CN101967518B - 一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 - Google Patents
一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101967518B CN101967518B CN 201010186434 CN201010186434A CN101967518B CN 101967518 B CN101967518 B CN 101967518B CN 201010186434 CN201010186434 CN 201010186434 CN 201010186434 A CN201010186434 A CN 201010186434A CN 101967518 B CN101967518 B CN 101967518B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- wheat
- leaf rust
- primer
- rust resistance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物，专用引物是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，是以待测小麦品种基因组DNA为模板，在由权利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。本发明的筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物将在小麦叶锈病抗病育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物。
背景技术
小麦叶锈病(Puccinia triticina f.sp.tritici)是一种世界性病害，条件适宜时可造成40％甚至更大的产量损失(摘自Knott D R.The wheat rust breeding forresistance.Monographs on Theoretical and Applied Genetics，1989)。在我国，小麦叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区，如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、西北及东北各地的发生也日趋严重。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的经济、有效、快捷的方法。加强小麦品种及其遗传资源的抗病性研究，对病害的持续控制、确保小麦安全生产至关重要。目前已有60余个抗叶锈病基因正式命名(McIntosh et al.Catalogue of gene symbols for wheat：2007 supplement[DB/OL].[2008-01-30]http://shigen.lab.nig.ac.jp//wheat/komugi/top/top.jsp)，由于叶锈菌大多数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。因此利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长抗病基因的抗性寿命是一重要手段。然而，我国由于缺少对生产品种中抗叶锈基因的全面分析，对使用品种的抗病性的了解不够全面，往往造成小麦品种的盲目推广使用，加上小麦叶锈菌新毒性基因的产生致使抗病品种不断丧失抗病性，小麦叶锈病发生日趋严重。因此，了解目前生产品种的抗叶锈性及其基因、发掘新的抗源成为有效控制该病害的一个重要环节。
在人类基因组研究的推动下，分子标记的研究与利用得到了迅速的发展并用于作物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很大的进展。寻找与重要农艺性状基因紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择和育种的基础。近年来，利用分子标记包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR和TRAP等定位和标记了多个小麦抗叶锈病基因。AFLP标记呈典型的孟德尔方式遗传，多态性高，稳定性好，可在短时间内对大量的DNA样品进行检测，非常适合遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位和快速构建遗传图谱等研究。但由于其检测过程涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳的使用，对技术要求高且工作量大，将在基因组随机分布的AFLP标记转化为STS标记则可为分子辅助育种提供方便、快捷的检测手段。
Lr24抗叶锈病基因来源于长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝70)，目前很少有对该基因表现有毒力的小麦叶锈菌，因此是非常具有应用潜力的抗病基因。通过对Lr24进行AFLP分析，找到了与该基因紧密连锁的分子标记，并转化为稳定的STS标记，用于标记辅助育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的引物。
本发明的另一个目的是提供一种可用于筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法。
本发明所提供的用于筛选Lr24抗病基因的引物，是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为A-S24，序列表中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2均由20个碱基组成，将用引物对A-S24经PCR扩增到得到的分子标记命名为TA-S24。
本发明所提供的筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，是以待测小麦品种基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物A-S24的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。
其中，20.0μL PCR反应体系为：模板DNA 50ng，Taq酶1U(TaKaRa)，上、下游引物(5μmol·L-1)各1.0μL，dNTP(10mmol·L-1)0.5μL，10×PCR缓冲液2.0μL，其余用无菌蒸馏水补充反应体系至20.0μL。反应程序为：94℃预变性3min，随后进行35个循环：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，10℃保存。
所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。具体方法为：取5μL扩增产物，加入0.5μL变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝)，在浓度为2.0％的琼脂糖凝胶中电泳分离。检测扩增产物中是否有212bp大小的条带。
本发明提供了一个与小麦抗叶锈病基因Lr24共分离的AFLP-STS标记TA-S24，Lr24基因对我国目前流行的大多数叶锈菌小种表现抗病。利用与该抗病基因共分离的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明的小麦抗叶锈病基因Lr24的专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为用A-S24引物抗感亲本和F2群体单株的PCR扩增结果。
