CN104946630B - 黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用。该分子标记是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一：序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。上述分子标记可鉴定目的基因黄瓜靶斑病抗病基因Cca的存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其他基因效应和环境因素的影响，可用于早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，为进行黄瓜靶斑病抗病育种提供技术支持。

Description

黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及与黄瓜靶斑病抗病基因Cca连锁的分子标记及其在黄瓜种质资源选择中的应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。
黄瓜棒孢叶斑病，又称靶斑病，是一种世界性分布的病害。目前已成为危害黄瓜露地和保护地栽培的重要病害之一，尤以越冬温室、冬春温室、春大棚等保护地内发生严重。主要危害叶部，病斑初呈淡褐色后变褐绿色，严重时叶片枯死。该病导致落叶率低于5％时，病情扩展慢，约2周，而后一周内发展快，落叶率可由5％发展至90％。棚室内反季节种植黄瓜在冬春季节和初夏均易流行发病。田间发病率一般在10％-25％，严重时为60％-70％，造成损失达30％以上。靶斑病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接使技术困难和劳动成本增加。因此选育抗病品种是解决靶斑病危害的最佳途径。
黄瓜靶斑病抗病基因影响黄瓜对靶斑病的抗性，它的研究将会推动抗病育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中十分有效。分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快育种进程。因此，开发用于辅助鉴定黄瓜靶斑病抗病基因Cca的分子标记十分重要。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记及其专用引物和应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记，是用以下引物自黄瓜总DNA中扩增出来的核苷酸序列之一：序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
获得上述黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记的引物如下：1)获得黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记CcaSNP1的引物为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；2)获得黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记CcaSNP2的引物为序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
利用上述引物对，通过常规PCR法可得到上述分子标记。
本发明涉及的与黄瓜抗靶斑病共分离的dCAPs标记CcaSNP1，是利用抗/感遗传群体(母本：WF2757，抗靶斑病；父本：新泰密刺，感靶斑病)进行精细定位和克隆获得的。通过利用150株的F2:3群体对靶斑病抗病基因Cca进行初步定位，然后利用2000株的F2群体对Cca基因进行精细定位到80kb的区间内。该区间内含3个基因，分别是NB-ARC抗病基因、BIM2-like转录因子相关基因和33-like肽重复序列结构蛋白相关基因，其中NB-ARC基因经过验证分析，被证实为靶斑病抗病基因Cca的重要候选基因。通过对比研究Cca基因在抗/感黄瓜材料中的序列差异，发现一个SNP位点，依据http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，在线设计软件，开发设计了与抗/感靶斑病紧密连锁的dCAPs分子标记CcaSNP1。同时利用CcaSNP1标记分析2000多株遗传群体材料，结合田间靶斑病接种鉴定研究，发现CcaSNP1标记与抗感靶斑病紧密连锁，达到共分离。
本发明涉及的另一个黄瓜抗靶斑病SNP2关键位点，其在抗病基因Cca中导致了氨基酸编码的变化。该SNP位点是通过对不同遗传背景的黄瓜靶斑病抗感材料进行基因组重测序获得的，通过对多个黄瓜抗感材料进行重测序，利用BWA-Samtools(v0.1.12a，mpileup按照默认参数)软件分析Cca基因在不同材料中的SNP位点，结合黄瓜基因组9930-V2和基因组注释，发现Cca基因的210位存在单碱基差异SNP2位点(由G到A)。并利用该SNP2位点设计标记，获得CcaSNP2分子标记，通过分析上述黄瓜材料的基因型，结合田间靶斑病接种鉴定材料抗感病表型，发现CcaSNP2标记分析的基因型与抗感表型一致，证明CcaSNP2可作为靶斑病紧密连锁分子标记，筛选黄瓜材料。
上述分子标记或引物在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用。
在上述应用中，优选地，所述分子标记CcaSNP1在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID NO:1和序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用MaeII内切酶对PCR产物酶切，如果得到165bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到135bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为WF2757或者长春密刺，或者以WF2757和/或长春密刺作为亲本得到的子代；
