CN109825604A - 与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用，属于生物工程技术领域。本发明中在抗桃绿蚜性状候选调控基因Rm3的定位过程中，发现了一个与其紧密连锁的20bp的特异插入片段；调控基因Rm3控制抗桃绿蚜性状，含有调控基因Rm3的植株则具有抗蚜性状；因此可以根据植株中是否含有这20bp的特异插入片段，判断植株中是否含有调控基因Rm3，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。利用该分子标记可以设计相应的引物、试剂盒和检测方法用于检测桃植株是否含有抗蚜性状，检测结果具有非常高的准确率。

Description

与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的 引物、试剂盒、方法及其应用

技术领域

本发明涉及与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

蚜虫是影响桃树生长的主要害虫之一，危害桃树的蚜虫有桃绿蚜、桃粉蚜和桃瘤蚜3种，其中以桃绿蚜(green peach aphid)危害最重，同时桃绿蚜也是世界范围内广泛分布的植物刺吸式害虫。蚜虫以刺吸式口器从幼嫩的植物组织中吸取汁液，造成植物营养损失，发育受阻，出现生长畸形、早衰、甚至死亡，除刺吸造成的直接危害，蚜虫还是众多植物病毒的传播载体，由此造成的生产损失甚至比蚜虫的直接危害更加严重。农业生产中，蚜虫普遍采用化学农药防治，既增加了生产成本和果品农药残留风险，还会杀灭害虫在自然界的天敌，导致生态环境的污染和破坏。另外，蚜虫已对近些年来广泛应用的有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性，导致其防治难度逐渐增加，培育桃抗蚜品种，是生产中预防桃蚜虫危害的重要途径，有助于从根本上减少蚜虫对桃产业的不良影响。

国内外对桃树抗蚜性状的研究，主要集中在抗蚜种质资源的鉴定、抗性遗传规律分析和抗蚜基因的定位等方面。王力荣等对桃属5个种419份资源进行抗蚜性状的田间鉴定，选出 15份抗性资源：山桃、寿星桃和碧桃。通过人工接种后，分析蚜虫的取食和迁飞规律后推测，寿星桃和碧桃类为抗生型抗性，山桃类为趋避型抗性，而国外基于蚜虫精确刺吸电位图谱的规律则得出与之不同的结果，所以，对于桃属植物抗蚜类型的划分还需要进一步的讨论 (《Settling behaviour and reproductive potential of the green peachaphid Myzus persicae on peach varieties and a related wild Prunus》，Entomologia experimentalis et applicata 1998,89(3): 233-242，Sauge M H等)。此前，法国最早开展了对桃树抗蚜性状的研究，并筛选出了三份抗蚜材料：垂枝花桃、砧木品种‘Rubira’和山桃‘P1908’。

遗传分析表明，垂枝花桃和‘Rubira’对桃绿蚜的抗性均呈显性单基因的遗传，并且抗性表型非常相似，都具有很强的趋避型抗性，即蚜虫不能在其枝稍上繁殖，通常会在3天内离开寄主，且刺吸部位会出现红色或黄色的过敏性坏死斑点。但与垂枝花桃不同，‘Rubira’具有很强的诱导型抗性特征，即前期蚜虫的危害会抑制后来蚜虫的危害行为，推测两种材料的调控机理可能并不相同。因此，将垂枝花桃和‘Rubira’的抗性调控位点分别命名为了Rm1 和Rm2。Lambert等人将Rm2位点定位在第1号染色体末端2.88Mb的区间内，2016年该团队又将区间缩小至1.14Mb(参见《Identifying SNP markers tightlyassociated with six major genes in peach[Prunus persica(L.)Batsch]using ahigh-density SNP array with an objective of marker-assisted selection(MAS)》，Tree Genetics&Genomes 2016,12(6):1-21，Lambert P等)。与‘垂枝花桃’和‘Rubira’不同的是，山桃对绿蚜蚜虫的抗性是数量性状位点，蚜虫刺吸电位图谱表明山桃为抗生型抗性，其上蚜虫的种群繁殖速率会受到明显的抑制，QTL定位分析表明，山桃中共存在7个影响桃绿蚜抗性的效应位点，主效位点位于第3号染色体上。

公开号为CN107604095A的中国发明专利申请中公开了一种与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，所述标记Pp-InDel-23检测的InDel位点对应于Lovel1基因组组装的 Scaffold1的第44057689碱基处，该处的碱基序列为A或AGTCAAAT，序列方向为5’-3’。当该处的碱基为A时，为抗性标记。该标记与一类毛桃种质或其后代抗绿色桃蚜性状紧密连锁，通过检测Pp-InDel-23分子标记可以预测桃材料对蚜虫的抗性，获知毛桃类型种质及其后代是否携带抗绿色桃蚜基因，从而应用于桃种质资源筛选或品种检测。但是该文献中仅验证了所述标记与毛桃种质2013-04-20R抗绿色桃蚜性状相关，而未验证其与桃栽培品种、抗蚜优系、野生毛桃及桃野生近缘种的抗蚜性状的关联性，因此其中的抗性标记仅适用于部分群体内部，而不能适用于更大范围的桃群体抗蚜性状的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记，该分子标记与抗蚜调控基因Rm3相关联，因此能够更大范围的用其检测出桃植株是否具有抗蚜性状。

