CN113832249B - 小麦骨干种质周8425b特异性染色体片段检测的分子标记及其应用 - Google Patents

小麦骨干种质周8425b特异性染色体片段检测的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，具体涉及小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记及其应用。所述分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列Z84‑1B‑1F和Z84‑1B‑1R所示的引物对进行PCR扩增，再以质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为207bp的DNA片段，申请人将该标记命名为ZH84‑ 1B‑1。分子标记ZH84‑1B‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该分子标记可用于检测小麦植株是否有周8425B特异的1BL/1RS易位片段。本发明提供的分子标记是周8425B特异性的、与三种病害基因连锁，能够同时用于三种病害的分子标记辅助选择，一次杂交后、该标记可以同时检测育种材料中是否导入了3个抗病基因，将抗病育种的检测效率提高了2倍。

Description

小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记及 其应用
技术领域
本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，具体涉及小麦骨干种质周8425B特异性染 色体片段检测的分子标记及其应用。
背景技术
小麦是我国最主要口粮作物之一，黄淮麦区小麦播种面积、总产量和商品粮调出率 分别占全国60％、70％、80％左右以上，对国家粮食安全和农产品有效供给起着举足轻重的 影响。70年代后该区小麦产量由长期低产快速向中高产过渡，但当时小麦品种大多秆高倒 伏、病害多发，严重影响小麦产量的进一步提高，小麦育种中亟待创制矮秆高产、抗病抗逆 的骨干亲本新种质。
小麦骨干种质周8425B是利用六倍体小黑麦与含有意、苏、德、英、中等国遗传背景的普通小麦品种进行远缘杂交，运用阶梯式复合杂交、辐射诱变和染色体检测等技术，创制出的新型1BL/1RS易位系小麦新种质。其培育过程如下：1978年选用大穗多粒、抗病耐 旱的六倍体小黑麦广麦74与早熟中矮秆的普通小麦练丰1号进行远缘杂交，以期解决小黑 麦广麦74秆高(125cm)、晚熟问题，而实现中秆大穗、中早熟的目标。针对远缘杂交亲和 性差，经重复授粉结实28粒；针对异源染色体配对困难、雄花败育问题，1979年F1与中大 穗、花粉量较大的普通小麦山前麦进一步杂交，提高了结实率，收到种子212粒。为了增加 变异、促进异源染色体交换易位，1980年对回交BC1F0干种子212粒进行钴60中等剂量辐 射(7.74c/kg)，存活成株116株；1981～1983年F2～F5大群体种植及F3加代，选育出中矮 秆、抗病、大粒(千粒重60g)的中间材料周78A，但籽粒饱满度差。1984年周78A与大 粒且饱满的安农7959杂交，以期实现矮秆大穗、籽粒饱满、多抗的目标。针对辐射诱变和 阶梯式复合杂交纯合速度慢的问题，采取加代技术，1984年春化处理后夏繁加代为F1， 1985年F2扩大群体种植，重点针对矮秆大穗、抗病落黄好、籽粒饱满度好等性状进行选 择，选出84株，1985年夏对84株全部加代为F3，1986～1988年F4～F5连续选优及接种条 锈病、叶锈病和白粉病病菌，1988年F5第25个株系表现稳定符合创育目标，定名为周 8425B。周8425B具有多个优良性状：矮秆(株高70cm)、大穗(穗长15cm)、大粒(千 粒重50g)、叶片短宽内卷上冲、对条锈病、叶锈病和白粉病高抗至免疫。
自上世纪80年代创制以来，周8425B在全国10余个省市用作亲本，至2019年育成审定衍生新品种415个。衍生品种形成了周麦、郑麦、百农、豫麦、存麦、中麦等品种系 列，种植面积占黄淮南片麦区65％以上，对黄淮麦区小麦品种更新换代、生产发展及我国粮 食安全和农民增产增收作出了重要贡献(简俊涛等，周8425B与小偃81的RIL品质、物 候型及农艺性状分析，中国种业，2020,11:76-80；唐建卫等，小麦骨干亲本周8425B及其 衍生品种(系)的农艺性状和加工品质综合分析.麦类作物学报,2015,35:777-784；张德强等， 小麦周8425B及其衍生品种与黄淮麦区主栽品种的遗传解析，麦类作物学报2016，36： 1328-1334)。