在上述应用中，优选地，所述分子标记CcaSNP2在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ ID NO:3和序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用XbaI内切酶对PCR产物酶切，如果得到164bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到134bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料；更优选地，所述待测黄瓜材料为BANNA HUANGGUA，或者CUCUMISHARDWICKII，或者DI HUANGGUA，或者以BANNA HUANGGUA和/或者CUCUMIS HARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以DI HUANGGUA作为亲本得到的子代，或者DI HUANGGUA和CUCUMISHARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以BANNA HUANGGUA和DI HUANGGUA作为亲本得到的子代。
本发明具有如下有益效果：
本发明的dCAPs标记CcaSNP1和CcaSNP2与黄瓜靶斑病抗病存在紧密连锁关系(共分离)，可鉴定目的基因黄瓜靶斑病抗病基因Cca的存在，实现对抗病植株的间接选择，由于不受其他基因效应和环境因素的影响，可用于早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，为进行黄瓜靶斑病抗病育种提供技术支持。
附图说明
图1是黄瓜靶斑病抗病基因Cca定位连锁图谱，其中左图黄瓜靶斑病基因初定位示意图，中间两个图为靶斑病抗病基因精细定位示意图，右图为80kb区间范围内基因分布情况及基因注释；
图2是Cca基因CcaSNP1分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
图3是Cca基因CcaSNP2分子标记在某一群体中酶切验证结果示意图；
图4是Cca基因CcaSNP1分子标记在未知另一群体中的酶切鉴定结果示意图；
图5是Cca基因CcaSNP2分子标记在另一未知群体中的酶切结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
实施例1：黄瓜靶斑病抗病基因Cca的获得
一、黄瓜靶斑病抗病基因Cca初步定位和精细定位
具体的定位方法包括以下步骤：
A、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究亲本及遗传群体：
分别选择WF2757(母本)和新泰密刺(父本)为抗感亲本，构建150株的F2:3群体和超过2000株的F2大群体。其中，父本新泰密刺和母本WF2757购自北京市农作物种质资源库。
B、黄瓜靶斑病抗病基因定位研究病情指数调查：
将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。
黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei.]是通过高苇等在文献(河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌种群分化的研究，华北农学报，2011，26(5):9-15)中记载的分离方法获得的。采用阚琳娜等(黄瓜褐斑病防治药剂的活体筛选，中国蔬菜，2007(4):22～24)的方法制备黄瓜靶斑病菌液，浓度为1×105个孢子/mL，血球计数板测定孢子浓度。于黄瓜幼苗期进行悬浮菌液喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮菌液均匀地喷洒于黄瓜叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后置于25℃光照培养箱中保湿培养。进行3次重复，每次重复30株。
按上述方法接种后7～10d进行病情调查。病情分级标准为：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占5％～25％；3级：病斑面积占26％～50％；4级：病斑面积占51％～75％；5级：病斑面积达75％以上。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
对亲本及各群体的病情进行精确统计。
C、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的初步定位：
利用Cavagnar等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber.BMC Genomics，2010,11:569)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息和和本实验室开发的Indel和SNP引物信息(参见表1中序号为1-8的引物信息)，结合150株的F2:3群体病情指数的精确统计，对亲本和后代群体进行分子标记分析，编码采集亲本及群体单株的基因型数据。母本基因型记为A，父本的基因型记为B，F1杂合基因型记为H，模糊或缺失数据记为U。用χ2test对数据进行比例适合性检验分析，采用JoinMap4.0软件(Stam1993；Van Ooijen2001)构建连锁图谱，设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi1944)，对黄瓜抗靶斑病基因初步定位在6号染色体的530kb(Indel16624801和Indel17156286)区间内，根据Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-codinggenes in the cucumber genome.BMC genomics，2011,12:540)对黄瓜基因组的注释和通过Softberry在线软件进行预测，该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域)，难以预测和选择候选基因。所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。
