CN1858256A

CN1858256A - 一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物

Info

Publication number: CN1858256A
Application number: CN 200610058736
Authority: CN
Inventors: 何中虎; 郑天存; 夏先春; 李在峰; 李新平
Original assignee: Zhoukou Academy of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhoukou Academy of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2006-11-08

Abstract

本发明公开了一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。用于筛选抗条锈病小麦的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。该筛选抗条锈病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，在由序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有265bp大小的条带，并且在由序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有238bp大小的条带的小麦品种为抗条锈病小麦。SSR标记Xcfa2040和Xbarc32的连锁距离分别为1.4cm和4.8cm。本发明的新抗病基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。

背景技术

小麦条锈病(Puccinia striiformis f.sp.tritici)是一种分布广泛的气传病害，几乎在所有小麦主产国家都有发生，冷凉和高海拔地区尤为严重。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，主要发生在我国的西北和西南地区。从20世纪50年代至今，我国曾发生15次中度流行和7次较大规模流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行发生面积最大，危害也最重，前两次发病面积达2亿亩以上，后两次发病1.1亿亩以上，分别损失小麦600、300、265和100万吨(万安民等，2002年我国小麦条锈病发生回顾植物保护2003，29(2)：5-8)。选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。目前已经命名的小麦抗条锈病基因有40个，分布于37个位点(有3个复等位基因)，这些命名的基因多是有生理专化性的苗期抗病基因，苗期抗病基因由于其对条锈病害的高抗而深受育种家喜爱，但是当大面积种植抗病基因单一的品种会加速病原物小种的定向化选择，并哺育优势小种种群的增长，导致抗锈品种在生产上大面积应用几年之后丧失其抗病性。由于“洛类”和“繁6”衍生系的大面积种植导致新致病小种CYR31和CYR32的出现而爆发了2002年的条锈病大流行。由于认识到单一抗病基因的潜在危害，育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Yr5、Yr10、Yr15、Yr24和Yr26，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。

分子标记(包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP)在小麦的基因作图中得到了广泛应用，近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗条锈病基因。SSR标记由于其多态性高，适合基因定位和作图，共显性和重复性好而受到更广泛的应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和聚合育种。

1987年育成的小麦品系周8425B是一个很好的抗病育种材料，是目前抗我国所有条锈菌流行小种。以周8425B为亲本材料已育出7个推广品种，其中周麦11和周麦12从1997到2005年每年平均种植面积50万公顷。我们对周8425B进行苗期基因推导发现其可能含有新的抗条锈病基因，进一步通过对周8425B和中国春杂交产生的F₁、F₂和F₃进行遗传分析和分子标记，将抗病基因定位于7BL染色体上，找到其紧密连锁的SSR标记，并用于标记辅助育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于筛选抗条锈病小麦的引物。

本发明所提供的用于筛选抗条锈病小麦的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。

将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为cfa2040，序列表中SEQ ID №：1由24个碱基组成，SEQ ID №：2由20个碱基组成，将用引物对cfa2040经PCR扩增得到的分子标记命名为Xcfa2040；将由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对命名为barc32，序列表中SEQ ID №：3由26个碱基组成，SEQ ID №：4由26个碱基组成，将用引物对barc32经PCR扩增得到的分子标记命名为Xbarc32。

本发明的第二个目的是提供一种筛选抗条锈病小麦的方法。

本发明所提供的筛选抗条锈病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对cfa2040的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有265bp大小的条带，并且在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对barc32的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有238bp大小的条带的侯选小麦品种为抗条锈病小麦。

其中，20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天为时代公司)，上、下游引物(2μmol·L^-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L^-1)0.2μl，10×PCR缓冲液2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl。反应程序为：94℃预变性4min，随后进行35个循环：94℃变性40s，55℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体方法可为：取20μl扩增产物，加入4μl变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，94℃变性5min后，立即放入冰水混合物中冷却5-10min，每份变性的扩增样品6μl在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。检测扩增产物中是否有265bp和238bp大小的条带。

