CN104928299B - 黄瓜靶斑病抗病基因Cca及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄瓜靶斑病抗病基因Cca及其编码蛋白和应用。该基因为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或者为具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90％以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。本发明提供的抗病基因Cca具有重要的应用价值，其可辅助用于选育黄瓜靶斑病抗病品种，另外根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率。

Description

黄瓜靶斑病抗病基因Cca及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因序列和应用领域，具体涉及黄瓜靶斑病抗病基因Cca及其编码蛋白和应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。

黄瓜棒孢叶斑病，又称靶斑病，是一种世界性分布的病害。目前已成为危害黄瓜露地和保护地栽培的重要病害之一，尤以越冬温室、冬春温室、春大棚等保护地内发生严重。主要危害叶部，病斑初呈淡褐色后变褐绿色，严重时叶片枯死。该病导致落叶率低于5％时，病情扩展慢，约2周，而后一周内发展快，落叶率可由5％发展至90％。棚室内反季节种植黄瓜在冬春季节和初夏均易流行发病。田间发病率一般在10％-25％，严重时为60％-70％，造成损失达30％以上。

黄瓜靶斑病的病原菌为多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei.]，属半知菌类真菌。多主棒孢菌丝分枝、半透明、壁光滑，宽2～6μm。无子座。分生孢子梗由菌丝衍化而来，直立、单生、浅棕色，有隔膜。分生孢子梗顶端具有0～9个圆柱状的层出梗，层出梗宽4～11μm，长110～850μm。分生孢子常单生，或2～6个串生于顶端，分生孢子直立或稍弯，圆柱形或倒棍棒形，半透明至浅橄榄色，4～20个假隔膜，基脐4～8μm宽，孢子大小为9～22μm×40～220μm。多主棒孢是一个高度变异的群体，导致棒孢叶斑病防治过程中常常存在抗病品种持效期短、化学药剂防效不稳定等，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接使技术困难和劳动成本增加。因此快速选育抗病品种是解决靶斑病危害的最佳途径。

克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆(Map-based cloning)是利用分子遗传图谱，把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联系起来，把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间；也可以用群体分离分析法(BSA法)或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记，然后利用作图群体把该分子标记定位到图谱上。然后由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段，最终再辅之以转化和互补测验加以验证(王永飞，分子标记在植物遗传育种中的应用原理及现状，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2001，106-113)。目前，运用基于图位克隆技术已分离到了大量的植物基因，尤其是与抗病有关的基因(闫其涛，植物基因分离的图位克隆技术，分子植物育种，2005，585-590)，但未见有关黄瓜靶斑病的抗病基因被成功克隆的报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种黄瓜靶斑病抗病基因Cca。

本发明的目的之二在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca的遗传标记。

本发明的目的之三在于提供用于扩增上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca的一对引物。

本发明的目的之四在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca的cDNA序列。

本发明的目的之五在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca的编码蛋白。

本发明的目的之六在于提供一种上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca及遗传标记的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

黄瓜靶斑病抗病基因Cca，(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，(b)为具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90％以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。

本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因Cca是利用抗感遗传群体进行精细定位克隆获得的。本发明选择经典抗病材料WF2757和重要骨干亲本感病材料新泰密刺，构建F_2：3和F₂遗传群体，对抗病基因进行初步定位和精细定位，抗靶斑病基因精细定位在6号染色体的80kb区间范围内，该区间存在3个基因，第1个基因为NB-ARC类基因，第2个基因为BIM2-like的转录因子相关基因，第三个基因为33-like肽重复序列结构蛋白相关基因。众所周知，NB-ARC基因具有的保守结构域是典型的NBS-LRR类抗病基因，因此推测该NB-ARC基因是抗靶斑病的重要候选基因Cca，其DNA序列是通过对精细定位区间内的基因序列进行测序获得的。

上述SEQ ID NO:1所示的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的遗传标记，感病基因的第1481位的碱基T突变为碱基G。

用于扩增上述SEQ ID NO:1所示黄瓜靶斑病抗病基因Cca的一对引物，分别具有序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明根据已公布的黄瓜基因组9930和GY14序列信息，结合利用Softberry在线预测软件FGENESH(http://sunl.softberry.com/)预测基因结构，并根据预测结果的起始和终止编码序列，设计基因全长扩增引物一对分别为：序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，分别利用抗/感材料基因组DNA进行PCR扩增，获得抗/感材料中基因Cca的DNA全长序列SEQ ID NO:1(抗病材料)和SEQ ID NO:2(感病材料)，全长3255bp，并对抗感材料中的两个基因DNA序列进行对比和分析，Cca的DNA序列在抗/感材料中存在一个SNP位点，即在该基因的第1481位，感病材料的碱基为T，抗病材料的碱基为G，其可以应用于开发抗黄瓜靶斑病分子标记。