D、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的精细定位：
经过构建超过2000株的F2大群体继续对抗靶斑病基因进行精细定位，同时，本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序，经过生物信息比对分析，在双亲间开发Indel和SNP分子标记，在初定位区间的530kb范围内选择设计了19对Indel分子标记(参见表1序列号为9-27的引物信息)进行群体分析，经过验证后利用这19对Indel标记对抗靶斑病基因进行了精细定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，最终在2000株的F2大群体中精细定位到80kb(Indel16874230和Indel16953846)的范围内，参见图1。在精细定位区间内近2200株的试验材料中存在4个交换单株。
采用上述19对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10μL)如下：25ng基因组模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到10μL。
PCR反应程序为：阶段1：95℃预变性3min；阶段2：94℃30s，60℃1min，72℃1min，退火温度每个循环降1℃，共8个循环；阶段3：94℃30s，53℃30s，72℃1min，共32个循环；阶段4：72℃延伸5min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler。
表1Cca基因定位部分分子标记信息
E、抗靶斑病基因预测分析：
在精细定位的80kb区间内，有3个基因，经过NCBI Blast在线比对分析，第1个基因为NB-ARC基因，第2个基因为BIM2-like的转录因子相关基因，第三个基因为33-like肽重复序列结构蛋白相关基因。NB-ARC是NBS-LRR类抗病基因中常见的保守结构域，因此定位该NB-ARC基因是抗靶斑病的重要候选基因Cca。精细定位的结果排除了初定位区间中NBS-LRR串联抗病基因的干扰。Cca基因在抗/感材料间存在一个SNP，在基因的第1481位，抗病基因碱基为G，而感病基因碱基为T。推测该SNP可能导致抗病力的改变，可用于开发抗靶斑病紧密连锁分子标记，该NB-ARC基因为靶斑病的抗病候选基因。
二、黄瓜靶斑病抗病基因Cca全长DNA序列的获得
A、供试材料：
所述的供试材料为抗病材料WF2757，以感病材料新泰密刺作为对照。
B、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的DNA全长的扩增：
黄瓜基因组DNA的提取采用CTAB法，以供试抗/感材料基因组DNA为模板，利用Cca基因全长扩增上下游引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6进行基因全长PCR扩增，经过序列拼接分别得到Cca基因在抗/感材料上的基因全长SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，全长均计3255bp。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Cca基因全长进行比对分析，发现在抗/感材料间Cca基因的第1481位存在一个SNP，抗病材料中碱基为G，而感病材料中碱基为T。该SNP可做为抗靶斑病紧密连锁的分子标记，应用于世界范围内的黄瓜靶斑病抗病育种。
所述的PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到20μL。
所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，60℃1min，72℃4min，共42个循环；72℃延伸10min；PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well ThermalCycler。
所述的扩增产物用灭菌的去离子水稀释至80μL，放入Caliper核酸自动分析仪进行分析。
上下游引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，DNA全长序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行合成和分析。测序结果表明黄瓜靶斑病抗病基因Cca的全长DNA序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，共3255bp。
三、黄瓜靶斑病抗病基因Cca的功能验证
待测材料：以WF2757和长春密刺为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取120个单株进行靶斑病抗病鉴定和测序。其中，父本长春密刺和母本WF2757购自北京市农作物种质库。
将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6进行Cca基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述120份待测材料中有34株幼苗具有SEQ ID NO:7所示的Cca基因。所述PCR扩增参见本实施例第二部分步骤B。
3、对具有SEQ ID NO:7所示的Cca基因的幼苗进行靶斑病抗性检测
采用本实施例第一部分步骤B的方法对上述34株具有SEQ ID NO:7所示的Cca基因的黄瓜材料进行田间靶斑病抗性检测。
通过病情统计分析发现，上述具有SEQ ID NO:7所示的Cca基因的黄瓜苗中，病情均在2级以下，其中12株0级，13株1级、9株2级，由此说明，Cca基因的存在与黄瓜抗靶斑病性状具有一致性。
实施例2：与黄瓜靶斑病抗病基因Cca共分离的dCAPs标记CcaSNP1的获得及功能验证
一、dCAPs标记CcaSNP1的获得
