020001位点，CM-24表示牛24号染色体第8920001位点，CM-31表示牛31号染色体第3720001位点。
再提取待鉴定的牛的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合的任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为海南黄牛品种。
PCR扩增的引物如表1所示：
表1扩增位点引物序列(5’-3’)
PCR扩增的反应体系为：模板DNA 5μL、上下游引物各1μL、H2O 18μL、2×PrimerSTAR Max Premix 25μL；反应程序为94℃预变性7min，94℃预变性30s，退火温度如表2所示，72℃延伸30s，循环次数35次，72℃再延伸7min。
表2扩增位点引物及产物信息
注：表中，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置。
琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5％，凝胶电泳条带长度要求为如表2所示。
测序产物鉴定位点对比信息如表3所示：
表3测序产物鉴定位点对比信息
| SNP | Ref | Alt |
| CM-2 | A | C |
| CM-6 | T | G |
| CM-9 | A | G |
| CM-18 | A | C |
| CM-24 | C | T |
| CM-31 | G | T |
注：表中Ref代表参考基因型，Alt代表突变基因型。
如表3所示，各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测牛检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测牛检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义，例如一头待测牛a在CM-2位点，如果测序数据为A，则认为待测牛a在CM-2位点不具备鉴定意义；如果测序数据为C，则认为待测牛a在CM-2位点具有鉴定意义。
由于单个位点作为鉴定依据的存在假阳性错判，且错判概率较高，所以本发明利用位点组合作为鉴定Marker。
各个品种鉴定位点组合鉴定Marker信息如表4所示。
表4鉴定标记组合信息
如表4所示，Marker 1-20为海南黄牛鉴定标记组合，例如当待测牛a具备20个Marker组合中的任意一种位点突变组合的时候，则认为待测牛a为海南黄牛。
应用例
随机选取待测牛种DNA样品10份。
利用引物对DNA样品进行PCR反应扩增。
PCR反应的反应体系为50μL体系：模板DNA 5μL、上下游引物各1μL、H2O 18μL、2×Primer STARMax Premix 25μL；反应程序为94℃预变性7min，94℃预变性30s，退火温度如上表1所述，72℃延伸30s，循环次数35次，72℃再延伸7min。
用1.5％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，凝胶电泳条件为电流200mA，电压120伏，时间20～25分钟。电泳所使用的Marker为DL2000 DNAMarker，参考片段：100、250、500、750、1000、2000bp。不同引物的扩增产物与表1中的标准产物长度进行比对，产物长度在误差范围内且与标准产物长度一致，则认为扩增结果合格。
各样品电泳检测结果如图2-5所示。以图5为例，目标条带长度623bp，杂带长度均在250bp以下，能够明显区分。
将合格的样本PCR扩增产物进行Sanger测序，得到各个检测位点的信息，对测序结果进行分析：
表5样本测序结果SNP多态性分析表
| Ref | Alt | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| A | C | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| T | G | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| A | G | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| A | C | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| C | T | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ||
| G | T | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
表中Ref参考基因型，Alt突变基因型，√代表检测到突变基因型。
利用位点组合Marker的方式来进行鉴定：1、2、5、6、7、9、10号牛在所有待测位点检测到突变，符合Marker1-20的鉴定信息，鉴定他们为海南黄牛；3、4、8号牛均检测到5个位点突变，同样符合Marker1-20的鉴定信息，鉴定他们为海南黄牛。
本发明将第三代分子标记运用于海南黄牛品种鉴定，填补了市场的空缺，有效解决了海南黄牛的鉴伪问题。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.鉴定海南黄牛品种的SNP标记组合的扩增引物组，所述SNP标记组合包括：CM-2、CM-6、CM-9、CM-18、CM-24和CM-31位点，所述CM-2表示牛2号染色体第7460001位点，CM-6表示牛6号染色体第79260001位点，CM-9表示牛9号染色体第34040001位点，CM-18表示牛18号染色体第45020001位点，CM-24表示牛24号染色体第8920001位点，CM-31表示牛31号染色体第3720001位点；
所述扩增引物组包括：
CM-2-F：5’-GTAAACCCAGTAAAACAACATAAA-3’，
CM-2-R：5’-ATCTTCGGTATCAAAACAAAAT-3’；
CM-6-F：5’-TATGAGGAAGGAAGAAAAGCC-3’，
CM-6-R：5’-TTCCTCAATCGGAGTAAAACC-3’；
CM-9-F：5’-GCCCATTATTTTTGGTTAGTCTG-3’，
CM-9-R：5’-GATCTTGGTTTTATTTGTGCTCAC-3’；
CM-18-F：5’-ACTGTACCTCTTTTGTATACCCATG-3’，
CM-18-R：5’-CACACTTTTTAGTCTCAGAACTCCTT-3’；
CM-24-F：5’-GGGTGCCTGGAACTCTGA-3’，
CM-24-R：5’-ATTCTCCTCCAAAGCGTCAT-3’；
CM-31-F：5’-TGATAGTGACCAGGGTTTGT-3’，
CM-31-R：5’-AGTGACCTAATGCCCCTC-3’。
2.基于SNP标记组合鉴定海南黄牛品种的方法，所述SNP标记组合包括：CM-2、CM-6、CM-9、CM-18、CM-24和CM-31位点，所述CM-2表示牛2号染色体第7460001位点，CM-6表示牛6号染色体第79260001位点，CM-9表示牛9号染色体第34040001位点，CM-18表示牛18号染色体第45020001位点，CM-24表示牛24号染色体第8920001位点，CM-31表示牛31号染色体第3720001位点；所述方法包括：首先提取待鉴定牛的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合的任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为海南黄牛；
所述PCR扩增的扩增引物组为：
CM-2-F：5’-GTAAACCCAGTAAAACAACATAAA-3’，
CM-2-R：5’-ATCTTCGGTATCAAAACAAAAT-3’；
CM-6-F：5’-TATGAGGAAGGAAGAAAAGCC-3’，
CM-6-R：5’-TTCCTCAATCGGAGTAAAACC-3’；
CM-9-F：5’-GCCCATTATTTTTGGTTAGTCTG-3’，
CM-9-R：5’-GATCTTGGTTTTATTTGTGCTCAC-3’；
CM-18-F：5’-ACTGTACCTCTTTTGTATACCCATG-3’，
CM-18-R：5’-CACACTTTTTAGTCTCAGAACTCCTT-3’；
CM-24-F：5’-GGGTGCCTGGAACTCTGA-3’，
CM-24-R：5’-ATTCTCCTCCAAAGCGTCAT-3’；
CM-31-F：5’-TGATAGTGACCAGGGTTTGT-3’，
CM-31-R：5’-AGTGACCTAATGCCCCTC-3’；
不同位点PCR扩增的产物信息为：
其中，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置；
测序产物检测位点对比信息如下表所示：
表中Ref代表参考基因型，Alt代表突变基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：模板DNA 5μL、上下游引物各1μL、H2O 18μL、2×Primer STAR Max Premix 25μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性7min，94℃预变性30s，56~60℃退火，72℃延伸30s，循环次数35次，72℃再延伸7min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，不同位点PCR扩增的退火温度为：CM-2：56℃，CM-6：56℃，CM-9：58℃，CM-18：60℃，CM-24：56℃，CM-31：60℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述各个检测位点的信息为各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待鉴定牛的检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待鉴定牛的检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义。
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2023
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