CN112921102A - 一种与细毛羊羊毛性状相关的snp标记及其检测引物组、试剂盒、检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒、检测方法和应用，属于分子标记检测技术领域；所述SNP分子标记位于绵羊第3号染色体第61927840bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与细毛羊羊毛性状具有显著的相关性。本发明的SNP标记能够用于绵羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受绵羊的年龄、性别等限制，能够用于细毛羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，能够显著促进细羊毛选育的育种进程。

Description

一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记及其检测引物组、试剂 盒、检测方法和应用
技术领域
本发明涉及分子标记检测技术领域，具体地说，涉及一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒、检测方法和应用。
背景技术
EDAR基因是调控毛囊发育的关键基因之一，存在于皮肤组织中，在毛囊的外胚层中特异表达，EDAR基因在在早期初级毛囊的发生、成体毛囊周期性生长和被毛纤维直径等方面都发挥重要的调控作用。该基因突变后会影响外胚层衍生物的发育和体内稳态，引起少汗性外胚层发育不良(HED)，其特征是早期皮肤外胚层附属物发育严重缺陷,包括头发、指甲、牙齿、外分泌腺等。在细毛羊、半细毛羊和蒙古羊群体中进行选择信号筛选，发现EDAR基因座位的多态性变异对细毛羊毛囊发育的影响达到显著水平。
羊毛是毛用羊的主要的经济产物，且作为一种重要原材料用于纺织产业，而羊毛品质则是决定纺织品质量的最主要因素。粗毛羊和细毛羊的毛纤维细度和长度差异显著。最明显的差异表现在由初级毛囊发育形成的外层羊毛。毛囊的发育是一个复杂的生物过程，涉及到许多不同的蛋白质。近年来，分子遗传技术的飞速发展，使DNA分子标记技术在细毛羊遗传多样性研究中起着重要作用，为更好地开发和利用优良品种的优良经济特性及保护和合理的利用品种资源。因此有必要开发细毛羊特异的分子标记，应用于细毛羊的选育，并为毛用绵羊的分子育种提供一定的理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒、检测方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于绵羊第3号染色体第61927840bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与细毛羊羊毛性状具有显著的相关性；所述SNP分子标记基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月。
本发明还提供了用于检测上述方案所述SNP标记的引物组，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
本发明还提供了一种用于检测上述方案所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物组。
优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供了一种用于检测上述方案所述SNP标记的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)检测所述PCR扩增产物的第120bp处的基因型，得到所述SNP位点的基因型。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应的体系以25μl计包括以下组分：待测绵羊的基因组DNA 1μl，正向引物和反向引物各1μl，dNTP mix 0.5μl，Phanta Max Super-FidelityDNA聚合酶0.5μl，2×PCR反应缓冲液12.5μl和余量的双蒸水；
所述待测绵羊的基因组DNA的浓度为50～100ng/μl；所述正向引物和反向引物的浓度分别为10pmol/μl；所述dNTP mix的浓度为10mmol/L。
优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min，共34个循环；72℃保温2min。
本发明还提供了上述方案所述SNP标记或者所述引物组或者所述试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于绵羊第3号染色体第61927840bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与细毛羊羊毛性状具有显著的相关性。本发明的SNP标记能够用于绵羊分子标记辅助育种。本发明提供的分子标记不受绵羊的年龄、性别等限制，能够用于细毛羊选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，能够显著促进细羊毛选育的育种进程。
附图说明
图1为三种基因型测序峰图；其中，(a)为CC型；(b)为TC型；(c)为TT型；
图2为SNP位点的扩群验证结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记，所述SNP分子标记位于绵羊第3号染色体第61927840bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与细毛羊羊毛性状具有显著的相关性，该基因存在CC、TC和TT三种基因型，TT基因型的个体细毛羊显著高于TC基因型以及CC基因型；所述SNP分子标记基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月。
在本发明中，在绵羊第3号染色体第61927840bp位点，等位基因T在细毛羊和半细毛羊中的频率高达95.5％和94.4％，而在粗毛羊中频率只有55.6％。对于通过基因型区分和筛选出细毛羊羊毛性状的绵羊具有较大的指导意义，能够提高绵羊羊毛筛选的准确率和效率。
本发明还提供了用于检测上述方案所述SNP标记的引物组，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：5’-ACTGGATTCAGACCCACCCT-3’；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：5’-CTTCTGTGTGGGGTCTTCGT-3’。
本发明还提供了一种用于检测上述方案所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物组。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括dNTPs、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
在本发明中，所述试剂盒优选的还包括标准阳性模板；所述标准阳性模板的基因型为TT；所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。
本发明还提供了一种用于检测上述方案所述SNP标记的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)检测所述PCR扩增产物的第120bp处的基因型，得到所述SNP位点的基因型。
本发明首先提取待测绵羊的基因组DNA；本发明对所述提取待测绵羊的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
得到待测绵羊的基因组DNA后，本发明以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物。
在本发明中，所述PCR扩增反应的体系优选的以25μl计包括以下组分：待测绵羊的基因组DNA 1μl，正向引物和反向引物各1μl，dNTP mix 0.5μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μl，2×PCR反应缓冲液12.5μl和余量的双蒸水。在本发明中，所述待测绵羊的基因组DNA的浓度优选为50～100ng/μl，进一步优选为60～80ng/μl；所述正向引物和反向引物的浓度分别优选为10pmol/μl；所述dNTP mix的浓度优选为10mmol/L。
在本发明中，所述PCR扩增反应的程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min，共34个循环；72℃保温2min。
得到PCR扩增产物后，本发明检测所述PCR扩增产物的第120bp处的基因型，得到所述SNP位点的基因型。
本发明对于检测PCR扩增产物的基因型的方法没有特别的限制，利用本领域常规的基因型检测方法即可。本发明具体实施过程中，利用sanger测序方法来检测待测绵羊的基因型。
本发明的方法具有准确可靠，操作简便的优势。
本发明还提供了上述方案所述SNP标记或者所述引物组或者所述试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。本发明所述的SNP标记或者所述引物组或者所述试剂盒能够与其他用于中国绵羊表型检测的特异性引物或者试剂盒相结合用于中国绵羊分类和育种研究。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1绵羊EDAR基因多态性位点的鉴定
1.1提取待测中国绵羊组织中的基因组DNA
采集84只半细毛羊(包括20只来自凉山、24只来自贵州、40只来自云南)、165只细毛羊(包括84只来自新疆、20只来自青海、21只来自甘肃、20只来自内蒙、20只来自吉林)和来自青海地区的39只蒙古羊的组织样，采用磁珠法提取组织中的基因组DNA。
1.2扩增含SNP位点的核苷酸片段。
根据NCBI数据库收录的EDAR基因座位的序列设计引物，包括正向引物F：5’-ACTGGATTCAGACCCACCCT-3’，如SEQ ID NO.1所示；和反向引物R：5’-CTTCTGTGTGGGGTCTTCGT-3’，SEQ ID NO.2所示，以1.1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.3所示，具体为：
ACTGGATTCAGACCCACCCTGGGCTCCTGGCACCACCACCTCACCTGTGTCCCAGCAGAGACCAACCTGCCCTTCAAGGCAGCCTGCAGAGCTGAGGCCAGCCTGTGCATTCCCTTCATTATAAGGGGCAACAGGAAGGGCTTCTGTGAGCACGAAGACCCCACACAGAAG。
该SNP位点位于PCR扩增片段(SEQ ID NO.3所示)的120bp处，此处碱基为T或C。
其中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.5μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μl，2×PCR反应缓冲液12.5μl，余量为双蒸水。
其中PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min，共34个循环；72℃保温2min。
1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记
对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，所述PCR扩增产物的第120bp处的基因型为所述SNP位点的基因型。三种基因型的测序峰图如图1所示。
实施例2对668只中国绵羊的EDAR基因座位的多态性位点进行扩大群体分析。运用T检验进行检验分析，上述SNP位点在细毛羊和半细毛羊中的等位基因T的频率显著高于在粗毛羊中的等位基因T的频率(P<1.95e-4)。进一步验证了该处SNP位点的等位基因T与细毛羊羊毛性状的相关性(如表1和图2所示)。由表1和图2可以看出“TT”是细毛羊品种的优势基因型，而“CC”和“TC”是粗毛羊品种中的基因型。
表1 SNP位点在细毛羊、半细毛羊与粗毛羊品种中的基因型频率以及等位基因频率
表型 TT TC CC
细毛羊 165 16 -
半细毛羊 72 9 -
粗毛羊 134 183 88
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记及其检测引物组、试剂盒、检测方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actggattca gacccaccct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttctgtgtg gggtcttcgt 20
<210> 3
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actggattca gacccaccct gggctcctgg caccaccacc tcacctgtgt cccagcagag 60
accaacctgc ccttcaaggc agcctgcaga gctgaggcca gcctgtgcat tcccttcatt 120
ataaggggca acaggaaggg cttctgtgag cacgaagacc ccacacagaa g 171

Claims (9)

1.一种与细毛羊羊毛性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于绵羊第3号染色体第61927840bp位点；所述位点上存在T/C碱基突变，与细毛羊羊毛性状具有显著的相关性；所述SNP分子标记基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年11月。
2.用于检测权利要求1所述SNP标记的引物组，包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、PhantaMaxSuper-Fidelity DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物；
3)检测所述PCR扩增产物的第120bp处的基因型，得到所述SNP位点的基因型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应的体系以25μl计包括以下组分：待测绵羊的基因组DNA 1μl，正向引物和反向引物各1μl，dNTP mix 0.5μl，PhantaMax Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μl，2×PCR反应缓冲液12.5μl和余量的双蒸水；
所述待测绵羊的基因组DNA的浓度为50～100ng/μl；所述正向引物和反向引物的浓度分别为10pmol/μl；所述dNTPmix的浓度为10mmol/L。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸2min，共34个循环；72℃保温2min。
9.权利要求1所述SNP标记或者权利要求2所述引物组或者权利要求3～5任意一项所述试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
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