周8425B具有矮秆抗倒、大穗大粒、抗条锈病叶锈病白粉病等突出特点，截止目前，从周8425B中已发现20余个新基因和17个与产量和生理性状显著相关的QTL区域， 尤其是在其1B染色体上有多个抗病、高产相关的基因/QTL，如抗条锈病的YrZH84.2、QYr caas-1B，抗叶锈基因LrZH84，抗白粉病QTL QPm.caas-1BL，穗数、穗粒数、穗长相关 QTLQSN.caas-1BL、QKNS.caas-1BS.1、QSL.caas-1BL等(Jia et al.Mapping and validationof a new QTL for adult-plant resistance to powdery mildew in Chinese elitebread wheat line Zhou8425B.Theor Appl Genet,2018,131:1063-1071；Zhang etal.QTL mapping of adult-plant resistance to leaf rust in the wheat cross Zhou8425B/Chinese Spring using high-density SNP markers.Front plant sci,2017,8:793；Gao et al.Genome-wide linkage mapping of QTL for yield components,plantheight and yield-related physiological traits in the Chinese wheat cross Zhou8425B/Chinese Spring.Front plant sci,2015,6:1099；肖永贵等，小麦骨干亲本“周8425B” 及其衍生品种的遗传解析和抗条锈病基因定位.中国农业科学,2011,44:3919-3929)。虽然针 对每个抗病、产量相关的基因或QTL都开发了相应的分子标记，但是这些分子标记每次只 能检测一个位点，效率较低，目前还没有针对小麦骨干种质周8425B的多个位点进行特异 性检测的分子标记。
小麦病害的严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，在自然大田条件下，不同病害表型鉴定的结果在不同年度与地点间往往不稳定，给育种工作带来了 较大的困扰。黄淮冬麦区是我国小麦生产的优势核心产区，而该区目前推广利用的小麦品种 普遍感条锈病、叶锈病、白粉病等小麦病害。目前生产上应对小麦病害的主要措施为化学药 物防治，虽然有一定的防治效果，但是不可避免的会带来环境污染问题，同时增加生产成 本，而培育和种植抗病小麦品种是防治小麦病害最经济和有效的手段。可见，培育兼抗多种 病害的小麦新品种已成为小麦生产上亟待解决的问题之一。
白粉病、条锈病、叶锈病是黄淮麦区小麦常发病害，通过分子标记辅助选择，可以将抗上述三种病害的基因/QTL聚合在高产品种中，加快多抗小麦新品种培育的进程，然而不同基因聚合大大增强了育种的难度并延长了育种的时间，如果开发能对周8425B的 1BL/1RS易位片段进行特异性检测的分子标记，意味着可以一次性的检测是否导入多个抗 病、高产相关的基因，将大大提高育种效率，然而，目前没有见到可用于育种后代筛选的周8425B特异性的1BL/1RS易位片段检测的分子标记的报道。另外，小麦叶锈病比白粉病的 发生晚，黄淮麦区进行接菌鉴定一般在4月20日左右进入高发期，这时候多数的品种已经 入开花期，进行表型鉴定的结果只能指导下一年的杂交组合配置，而借助于分子标记检测可以根据抗病基因型配置杂交组合、使育种进程提前一年进行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对目前小麦骨干种质周8425B的1B染色体特异性检 测分子标记缺乏的问题，本发明提供一个特异性检测小麦骨干种质周8425B的1B染色体的 分子标记，判断小麦植株是否遗传了周8425B的1B染色体，进而预测小麦植株对叶锈病、条锈病、白粉病的抗性，加快高产、多抗小麦品种的选育进程。
具体的技术方案如下：
