CN111876518A

CN111876518A - 一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法

Info

Publication number: CN111876518A
Application number: CN202010787073.5A
Authority: CN
Inventors: 徐晴; 董静; 李梅芳; 许甫超; 秦丹丹; 杨立军; 董建辉; 葛双桃; 彭严春
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法。该方法包括如下步骤：检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型，如果为GG纯合型，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性；否则待测小麦具有或疑似具有赤霉病抗性；所述A36G SNP位点为小麦基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第36位核苷酸。本发明可以鉴定小麦赤霉病抗性，具有重要的应用价值。

Description

一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法。

背景技术

小麦赤霉病是禾谷镰刀菌引起的小麦真菌性病害，多发于温暖湿润气候条件地区。病害流行年份，赤霉病可以造成小麦严重减产；同时染病小麦籽粒含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON毒素)，不仅危害人畜健康，还严重影响食用和饲用价值。因此，赤霉病发生可对小麦生产造成严重经济损失。我国长江中下游麦区，小麦开花期常遇高温高湿天气，赤霉病在该地区高发频发。近些年来，随着秸秆还田等耕作制度的改变，赤霉病发生有向黄淮和北方麦区蔓延的趋势。虽然药物防治在病害不严重的年份能起到一定的作用，但是易造成环境污染。因此，解析赤霉病的抗病遗传机制，培育抗赤霉病小麦新品种是防治赤霉病最经济有效的手段。

研究表明，小麦赤霉病抗性为多基因控制的数量性状。由于抗性的复杂性和其表型鉴定易受环境条件影响，因此，小麦赤霉病抗性基因挖掘和分子机理研究进展较慢。目前，美国、日本、巴西和瑞士等都发现了赤霉病抗性较好的小麦种质，根据这些种质定位到的赤霉病抗性位点几乎分布于小麦的每条染色体，但多数基因位点效应值较小。源于我国江苏省的小麦地方品种苏麦3号和望水白是迄今世界上公认的赤霉病抗性较高的材料；在这两个材料中均定位到位于3BS上的主效基因位点Fhb1。2019年，南京农业大学马正强教授团队和美国Kansas州立大学的柏贵华教授团队克隆出Fhb1基因，其编码富含组氨酸的钙结合蛋白TaHRC。

虽然苏麦3号等地方品种具有较强的赤霉病抗性，但是由于不利连锁的存在，该材料其它农艺性状较差，育种中较难使用。因此，挖掘新的赤霉病抗性材料及抗性相关基因位点是小麦赤霉病抗性育种的重要方面。

荆州66，是20世纪80年代湖北省荆州地区农科所选育的一个小麦品种，其田间赤霉病抗性多年鉴定为中抗，曾在赤霉病高发的湖北省广泛种植。荆州66的系谱(普通小麦阿夫/埃及硬粒小麦F₃//Mentana/荆州黑麦F₆)分析显示，荆州66赤霉病抗性来源较广。

发明内容

本发明的目的为如何鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性。

本发明首先保护鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法。

本发明所保护的鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型，如果为GG纯合型，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性；否则待测小麦具有或疑似具有赤霉病抗性；

所述A36G SNP位点为小麦基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第36位核苷酸。

本发明所保护的鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ IDNO：2所示的DNA片段2，如果含有所述DNA片段1且不含有所述DNA片段2，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性；否则待测小麦具有或疑似具有赤霉病抗性。

上述任一所述的方法中，所述检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型或所述检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2的方法可为直接测序。

上述任一所述的方法中，所述检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型或所述检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2的方法可如下：

(a1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物组由SEQ ID NO：4所示的引物1、SEQ ID NO：5所示的引物2和SEQ ID NO：8所示的引物3组成；

(a2)取步骤(a1)得到的PCR扩增产物，测序。

(b1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用PARMS标记引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述PARMS标记引物组由SEQ ID NO：6所示的引物a、SEQ ID NO：7所示的引物b和SEQ ID NO：8所示的引物3组成；

(b2)完成步骤(b1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，之后根据荧光信号的颜色判断。

所述(b2)中，如果荧光信号的颜色显示绿色，则相应的小麦为或疑似为感赤霉病；如果荧光信号的颜色显示蓝色，则相应的小麦为或疑似为抗赤霉病。荧光信号的颜色可在TECAN Infinite M1000上进行信号读取获得。

本发明还保护一种筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦的方法，可为选择基因组中基于A36G SNP位点的基因型不为GG纯合型的小麦或基因组中不含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1的小麦；

本发明还保护一种筛选不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦的方法，可为选择基因组中基于A36G SNP位点的基因型为GG纯合型的小麦或基因组中含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1且不含有SEQ ID NO：2所示的所述DNA片段2的小麦；

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的试剂盒，可包括上述任一所述引物组和/或上述任一所述PARMS标记引物组。

所述试剂盒具体可由上述任一所述引物组和/或上述任一所述PARMS标记引物组组成。

所述引物1和所述引物3的靶序列为SEQ ID NO：2所示的DNA片段。

所述引物2和所述引物3的靶序列为SEQ ID NO：3所示的DNA片段。

本发明还保护SEQ ID NO：1所示的DNA片段。

(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)也属于本发明的保护范围。

(z1)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用。

(z2)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在制备用于鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的产品中的应用。

(z3)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在筛选或辅助筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦品种、或、不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦品种中的应用。

(z4)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在制备用于筛选或辅助筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦品种、或、不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦品种的产品中的应用。

(z5)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在小麦育种中的应用。

(z6)上述任一所述试剂盒或SEQ ID NO：1所示的DNA片段在制备用于小麦育种的产品中的应用。

上述任一所述的应用中，当待测小麦基因组中SEQ ID NO：1所示的DNA片段自5’末端起第36位核苷酸为GG纯合型，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性。

实验证明，采用本发明所提供的方法可以在种子或苗期鉴定或辅助鉴定待测小麦是否具有赤霉病抗性，不仅节约时间和经济成本，不受环境影响，而且具有较高的准确性。本发明在小麦育种中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤四中采用PARMS引物组检测209个双单倍体家系的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦品种荆州66记载于如下文献中：敖立万.湖北小麦[D].湖北科学技术出版社.在下文中，小麦品种荆州66简称荆州66。荆州66属于中抗赤霉病品种。

在下文中，小麦品种矮抗58简称矮抗58。矮抗58属于感赤霉病品种。

发病指数＝发病率×严重度，其中发病率＝发病穗数/总穗数，严重度＝发病小穗数/总小穗数，均以百分率计。

实施例1、A36G SNP的发现及其在鉴定小麦赤霉病抗性中的应用

本发明的发明人前期研究表明，荆州66的赤霉病抗性不受Fhb1基因的控制，但其抗性机制尚不明确；为进一步研究赤霉病抗性机制，进行如下实验。

一、双单体遗传群体的构建

将荆州66和矮抗58杂交，得到杂交F₁；之后杂交F₁加倍，获得209个双单倍体家系，依次命名为DH1-DH209。

209个双单倍体家系组成双单倍体遗传群体。

二、小麦赤霉病抗性分析

待测小麦为荆州66、矮抗58和209个双单倍体家系。

本发明的发明人分别于2019年武汉和2019年鄂州共2个环境鉴定待测小麦的赤霉病抗性。苏麦3号、鄂恩1号和安农8455依次作为赤霉病抗性、中抗和感病对照。

1、在2019年武汉赤霉病病鉴圃中鉴定待测小麦的赤霉病抗性

赤霉病病鉴圃配有电脑控制的喷雾装置，从小麦开花期到调查结束采用微电脑控制的定时迷雾装置增湿，促进发病。

(1)当季秋播时，采用点播方式播种于田间。待测株系完全随机区组设计，重复2次，每小区为1行，行长1m，行距0.25m，每行播种65-70粒。

(2)统计赤霉病发病指数(DI：Disease Index)。方法如下：

(2-1)小麦开花期，每小区随机标记10个开花的穗子，用赤霉镰刀菌分生孢子悬浮液进行喷雾接种。

赤霉镰刀菌分生孢子悬浮液：将50g绿豆配以适量水煮沸，然后用蒸馏水定容至1L，三层纱布过滤后分装200～300mL到500ml三角瓶中高温灭菌，灭菌后置于超净工作台中，向其中加入1ml黄冈1号菌丝体悬浮液，28℃、180rpm培养5～7天，三层纱布过滤培养后的孢子液；根据浓度稀释，最终得到浓度为1×10⁵个/ml的赤霉镰刀菌分生孢子悬浮液，加入0.5％体积Tween-20摇匀备用。

(2-2)接种后第21天，调查各小区标记的10个穗子中的发病穗数、发病小穗数和总小穗数，计算发病率、严重度和发病指数。

2、在2019年鄂州鉴定待测小麦的赤霉病抗性

(1)秋播时常规播种。待测株系采用完全随机区组设计，重复2次，每小区为1行，行长1m，行距0.25m，每行播种65-70粒。

(2)在小麦开花前3周，采用撒播病麦粒的方法接种赤霉镰刀菌，具体为染菌病麦粒以600g/100m²的撒播量撒播于小区。

染菌病麦粒：(1)取待测小麦种子，用水清洗干净，用微波炉煮沸30min，装瓶密封灭菌(若量多则用双层保鲜袋装袋，挤出空气密封)，120℃灭菌30min，置于无菌超净工作台上放凉。(2)将强致病力菌株黄冈1号接种于PDA固体培养基活化培养，然后用打孔器打出菌饼。(3)将步骤(2)获得的菌饼和步骤(1)获得的无菌麦粒混匀，23-28℃培养12-20天，得到染菌病麦粒。

(3)接种后第28天，每小区随机选择30个穗子，调查30个穗子的发病穗数、总穗数、发病小穗数和总小穗数，计算发病率、严重度和发病指数。

将待测株系的发病指数与苏麦3号、鄂恩1号和安农8455的发病指数进行比较，然后进行如下判断：如果待测株系的DI≤苏麦3号的DI，则该待测株系的赤霉病抗性为抗；如果苏麦3号的DI<待测株系的DI≤鄂恩1号的DI，则该待测株系的赤霉病抗性为中抗；如果鄂恩1号的DI<待测株系的DI<安农8455，则该待测株系的赤霉病抗性为中感；如果待测株系的DI≤安农8455，则该待测株系的赤霉病抗性为感。

各个待测株系的发病指数和抗性类型统计结果见表1。

表1

三、小麦遗传连锁图的构建、小麦赤霉病抗性QTL检测和A36G SNP的发现待测小麦为荆州66、矮抗58和209个双单倍体家系。

1、采用植物基因组提取试剂盒(天根)提取待测小麦叶片的基因组DNA。

2、采用小麦55K SNP芯片分析待测小麦叶片的基因组DNA的基因型，仅保留poly-high类型标记；之后然后筛选亲本间有差异且纯合的SNP标记，用软件Icimapping4.1去重复后，用Joinmap4.0进行图谱构建。

芯片扫描在中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司完成，芯片产品号为AffymetrixAxiom Genotyping Array(384sample)。

结果表明，4500个SNP标记在亲本间存在差异；去重复后，每个位点上保留一个标记，最终得到718个BIN标记；通过遗传连锁作图，产生了覆盖小麦21条染色体的29个连锁群。其中，B基因组包含271个BIN标记，A和D基因组分别包含262和185个BIN标记。图谱总长度为2489.3cM，平均图距3.5cM。

3、在步骤2获得的遗传连锁图的基础上，结合2个环境(即2019年武汉和2019年鄂州)的赤霉病抗性数据，利用Icimapping4.1软件(将LOD值设置为2.5)进行QTL定位。

最终定位到来源于荆州66的小麦赤霉病抗性基因位点QFhb.hbaas-3AL。QFhb.hbaas-3AL是一个新的赤霉病抗性基因位点，位于小麦染色体3A长臂上，对赤霉病抗性表型贡献率为7.3％。与QFhb.hbaas-3AL的紧密连锁标记为AX-110591324(见表2)。

表2

基因位点	物理位置Mb	标记	PVE(％)
				QFhb.hbaas-3AL	530.9	AX-110591324	7.3

与QFhb.hbaas-3AL紧密连锁标记AX-110591324含有的SNP位点(即A36G SNP)的信息见表3。

表3

四、小麦赤霉病抗性相关标记的开发与验证

1、根据标记AX-110591324上A36G SNP前后位置的核苷酸序列，设计引物A：5’-GA AGGTGACCAAGTTCATGCTGGTCCAACACCTCTCTAAGCGT-3’(SEQ ID NO：6)(下划线为接头引物序列)、引物B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCCAACACCTCTCTAAGCGC-3’(SEQ ID NO：7)(下划线为接头引物序列)和引物common：5’-ATGAAGGCGAACCAGACGG-3’(SEQ ID NO：8)。引物A、引物B和引物common组成PARMS引物组。

2、采用PARMS引物组检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型。待测小麦为荆州66、矮抗58和209个双单倍体家系。