通过实施例1可知，Cca基因在抗/感材料间的第1481位间存在一个SNP，抗病材料中碱基为G，而感病材料中碱基为T，利用此SNP位点，依据dCAPs引物在线设计网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，开发设计与抗/感靶斑病紧密连锁的dCAPs分子标记，命名为CcaSNP1，其上下游引物如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
通过上述引物对(序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)以双亲材料(抗病材料WF2757和感病材料新泰密刺)的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，并结合MaeII内切酶对PCR产物酶切，分别获得抗/感病特异条带，其中抗病条带为165bp，而感病条带为135bp。
二、与靶斑病抗病基因Cca共分离的dCAPs标记CcaSNP1的验证
利用上述引物对(序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对实施例1第一部分步骤A构建的150株F2:3群体株系和2000株F2遗传群体中的早期黄瓜材料进行PCR和酶切分析，即以150株F2:3群体株系和2000株F2遗传群体中的早期黄瓜材料的基因组DNA作为模板，利用上述引物进行PCR反应，然后对PCR产物进行MaeII内切酶酶切鉴定，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，如酶切产物中有165bp的抗病条带则该株系为候选的抗病植株，如酶切产物中有135bp的感病条带则该株系不具有黄瓜靶斑病抗性，部分电泳结果参见图2；同时按照实施例1第一部分步骤B的方法对这2150株黄瓜材料的抗病性进行田间鉴定，结果发现，利用上述dCAPs分子标记CcaSNP1的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达到100％，即Cca基因中的dCAPs分子标记与2150株黄瓜材料抗病表型紧密连锁，一致性达100％，达到共分离的水平。充分证实了由该SNP位点开发的dCAPs分子标记能够应用与靶斑病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。
本实施例中的PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1中第一部分的步骤D。
酶切体系(30μl)中含有：PCR扩增产物10μl，10×Buffer R(购自Thermo公司)2μl，MaeII(购自Thermo公司)1.0μl，灭菌双蒸水补足到30μl。
所述的酶切反应程序为：阶段1：65℃温育10h；阶段2：80℃20min失活；阶段3：4℃保存。
实施例3应用dCAPs分子标记CcaSNP1鉴定黄瓜材料的靶斑病抗性
1、待测材料：以WF2757和津研二号为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取100个单株进行以下实验。其中，父本津研二号和母本WF2757均购自北京市农作物种质资源库。
2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从述待测材料的幼苗中提取基因组DNA，以上述待测材料的各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增，对PCR产物进行MaeII内切酶酶切鉴定，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，如酶切产物中有165bp的抗病条带则该株系为候选的抗病植株，如酶切产物中有135bp的感病条带则该株系不具有黄瓜靶斑病抗性，部分电泳结果参见图4；同时按照实施例1第一部分步骤B的方法对这些待测黄瓜材料的抗病性进行田间鉴定，结果发现，利用上述dCAPs分子标记CcaSNP1的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达到100％。
本实施例中的PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1中第一部分的步骤D。
本实施例中的酶切体系和反应程序同实施例2。
实施例4：与黄瓜靶斑病抗病基因Cca共分离的dCAPs标记CcaSNP2的获得及验证
具体的获得方法包括以下步骤：
A、遗传群体的构建
分别选择BANNA HUANGGUA(母本)和长春密刺(父本)为抗感亲本，构建150个RIL-F8株系和2000株的F2群体。其中，父本长春密刺和母本BANNA HUANGGUA均购自北京市农作物种质资源库。
B、与抗病基因Cca共分离的dCAPs标记CcaSNP2的获得
本发明对上述抗感亲本进行基因组序列重测序，利用生物信息软件BWA-Samtools(v0.1.12a，mpileup按照默认参数)和BCFTOOLS对抗感材料的重测序序列进行比对分析，结合序列扩增SANGER测序验证，获得抗感材料的Cca基因全长序列，并利用DNAStar进行序列差异分析，获取Cca基因在不同材料中的SNP位点，结合黄瓜基因组9930-V2和基因组注释，发现Cca基因的210位存在单碱基差异SNP2位点(由G到A)即感病材料中碱基为G，抗病材料中碱基为A。利用该SNP位点，依据dCAPs引物在线设计网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，开发设计与抗/感靶斑病紧密连锁的dCAPs分子标记，获得CcaSNP2分子标记，其上下游引物如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
通过上述引物对(序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)以双亲材料(抗病材料BANNA HUANGGUA和长春密刺)的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，并结合XbaI内切酶对PCR产物酶切，分别获得抗/感病特异条带，其中抗病条带为164bp，而感病条带为134bp。
C、与靶斑病抗病基因Cca共分离的dCAPs标记CcaSNP2的验证