本发明提供一个小麦骨干种质周8425B的1B染色体特异性检测的分子标记，所述分子标记 是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列Z84-1B-1F和Z84-1B-1R所示的引物对进行PCR扩 增，再以质量分数为8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为207bp的DNA片段，申 请人将该标记命名为ZH84-1B-1。分子标记ZH84-1B-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明对周8425B、矮抗58、山前麦、矮孟牛、丰德存麦1号、周麦11号的1B染 色体的重测序数据进行序列比对，查找InDel位点，根据序列差异设计引物，开发了特异性 检测周8425B的1B染色体的分子标记，标记定位于1B染色体306294013bp～306294220bp 之间，与现有报道的基于黑麦染色体序列开发的小麦1BL/1RS易位系检测的标记不同，为 新开发的分子标记。
本发明分子标记的应用步骤如下所示；
a、采用小麦植株叶片DNA为模板，以Z84-1B-1F和Z84-1B-1R为引物对进行PCR扩增， 所述PCR反应体系为10μL体系，其中包括：2×HieffTM PCR Master Mix(No Dye)5μ L，10μmol/L的ZH84-1B-1F和ZH84-1B-1R引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL，3μL的ddH2O。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃退火30s和72℃延伸30S (40个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物。
本发明的小麦DNA模板是以小麦植株的叶片为样品提取获得的DNA，该叶片DNA 提取方法为本领域常规方法，如CTAB法提取(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术. 科学出版社,1998:370–372)；
b、取2uL PCR产物进行质量分数为8％的丙烯酰胺凝胶电泳，若电泳产物存在大小为207 bp的片段，则说明该样品1B染色体为周8425B特异性的，预测该小麦植株具有白粉病、叶 锈病与条锈病抗性；否则，则该样品1B染色体为非周8425B特异性，其白粉病、叶锈病、 条锈病抗性未知。
所述小麦植株为小麦骨干种质周8415B、以周8425B为亲本衍生的小麦品种、或以周8425B为父本与其它小麦品种杂交后回交得到的BC1群体；
本发明所述小麦骨干种质周8425B为发明人所在课题组参与创制的育种材料，用于1B染色 体序列比对的小麦品种矮抗58、山前麦、矮孟牛、丰德存麦1号、周麦11为发明人所在课 题组保存的育种材料。上述材料皆为本领域常见小麦种质资源。
本发明的创新性及积极有益效果：
周8425B为抗条锈病叶锈病白粉病、大穗大粒、矮秆抗倒的优异小麦骨干种质。虽然以周 8425B为亲本构建遗传群体，已经分别开发了针对不同病害以及大穗大粒性状相关的分子标 记，然而通过分子标记在同一个高产小麦品种中聚合三种病害的抗病基因要耗费大量的时间 与精力，另外，目前常规育种中对白粉病、条锈病、叶锈病的抗性鉴定方法往往在小麦拔节 后期进行，特别是叶锈病的鉴定在4月20日左右才能观察病害发生情况，其鉴定结果只能 指导下一年的杂交组合，这将耗费可贵的科研及育种时间。针对聚合多种主要小麦病害抗病 基因费时费力的现状，本发明提供了一个周8425B的1BL/1RS特异性检测的分子标记，用 于周8425B的特异性检测，其创新性及有益效果具体体现在以下三个方面：
1、节约时间：一般育种中，1个标记只能鉴定1个抗病性状，在高产品种中聚合源于周 8425B的抗白粉病、条锈病、叶锈病基因需要用3个分子标记进行3次检测，而本发明提供的分子标记是周8425B特异性的、与三种病害基因连锁，能够同时用于三种病害的分子标记辅助选择，一次杂交后、可以同时检测育种后代中是否导入了3个抗病基因，相对于常规育种一次鉴定1个抗病性状，将抗病育种的检测效率提高了2倍，而且检测结果能用于指导当年的杂交组合配置，节约了可贵的科研及育种时间。
2、结果稳定：本发明方法通过分子标记特异性检测小麦骨干种质周8425B的1B染色体片段，预测小麦品种对白粉病、条锈病与叶锈病的抗性与抗病单株的筛选，克服了常规抗病鉴定易受环境和人为等因素影响而导致的鉴定结果在年度与地点间不稳定的现象，且本 发明PCR扩增稳定，操作简单，便于不同单位使用。