图2为用A-S24引物对已知含有Lr24抗叶锈病基因Lr24的小麦品种的PCR扩增结果。
图1中R：抗病F2单株；S：感病F2单株24、Tc分别代表抗病亲本和感病亲本。图2中1、9、10、19、20、29、35、37、44：相应的近等基因系；N1-N5：5个小麦品种，依次为鄂恩1号、5R625、周19、1R13、1R17；M：DL2000Marker。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，引物由上海生工生物工程公司合成。小麦近等基因系、TcLr24×Thatcher杂交后代及小麦品种等植物材料均由河北农业大学小麦叶锈病研究中心收集保存。
实施例1、小麦抗叶锈病基因Lr24 AFLP-STS标记的获得
用对小麦抗叶锈病基因Lr24低毒，对感病亲本Thatcher高毒的小麦叶锈菌单孢菌系(BGQQ和SHRT)对TcLr24和Thatcher杂交的F1和F2代群体进行苗期抗叶锈性鉴定，共鉴定F1群体10株，F2群体141株，结果F1全部抗病，F2抗感符合3∶1分离比例，如表1所示，表明TcLr24对BGQQ和SHRT的抗性由显性单基因控制。
表1 TcLr24×Thatcher F2群体对叶锈菌菌系BGQQ及SHRT抗感分离
选用224对AFLP引物以TcLr24、Thatcher和其F2代进行分析，基因组DNA经Pst I、Mse I双酶切、连接并进行预扩增，预扩产物稀释20倍。选扩反应总体系为20.0μL，反应液组成为1×PCR Buffer、dNTP 280μM、每个引物0.2μM，稀释20倍的预扩产物4.0μL，Tag聚合酶1U。反应程序为：94℃预变性2min后，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，12个循环(每循环退火温度降低0.7℃)，接着94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，23个循环，最后72℃延伸2min，10℃保存。
然后按下述方法对PCR扩增产物进行5.0％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体方法为：20μL扩增产物中加入8μL变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯氢氟)，94℃变性10min后，立即放入冰上冷却，每份变性的扩增样品取5μL在浓度为5.0％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。AFLP引物P-ACG/M-CGC对样品进行PCR扩增后，将抗病亲本及抗病单株中特异性片段回收，取所得洗脱液4μL用P-ACG/M-CGC进行再扩增。PCR纯化产物连接(pGEM-T easy载体)、转化(DH5α感受态细胞)，挑取3个独立的阳性克隆交与上海生工生物工程公司测序。所得序列为233bp，根据该序列设计合成的STS引物(A-S24)对TcLr24有特异性扩增，与预期片段大小相同。用该A-S24引物对TcLr24×Thatcher群体所有F2单株(其中抗病单株107株，感病单株34株)进行验证，可在抗病单株中扩增出预期的特异性条带，片段大小为212bp，见图1中扩增带。
实施例2、用A-S24分子标记筛选抗叶锈病近等基因系和小麦品种
试验用小麦抗叶锈病近等基因系：TcLr1、TcLr9、TcLr10、TcLr19、TcLr20、TcLr29、TcLr35、TcLr37、TcLr44。
试验用小麦品种：鄂恩1号、5R625、周19、1R13、1R17。
按常规方法种植上述小麦抗叶锈病近等基因系和小麦品种，并提取各材料的基因组DNA，然后以其为模板，在由序列表中引物A-S24的上下游核苷酸序列组成的引物对的引导下，进行PCR扩增，20μL PCR反应体系为：模板DNA 50ng，Taq酶1U，上、下游引物(5μmol·L-1)各1.0μL，dNTP(10mmol·L-1)0.5μL，10×PCR缓冲液2.0μL，其余用无菌蒸馏水补冲反应体系至20.0μL。反应程序为：94℃预变性3min，随后进行35个循环：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，10℃保存。
获得的PCR扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。引物A-S24在小麦品种5R625、1R13和1R17可扩增出212bp的特异性条带，表明这几个材料含有Lr24抗叶锈病基因，与这几个材料抗性鉴定结果一致，除TcLr24外，其余小麦抗叶锈病近等基因系及另外2个小麦品种材料不含有该抗病基因，见图2中扩增带，证明212bp扩增片段的有无与是否含Lr24基因密切相关。
序列表
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>1
gagtaacgcgcctcaaatgt
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>2
ggaggaaaggaaaaggttcg
Claims (4)
1.一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的专用引物，其特征在于，引物对由序列表中的序列1与序列2配对组成，序列分别为，序列1：gagtaacgcgcctcaaatgt，序列2：ggaggaaaggaaaaggttcg。
2.一种筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，其特征在于，是以待测小麦品种基因组DNA为模板，在由权利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，20μL PCR反应体系为：模板DNA 50ng，Taq酶1U，上、下游引物各1.0μL，dNTP0.5μL，10×PCR缓冲液2.0μL，其余用无菌蒸馏水补充反应体系至20.0μL；反应程序为：94℃预变性3min，随后进行35个循环：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，10℃保存。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，检测扩增产物的方法为：对扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010186434 CN101967518B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010186434 CN101967518B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101967518A CN101967518A (zh) | 2011-02-09 |
| CN101967518B true CN101967518B (zh) | 2013-01-30 |
Family
ID=43546740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010186434 Expired - Fee Related CN101967518B (zh) | 2010-05-26 | 2010-05-26 | 一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101967518B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104911190A (zh) * | 2014-03-10 | 2015-09-16 | 河北农业大学 | 一个与小麦垂直抗叶锈相关的TaPDRABCG基因 |
| CN104975073A (zh) * | 2014-04-09 | 2015-10-14 | 河北农业大学 | 鉴定小麦叶锈菌生理小种thts特异引物应用 |