本发明还提供了用于检测桃抗蚜性状的引物，该引物能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。

本发明还提供了用于检测桃抗蚜性状的试剂盒，该试剂盒能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。

本发明还提供了桃抗蚜性状的检测方法，该方法能够检测出桃植株是否具有抗蚜性状。

本发明还提供了上述的用于检测桃抗蚜性状的引物、用于检测桃抗蚜性状的试剂盒或者桃抗蚜性状的检测方法的应用，能够用于筛选桃种质资源或品种检测。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中在抗桃绿蚜性状候选调控基因Rm3的定位过程中，发现了一个与其紧密连锁的 20bp的特异插入片段(如SEQ ID NO.1所示)；调控基因Rm3控制抗桃绿蚜性状，含有调控基因Rm3的植株则具有抗蚜性状；因此可以根据植株中是否含有这20bp的特异插入片段，判断植株中是否含有调控基因Rm3，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。

用于检测桃抗蚜性状的引物，所述引物的扩增区域覆盖与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel 分子标记的插入位点，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中根据上述的20bp的特异插入片段设计覆盖改片段的引物，能够检测出植株中是否含有这20bp的特异插入片段，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。

优选的，所述引物的扩增区域还覆盖控制桃抗蚜性状的抗性基因所在的区域，所述抗性基因位于桃基因组1号染色体Pp01:45,727,868-45,733,266bp的位置。

桃野生近缘种中存在与Rm3基因相似度很高的同源基因，引物的扩增区域还覆盖控制桃抗蚜性状的抗性基因所在的区域可以很好的区分这些近缘种中的同源基因，用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。

优选的，所述引物的序列如下所示：P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

该对引物的扩增片段全长为229bp，覆盖了上述的20bp的特异插入片段，含有抗蚜性状的植株扩增结果为229bp；不含抗蚜性状的植株扩增结果为209bp；可以以此判断植株是否具有抗蚜性状。该对引物扩增片段短，对扩增试剂要求不高，扩增时短，能在聚丙烯酰胺凝胶上检测，更加适用于大规模的样品基因型鉴定。目前已经在10个分离群体近1800个分离单株进行过分析验证，准确率为100％；在140份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料中检测抗蚜性的准确性为100％；同时使用该引物检测了来源于全国范围的野生毛桃20份，标记的鉴定结果100％准确。

优选的，所述引物的序列如下所示：Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

上述引物能够扩增出Rm3完整基因和其附近共9019bp的基因组序列。该对引物扩增所使用试剂成本高，扩增时间长，但应用范围更广，长基因片段扩增引物可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。

用于检测桃抗蚜性状的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于检测桃抗蚜性状的引物。

本申请中的试剂盒可以检测出与桃抗蚜性状紧密连锁的20bp的InDel分子标记，由此可以检测桃植株是否含有抗蚜性状。

一种桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：

1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

提取待测桃的基因组DNA，利用设计的引物进行PCR扩增；

2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状。

本发明中的检测方法中扩增区域覆盖与桃抗蚜性状紧密连锁的20bp的InDel分子标记的插入位点，因此可以检测出桃植株中是否含有这20bp特异插入片段，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。

所述根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状为：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。

本发明中通过研究发现20bp的特异插入片段与抗桃绿蚜性状候选调控基因Rm3紧密连锁；而调控基因Rm3控制抗桃绿蚜性状，含有调控基因Rm3的植株则具有抗蚜性状；因此可以根据植株中是否含有这20bp的特异插入片段，判断植株中是否含有调控基因Rm3，进而判断植株中是否具有抗蚜性状。

优选的，所述引物的序列如下所示：P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

该对引物的扩增片段全长为229bp，覆盖了上述的20bp的特异插入片段，含有抗蚜性状的植株扩增结果为229bp；不含抗蚜性状的植株扩增结果为209bp；可以以此判断植株是否具有抗蚜性状。

优选的，所述引物的序列如下所示：Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

上述引物能够扩增出Rm3完整基因和其附近共9019bp的基因组序列，可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。

上述的用于检测桃抗蚜性状的引物、上述的用于检测桃抗蚜性状的试剂盒或者上述桃抗蚜性状的检测方法在筛选桃种质资源或品种检测中的应用。

上述的引物、试剂盒和方法都可以用在筛选桃种质资源或品种检测中，具体的，可以依靠上述引物、试剂盒和方法鉴定和筛选出含有抗蚜性状桃植株，作为优秀的桃种质资源。

附图说明

图1为本发明中寿星桃来源抗桃绿蚜性状候选调控区间精细定位图；

图2为本发明中精细定位区间内基因表达情况图；

图3为本发明中桃绿蚜性状候选调控精细定位区间内基因功能及表达量分析图；

图4为本发明中新R基因的获得示意图；

图5为本发明中基于BAC文库构建与测序对精细定位区间进行重新组装拼接图；

图6为本发明中寿星桃抗蚜品种和感蚜品种的表型图；

图7为本发明中‘01-77-3’X‘中油桃13号’分离后代的蚜虫抗性表型与基因型展示图；

图8为本发明中Rm3基因上游的P62F和P62R引物在栽培品种、抗感优系、野生毛桃和桃近缘种中进行抗蚜鉴定的应用表现图；

图9为本发明中Rm3基因在光核桃、山桃、甘肃桃和毛桃中的同源基因编码蛋白的序列对比图；

图10为Rm3基因全长引物区分寿星桃、光核桃、山桃、甘肃桃和新疆桃等野生近缘种展示图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。‘01-77-3’是由‘87-71’(抗蚜)和‘92-60’ (蟠桃)经杂交得到，‘01-77-03’的抗性来自源于‘87-71’，‘87-71’是北京市农林科学院培育的观赏和食用的兼用品种，‘87-71’的抗性来自源于寿星桃(北京地区两用桃育种研究进展[J].北京农业科学，2000，18(6):23-25，刘佳棽，王虞英，宋婧一.)。

桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的实施例1

本实施例中与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例1

本实施例中用于检测桃抗蚜性状的引物的序列如下所示：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例2

本实施例中用于检测桃抗蚜性状的引物的序列如下所示：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’(如SEQ ID NO.5所示)。