3、降低成本、减少劳动量：相对于大田鉴定的致病菌培养、孢子液制作、致病菌接种、套袋保湿、病情调查等繁琐的环节，本发明方法仅需要提取DNA、进行PCR与凝胶电 泳，节省了大量的人力物力。
本发明方法通过分子标记检测，能够快速的进行小麦对白粉病、条锈病与叶锈病的 抗性预测与筛选，节省了宝贵的科研时间与大量的人力物力，且鉴定结果稳定。因此，本发 明方法可以同时准确、高效地筛选抗白粉病、条锈病与叶锈病的小麦品系，大大提高了高 产、多抗小麦的育种效率。
附图说明
图1：用本发明的方法对周8425B及其它1BL/1RS易位系进行标记Z84-1B-1检测的结果。
图中M为分子量标准(D2000 DNA Marker)；1～5分别为周8425B、以及周8425B 的亲本山前麦、广麦74、练丰1号、安农7959；6～13分别为兰考矮早8、兰考906、洛夫 林10、阿芙乐尔、洛夫林13、牛朱特、高加索、广麦74(国内外著名的1BL/1RS易位 系)；14～22分别为百农207、周麦36、周麦22、郑麦366、西农388、平安518、赛德麦5 号、新麦36、矮抗58(黄淮麦区生产上大面积推广的小麦品种)。
白色箭头所示为周8425B扩增出的Z84-1B-1标记的产物，大小为207bp，该分子标记与小麦白粉病、叶锈病、条锈病抗性相关，周8425B的亲本及矮孟牛等其它常见的 1BL/1RS小麦易位系对应位置无该标记。
具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
(1)实施例中的引物对序列为：
Z84-1B-1F：5′-TCCAGGACTCCCTCAAC-3′；
Z84-1B-1R：5′-AGGCGATGGATAGTCTAAT-3′；
(2)8％聚丙烯酰胺凝胶：100mL聚丙烯酰胺胶溶液中加入有7.7g丙烯酰胺和0.3g甲叉双 丙烯酰胺。
实施例1：
种质资源特异性检测：小麦骨干种质周8425B的亲本广麦74、练丰1号、山前麦与安农 7959，收集到其它国内外著名的1BL/1RS小麦种质矮孟牛、洛夫林10号、洛夫林13号、 兰考906、牛朱特、阿芙洛尔、高加索麦，以及百农207、周麦36、周麦22、郑麦366、西 农388、平安518、赛德麦5号、新麦36、矮抗58等黄淮麦区生产上大面积推广的小麦品 种和科研中常用的种质中国春。
小麦骨干种质周8425B是利用小黑麦与普通小麦品种进行远缘杂交，经过阶梯式复 合杂交、辐射诱变和染色体检测等技术，创制出的新型1BL/1RS易位系小麦新种质。首先是六倍体小黑麦广麦74与普通小麦练丰1号进行远缘杂交，其F1与普通1BL/1RS易位系小麦山前麦进一步杂交，提高了结实率；为了增加变异对回交BC1F0干种子进行钴60辐射； 然后从F2～F5大群体种植(F3加代)，选育出中矮秆、抗病、大粒但是籽粒饱满度差的周 78A，周78A与大粒饱满的安农7959杂交，连续选优及接种条锈病、叶锈病和白粉病病 菌，选育出矮秆抗倒、大穗大粒、叶片短宽内卷上冲、对条锈病叶锈病白粉病高抗至免疫的 新型1BL/1RS易位系周8425B。
发明人采用现有技术中报道的113对检测1BL/1RS的标记，都不能区分不同类型的易位系、更不能把周8425B特异的1BL/1RS易位片段检测出来。而周8425B有许多区别于 其它IBL/IRS易位系的性状，尤其是有许多优良的农艺性状与抗病性，需要有特异性的标记对其进行特异性检测。然而寻找用于周8425B进行特异性检测的标记具有很大的难度，其难点在于：
(1)小麦是6倍体(含A、B、D三个染色体组)，针对1个染色体组(如本发明中的1B 染色体)序列差异设计的引物，在另外两个染色体组不一定有差异，可能扩增不出特异的条带，要找到3个染色体组都有差异的DNA序列设计引物才能保证引物的特异性。
(2)1BL/1RS易位系小麦类型很多，如洛夫林类、矮孟牛类、山前麦类等等，许多 基于黑麦基因组序列开发的检测1BL/1RS的分子标记，能将周8425B与非易位系小麦品种 如中国春区分开、但不能区分不同类型的易位系。
发明人对周8425B、山前麦、矮孟牛、矮抗58、周麦11的1B染色体进行重测序， 通过序列比对，检测到1758个5bp以上的Indel位点，根据这些位点设计引物525对、开 发能特异性检测周8425B的PCR标记，其中仅有本发明所述的标记Z84-1B-1能够很好的对 周8425B进行特异性检测，其它引物对无法对周8425B的1BL/1RS易位片段进行有效的检 测。