| CN107630107B (zh) * | 2017-11-21 | 2021-08-24 | 山东农业大学 | 一种快速检测长穗偃麦草抗叶锈病基因的分子标记及应用 |
| CN113151571B (zh) * | 2021-05-26 | 2022-10-28 | 河北农业大学 | 用于检测小麦叶锈菌无毒基因AvrLr1分子标记的引物及其检测方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101260437A (zh) * | 2008-04-21 | 2008-09-10 | 河北农业大学 | 一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物 |
-
2010
- 2010-05-26 CN CN 201010186434 patent/CN101967518B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101260437A (zh) * | 2008-04-21 | 2008-09-10 | 河北农业大学 | 一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 《Leaf rust resistance genes of wheat:identification in cultivars and resistance sources》;Lukasz STEPIEN etc;《Journal of Applied Genetics》;20031231;第44卷(第2期);139-149 * |
| 《小麦抗叶锈病基因Lr24的一个新STS标记》;张娜 等;《作物学报》;20081231;第34卷(第2期);212-216 * |
| Lukasz STEPIEN etc.《Leaf rust resistance genes of wheat:identification in cultivars and resistance sources》.《Journal of Applied Genetics》.2003,第44卷(第2期),139-149. |
| 刘志勇等.小麦抗叶锈基因Lr9、Lr24的分子标记辅助选择研究.《农业生物技术学报》.2000,(第01期), |
| 小麦抗叶锈基因Lr9、Lr24的分子标记辅助选择研究;刘志勇等;《农业生物技术学报》;20000330(第01期) * |
| 张娜 等.《小麦抗叶锈病基因Lr24的一个新STS标记》.《作物学报》.2008,第34卷(第2期),212-216. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101967518A (zh) | 2011-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xiao et al. | Genetic structure and linkage disequilibrium pattern of a rapeseed (Brassica napus L.) association mapping panel revealed by microsatellites | |
| Song et al. | Identifying genetic diversity and a preliminary core collection of Pyrus pyrifolia cultivars by a genome-wide set of SSR markers | |
| CN102162011B (zh) | 一个水稻抗稻瘟病基因的分子标记方法 | |
| CN101302564B (zh) | 一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物及其应用 | |
| CN102154471B (zh) | 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法 | |
| CN102154470A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因Pi-hk1(t)的分子标记方法 | |
| CN101967518B (zh) | 一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物 | |
| CN110129478A (zh) | 一种快速鉴定或辅助鉴定番茄可溶性固形物的dCAPS分子标记及应用 | |
| CN104178560A (zh) | 水稻柱头外露主效qtl位点的分子标记方法 | |
| Li et al. | Analysis of the genetic relationships in Chinese Ziziphus with SRAP markers | |
| CN101260437B (zh) | 一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物 | |
| CN101423867A (zh) | 一种鉴定大白菜—甘蓝异附加系的方法 | |
| CN102140455B (zh) | 砀山酥梨果实单果重主效qtl的分子标记及其应用 | |
| CN106222262B (zh) | 引物对及其在鉴别水稻氮高效利用基因nrt1.1b基因型中的应用 | |
| CN103290002B (zh) | 小麦分蘖QTL QMtn.sicau-2B.1的分子标记及应用 | |
| CN104818271B (zh) | 一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记HRM5及其应用 | |
| CN110106279A (zh) | 基于老芒麦基因组序列开发的单位点ssr引物组及其应用 | |
| Sun et al. | Genetic variation in eight Chinese cattle breeds based on the analysis of microsatellite markers | |
| He et al. | Intraspecific DNA methylation polymorphism in the non-edible oilseed plant castor bean | |
| CN104818272B (zh) | 一种小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记SSR52及其应用 | |
| Xie et al. | Genetic diversity and phylogenetic relationships among five endemic Pinus taxa (Pinaceae) of China as revealed by SRAP markers | |
| CN101838694B (zh) | 一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用 | |
| CN104561353B (zh) | 与甘蓝育性紧密连锁的InDel标记及其检测方法和应用 | |
| CN110305982A (zh) | 小麦白粉病抗性基因mlxbd跨内含子分子标记及应用 | |
| CN105177020B (zh) | 小麦颖壳绒毛基因Hg连锁的SSR分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130130 Termination date: 20150526 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |