CN101838694B

CN101838694B - 一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用

Info

Publication number: CN101838694B
Application number: CN201010124621A
Authority: CN
Inventors: 李在峰; 刘大群; 张海; 李星; 王海燕; 张汀
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: CN101838694A

Abstract

本发明公开了一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用，所述引物序列是由序列表中引物wms582和barc8的上下游核苷酸序列组成的引物对。本发明提供了一个新的小麦抗叶锈病基因LrBi16的SSR标记cfa2257和gwm344，连锁距离分别为2.8cM和2.9cM，LrBi16对我国目前多数小种表现抗病。利用与该抗病基因紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明中发现的新抗叶锈基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用，尤其是一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用。

背景技术

小麦叶锈病是一种世界性病害，对小麦生产会造成严重的危害。小麦叶锈病菌适应不同的气候条件，可在全世界不同的小麦种植区发生，若条件适宜可造成40％甚至更大的产量损失(Knott 1989)。在我国，小麦叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、黄淮麦区也日趋严重。在我国1969年、1973年、1975年、1979年和1998年曾几度大面积流行，造成严重减产。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的最经济、有效、快捷的方法。目前已有66个抗叶锈病基因正式命名(McIntosh et al.2009)，其中大多数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Lr9，Lr19，Lr24和Lr38，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。

目前，在寻找和发掘抗源的过程中，分子标记技术使用较为广泛，特别是在小麦的基因作图中得到了广泛应用。分子标记包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP，近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗叶锈病基因。其中SSR标记由于其多态性高、共显性、稳定性好及染色体位置清楚而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和聚合育种。在利用分子标记进行抗性筛选和鉴定的过程中，特异性的引物是关键。

小麦品种毕麦16由贵州省毕节地区农科所在2004年育成，累积推广种植面积达20万公顷，其综合农艺性状优良，田间高抗小麦叶锈病和条锈病，苗期高抗我国大多数叶锈菌生理小种(Li et al.2006，2010)，可能含有新的抗叶锈基因。进一步通过对毕麦16和Thatcher杂交产生的F₁、F₂和F₃群体用于遗传分析和基因定位，将抗病基因定位于7BL染色体上，该基因命名为LrBi16，找到了与抗病基因紧密连锁的SSR标记，可用于标记辅助育种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列，用于筛选LrBi16基因。

为解决上述技术问题，本发明所述引物序列包括cfa2257和wms344。

其中引物cfa2257由序列表中其上游序列(20个碱基)和下游序列(25个碱基)组成；引物wms344由序列表中其上游序列(20个碱基)和下游序列(20个碱基)组成，见表1。

表1用于检测抗叶锈基因的两引物上下游序列

引物名称	上游序列	下游序列
			cfa2257	5’GATACAATAGGTGCCTCCGC 3’	5’CCATTATGTAAATGCTTCTGTTTGA 3’
wms344	5’CAAGGAAATAGGCGGTAACT 3’	5’ATTTGAGTCTGAAGTTTGCA 3’

本发明所提供的用于筛选小麦抗叶锈病基因的分子标记分别是cfa2257和gwm344，标记cfa2257由引物cfa2257扩增获得(188bp)，标记gwm344由引物wms344扩增获得(185bp)。

本发明还提供了引物序列在筛选小麦叶锈病基因中的应用。

本发明应用的具体方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物cfa2257和wms344的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用cfa2257扩增的产物有188bp条带，并且用wms344扩增的产物有185bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶锈病基因LrBi16。

本发明应用中所述的PCR扩增中：

20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，4μmol·L^-1的上、下游引物各2μL，10mmol·L^-1的dNTP 0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL；

PCR反应程序为：先94℃5min；然后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min，4℃保存。

本发明应用中所述的对扩增产物进行检测是：对扩增产物在6％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后银染显色。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明提供了一个新的小麦抗叶锈病基因LrBi16的SSR标记cfa2257和gwm344，连锁距离分别为2.8cM和2.9cM，LrBi16对我国目前多数小种表现抗病。利用与该抗病基因紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明中发现的新抗叶锈基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是用微卫星引物cfa2257对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果；