2019年对周8425B、周8425B的亲本及矮孟牛等1BL/1RS易位系材料进行该标记的分子检测，具体检测方法如下：
a、样品采集：取周8425B、周8425B亲本及其它1BL/1RS易位系材料的籽粒2粒，锤头敲 碎成粉末，装入灭菌的2.0mL离心管中，用于提取DNA；
b、DNA提取：用CTAB的方法(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.科学出版社, 1998：370–372)提取步骤a中样品的DNA，
①加600μL CTAB提取液于离心管中，混合均匀，放置在65℃水浴锅1小时，每隔15分 钟摇匀一下；
②取出样品冰上冷却，加600μL氯仿/异戊醇(体积比24：1)，充分摇匀5分钟，室温，12000rpm，离心10min；
③取上清300μL，加300μL氯仿/异戊醇(体积比24：1)，充分摇匀5分钟，室温，12000rpm，离心10min；
④备新的离心管，预先加入200μL 4℃预冷的异丙醇，取上清液200μL加入管中，轻缓摇 动至絮状沉淀出现后4℃静置1小时；
⑤4℃，8000rpm离心5min，沉淀DNA；
⑥弃上清，用250μL75％酒精洗涤DNA沉淀后，4℃，8000rpm，离心5min(重复一次)。
⑦干燥DNA沉淀，加入50μl TE缓冲液，室温静置30min，-20℃保存备用。
c、PCR扩增：采用下列反应体系及扩增程序进行，PCR反应体系为10μL，其中包 括：其中包括：2×HieffTM PCR Master Mix(No Dye)5μL，10μmol/L的ZH84-1B-1F和 ZH84-1B-1R引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL，3μL的ddH2O；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃退火30s和72℃延伸30S(40个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物；
d、电泳及结果观察：在PCR产物中加入1μL 10×Loadingbuffer，混匀，于8％聚丙烯酰 胺凝胶加样2uL，500V电泳1小时，银染。
电泳结果见图1，图中M为分子量标准(D2000 DNA Marker)，图中M为分子量标准(D2000 DNA Marker)；1～5分别为周8425B、以及周8425B的亲本山前麦、广麦74、练丰 1号、安农7959；6～13分别为兰考矮早8、兰考906、洛夫林10、阿芙乐尔、洛夫林13、 牛朱特、高加索、广麦74(国内外著名的1BL/1RS易位系)；14～22分别为百农207、周麦 36、周麦22、郑麦366、西农388、平安518、赛德麦5号、新麦36、矮抗58(黄淮麦区生 产上大面积推广的小麦品种)。白色箭头所示为周8425B扩增出的Z84-1B-1标记的产物，大 小为207bp，该分子标记与小麦白粉病、叶锈病、条锈病抗性相关，周8425B的亲本及矮 孟牛等国内外著名1BL/1RS小麦易位系对应位置无该标记。
实施例2：
2020年3月份，用本发明方法对74份周8425B的衍生品种进行分子检测，预测其对条锈病 与叶锈病的抗性，检测的详细步骤如下：
a、样品采集：在小麦拔节期，取184个周8425B衍生品种各1.5cm长的叶片，装入灭菌的 1.5mL离心管中，置于冰盒内带回实验室，用于提取DNA；
b、DNA提取：用CTAB的方法(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.科学出版社, 1998：370–372)提取步骤a中样品的DNA，
①液氮研磨叶片后迅速加600μL CTAB提取液于离心管中，混合均匀，放置在65℃水浴锅 1小时，每隔15分钟摇匀一下；
②取出样品冰上冷却，加600μL氯仿/异戊醇(体积比24：1)，充分摇匀5分钟，室温，12000rpm，离心10min；
③备新的离心管，预先加入200μL 4℃预冷的异丙醇，取上清液200μL加入管中，轻缓摇 动至絮状沉淀出现后4℃静置1小时；
④4℃，8000rpm离心5min，沉淀DNA；
⑤弃上清，用250μL75％酒精洗涤DNA沉淀后，4℃，8000rpm，离心5min(重复一次)。
⑥干燥DNA沉淀，加入50μl TE缓冲液，室温静置30min，-20℃保存备用。