用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例1

本实施例中用于检测桃抗蚜性状的试剂盒包含如下所示的引物：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例2

本实施例中用于检测桃抗蚜性状的试剂盒包含dNTPs、DNA聚合酶、PCR缓冲液，以及如下所示的引物：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

桃抗蚜性状的检测方法的实施例1

本实施例中桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：

1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

提取待测桃的基因组DNA，利用设计的引物进行PCR扩增；

2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。

上述的引物的序列如下所示：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

桃抗蚜性状的检测方法的实施例2

本实施例中桃抗蚜性状的检测方法，包括以下步骤：

1)根据与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

提取待测桃的基因组DNA，利用设计的引物进行PCR扩增；

2)根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。

上述的引物的序列如下所示：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

用于检测桃抗蚜性状的引物在筛选桃种质资源或品种检测中的应用的实施例1

本实施例中所用到的引物为“用于检测桃抗蚜性状的引物的实施例1”中的引物，以待测桃样品的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。

用于检测桃抗蚜性状的试剂盒在筛选桃种质资源或品种检测中的应用的实施例1

本实施例中的所用到的试剂盒为“用于检测桃抗蚜性状的试剂盒的实施例1”中的试剂盒，其中包含如下所述的引物：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

以待测桃样品的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。

桃抗蚜性状的检测方法在筛选桃种质资源中的应用的实施例1

本实施例中的所用到的方法为“桃抗蚜性状的检测方法的实施例1”中的方法，根据上述的方法挑选出含有抗蚜性状的桃植株作为优秀的桃种质资源。

桃抗蚜性状的检测方法在品种检测中的应用的实施例2

本实施例中的所用到的方法为“桃抗蚜性状的检测方法的实施例2”中的方法，可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定。

试验例1

1、寿星桃来源抗蚜性状调控基因的精细定位、新R基因的发现及关于基因组结构变异的推断

前期研究中通过精细定位将抗桃绿蚜性状候选调控基因Rm3锁定在桃1号染色体一个 160kb的区间中(如图1所示)，该区间内共有21个基因，通过结合抗感品种桃绿蚜处理后转录组分析(Niu L,Pan L,Zeng W,e tal.Dynamic transcriptomes of resistant andsusceptible peach lines after infestation by green peach aphids(Myzuspersicae,Sülzer)reveal defence responses controlled by the Rm3,locus[J].BMCGenomics,2018,19(1):846.)，发现区间内共有 12个基因表达(如图2所示)。

根据基因表达情况分析发现，定位区间中12个表达的基因在抗感蚜品种接种蚜虫后的变化趋势为没有变化；蚜虫是刺吸式害虫之一，目前已经克隆到的6个刺吸式害虫抗性调控基因都是抗性基因(resistance gene,R gene)R gene，分别是番茄中的Mi-1.2、甜瓜中的VAT和水稻中的Bph1/2/7/9。

从基因功能角度分析定位区间的12个中只有R gene(ppa000596m)与植物抗虫性相关 (如图3所示)，故将其视为重点候选基因进行研究。以该基因上游600bp处的插入位点即标记Indel-45.734为上游引物，以ppa000596m基因终止子下游的一段序列为下游引物，扩增到了一个全新的抗病基因，命名为Rm3(如图4所示)。连锁分析表明该基因位于精细定位区间，但桃参考基因并不存在该基因，说明参考基因组在精细定位区间有大型结构变异，候选调控基因Rm3就处于这一结构变异区域，单独依靠桃参考基因应该并不能找到候选调控基因。

2、基于细菌人工染色体文库(BAC)重新组装精细定位区间

鉴于候选调控基因Rm3很可能位于精细定位区间的结构变异中，因此采用抗性来源品种寿星桃构建了10倍覆盖的的细菌人工染色体文库(BAC)，平均插入片段大小110Kb，并挑选到4个克隆能够完整覆盖精细定位区间，其中部分克隆已经测序组装完成(如图5所示)。

3、Rm3基因序列信息及相关引物设计

通过BAC文库克隆并测序，得到Rm3完整序列，并且Rm3基因确实位于ppa000596m所在的位置(如图5所示)。Rm3基因起始密码子前2553bp和终止密码子之后956bp已经得到PCR测序加一代测序验证，全长为9019bp。该片段的扩增引物如下所示：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3'；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3'。

PCR扩增采用宝生物GXL DNA Polymerase(货号R050A)，扩增序列如SEQ ID NO.10所示，扩增反应体系如表1所示，扩增反应程序如表2所示。

表1 PCR扩增反应体系

表2 PCR扩增反应程序

对比Rm3基因和ppa000596m(如SEQ ID NO.11所示)基因序列，发现两个基因的DNA序列相似性很高。因此设计的PpRm3基因扩增引物为：

上游引物：5’-CTTGCTACCAAGTCAAGTGTATAGC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

下游引物：5’-CATTTCAAGAAATTGTTGTCACTG-3’(如SEQ ID NO.7所示)；扩增全长6165bp。

由根据上述的分析内容设计了扩增片段较短的一对引物P62F/P62R，其序列如下所示：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。该对引物的扩增产物在200bp左右，既能扩增Rm3基因又能扩增ppa000596基因，但Rm3基因的对应片段长220bp。该对引物与基因全长的扩增引物都可以用于Rm3基因的检测，但P62F和P62R扩增片段短，对扩增试剂要求不高，扩增时短，能在聚丙烯酰胺凝胶上检测，更加适用于大规模的样品基因型鉴定。 PCR扩增采用Vazyme LAmp DNA Polymerase(货号P302-d1)，扩增反应体系如表3所示，扩增反应程序如表4所示。

表3 PCR扩增反应体系

表4 PCR扩增反应程序

4、Rm3相关标记在抗蚜分离群体抗感鉴定及野生近缘种抗感鉴定中的应用效果分析

4.1寿星桃抗蚜性状的鉴定方法

参考PASCAL等(Pascal T,Pfeiffer F,Kervella J,Lacroze J P,Sauger M H,Weber W E. Inheritance of green peach aphid resistance in the peach cultivar‘Rubira’.Plant Breeding,2002, 121(5):459-461.)的抗蚜表型鉴定方法和标准，结合人工接蚜鉴定和田间鉴定方法确定分离群体中各单株的抗性有无。人工鉴定：群体分离单株放入网室中进行接种处理，人工接种10 头桃绿蚜后套上小纱网，2周后观察蚜虫对新梢的危害，两年连续鉴定。田间条件下鉴定，桃绿蚜是桃树早春最重要的虫害，早春对需要鉴定的群体不进行化学农药防治，让蚜虫虫害自然发生后，鉴定表型。寿星桃对桃绿蚜的抗性是单基因调控的(牛良,鲁振华,曾文芳,崔国朝,潘磊,徐强,李国怀,王志强.‘粉寿星’对桃绿蚜抗性的遗传分析[J].果树学报,2016,33(05): 578-584.)，感蚜单株的表型为蚜虫着生和卷叶；抗蚜单株的表型为蚜虫不能着生，短期取食后离开，取食过的嫩茎留下红色的过敏斑点，并且不会发生卷叶现象(如图6所示)。

4.2 Rm3相关标记在‘01-77-3’X‘中油桃13号’分离群体中的抗性鉴定应用

母本‘01-77-3’(Rr)的抗蚜性来源为‘粉寿星’，父本‘中油桃13号’感蚜(rr)，2014年人工授粉杂交，获得147杂种后代，按照段落4.1的方法进行了1年温室鉴定和连续两年田间鉴定，分离单株的抗感蚜性状表型稳定，用P62F和P62R引物检测该群体的抗感蚜基因型和表现型100％一致。如图7所示，从左至右1-4排分别为亲本‘01-77-3’、‘中油桃13号’、单株612至657、701至756和单株801至845，图示为单株用P62F和P62R检测的结果，PAGE 胶上面的条带指示Rm3，下面的条带指示ppa000596m，条带下字母“R”和“S”分别表示单株抗蚜或感蚜表型。2016年本人所在的课题组组配了大量以抗蚜材料为亲本的杂交组合， 9个杂交组合共得到杂种苗1600余株(如表5所示)杂交得到的种子在2017年春季定植前采用P62F和P62R引物基因型后按照抗感分开定植，并于2017年和2018年春季蚜虫危害季节进行两年连续的田间鉴定，鉴定结果表明，该标记在9个组合1600余株的杂种分离后代中鉴定的准确率为100％。

表5 2017年定植抗蚜组合情况

4.3 Rm3相关标记在栽培品种、抗感优系、野生毛桃和桃近缘种中进行抗蚜鉴定的应用表现

目前认为Rm3基因是控制寿星桃抗蚜性状的调控基因，则其上的相关筛选标记的准确性应该不止在于相关的抗蚜分离群体。因此用Rm3基因上游的P62F和P62R引物检测了140 份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料，该标记鉴定的准确度为100％(如图8所示，其中第1-5排，图中寿星桃类抗蚜品种用品种名后加圆圈表示)；又检测了来源于全国范围的野生毛桃20份，标记的鉴定结果100％准确(如图8所示，其中第 6排)。

目前研究的蚜虫抗源来自半野生的观赏桃品种寿星桃，寿星桃和栽培桃同属于桃亚属 (subgenus Amygdalus L.)，此外桃亚属真桃组还包括光核桃、甘肃桃、陕甘山桃、山桃和新疆桃，以上五种植物作为桃的野生近缘种，在新品种选育过程中也会作为亲本材料加以使用，因此有必要对Rm3相关抗蚜筛选标记在这些野生近缘种中的筛选效果进行评价。因此用Rm3 基因上游的P62F和P62R检测了24份的有代表性的桃野生近缘种材料，包括4份光核桃、6 份山桃、1份陕甘山桃、5份甘肃桃、6份新疆桃和两份扁桃材料。结果如图8中第7排所示，发现除了新疆桃和扁桃的检测结果的表现型一致外，光核桃、山桃、陕甘山桃和甘肃桃虽然都不具有寿星桃来源的趋避性抗蚜性(其中山桃虽然抗蚜，但是和寿星桃不是一种类型，应认定为不具有本文中提及的抗蚜基因)，但P62F和P62R的检测基因型为抗蚜，说明抗蚜品种中的Rm3基因在这4个品种中可能有同源基因存在。因此又对这些4种近缘种进行了进一步研究。

用Rm3基因RNA扩增引物(RNA-F和RNA-R)从光核桃、山桃和甘肃桃叶片样品的cDNA都能扩增出寿星桃Rm3基因同源序列，因为蛋白序列更能反映基因的功能，对RNA 编码的氨基酸局部序列进行了展示(如图9中所示)，表明Rm3基因引物在光核桃、山桃和甘肃桃中扩增到的基因只是他的同源基因而非Rm3基因本身，桃野生近缘种中存在与Rm3 基因相似度很高的同源基因，目前的Rm3基因上的引物没能很好的区分这些近缘种中的同源基因。

RNA-F和RNA-R的引物序列如下所示：

RNA-F：5’-TCTGCTCGAGTCGGATCGGAAGGCC-3’(如SEQ ID NO.8所示)；

RNA-R：5’-CAGTGACAACAATTTCTTGAAATG-3’(如SEQ ID NO.9所示)；扩增产物为5632bp。

PCR扩增采用宝生物GXL DNA Polymerase(货号R050A)，扩增反应体系如表6所示，扩增反应程序如表7所示。

表6 PCR扩增反应体系

表7 PCR扩增反应程序

考虑到同一物种如栽培桃中R基因也存在较多相似性较高的基因，设计用来群分近缘种的引物是沿着Rm3基因的附近3Kb的范围开展的，最终获得一对引物能够很好的将抗感品种、毛桃和野生近缘种区分开来，即上文提到的Rm3-0001F和Rm3-9027R，其上游引物位于Rm3 起始密码子上游2553bp，下游引物位于终止密码子下游956bp，扩增Rm3完整基因和附近共9019bp的基因组序列。

PCR扩增采用宝生物GXL DNA Polymerase(货号R050A)，扩增反应体系如表8所示，扩增反应程序如表9所示。PCR扩增结果如图10中所示，从图中可以看出，该引物能够将抗感品种、毛桃和野生近缘种区分开来。

表8 PCR扩增反应体系

表9在PCR扩增反应程序

5、Rm3功能标记的特点

本文所述标记是基于精细定位和候选基因筛选找到的Rm3抗蚜调控基因相关的功能标记，适用范围广；而非单独基于1个分离群体获得的只在群体内部有适用性的标记。

本文所述标记在寿星桃类抗蚜分离群体、栽培种、毛桃和野生近缘种中均具有优异的鉴定区分效能。

本文涉及的抗蚜鉴定标记有两对：(1)短片段扩增引物P62F和P62R：目前已经在10个分离群体近1800个分离单株进行过分析验证，准确率100％；在140份国内外的桃栽培品种和47份本单位保存的育种优系共180余份材料中检测抗蚜性的准确性为100％。该标记试剂成本低，扩增时间短，易用性强；(2)长基因片段扩增引物Rm3-0001F和Rm3-9027R：能够从桃野生基因种中将寿星桃类抗蚜性状区分出来。该标记试剂成本高，扩增时间长，但应用范围更广。长基因片段标记可用于具有野生近缘种育种亲本材料的基因型鉴定，短标记可用于亲缘关系材料和寿星桃后代的抗蚜性鉴定，鉴于目前桃新品种选育过程中野生近缘种的利用非常少，短标记即可完成满足几乎全部的寿星桃抗蚜性状的鉴定需求。

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 与桃抗蚜性状紧密连锁的分子标记，用于检测桃抗蚜性状的引物、试剂盒、方法及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 20

<212> DNA

<213> 寿星桃

<221> InDel分子标记

<400> 1

taccaagtca agtgtatagc 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P62F

<400> 2

agttaatttc ccaaggtgtt ctt 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P62R

<400> 3

tgcaaattgt agagaaattg agag 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Rm3-0001F

<400> 4

ccatctcgca agtttggtct ga 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Rm3-0001R

<400> 5

actagtgatt ggcttagagc ggacg 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PpRm3基因扩增上游引物

<400> 6

cttgctacca agtcaagtgt atagc 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> PpRm3基因扩增下游引物

<400> 7

catttcaaga aattgttgtc actg 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RNA-F

<400> 8

tctgctcgag tcggatcgga aggcc 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> RNA-R

<400> 9

cagtgacaac aatttcttga aatg 24

<211> 9019

<212> DNA

<213> 寿星桃

<221> Rm3-0001F/Rm3-9027R扩增序列

<400> 10

ccatctcgca agtttggtct gaaacggagg gttagatcgt ttacgatcgc acgatcggtc 60

ggttattaaa aaccgcaaac tttaagttat tgaatcggaa catccggggc tccgattcaa 120

gattcgcgaa gtcctacacg atcctaggaa tacctagaac aacatatttt aattgggaaa 180

cgatccaacg gccagaacct atcgaacccg gataacgcac aatatgcgaa aatccgttcg 240

atagtcaaac aatgtccgaa ttgagatccg caaaatccta cgcactcgtg acaaccagga 300

gatcacattg ggacagtaat gcccctctgc tacagtgccc acgcgccgcc acatgtgccg 360

acagcgcgcg agtgtccaaa gcaataaagt ttcaccggaa aatctccaaa ttacaagcca 420

cccttccggc tacaggttct actcgatgag tggaacactt tattcaacta cacccaagtc 480

caattcggac ggcaagggcc agaatctgcg tcggaaactc acggtttaac ccggaacttc 540

acggcctcga tccggcgacc accgtcacca ttgtcgtcgc acaacctagg aaatagctag 600

taggggagga gagctacctg ttccaagtga ctgcgcagct cacaatggtc gaaaacgtcg 660

ccggtgacgt cggcagtttt ggctgatttt cacgtcgttg ccaccgccgt ttgccgggtt 720

ttcgatcaga gaaaaggggt gggctgggta gaggaggaag agaggaagct tttgcaagaa 780

acggcacctg aaatggaggt cggacggcga agttctcgct gtctgaaatt ccggcaaaaa 840

atcaaaacgg ggaggggggt tcagccacgc gagaaagaga gagagagaga gagagagaga 900

tcagatattt taaacccaaa ttttgaaata tttacgattt tgtcattgtc gatgttttaa 960

tcgtaacctc ttcgttacaa ctccgaatta agcctaccgc gtgtctacga attcgtctca 1020

gtacaaccta tccaaaaata ccagtcacta ccccaaacac cttccgagca agaaaatgac 1080

caatttaccc ctactctaag ggtaacttcg taaattcact taaataatgt aaaatatgaa 1140

ttaaatttgg agtcggggtg ttacacaact tgtgcataat ttgtagttga tgacttaatt 1200

gtcacaggta gtacccttct tgcagttaac aaattcatcg atgacttatg ttcaaccttt 1260

gatagtcgca ggctaggaga gctcaatttt tttcttggca tggaagtttg tcgcaccaat 1320

gactgtctat taatctctca agctcgttat gcatctgacc ttctcaccaa atttaatatg 1380

gcagcatgta aaccaagtcc cacaccactg ctctcctcta ccagactctc tgcaaatgat 1440

ggtgatccga tctctgaccc cacactatac tgatgcatgg ttgggggcct ccagtacctc 1500

actctgtctc gccccgatac cgcttttgcc atgaatcaag tgtgccaatt catgcatcat 1560

ccgtgttcca ctcaccttca agctgttaaa aggatctatc gctacattaa ggacactctt 1620

gagcaatcca ccgtatcccg ctcaagctct gaagccgagt atcgcgcact tgctaccact 1680

acagctgagc ttcgttggtt tggctacttg tttcgtgagt tgggtattcc tctttgttcc 1740

cctccatgta tctttgtcga caacatatct gccctccaca tggccgcaaa tcccgtcttc 1800

catgctcgta cccgccatgt tgaaatcaac taccattttg ttcacgagtt aatttcccaa 1860

ggtgttcttc agacgcacta tgttccctct acttctcaac ttgccgatct cttcgccaac 1920

agcttgtcta gcgaacggtt tactcaactt gctaccaagt caagtgtata gcatataaaa 1980

gaactccaat acaactagaa tactcatcgt ggggtattct tccaattcta cttcttattc 2040

ttctcttacc tctctcaatt tctctacaat ttgcataagg ttttttttaa aaaaaaaatt 2100

tataaatgaa atcatcaatt tttgtacaaa taatgaacga aaatgaattt tgtgaaaaca 2160

aactgaaaca agacttgtgc ttttcttctt tttttttctt tttccctttt aattggacat 2220

tgtgctcgcc tcttccctct cttttcatgc ctctttcccc taagcttcct tgcattttcc 2280

tgcccttcaa ttttagccgt ccagtagatc gcgtagccaa aaagatatta tcttttcact 2340

gttcttccca cgtgggaact tttgcttttg tcgacagaca cggttgagga ccttgactat 2400

gcgtatttcg aatttattca tctgcgctgc aacacataaa ccactgccca gaaaaaataa 2460

ttgattatga aataacttct tctgctcgag tcggatcgga aggccaactt gtgcataatt 2520

tgtagttggt cttatctgaa ccagtatcaa ttaatggatg ccaggaaagc ccataaagcc 2580

tcctcttcat cctcaccatc ctcttcatca aaacgtcggg agtaccaagt gttcttgagc 2640

ttcagaggtg aagacacacg caagggcttc acaggccacc tccacgccgc attatctggt 2700

gacggattcc gcgcctttct tgatgacaac gagctaaaaa gggcggaatt tataaaaacc 2760

caactggagc aggcaatcga cgggtccatg atctccataa ttgtcttctc caagaggtat 2820

gccgattcca gttggtgtct tgacgagctg gtgaagatca tggagtgcag agaaaggcaa 2880

caggttttcc cattgttcta taatgttgac gcttcagatg tccggaaaca aactggtagt 2940

tttgcacaag catttgagaa acatgaagcg ggcatctgtg aaggtaaaca tgagaaagaa 3000

aaggtacagc ggtggagaaa tgctctcact caagctgcag atttgtgtgg ggaagatctc 3060

aaaaatgctg atgggtaatt actaatttct tgttccttgg attatcatct ccttacttga 3120

caaccatatg ttttctgtcc tttttgcttt tgtttttgtt tttccaacca taatgttaaa 3180

tcccaatctt aattgttaat tatatcttag tataaaaaaa gaaaataatt tgctcattct 3240

aaattattaa gttagggatt caatttaacc ttgtagtttg ctctgcttct gtgtttaatt 3300

gccaggcatg aagcaaagtt tatcaagaaa attcttggga aggttaataa cttggtgaac 3360

agcaaatacc aattagacac cgaagacctt gttggaatta cttctcgggt gaacgatgtt 3420

gttcgcatga ttggtattga aaattcaggt tctaaggatg ttgttcgcat gattggtatt 3480