本发明提供了一个新的小麦抗条锈病基因的SSR标记Xcfa2040和Xbarc32，连锁距离分别为1.4cM和4.8cM，该抗条锈病基因对我国目前的流行小种都表现抗病。利用该抗病基因紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明的新抗病基因及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为用微卫星引物cfa2040对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果

图2为用微卫星引物Xbarc32对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果

图3为7个SSR标记与该抗病基因的连锁图

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成均由大连宝生物(TaKaRa)公司或上海生工完成。小麦材料周8425B由河南省周口市农科院选育，未注明来源的小麦材料均购自于国家种质资源库。

实施例1、小麦抗条锈病新基因的SSR标记Xcfa2040和Xbarc32的获得及基因来源鉴定

一、小麦抗条锈病新基因的SSR标记Xcfa2040和Xbarc32的获得

用我国目前流行的条锈病小种CYR32对小麦材料周8425B和中国春(亲本)的F₁、F₂和F₃代群体进行苗期抗性鉴定，共鉴定F₁群体8株，F₂群体611株，F₃家系97株，结果如表1所示，F₁全部抗病，F₂抗感分离符合3∶1(x²＝2.91，P＞0.05)，F₃家系分离比例为纯合抗∶抗感分离∶纯合感＝1∶2∶1(x²＝1.268，P＞0.5)，表明周8425B中含有一个显性抗病基因。从中选用20个典型抗病株和10个感病株分别组成抗病池和感病池。

表1 亲本周8425B、中国春以及它们的后代F₁和F₂群体对小种CYR32的苗期侵染型

植物材料	各种侵染型的分离
	各种侵染型的分离					0	0；	1	2	3	4
	中国春周8425BF₁F₂	2121	688	48231	25	0	0；	1	2	3	4	18146

说明：0；-2为抗病侵染型；3-4为感病侵染型

选用790个SSR引物，其中GWM(Gatersleben wheat microsatellite)系列240个(http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes?arg1=WMS*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，WMC(Wheat Microsatellite Consortium)系列543个(http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes?arg1=WMC*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，5个BARC系列引物(barc10、barc32、barc94、barc123和barc182，http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes?arg1=BARC*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，2个CFA系列引物(cfa2040和cfa2106，http://www.graingenes.org/cgi-bin/ace/queryEdit/graingenes?arg1=CFA*&run=1&query=microsatellites&arg2=1D)，以周8425B、中国春、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR检测，20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天为时代公司)，上、下游引物(2μmol·L-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR缓冲液2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl。PCR反应程序为：先94℃ 4min；然后94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min，4℃保存。

然后按下述方法对PCR扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，取20μl扩增产物，加入4μl变性载样指示剂(98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青)，94℃变性5min后，立即放入冰水混合物中冷却5-10min，每份变性的扩增样品6μl在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果位于染色体7BL上的7个标记Xgwm577、Xwmc273、Xwmc276、Xwmc526、Xbarc32、Xbarc182和Xcfa2040在亲本和抗感池之间有多态性，初步表明这些标记和抗条锈病基因连锁，其中，用微卫星引物Xcfa2040(序列表中的序列1和序列2)和Xbarc32(序列表中的序列3和序列4)对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增产物的检测结果如图1和图2所示(M为Marker，P1为周8425B，P2为中国春，Br为抗病池，Bs为感病池，R为抗病单株，S为感病单株)，用引物cfa2040扩增，出现了3种电泳带型，分别称为带型A(265bp)、B(286bp)和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单株可扩增出265bp的DNA片段，见图1中带型A，P2、感病池和感病单株可扩增出286bp的DNA片段，见图1中带型B；用引物Xbarc32扩增，出现了3种电泳带型，分别称为带型A(238bp)、B(213bp)和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单株可扩增出238bp的DNA片段，见图1中带型A，P2、感病池和感病单株可扩增出213bp的DNA片段，见图1中带型B。