图2是用微卫星引物wms344对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果；

图3是7个SSR标记与抗叶锈病基因LrBi16的连锁图。

具体实施方式

用于筛选小麦抗叶锈病基因LrBi16的引物，是由序列表中引物cfa2257和wms344的上下游核苷酸序列组成的引物对。

应用本引物序列筛选小麦抗叶锈病基因LrBi16的具体方法如下：

1、提取待测小麦基因组DNA为模板；

2、以cfa2257和wms344为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增。20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4μmol·L^-1)各2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL；反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸10min，最后4℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入变性载样指示剂，94℃变性10min后，于冰水混合物中冷却，然后在浓度为6％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若扩增产物中含有188bp和185bp大小的条带，则待测小麦有抗叶锈病基因。所述变性载样指示剂组成为：98％(v/v)无离子甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.25％(w/v)溴酚蓝，0.25％(w/v)二甲苯氢氟，溶剂为蒸馏水。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实验例：

小麦抗叶锈病新基因LrBi16的SSR标记gwm344和cfa2257的获得：

用我国目前强毒力叶锈菌生理小种FHTT对小麦材料毕麦16和Thatcher的F₁、F₂和F₃代群体进行苗期抗病性鉴定，共鉴定16个F₁单株、F₂群体359株和298个F₃家系，毕麦16表现中抗，Thatcher表现感病，F₁全部抗病，F₂中有258株表现抗病，101株表现感病，抗感分离符合3∶1(χ²＝1.88，P＞0.1)。298个F₃家系中65个家系表现纯合抗病，165个家系表现抗感分离，68个家系表现为感病。F₃家系分离比例为纯合抗∶抗感分离∶纯合感＝1∶2∶1(χ²＝3.5，P＞0.1)如表2所示，表明毕麦16中含有一个显性抗病基因，命名为LrBi16。从F₂代单株中选用10个抗病单株和10个感病单株分别组成抗病池和感病池。

选用1255个SSR引物，其中WMC(Wheat Microsatellite Consortium)系列引物416个，BARC系列引物442个，GWM(Gatersleben wheatmicrosatellite)系列引物175个，CFA系列引物222个，所有引物序列源自美国农业部网站(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/quickquery.shtml)，以毕麦16、Thatcher、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR检测，20μLPCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4μmol·L^-1)各2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL。PCR反应程序为：先94℃5min；然后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min，4℃保存。

然后按下述方法对PCR扩增产物进行6T％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：取20μL扩增产物，加入5μL变性载样指示剂(98％(v/v)无离子甲酰胺，10mM EDTA(pH＝8.0)，0.25％(w/v)溴酚蓝和0.25％(w/v)二甲苯氢氟)，94℃变性10min后，4℃保存，每份变性的扩增样品取5μL在浓度为6T％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果位于染色体7BL上的7个SSR位点barc50、barc32、wmc70、cfa2257、barc182、gwm146和gwm344在亲本和抗感池之间有多态性，初步表明这些位点和抗叶锈病基因连锁，其中用微卫星引物cfa2257和wms344对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增产物的检测结果如图1和图2所示(P1为毕麦16，P2为Thatcher，Br为抗病池，Bs为感病池，R为抗病单株，S为感病单株)，用引物cfa2257检测出现了3种电泳带型，分别称为带型A、B和H(杂合带型)，毕麦16、抗病池和抗病单株可扩增出188bp的DNA片段，见图1中带型A，P2、感病池和感病单株可扩增出208bp的DNA片段，见图1中带型B。用引物wms344检测出现了2种电泳带型，分别称为D和B，毕麦16、抗病池和抗病单株可扩增出185bp的DNA片段，见图2中D带型，P2、感病池和感病单株不能扩增出特异的DNA片段，为图2中B带型。