ttggggatgg gcggcattgg aaaaacaacg cttgccaaaa ccatttataa caaatttgga 3540

cctatctttg aaggtaggag tttccttgca gacgtgaggg aagtatttgc aaaccaacgc 3600

agtaatggtc tggttggttt gcaagaacaa cttctaaatg atatcttgaa aaacgagggc 3660

ataaaggttg gatctgttgc taaagggatc gatatgataa gagaaagact ttgctgtaaa 3720

agagcacttg tcataattga cgatgcagat gatctacagc aactaaaagc aatagctaga 3780

gctcgtgatt ggtttggtcc tggaagtaga attgttataa caacaagaaa tcaacatttg 3840

ctagaccaag ttggagtgga tagcacatat atggctcaag caatggacga ggaagaagct 3900

ctagagctct ttagttggca tgcctttgaa attggttatc ctgatcaaga atatcttaac 3960

ctctcaaaac gtgtaattcg ttactgtcaa ggcttgccac tagcacttcg agttgtaggg 4020

tcttttctga ttaaaagatc catagttgag tgggaaagcc atttggagaa attggaaagg 4080

agtcctcctg atggagaaat tcaaaaagta ctcagaataa gctttgactt gctacctgat 4140

caggaaaaga gagagatatt ccttgatata tcttgtttct ttataggaat ggacaaggac 4200

tacgtaacac aaatattaaa gggatgtgac ttttctgcaa cgataggaat cagtgtcctc 4260

attgagcggt gccttgtaac tgttagtgag gaaaagctga ggatgcatga tttgcttcga 4320

gacatgggaa gagagatcgt tcgtgaaaag tccaccggcc gtgctgaaaa atttagtaga 4380

ttgtggaaag gtgaagacgt aatagatgta ttgagtgatg aatctgtaag tattttccca 4440

gtaaagtttt agaatgcgtc atgcaagaga agcatatgta tcccatgtct ataataaatt 4500

aaaatgtcta aaccaaagta aaagaggggg ttctcacaca ttcacactac caaggtgcca 4560

tatgaatttg aacttgagac cttagtctac aagtttagat catttttcac ttcactagac 4620

cccgttgatc aaagctcaat taggcataac caacaaaaaa tatgtccctt gattgcaaac 4680

ataaacttat agggcgtaac atggtccaat actattcatg tttgtaaatc atttttctaa 4740

ctcggtatct tttgttaata gggaactaaa aaaattggag gagttgctct agattcggat 4800

ctagatttta ttagcttccg tgcacaagca tttaccaaca tgaaaaaact gaggttactc 4860

cacctcagcg gagtggagct cactggagag tacaaagatt ttccccaaaa tttaatatgg 4920

ttgagctggc ttcgattccc tttagagtcc ataccagatg actttcctgt gcaaccaaaa 4980

ctagttgctt tagacctgca gtgtagcgaa ctcaaaatag tttggaagga tagcaaggta 5040

taataatctc aacctagttg ttgttggttc tttccttgtg gttctataca tatattatac 5100

ttcaccttct cttcattttg gtttaattcc tgtatcagag accttccttt tggattttaa 5160

tttccattct aattttgttt ttgtgtaaca gttgcatcag aatttgaaaa tccttaatct 5220

cagtggttcc tataagctaa caaaatcacc agacttttca aaactcccaa atctggagga 5280

attgatattg gaagactgtg agagtttgtc tgaggttcac tcatccatcg gggatcttgg 5340

aagactttct ttggtaaatc ttaaaggctg cataatgcta aaggatctcc cactgaattt 5400

ctataaatcc aagtctattg aaactcttat actgaataag tgtaggagtt ttgtaaagtt 5460

ggctgagggc ttaggggaca tggtatcatt gacaactctg aaagcggatg agacagccat 5520

aagacaaata ccatcttcca tattaaaatt gaagaaactg aaagttttat cattatgtaa 5580

tgtgaatggg tcgccatcaa caaatctttt gcctccttcg ttgcaaagtt taagctcttt 5640

aagagaatta gctcttgcag actggagttt aactgatgat gcattcccca aggatctcgg 5700

tagcctaatt tccttagaaa atttagatct tgcaggaaat gatttttgca gcctaccaag 5760

cttcagtcgt ctttcaaagc ttcatgattt gtctttaagt aagtgcaaaa atcttcgtgc 5820

aatcccagat ttaccaacaa atttgaaagt cttaaaagca gaatattgct ttgaattgga 5880

aaaaatgcca gatttttcag aaatgtcaaa tataaaagaa ttgtatctaa gtggttcgga 5940

caaagtcact gagattccag gcctggataa gtcattaaac tccatgacaa tgatttctat 6000

ggatggctgc actaatctca ctgctgattt taggaagaac atcctacagg tcaatccttc 6060

tctctctctc tcaaacacac acatacatct ttctctttct atcacataca acgcatatgt 6120

acacatgcag gcataagaat gtatttctta tagaaatttg gctctacatg gtatagggat 6180

ggacttcttg cggatatggt ggcatttttc tcagtggaaa tgatattcct gattggttcg 6240

actgcgtcca tgacgacgat attgtgtatt tcactgtgcc tcgaagtgtt ggtcgtaatt 6300

ttaaagggtt aactttgtcc ttcgtttcct ctccaggctt tttaagtcgt cctattagca 6360

ttagcattaa aaacatgacc aagggggctg agcttgaagc caggatcata cccgattgtc 6420

caattgacca agggggctgg ctcatttaca atccagtttc ttatctttgg cagggacagt 6480

tatcaaatga cgagctcaaa ttgcaagacg gtgataaagt cttgattgaa ataatagtgg 6540

aggattatta tagggtgaag gtcaaggtga agaaaacagg tgttagtctg gtatgggaca 6600

aatttatgaa cgaaaatatg attgattacc atctttgtgc gtatgaacga cgcccatctc 6660

aaaatctggt caatgatgat gacatcattc atgtcgaaga tgataatcac ataacaaaat 6720

caccagactt ttcaaaattc ccaaatctcg agaagttgat attgaaaggt tgtaagaagt 6780

tgattaaggt tcactcatac atcggggatc ttggaagact ttctttggta aatcttgaag 6840

actgcgaaat gctaagggat ctcccactga atttctataa atccaagtct attgaaactc 6900

ttatactgaa tggttgttca agatttgaag acttggctga tggcttaggg gacatggtat 6960