具体步骤如下：

(1)提取待测小麦的基因组DNA，碱解，得到碱解DNA。

(2)制备反应体系。反应体系为5μl，包括2.5μl 2×PARMS PCR reaction mix(武汉市景肽生物科技有限公司的产品)、引物A水溶液、引物B水溶液、引物common水溶液、碱解DNA和水。反应体系中，引物A和引物B的浓度均为150nM，引物common的浓度为400nM。

(3)向反应体系中加入5μl矿物油(防止样品蒸发)，之后进行PCR扩增。

反应程序为：95℃15min；95℃20s，65℃1min，每循环降0.8℃，直到57℃，10个循环；95℃20s，57℃1min，32个循环。

(4)完成步骤(3)后，在TECAN Infinite M1000上进行信号读取，然后进行如下判断：如果显示绿色，则相应的小麦为或疑似为感赤霉病；如果显示蓝色，则相应的小麦为或疑似为抗赤霉病。

散点图可以用线上软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)生成。

209个双单倍体家系的检测结果见图1。

荆州66、矮抗58和209个双单倍体家系基于A36G SNP位点的基因型见表4。

表4

采用PARMS引物组检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型的结果与采用小麦55K SNP芯片检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型的结果基本一致，一致率为96％。由此可见，可以采用PARMS引物组检测小麦基于A36G SNP位点的基因型。

3、基因型与性状的关系

(1)2019年武汉

209个双单倍体家系中，96个家系基于A36G SNP位点的基因型为GG纯合型，其中不具有赤霉病抗性(即鉴定为感或中感)的为87个，准确性达到91％。

(2)2019年鄂州

209个双单倍体家系中，96个家系基于A36G SNP位点的基因型为GG纯合型，其中不具有赤霉病抗性(即鉴定为感或中感)的为80个，准确性达到83％。

由此可见，通过检测A36G SNP位点的基因型可以鉴定或辅助鉴定待测小麦的赤霉病抗性，且具有较高的准确性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>71

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

tactgctgat gaaggcgaac cagacggaag gaacancgct tagagaggtg ttggacctgt 60

atgaaaattg t 71

<210>2

<211>49

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

atgaaggcga accagacgga aggaacaacg cttagagagg tgttggacc 49

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

atgaaggcga accagacgga aggaacagcg cttagagagg tgttggac 48

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

ggtccaacac ctctctaagc gt 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

gtccaacacc tctctaagcg c 21

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

gaaggtgacc aagttcatgc tggtccaaca cctctctaag cgt 43

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

gaaggtcgga gtcaacggat tgtccaacac ctctctaagc gc 42

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

atgaaggcga accagacgg 19

Claims

1.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型，如果为GG纯合型，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性；否则待测小麦具有或疑似具有赤霉病抗性；

2.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦赤霉病抗性的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2，如果含有所述DNA片段1且不含有所述DNA片段2，则待测小麦不具有或疑似不具有赤霉病抗性；否则待测小麦具有或疑似具有赤霉病抗性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型或所述检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2的方法为直接测序。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型或所述检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2的方法如下：

(a2)取步骤(a1)得到的PCR扩增产物，测序。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基于A36G SNP位点的基因型或所述检测待测小麦基因组中是否含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1和SEQ ID NO：2所示的DNA片段2的方法如下：

所述PARMS标记引物组由SEQ ID NO：6所示的引物a、SEQ ID NO：7所示的引物b和SEQID NO：8所示的引物3组成；

6.一种筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦的方法，为选择基因组中基于A36G SNP位点的基因型不为GG纯合型的小麦或基因组中不含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1的小麦；

7.一种筛选不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦的方法，为选择基因组中基于A36GSNP位点的基因型为GG纯合型的小麦或基因组中含有SEQ ID NO：3所示的DNA片段1且不含有SEQ ID NO：2所示的所述DNA片段2的小麦；

8.一种鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的试剂盒，包括权利要求4中所述引物组和/或权利要求5中所述PARMS标记引物组。

9.SEQ ID NO：1所示的DNA片段。

10.(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)：

(z1)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；

(z2)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在制备用于鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的产品中的应用；

(z3)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在筛选或辅助筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦品种、或、不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦品种中的应用；

(z4)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在制备用于筛选或辅助筛选具有或疑似具有赤霉病抗性小麦品种、或、不具有或疑似不具有赤霉病抗性小麦品种的产品中的应用；

(z5)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在小麦育种中的应用；

(z6)权利要求8所述试剂盒或权利要求9所述DNA片段在制备用于小麦育种的产品中的应用。