再用染色体7BL上的7个引物Xgwm577、Xwmc273、Xwmc276、Xwmc526、Xbarc32、Xbarc182和Xcfa2040对F₂群体611个单株分别进行扩增(反应体系和反应条件同上)，用Mapmanager QTX b20进行处理，绘制基因连锁图，如图3所示，表明这7个标记都与抗病基因连锁，遗传距离从1.4cM到11.3cM。

用距离抗病基因较近的两个标记Xcfa2040和Xbarc32对97个F₃家系进行检测，结果如表2所示，用Mapmanager QTX b20进行处理，表明这两个标记与抗病基因的遗传距离分别为5.7cM和5.6cM。

表2 97F₃家系的苗期鉴定结果及SSR标记Xcfa2040-7B和Xbarc32-7B在各个F₃家系中带型

标记	基因型	带型			总和
		带型				A	H	B
		Xcfa2040-7BXbarc32-7B	RRRrrrTotalRRRrrrTotal	2913027229		A	H	B	43346241245	2192132023	2946229729462297

说明：RR表示纯合抗病的家系，Rr表示发生抗感分离的家系，Rr表示纯合感病的家系；A代表周8425B中的带型，B代表中国春中的带型，H代表杂合带型。

二、小麦抗条锈病新基因的来源鉴定

现检测该抗条锈病基因的来源，对周8425B的两个亲本周78A和安农7959用CYR32进行苗期抗性鉴定，周78A由于没有发芽没有作鉴定，安农7959对CYR32表现中抗，与周8425B反应型相同，又分别用引物对cfa2040和barc32以周8425B、中国春、周78A和安农7959的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果安农7959与周8425B带型一致，两个引物分别扩增出265bp和238bp与抗病基因连锁的带型，周78A和中国春的带型相同，分别扩增出286bp和213bp在感病植株里出现的带，表明周8425B中的该抗条锈病基因来源于安农7959。

实施例2、用Xcfa2040和Xbarc32分子标记筛选抗条锈病小麦

实验用小麦品种：练丰一号、山前麦、St2422/464和安农7959

按常规方法种植上述小麦品种，收获籽粒后提取各个小麦品种的基因组DNA，然后以其为模板，分别在由序列表中引物cfa2040和barc32的上下游核苷酸序列组成的引物对的引导下，进行PCR扩增。20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U(北京天为时代公司)，上、下游引物(2μmol·L^-1)各1.5μl，dNTPs(25μmol·L^-1)0.2μl，10×PCR缓冲液2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl。PCR反应程序为：先94℃ 4min；然后94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min，4℃保存。将得到的PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色，引物cfa2040扩增出两种带型为A(265bp)和B(286bp)，在小麦品种练丰一号、山前麦和St2422/464中扩增出了B带(286bp)，在安农7959扩增出了A带(265bp)；引物barc32扩增出的两种带型为A(238bp)和B(213bp)，练丰一号、山前麦和St2422/464中扩增出B带(213bp)，安农7959扩增出A带(238bp)，表明安农7959含有实施例1中的抗条锈病新基因，另外几个品种不含有该抗病基因，与抗病性鉴定结果一致，证明Xcfa2040的265bp扩增片段和Xbarc32的238bp扩增片段的有无同小麦品种的条锈病抗性有无密切相关。

序列表

<160>4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

tcaaatgatt tcaggtaacc acta 24

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

ttcctgatcc caccaaacat 20

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>3

gcgtgaatcc ggaaacccaa tctgtg 26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>4

tggagaacct tcgcattgtg tcatta 26

Claims

1、用于筛选抗条锈病小麦的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对以及由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对。

2、一种筛选抗条锈病小麦的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，在权利要求1所述的由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有265bp大小的条带，并且在由序列表中序列3和序列4的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有238bp大小的条带的侯选小麦品种为抗条锈病小麦。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：20μl PCR反应体系为：模板DNA 60ng，Taq酶1U，2μmol·L^-1上、下游引物各1.5μl，25μmol·L^-1dNTPs 0.2μl，10×PCR缓冲液2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；PCR反应程序为：先94℃4min；然后94℃40s，55℃1min，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min。

4、根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述检测扩增产物方法为：对扩增产物进行6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。