上述SEQ ID NO:1所示的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的cDNA序列，具有序列表中SEQID NO:3所示的核苷酸序列。

本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因Cca cDNA(mRNA)序列是利用全长引物SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8作为上下游引物以抗/感材料的总RNA反转录后第一链作为模板进行PCR扩增获得的，在抗/感材料中基因Cca的cDNA(mRNA)序列全长分别为SEQ ID NO:3和SEQID NO:4。利用Softberry在线预测Cca序列，获得cDNA结构，通过SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列的对比，黄瓜抗靶斑病基因Cca的cDNA(mRNA)在抗/感材料中均仅有一个外显子，无内含子结构，但是在cDNA序列的981bp的位置抗病材料的碱基为G，感病材料的碱基为T，正是由于在抗/感材料中这一处碱基的差别，从而导致氨基酸编码的差异，由此导致功能不同，进而导致NB-ARC基因的抗病性发生变化。

上述SEQ ID NO:1所示黄瓜靶斑病抗病基因Cca的编码蛋白为序列表中的SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。

本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因氨基酸序列是利用Cca基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分别经过softberry在线预测软件翻译获得抗/感材料中Cca氨基酸(蛋白)序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，并对抗/感材料中的Cca氨基酸序列进行比对分析，Cca在抗/感病材料中存在1个氨基酸编码差异，表现在第493位(K-N)。推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致NB-ARC基因的抗病性发生变化。

上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca或者上述黄瓜靶斑病抗病基因Cca的cDNA在选育黄瓜靶斑病抗病品种中的应用。

上述遗传标记在选育黄瓜靶斑病抗病品种中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用图位克隆和正向遗传学方法，对黄瓜靶斑病抗病基因Cca进行精细定位和克隆，获得黄瓜靶斑病抗病基因Cca，并对该基因在抗/感病材料中的核酸序列和氨基酸序列进行分析和比对，获得黄瓜靶斑病抗病基因Cca在抗/感病材料中差异和多态性分析。本发明通过对不同抗感材料进行序列分析试验以及与田间抗性鉴定结果的对比，验证了该黄瓜靶斑病抗病基因Cca的功能。本发明提供的抗病基因Cca具有重要的应用价值，可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、InDel(插入缺失多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)，用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率。

附图说明

图1是黄瓜靶斑病抗病基因Cca定位连锁图谱，其中左图为黄瓜靶斑病基因初定位示意图，中间两个图为靶斑病抗病基因精细定位示意图，右图为80kb区间范围内基因分布情况及基因注释。

图2是Cca基因SNP分子标记酶切验证结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。

实施例1：黄瓜靶斑病抗病基因Cca的获得

一、黄瓜靶斑病抗病基因Cca初步定位和精细定位

具体的定位方法包括以下步骤：

A、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究亲本及遗传群体：

分别选择WF2757(母本)和新泰密刺(父本)为抗感亲本，构建150株的F_2:3群体和超过2000株的F₂大群体。其中，父本新泰密刺和母本WF2757购自北京市农作物种质资源库。

B、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究病情指数调查：

将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。

黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei.]是通过高苇等在文献(河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌种群分化的研究，华北农学报，2011，26(5):9-15)中记载的分离方法获得的。采用阚琳娜等(黄瓜褐斑病防治药剂的活体筛选，中国蔬菜，2007(4):22～24)的方法制备黄瓜靶斑病菌液，浓度为1×10⁵个孢子/mL，血球计数板测定孢子浓度。于黄瓜幼苗期进行悬浮菌液喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮菌液均匀地喷洒于黄瓜叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后置于25℃光照培养箱中保湿培养。进行3次重复，每次重复30株。

按上述方法接种后7～10d进行病情调查。病情分级标准为：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占5％～25％；3级：病斑面积占26％～50％；4级：病斑面积占51％～75％；5级：病斑面积达75％以上。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。