用染色体7BL上的7个SSR标记barc50、barc32、wmc70、cfa2257、barc182、gwm146和gwm344对F₂群体354个单株分别进行检测(反应体系和反应条件同上)，用Mapmanager QTX b2.0进行处理，绘制基因连锁图，如图3所示，表明这7个标记都与抗病基因连锁，遗传距离从2.8cM到19.6cM。距抗病基因较近的两个标记cfa2257和gwm344遗传距离分别为2.8cM和2.9cM。

用两个标记cfa2257和gwm344对298个F₃家系进行检测，结果如表1所示，表明这两个标记与抗病基因的遗传距离分别为3.6cM和4.0cM。表1298个F₃家系的苗期鉴定结果及SSR标记cfa2257和gwm344在各个F₃

家系中带型

注：A和D为抗病带型，H为杂合带型，B为感病带型。

实施例1：

1、提取毕麦16基因组DNA为模板；

2、以cfa2257和wms344为引物、毕麦16基因组DNA为模板，进行PCR扩增。20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4μmol·L^-1)各2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL；反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸10min，最后4℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入变性载样指示剂，94℃变性10min后，于冰水混合物中冷却，然后在浓度为6％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，扩增产物中含有188bp和185bp大小的条带，表明毕麦16含有抗叶锈病基因LrBi16。

实施例2：

1、提取Thatcher基因组DNA为模板；

2、以cfa2257和wms344为引物、Thatcher基因组DNA为模板，进行PCR扩增。20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，上、下游引物(4μmol·L^-1)各2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL；反应程序是94℃预变性5min，随后进行35个循环：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min；72℃延伸10min，最后4℃保存。

3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入变性载样指示剂，94℃变性10min后，于冰水混合物中冷却，然后在浓度为6％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，引物cfa2257扩增产物中不含有188bp(含有208bp)以及引物wms344扩增产物中不含有185bp大小的条带，表明Thatcher不含有抗叶锈病基因LrBi16。

<110>河北农业人学

<120>一种用于筛选小麦抗叶锈病基因的引物序列及其应用

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物cfa2257的上游序列

<400>1

gatacaatag gtgcctccgc 20

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物cfa2257的下游序列

<400>2

ccattatgta aatgcttctg tttga 25

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物wms344的上游序列

<400>3

caaggaaata ggcggtaact 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物wms344的下游序列

<400>4

atttgagtct gaagtttgca 20

Claims

1.一种用于筛选含有抗叶锈病基因小麦的引物，其特征在于：该引物是由引物cfa2257和wms344的上下游核苷酸序列组成的引物对；

所述引物cfa2257的上游序列为：5' GATACAATAGGTGCCTCCGC 3'，下游序列为：5' CCATTATGTAAATGCTTCTGTTTGA 3'；

所述引物wms344的上游序列为：5' CAAGGAAATAGGCGGTAACT 3'，下游序列为：5' ATTTGAGTCTGAAGTTTGCA 3'。

2.权利要求1所述的引物在筛选含有抗叶锈病基因小麦中的应用。

3.根据权利要求1所述的引物在筛选含有抗叶锈病基因小麦中的应用，其特征在于：以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物cfa2257和wms344的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用cfa2257扩增的产物有188 bp条带，并且用wms344扩增的产物有185 bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶锈病基因。

4.根据权利要求3所述的引物在筛选含有抗叶锈病基因小麦中的应用，其特征在于，所述的PCR扩增：

20 μl PCR反应体系为：模板DNA 60 ng，Taq 酶1U，4 μmol·L^-1的上、下游引物各2 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 0.4 μL，10 × PCR缓冲液2μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；

PCR反应程序为：先94℃ 5 min；然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环；最后72℃ 10 min，4℃保存。

5.根据权利要求3或4所述的引物在筛选含有抗叶锈病基因小麦中的应用，其特征在于，所述的对扩增产物进行检测是：对扩增产物在6％(w/v)的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后银染显色。