利用上述引物对(序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)对本实施例构建的150个RIL-F8株系和2000株F2遗传群体中的早期黄瓜材料进行PCR和酶切分析，即以150个RIL-F8株系和2000株F2遗传群体中的早期黄瓜材料的基因组DNA作为模板，利用上述引物对进行PCR反应，然后对PCR产物进行XbaI内切酶酶切鉴定，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，如酶切产物中有164bp的抗病条带则该株系为候选的抗病植株，如酶切产物中有134bp的感病条带则该株系不具有黄瓜靶斑病抗性，部分电泳结果参见图3；同时按照实施例1第一部分步骤B的方法对这2150株黄瓜材料的抗病性进行田间鉴定，结果发现，利用上述dCAPs分子标记CcaSNP2的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达到100％，即Cca基因中的dCAPs分子标记与2150株黄瓜材料抗病表型紧密连锁，一致性达100％，达到共分离的水平。充分证实了由该SNP位点开发的dCAPs分子标记能够应用与靶斑病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。
本实施例中的PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1中第一部分的步骤D。
酶切体系(20μl)中含有：10×NEB缓冲液(购自Thermo公司)2μl，PCR扩增产物10μl，内切酶XbaI0.5μl，灭菌双蒸水补足到20μl。
所述的酶切反应程序为：阶段1：37℃温育10h；阶段2：65℃20min失活；阶段3：4℃保存。
实施例5应用dCAPs分子标记CcaSNP2鉴定黄瓜材料的靶斑病抗性
1、待测材料：以DI HUANGGUA和津研二号为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取100个单株进行以下实验。其中，父本津研二号和母本DI HUANGGUA均购自北京市农作物种质资源库。
2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从述待测材料的幼苗中提取基因组DNA，以上述待测材料的各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4进行PCR扩增，对PCR产物进行XbaI内切酶酶切鉴定，酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，如酶切产物中有164bp的抗病条带则该株系为候选的抗病植株，如酶切产物中有134bp的感病条带则该株系不具有黄瓜靶斑病抗性，部分电泳结果参见图5；同时按照实施例1第一部分步骤B的方法对这这些待测黄瓜材料的抗病性进行田间鉴定，结果发现，利用上述dCAPs分子标记CcaSNP2的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达到100％。
本实施例中的PCR反应体系和PCR反应程序同实施例1中第一部分的步骤D。
本实施例中的酶切体系和反应程序同实施例2。

Claims (6)

1.获得黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记的引物，其特征在于：1)获得黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记CcaSNP1的引物，为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；2)获得黄瓜靶斑病抗病连锁分子标记CcaSNP2的引物，为序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
2.权利要求1所述的引物在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记CcaSNP1在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ IDNO:1和序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用MaeII内切酶对PCR产物酶切，如果得到165bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到135bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述待测黄瓜材料为WF2757或者长春密刺，或者以WF2757和/或长春密刺作为亲本得到的子代。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记CcaSNP2在选育抗黄瓜靶斑病品种中的应用的具体方法为：以待测黄瓜材料的基因组DNA作为模板，用序列表中SEQ IDNO:3和序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸组成的特异性引物进行PCR扩增，然后采用XbaI内切酶对PCR产物酶切，如果得到164bp的酶切产物，则待测黄瓜为抗病材料；如果得到134bp的酶切产物，则待测黄瓜为感病材料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述待测黄瓜材料为BANNA HUANGGUA，或者CUCUMIS HARDWICKII，或者DI HUANGGUA，或者以BANNA HUANGGUA和/或者CUCUMISHARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以DI HUANGGUA作为亲本得到的子代，或者DIHUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII作为亲本得到的子代，或者以BANNA HUANGGUA和DIHUANGGUA作为亲本得到的子代。
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