对亲本及各群体的病情进行精确统计。

C、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的初步定位：

利用Cavagnar等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber.BMC Genomics，2010,11:569)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息和本实验室开发的Indel和SNP引物信息(参见表1中序号为1-8的引物信息)，结合150株的F2:3群体病情指数的精确统计，对亲本和后代群体进行分子标记分析，编码采集亲本及群体单株的基因型数据。母本基因型记为A，父本的基因型记为B，F₁杂合基因型记为H，模糊或缺失数据记为U。用χ²test对数据进行比例适合性检验分析，采用JoinMap4.0软件(Stam1993；Van Ooijen2001)构建连锁图谱，设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi1944)，对黄瓜抗靶斑病基因初步定位在6号染色体的530kb(Indel16624801和Indel17156286)区间内，根据Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-codinggenes in the cucumber genome.BMC genomics,2011,12:540)对黄瓜基因组的注释和通过Softberry在线软件进行预测，该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域)，难以预测和选择候选基因。所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。

D、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的精细定位：

经过构建超过2000株的F₂大群体继续对抗靶斑病基因进行精细定位，同时，本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序，经过生物信息比对分析，在双亲间开发Indel和SNP分子标记，在初定位区间的530kb范围内选择设计了19对Indel分子标记(参见表1序列号为9-27的引物信息)进行群体分析，经过验证后利用这19对Indel标记对抗靶斑病基因进行了精细定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，最终在2000株的F₂大群体中精细定位到80kb(Indel16874230和Indel16953846)的范围内，参见图1。在精细定位区间内近2200株的试验材料中存在4个交换单株。

采用上述19对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10μL)如下：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCRBuffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到10μL。

PCR反应程序为：阶段1：95℃预变性3min；阶段2：94℃30s，60℃1min，72℃1min，退火温度每个循环降1℃，共8个循环；阶段3：94℃30s，53℃30s，72℃1min，共32个循环；阶段4：72℃延伸5min；阶段5：4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler。

表1Cca基因定位部分分子标记信息

E、抗靶斑病基因预测分析：

在精细定位的80kb区间内，有3个基因，经过NCBI Blast在线比对分析，第1个基因为NB-ARC基因，第2个基因为BIM2-like的转录因子相关基因，第三个基因为33-like肽重复序列结构蛋白相关基因。NB-ARC是NBS-LRR类抗病基因中常见的保守结构域，因此定位该NB-ARC基因是抗靶斑病的重要候选基因Cca。精细定位的结果排除了初定位区间中NBS-LRR串联抗病基因的干扰。Cca基因在抗/感材料间存在一个SNP，在基因的第1481位，抗病基因碱基为G，而感病基因碱基为T。推测该SNP可能导致抗病力的改变，可用于开发抗靶斑病紧密连锁分子标记，该NB-ARC基因为靶斑病的抗病候选基因。

二、黄瓜靶斑病抗病基因Cca全长DNA序列的获得

A、供试材料：

所述的供试材料为抗病材料WF2757，以感病材料新泰密刺作为对照。

B、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的DNA全长的扩增：

黄瓜基因组DNA的提取采用CTAB法，以供试抗/感材料基因组DNA为模板，利用Cca基因全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行基因全长PCR扩增，经过序列拼接分别得到Cca基因在抗/感材料上的基因全长SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，全长均计3255bp。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Cca基因全长进行比对分析，发现在抗/感材料间Cca基因的第1481位存在一个SNP，抗病材料中碱基为G，而感病材料中碱基为T。该SNP可做为抗枯萎病紧密连锁的分子标记，应用于世界范围内的黄瓜靶斑病抗病育种。

所述的PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH₂O补足到20μL。

所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，60℃1min，72℃4min，共42个循环；72℃延伸10min；PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well ThermalCycler。

所述的扩增产物用灭菌的去离子水稀释至80μL，放入Caliper核酸自动分析仪进行分析。

上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，DNA全长序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行合成和分析。测序结果表明黄瓜靶斑病抗病基因Cca的全长DNA序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，共3255bp。

实施例2：黄瓜靶斑病抗病基因Cca cDNA和蛋白序列鉴定分析

一、黄瓜枯萎靶斑病基因Cca的cDNA(mRNA)全长扩增：

利用抗感亲本材料WF2757和新泰密刺，分别选取幼嫩叶片组织提取总RNA，进行反转录合成mRNA的第一链(cDNA)，以该mRNA第一链为模板利用Cca基因的全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增，分别获取抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列全长SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Cca基因全长进行比对分析，发现该基因在抗/感材料中均仅有一个外显子，无内含子结构，但是在cDNA序列的981bp的位置抗病材料的碱基为G，感病材料的碱基为T，正是由于在抗/感材料中这一处碱基的差别，从而导致氨基酸编码的差异，由此导致功能不同，进而导致NB-ARC基因的抗病性发生变化。

所述的RNA提取、反转录试剂盒均购自Fermentas公司。

所述的PCR扩增反应的反应体系(50μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)5μl，ddH₂O补足到50μl。

所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，共40个循环；72℃延伸7min；PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well ThermalCycler。

所述的Cca基因cDNA序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行分析，其中抗病材料中的Cca基因的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示，感病材料中的Cca基因的cDNA序列如SEQ ID NO:4。

二、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的编码蛋白的序列分析：

本发明涉及的黄瓜靶斑病抗病基因氨基酸序列是利用Cca基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分别经过softberry在线预测软件翻译而获得的，抗/感材料中Cca氨基酸(蛋白)序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，并利用DNAMAN软件氨基酸序列在抗/感材料中进行比对分析，发现基因Cca编码的蛋白在抗/感病材料中存在1个氨基酸编码差异，表现在第493位(K-N)。推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致NB-ARC基因的抗病性发生变化。

实施例3：抗病基因Cca的功能验证及在选育黄瓜靶斑病抗病品种中应用

一、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的功能验证

1、待测材料：以WF2757和GY14为亲本，构建F₂遗传群体，从中随机选取120个单株进行靶斑病抗病鉴定和测序。其中，父本GY14和母本WF2757购自北京市农作物种质资源库。

2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Cca基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述120份待测材料中有34株幼苗具有SEQ ID NO:1所示的Cca基因。所述PCR扩增参见实施例1第二部分。

3、对具有SEQ ID NO:1所示的Cca基因的幼苗进行靶斑病抗性检测

采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述34株具有SEQ ID NO:1所示的Cca基因的幼苗进行田间靶斑病抗性检测。

通过病情统计分析发现，上述具有SEQ ID NO:1所示的Cca基因的幼苗中，病情均在2级以下，其中，12株0级，13株1级，9株2级，由此说明，SEQ ID NO:1所示Cca基因的存在与黄瓜抗靶斑病性状具有一致性。

二、遗传标记在选育黄瓜靶斑病抗病品种中应用

本发明利用实施例1得到的Cca基因在抗感材料中的SNP位，依据dCAPs引物在线设计网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，开发设计与抗/感靶斑病紧密连锁的dCAPs分子标记，其中正向和反向扩增引物分别为：SEQ ID NO:9(5’-GAACTACTTTGGTGTGAAAATTTGAC-3’)和SEQ ID NO:10(5’-GGTACTTAAATTGGGACAATCATCG-3’)。通过该引物对以双亲材料(抗病材料WF2757和感病材料新泰密刺)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并结合MaeII内切酶对PCR产物酶切，分别获得抗/感病特异条带，其中抗病条带为165bp，而感病条带为135bp。

本部分的PCR反应体系和程序参照实施例1第一部分的步骤D；酶切体系(30μl)中含有：PCR扩增产物10μl，10×Buffer R(购自Thermo公司)2μl，MaeII(购自Thermo公司)1.0μl，灭菌双蒸水补足到30μl。所述的酶切反应程序为：阶段1：65℃温育10h；阶段2：80℃20min失活；阶段3：4℃保存。

利用该dCAPs分子标记对实施例1中的150株F_2:3群体株系、2000株F2遗传群体及21个不同遗传背景的自然群体中的黄瓜材料进行上述PCR和MaeII酶切分析，并考察酶切结果与抗病表型(抗病表型检测参见实施例1第一部分步骤B的田间靶斑病抗性鉴定方法)的关系，发现Cca基因中的dCAPs分子标记与2171株黄瓜材料抗病表型紧密连锁，一致性达100％，达到共分离的水平,部分株系的酶切图参见图2。也就是说，以田间抗性鉴定为抗病品种的株系的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10作为上下引物进行PCR扩增，并采用MaeII内切酶对PCR产物酶切，肯定可以得到一条165bp的抗病条带；而以田间抗性鉴定为感病品种的株系的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10作为上下引物进行PCR扩增，并采用MaeII内切酶对PCR产物酶切，肯定可以得到一条135bp的感病条带。上述内容充分证实了Cca基因及根据其SNP开发的dCAPs分子标记能够应用于靶斑病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。

Claims (5)

1.黄瓜靶斑病抗病基因Cca，为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.用于扩增权利要求1所述的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的一对引物，分别为序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的cDNA序列，为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的编码蛋白，为序列表中的SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的黄瓜靶斑病抗病基因Cca或者权利要求3所述的黄瓜靶斑病抗病基因Cca的cDNA在选育黄瓜靶斑病抗病品种中的应用。