CN110106279A - 基于老芒麦基因组序列开发的单位点ssr引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提供一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用。该单位点SSR引物组是专门针对老芒麦植物开发的特异单位点SSR，利用本发明所述的10对引物对老芒麦种质材料进行扩增，解决了通用多位点SSR标记无法计算观测杂合度的问题，利用本发明所述的单位点SSR引物计算得到的各项遗传多样性指标相对于通用的多位点SSR引物而言准确度更高，更能准确的揭示老芒麦物种丰富的遗传多样性，同时利用本发明所述的10对单位点SSR引物就能准确的得到未知老芒草物种的群体信息。适合在SSR引物组领域推广运用。

Description

基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用
技术领域
本发明属于SSR引物组领域，具体涉及一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用。
背景技术
老芒麦(Elymus sibiricus L.)是披碱草属(Elymus L.)的模式种，为异源四倍体，具有StStHH的染色体组构成(2n＝4x＝28)，在我国主要分布于新疆、四川、西藏、青海、甘肃、内蒙古等地区。老芒麦也是青藏高原高寒牧区应用最为广泛的优良牧草资源，具有适应性强、抗寒、粗蛋白含量高、适口性好和易栽培等优良特性，主要用于建植人工草地和放牧草地，是高寒地区退化草地补播和改良的主要草种，
尽管老芒麦具有重要的生态和经济效益，但其种质资源研究工作仍较为薄弱，尤其分子水平研究较少，主要集中于老芒麦种质资源遗传多样性的研究与DNA指纹图谱的构建。虽较多分子标记如AFLP、ISSR、SRAP、SSR、EST-SSR和SCoT等运用于老芒麦研究中，但它们大多采用运用于其他物种上的通用引物，而有关老芒麦特异引物的报道却较少，导致老芒麦的育种进程停滞不前。因此，丰富老芒麦特异引物库已成为当务之急。
简单重复序列(SSR，Simple Sequence Repeat)又称为微卫星DNA，是分子标记辅助育种首选标记之一。其以2-6个核苷酸为基本单位的串联重复序列组成的DNA片段，长度大多为100-200个碱基对，具有分布广泛，多态性丰富，重复性好，共显性遗传，物种间转移性好等特点，已被广泛应用于品种鉴定，种质资源保存和利用、遗传多样性分析、分子标记辅助选育等研究领域。SSR分子标记是一种共显性标记，能够同时区分纯合和杂合基因型。SSR分子标记包含两种类型：其引物在PCR扩增过程中与多个基因座结合的多位点(multi-loci)SSR标记和只与一个特异基因座结合的单位点(single-loci)SSR标记，两者的主要区别在于：在多倍体物种的多态性分析中，多位点标记引物会在扩增过程中与多个基因座位点相结合，从而产生片段重叠扩增，同源性模糊等问题，导致其PCR产物的结果产生复杂的条带类型，致使无法用共显性标记方来准确进行基因分型，而单位点SSR标记引物可结合到特定基因组的基因座上，在二倍体和遵循二倍体遗传模式的异源四倍体物种上应用时能避免这些缺点，并精确计算观测杂合度(Ho)和多态性信息含量(PIC)。并在在一系列重要的分子遗传参数多态性信息含量(PIC)上比多位点标记更加精准，因此在遗传育种研究中更具有优势。SSR虽是以测序技术为基础的分子标记，但随着目前二代测序的越来越普遍以及三代测序的兴起，其开发费用的逐渐降低，加速了它在物种上的开发利用。迄今，未见结合基因组Survey测序技术运用于老芒麦植物并开发老芒麦特异单位点SSR分子标记开发应用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组，该内参基因为芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该基于芒草转录组序列开发的内参基因，所述单位点SSR引物组包括10对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示。
本发明还发现了基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组在老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析中的应用。
本发明还提供了利用所述基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，包括如下步骤：
A、提取待测老芒麦样品基因组DNA；
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEID NO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；
D、利用步骤C的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；
所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex 6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS 2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS 2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure 2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构，并通过Genlex 6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。
进一步的是，在步骤A中，提取待测老芒麦样品基因组DNA的具体方法如下所述：选取待测老芒麦样品的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。
进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2X Reaction Mix，0.4μL的Golden DNA Polymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-65℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
本发明的有益效果在于：本发明所述的基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组是专门针对老芒麦植物开发的特异单位点SSR，利用本发明所述的10对引物对老芒麦种质材料进行扩增，解决了通用多位点SSR标记无法计算观测杂合度的问题，本发明单位点SSR标记可以计算得到观测杂合度，同时计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)也远高于通用的多位点SSR标记扩增后计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)，因此，利用本发明所述的单位点SSR引物计算得到的各项遗传多样性指标相对于通用的多位点SSR引物而言准确度更高，更能准确的揭示老芒麦物种丰富的遗传多样性，同时利用本发明所述的10对单位点SSR引物就能准确的得到未知老芒草物种的群体信息。
附图说明
图1为基于单位点SSR标记遗传距离矩阵的23份参试老芒麦UPGMA聚类图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所述基于老芒麦基因组序列开发的10对单位点SSR引物组采用如下方法获得：对“川草2号”老芒麦幼叶进行基因组测序，四倍体老芒麦基因组序列集由四川农业大学草业科学系通过基因组Survey测序获得，使用PERL5script MIcroSAtellite软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)在该序列集中识别SSRs，从FASTA格式的基因组序列文件找到所有的微卫星重复单元，识别标准是：单核苷酸重复的次数在8次或8次以上；二核苷酸、三核苷酸、和四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重复的次数均在5以上；基于鉴定出的SSR侧翼序列，使用primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物。设计引物时设置的主要参数为：GC含量30％～70％，退火温度Tm在55～65℃，引物长度在18-27bp，预测PCR产物长度100～300bp；使用电子PCR(e-PCR)将设计的引物与川草2号老芒麦的测序拼接基因组序列集进行结合比对，在组装的基因组序列集上仅仅结合(hit)一个基因座的SSR视为单位点(single-locus)SSR。最后成功设计了10对单位点SSR引物(表1)。
表1基于老芒麦基因组序列开发的10对单位点SSR引物信息
本发明还发现了基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组在老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析中的应用。
本发明还提供了利用所述基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，包括如下步骤：
A、提取待测老芒麦样品基因组DNA；提取待测老芒麦样品基因组DNA的具体方法如下所述：选取待测老芒麦样品的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用；
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEID NO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2X Reaction Mix，0.4μL的Golden DNA Polymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
进一步的是，在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-65℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；
D、利用步骤C的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex 6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS 2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS 2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure 2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构，并通过Genlex 6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)，观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。
本发明所述的基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组是专门针对老芒麦植物开发的特异单位点SSR，利用本发明所述的10对引物对老芒麦种质材料进行扩增，解决了通用多位点SSR标记无法计算观测杂合度的问题，本发明单位点SSR标记可以计算得到观测杂合度，同时计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)也远高于通用的多位点SSR标记扩增后计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)，因此，利用本发明所述的单位点SSR引物计算得到的各项遗传多样性指标相对于通用的多位点SSR引物而言准确度更高，更能准确的揭示老芒麦物种丰富的遗传多样性，同时利用本发明所述的10对单位点SSR引物就能准确的得到未知老芒草物种的群体信息。
实施例
首先，筛选出23份老芒麦材料来验证开发的SSR标记性能，其供试老芒麦材料的详细情况见表2，其中包括，每份材料只选取1个单株提取DNA。
表2验证开发的单位点SSR引物性能所用的老芒麦供试材料
接着，提取待测老芒麦样品基因组DNA，选取上述23份老芒麦材料的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用；
然后，以上一步骤提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCE ID NO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2X Reaction Mix，0.4μL的Golden DNAPolymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-5665℃退火4530s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存；
将上一步得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；具体的，先将步骤B得到的PCR扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)进行检测，样品点样5μL，以博瑞克公司的D50Marker为对照，350V电压下电泳140min，银染法显影，照相保存；对SSR标记扩增产物的电泳图谱进行人工比对、校正，统计强带或清晰弱带，单位点的SSR引物的电泳结果首先通过条带位置的不同统计该引物在群体中扩增出多少种互异条带，互异条带种类数可视为等位基因数，每种条带依据DNA Ladder的位置估测分子量，随后以“分子量/分子量”的方式记录个体的扩增结果，如果该个体没有扩增条带，记录为“0/0”，使用软件Cervus记录每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；
最后利用得到的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；通过Genlex 6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)和期望杂合度(He)；所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex 6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS 2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS 2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure 2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构。
用23份老芒麦供试材料的基因组DNA对10对单位点SSR引物进行多态性扩增，其引物扩增详细情况见表3；
表3开发出的10对单位点SSR引物对23份老芒麦供试材料的扩增情况
筛选出的10对多态性EST-SSR引物，共扩增出36个等位基因，平均扩增出个3.6个等位基因，其中ESGA-SL-2与ESGA-SL-7扩增数量最多，扩增出了5个等位基因。所有ESGA-SL引物平均多态信息含量(PIC)平均值为0.505，其中ESGA-SL-2具有最高的PIC值，为0.700。观测杂合度(Ho)平均值为0.566，ESGA-SL-7拥有最高的Ho，为0.981。表明供试的单位点SSR引物多态性丰富、应用价值高，能够应用于老芒麦遗传多样性分析中以及群体结构分析，表4为基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组的老芒麦参试材料的遗传多样性分析；
表4基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组的老芒麦参试材料的遗传多样性分析
注：MG:蒙古地理亚群；XJ:新疆地理亚群；QT：青藏高原地理亚群；下同；
对比实施例
首先，筛选出23份老芒麦材料来验证开发的SSR标记性能，其供试老芒麦材料的详细情况见表2，其中包括，每份材料只选取1个单株提取DNA。
接着，提取待测老芒麦样品基因组DNA，选取上述23份老芒麦材料的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用；
然后，以上一步骤提取的待测样品DNA为模板，选取10对通用的老芒麦基因组多位点SSR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2X Reaction Mix，0.4μL的Golden DNAPolymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-5665℃退火4530s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存；表5为选取的10对通用的老芒麦基因组多位点SSR引物；
表5
将上一步得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果；具体的，先将步骤B得到的PCR扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE缓冲液)进行检测，样品点样5μL，以博瑞克公司的D50Marker为对照，350V电压下电泳140min，银染法显影，照相保存；对SSR标记扩增产物的电泳图谱进行人工比对、校正，统计强带或清晰弱带，单位点的SSR引物的电泳结果首先通过条带位置的不同统计该引物在群体中扩增出多少种互异条带，互异条带种类数可视为等位基因数，每种条带依据DNA Ladder的位置估测分子量，多位点SSR标记以分子表型数据记录，条带以“0/1”矩阵方式记录，具体为记录清晰明亮的条带，在相同迁移位置处有条带的记录为“1”，无条带的记录为“0”，使用软件Cervus记录分子表型数据得到统计结果；
最后利用得到的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算多态信息含量(PIC)，多态信息含量PICi＝2fi(1-fi)，fi：扩增带的等位基因频率(记为“1”的条带)；1-fi：无效等位基因频率(记为“0”的条带)，通过Genlex 6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)和期望杂合度(He)；所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex 6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS 2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS 2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure 2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构。表6为基于多位点SSR引物的老芒麦参试材料的遗传多样性分析。
表6基于多位点SSR引物的老芒麦参试材料的遗传多样性分析
由表4和表6可知，多位点SSR标记无法计算观测杂合度，多位点SSR标记的多态信息含量(PIC)范围为0.25～0.46，平均值为0.203，低于单位点SSR标记的多态信息含量(PIC)，将两组各个引物视为独立样本进行符号秩和检验，发现的多位点SSR标记计算的PIC值远低于单位点SSR标记计算的PIC值，二者存在显著差异，表明单位点SSR标记在多态信息含量上显著优于多位点SSR标记。单位点SSR标记的各地理亚群观测杂合度(Ho)与香农信息指数(I)都处于很高的水平，分别在0.514到0.590之间和0.673到0.793之间，平均值分别为0.550和0.735，由表4和表6可以明确得知本发明单位点SSR标记可以计算得到观测杂合度，同时计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)也远高于通用的多位点SSR标记扩增后计算得到的其他各项遗传多样性指标(多态信息含量值、等位基因数目，有效等位基因，香农多样性指数和期望杂合度)，表明单位点SSR引物相对于多位点SSR引物能揭示丰富的遗传多样性。单位点SSR引物揭示出23份参试老芒麦材料间平均遗传距离为0.323，基于遗传距离矩阵，23份材料能被分为三个遗传亚群：ClusterⅠ，ClusterⅡ和ClusterⅢ，图1为基于单位点SSR标记遗传距离矩阵的23份参试老芒麦UPGMA聚类图，从结果可知，参试材料的遗传亚群分布与地理类别分布完全一致，表明仅用10对单位点SSR引物就能很好地区分参试材料，证明了单位点SSR引物的高效性。
序列表
<110> 四川省草原科学研究院
四川农业大学
<120> 基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组及其应用
<130> 2019
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