c、PCR扩增：采用下列反应体系及扩增程序进行，PCR反应体系10μL，其中包 括：2×HieffTM PCR Master Mix(No Dye)5μL，10μmol/L的ZH84-1B-1F和ZH84-1B-1R 引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL，3μL的ddH2O；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、52℃退火30s和72℃延伸30S(40个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物。
d、电泳及结果观察：在PCR产物中加入1μL 10×Loadingbuffer，混匀，于8％聚 丙烯酰胺凝胶加样2uL，500V电泳1小时，银染。扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳 分离后，检查是否携带大小为207bp的Z84-1B-1分子标记，如含有Z84-1B-1分子标记，则 可预测该小麦植株具有条锈病与叶锈病抗性(表1)。
e、在拔节期对74个周8425B的衍生品种进行条锈病与叶锈病抗性鉴定，条锈病的致 病菌为条中32、条中33与条中34的混合菌；叶锈病的致病菌为叶锈菌株PHTT、THTT的 混合菌。
按照“中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1301-2007)-农作物品种(小麦)区域试验技术规程”中所述标准对74个小麦周8425B的衍生品种进行抗性评价，条锈病与叶锈病的评价标准为：1级，完全无症状，或偶有极小淡色斑点(记为免疫)；2级，叶片有黄白 色枯斑，或有极小孢子堆，其周围有明显枯斑(记为高抗)；3级，夏孢子堆少而分散，周 围有褪绿或死斑(记为中抗)；4级，夏孢子堆较多，周围有褪绿现象(记为中感)；5级， 夏孢子堆很多，较大，周围无褪绿现象(记为高感)。
f、将步骤d中利用Z84-1B-1分子标记检测结果与步骤e中实际的条锈病、叶锈病抗性鉴定结果比对，结果见表1。由表1可以看出，小麦骨干种质周8425B条锈病与叶锈病的 鉴定结果均为中抗；74个衍生品种中有7个家系携带标记Z84-1B-1，条锈病鉴定结果为6 个中抗、1个中感；叶锈病鉴定结果为5个中抗、2个中感；标记Z84-1B-1对周8425B衍生 品种叶锈病、条锈病抗性预测的准确率分别为85.7％与71.4％。另外，携带Z84-1B-1的品种 平均株高为78.0cm，其单株粒重、单穗重与千粒重分别比不携带Z84-1B-1的品种增加 50.7％、21.4％与15.5％，具有周8425B大穗、大粒的优良性状。
表1 74个周8425B衍生品种分子标记检测与条锈、叶锈病抗性鉴定结果
Figure BDA0003287998880000091
Figure BDA0003287998880000101
注明：
(1)+：表示有Z84-1B-1分子标记；-：表示无Z84-1B-1分子标记
(2)大田抗性鉴定试验在河南农业大学许昌小麦试验田(许昌市建安区)完成，大田条锈病与叶锈病的 抗性鉴定方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1301-2007进行；
(3)抗性评价中的HR，MR，MS与HS分别表示高抗、中抗、中感与高感。
实施例3：本发明可以实现提前预测发病率、提前1年做杂交，提高育种效率 检测材料为BC1群体的45个单株，BC1群体是高产品种周麦36(母本)与小麦骨干亲本种 质周8425B(父本)杂交、再回交一次得到的。45个BC1单株自定义为ZM36/Z84-1～ZM36/Z84-45。
基本检测步骤与实施例2基本相同，不同之处在于：
步骤b中：⑥干燥DNA沉淀，加入100μl超纯水，室温静置60min，-20℃保存备用。
2021年3月份对种植的45个BC1单株进行分子检测，检测结果见表2，2021年4月 从携带Z84-1B-1标记的14个单株筛选农艺性状优良的单株与高产轮回亲本周麦36号进行 了回交。如果进行大田鉴定，叶锈病抗性鉴定结果在2021年4月20日左右才能知道，杂交 工作在2022年4月份才能做。将抗病种质与高产品种杂交、回交再从BC1或BC2中筛选抗 病单株与高产亲本继续回交是获得高产抗病小麦的常用方法，表型鉴定是筛选抗病单株的前 提，如果用常规的鉴定方法，检测结果只能用于第二年的回交，而用本发明的分子标记检测 辅助选择的方法，能在当年就将抗病单株筛选出来，使多抗小麦育种进程提前1年。
表2对50个BC1的分子检测结果
植株编号 标记检测 植株编号 标记检测 植株编号 标记检测
ZM36/Z84-1-1 - ZM36/Z84-1-16 + ZM36/Z84-1-31 +
ZM36/Z84-1-2 - ZM36/Z84-1-17 - ZM36/Z84-1-32 -
ZM36/Z84-1-3 + ZM36/Z84-1-18 + ZM36/Z84-1-33 -
ZM36/Z84-1-4 - ZM36/Z84-1-19 - ZM36/Z84-1-34 +
ZM36/Z84-1-5 + ZM36/Z84-1-20 + ZM36/Z84-1-35 -
ZM36/Z84-1-6 + ZM36/Z84-1-21 + ZM36/Z84-1-36 +
ZM36/Z84-1-7 - ZM36/Z84-1-22 - ZM36/Z84-1-37 -
ZM36/Z84-1-8 - ZM36/Z84-1-23 - ZM36/Z84-1-38 -
ZM36/Z84-1-9 + ZM36/Z84-1-24 - ZM36/Z84-1-39 -
ZM36/Z84-1-10 - ZM36/Z84-1-25 - ZM36/Z84-1-40 -
ZM36/Z84-1-11 - ZM36/Z84-1-26 - ZM36/Z84-1-41 -
ZM36/Z84-1-12 - ZM36/Z84-1-27 - ZM36/Z84-1-42 +
ZM36/Z84-1-13 - ZM36/Z84-1-28 + ZM36/Z84-1-43 -
ZM36/Z84-1-14 - ZM36/Z84-1-29 + ZM36/Z84-1-44 -
ZM36/Z84-1-15 - ZM36/Z84-1-30 - ZM36/Z84-1-45 -
注明：+，表示有周8425B特异性分子标记Z84-1B-1；-，表示无周8425B特异性分子标记Z84-1B-1。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明 申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记及其应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tccaggactc cctcaaccag gaaagcttta aacaaacaat aaatttcttg aacttttcaa 60
gcattgatct tcaatttcta cgctaaccct ccatccacga tgagaaaaaa cgagttgggt 120
aagtagaacc aaacttaccc agttgttagc atcttctcac tcgaattgac agtaattcca 180
ccgtgttaat tagactatcc atcgcct 207

Claims (7)

1.小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.用以扩增权利要求1所述的小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记的引物对在检测小麦植株是否有周8425B特异的1BL/1RS易位片段中应用，其特征在于，所述引物对为：Z84-1B-1F：5′- TCCAGGACTCCCTCAAC -3′；Z84-1B-1R：5′-AGGCGATGGATAGTCTAAT -3′。
3.权利要求1所述小麦骨干种质周8425B特异性染色体片段检测的分子标记在检测小麦植株是否有周8425B特异的1BL/1RS易位片段中应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，检测步骤为：以小麦植株叶片或籽粒DNA为模板，以Z84-1B-1F和Z84-1B-1R所示序列为引物对进行PCR扩增，将扩增产物进行质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，若电泳产物存在大小为207bp的DNA片段，则说明该样品携带有所述的周8425B特异的1BL/1RS易位，预测该小麦植株对白粉病、条锈病、叶锈病抗性良好；所述Z84-1B-1F：5′- TCCAGGACTCCCTCAAC -3′；Z84-1B-1R：5′- AGGCGATGGATAGTCTAAT-3′。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR反应体系为10 μL体系，组成为：2×Hieff™ PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L的ZH84-1B-1 F和ZH84-1B-1R引物各0.5 μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0 μL，3 μL的ddH2O；
PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、52℃退火30 s和72℃延伸30S，40个循环；最后72℃延伸5 min，获得扩增产物。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳是指100 mL聚丙烯酰胺胶溶液中含有7.7 g丙烯酰胺和0.3g甲叉双丙烯酰胺。
7.如权利要求3～6任一项所述的应用，其特征在于，所述小麦植株是指小麦骨干种质周8425B、或以周8425B为父本与其它小麦品种杂交后回交得到的BC1群体。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002098209A2 (en) * 2001-06-04 2002-12-12 Northwest Plant Breeding Co. Cytoplasmic male sterility-based system for hybrid wheat plant and seed production
CN1858256A (zh) * 2006-03-03 2006-11-08 中国农业科学院作物科学研究所 一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物
CN101260437A (zh) * 2008-04-21 2008-09-10 河北农业大学 一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物
CN102229986A (zh) * 2011-05-24 2011-11-02 中国农业科学院作物科学研究所 一种辅助选育抗条锈病小麦品种的方法及其专用pcr试剂
CN108165656A (zh) * 2017-11-08 2018-06-15 河南丰德康种业有限公司 小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002098209A2 (en) * 2001-06-04 2002-12-12 Northwest Plant Breeding Co. Cytoplasmic male sterility-based system for hybrid wheat plant and seed production
CN1858256A (zh) * 2006-03-03 2006-11-08 中国农业科学院作物科学研究所 一种筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物
CN101260437A (zh) * 2008-04-21 2008-09-10 河北农业大学 一种筛选抗叶锈病小麦的方法及其专用引物
CN102229986A (zh) * 2011-05-24 2011-11-02 中国农业科学院作物科学研究所 一种辅助选育抗条锈病小麦品种的方法及其专用pcr试剂
CN108165656A (zh) * 2017-11-08 2018-06-15 河南丰德康种业有限公司 小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"1BL·1RS 特异性分子标记的筛选及其对不同来源小麦品种 1RS 易位染色体的鉴定";唐怀君等;《作物学报》;第35卷(第11期);第2107-2115页 *
"QTL Mapping of Adult-Plant Resistance to Leaf Rust in the Wheat Cross Zhou 8425B/Chinese Spring Using High-Density SNP Markers";Peipei Zhang et al.;《Front. Plant Sci.》;第8卷;第1-10页 *

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