catctgcaat atgcgttgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
caaccaaaag caccacaaga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
gaggacaggg tgcagtgatt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
ctgacgttgg aatggagaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
gttgcagaat gcatttccct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
gcggcgaaaa ttatgtctgt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
ggtggagaag ggagatgagt c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
aggctcatga ggaacaagtc tct 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
ctgccacttt tgacctgtct c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 10
gcctttctgt ctcctgtacc ata 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 11
gaatggagct ccgctttaag attt 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 12
gctccaaaca cggtataact ccac 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 13
ttatgtgatt tcataattgg ccc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 14
gctgctgcta ccgttcttat tta 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 15
gggtgtgatt cataaaacga atg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 16
tctttctcgt gactgttcct ttc 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 17
agttgctagt tgtgcttgtg tca 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 18
catctgcgta caaaactgtg aaa 23
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 19
cgtcttccgc ttcatcttct t 21
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 20
caaagatcca gatcacacca aac 23

Claims (6)

1.基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组，其特征在于：所述单位点SSR引物组包括10对引物，其核苷酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.1～20所示。
2.根据权利要求1所述的基于老芒麦基因组序列开发的单位点SSR引物组在老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析中的应用。
3.利用权利要求1所述基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，包括如下步骤：
A、提取待测老芒麦样品基因组DNA；
B、以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQUENCEID NO.1～20所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
C、将步骤B得到的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计每对单位点引物扩增的等位基因数目得到统计结果；
D、利用步骤C的统计结果进行老芒麦遗传多样性分析、群体结构分析，所述老芒麦遗传多样性分析的具体方法如下：利用软件Cervus计算观测杂合度(Ho)与多态信息含量(PIC)，多态信息含量其中，PICi表示标记i的多态性信息含量，Pi表示标记的第i个等位基因出现的频率，n为等位基因数量；观测杂合度u表示纯合子等位基因个体的频率，n为等位基因数量；通过Genlex 6.5计算群体的有效等位基因(Ne)，香农多样性指数(I)和期望杂合度(He)；
所述老芒麦群体结构分析的具体方法如下：利用Genlex 6.5软件计算待测老芒麦样品间的遗传距离矩阵，通过NTSYS 2.1软件对矩阵结果标准化，然后通过NTSYS 2.10和软件Figtree基于遗传距离矩阵对待测老芒麦样品材料进行UPGMA聚类，使用基于贝斯叶算法开发的Structure 2.3.4软件来分析参试老芒麦群体结构。
4.根据权利要求3所述的基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，其特征在于：在步骤A中，提取待测老芒麦样品基因组DNA的具体方法如下所述：选取待测老芒麦样品的健康幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并用分光光度计及1％的琼脂糖凝胶电泳检测供试材料DNA的浓度与纯度，将合格DNA样品放置于–20℃冰箱中保存备用。
5.根据权利要求3所述的基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，其特征在于：在步骤B中，所述PCR扩增反应优化体系总体积为15μL，其中包括3μL浓度为10ng/μL的模板DNA，7.5μL的2X Reaction Mix，0.4μL的Golden DNA Polymerase，0.8μL浓度为10pmol/μL的正向引物，0.8μL浓度为10pmol/μL的反向引物，余量为ddH2O。
6.根据权利要求3所述的基于芒草转录组序列开发的内参基因进行老芒麦遗传多样性分析、老芒麦群体结构分析的方法，其特征在于：在步骤B中，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52-65℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，于4℃保存。
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