cattaacagt tttggaagca aataagacag ccatcagacg aattccatct tccatagtaa 7020

aattgaagaa cttagaacat ctgcttcttg caaacaatta ctttcgtagc ctaccaagtc 7080

tcgctggtct ttcaaagctc aaggtcttgt ctttaaatgc atgcagagaa cttcgtgcaa 7140

tcccagattt accaaccaat ttgtatgttc tgaaagcaaa tggctgccca aatttggaaa 7200

caattccaga tttttcaaaa atgtcgaata tgagaaaatt gtatctccgt gattcggtca 7260

aactcactga ggttccaggc ttggataagt cgttaaactc catgacaagg attcgtatgg 7320

aaggctgcac caatctgact gccgatttta ggaacaacat ccaacaggtc tctctctctc 7380

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 7440

tcacacacac acacacacac agaggcacag ctgcagatgc ggcccatgta aatatgcata 7500

tgcatgtata agaatgtgtt gcttctggtg tgcagagatg gacttcttgc ggatttggtg 7560

gaatttattt gaatggaatt tatgatattc ctgagtggtt caaaatcctc aatgatgtgg 7620

gcaatatcgt cttctttgaa gttcctcaaa gaatcatggg tcgtgattta aaagggttga 7680

ctatatgctt cgtttactct tttgttgttt ttggccgaga acttgaaggt cctattggca 7740

ttatcgttag aaatcttacc aaacaaactg ctttgcacac caagatagca tttgccagat 7800

gcggaagacc agaaccggat ttgcttattt ggagactatt gtcaaccgga cttgaagacc 7860

gttatctttg gcagggacaa ttgtcaaacg atgtgctctg tttgcaagcc ggggaccaag 7920

tctccattct tgtaaggcct ctagttgatt ttgtgatagt gaagaagaca ggggttcatc 7980

tagaatggga caaagtcatg aaggagaata tggataatct ggatcctcat ttgtatgatt 8040

ggaaaacgaa tcgggatttt tgatggggag ttgatgaatc catttcaaga aattgttgtc 8100

actgagacaa agggtaacca tactgaggaa gccatcaatc ttgatggagg aagaagaagc 8160

aaagattgta ctacaacact attacacttt atacagctgt ctaactaatt caaatacact 8220

actaacaact cacgtgcctt gcacacctaa ctcacccctg aattagacca acactctaat 8280

gccagttaga actaggggtg gttgcggttc ggtaaccgcg aatttttact caaaccgcaa 8340

accgaccgac tatttgcggt ttggtgattt ttgaaaccgc aaaccgaccg cattttgcga 8400

tttaccgcat tgcggtaaac cgcaaaaatg cggtcggtta ccgcgaattt gcggtttaaa 8460

accgcaaatt ctcaagcatt cacaaaaata taaatttaca acctaaataa ataaatacac 8520

aacctcaatt tctcaagcat atataaattc acaatcgatt ccaattctca agcattcaca 8580

acctaagaaa attaaagtta caattccaaa cattccaatt aaagttaaac ttctcaagca 8640

ttccaattcc aaatccttta aatttacaaa ccaaaagcaa aatgaattaa agttacaacc 8700

aaaaagaaaa atccaattca cagttaatta aagttacaaa ctaaaaggaa aaatgcaata 8760

caccaatgtt acaaactcaa gtgttagtgg tgagtggatt tgaagaaccc ctttgtgttg 8820

tttgagcacc aatgctatct acaaataaaa caacatagtt tagtacattt tattataaga 8880

agaagcataa ataacattag cataaataaa ctaattactt acaagttgtc atatcttcca 8940

tttccttgta gaattcaacc tcatcatctg ttggttcctt gtaaaaggaa aattcgtccg 9000

ctctaagcca atcactagt 9019

<211> 6041

<212> DNA

<213> 桃

<221> ppa000596序列

<400> 11

agttaatttc ccaaggtgtt cttcagatgc actatgttcc cttttcttct caacttgccg 60

atctcttcgc caacaacttg tctcgcgaac ggtttactca acttgcatat aaaagaactc 120

caatacaacc agaatactca tcgtggggta ttcttccatt atacttctta ttctctctta 180

cctctctcaa tttctctaca atttgcataa ggtttttttt taaaaaaaaa tttataaatg 240

aaatcatcaa tttttgtcac tgaaacaaga cgtgtttttc ttcttctttt ctctttttct 300

tttgtgagtg gacattgtgc tcgtctcttc cctctgcttt catgcctctt tccccgatgc 360

ttccttgcat tttcctgacc ttcaatctta gccgtccagt agatcctgta gccaataaga 420

tattatattt tcactgttct ccccacatgg gaacttttgc ttttgttgac tgaaacattt 480

gaggaccttg actatgcgta tttcgaatta ttcatctgcg ctgcaacaca caaaccactg 540

cccagaaaaa ataattgata acttcttctg ctcaagtcgg atcggaaggc caacttgtgc 600

ataatttgtt gctggtctga tctgaaccga tagctcctcc agtatcaatt aatggatgcc 660

aggaaagccc ataaagcatc ctcttcatcc tcaacatcca cctcctcatc aaaacgtttg 720

aagtacgacg tgttcttgag cttcagaggt gaagacacac gcaagggctt cacaggccac 780

ctccacgccg cattatctga tgccggaatc agcacctttc ttgacgacaa cgagctagaa 840

agagcggaat ttataaaaac ccaactggag caggcaatcg acaagtccat tatctccata 900

attgtcttct ctaagagtta tgccgattcc agttggtgtc ttgacgagct ggtgaagatc 960

atggagtgta gagaaagatt ggggaaacat gttattccat tgttctacag tgttgatgct 1020

tcagatgtcc ggaaccaaaa aggtagtttt gcacaagcat ttgagaaaca tgaaggtaaa 1080

catgagaaag aaaaggtaca gcgatggaaa aaggctctca ctcaagttgc agatttgtgt 1140

ggggaagatc ttaaaaatgc tgacaatggg taattactaa tttcttgttc cttggattat 1200

catctcctta cttgacaacc atatgttttc tgtccttttt gtttttgttt ttgtttttgt 1260

ttttaactat ggtttggttt ggtttggttt gattttaact atccattctt tctaacttga 1320

taatgtaaga tccatttaac agttgatgtt aaatcccaat cttaattgtt aattatatct 1380

taattctaaa ttattaagtt agggattcaa tttaaccttg tagtttgttc cacatcgaat 1440

gattcgtagt tctgcttctt tgtttaattg ccaggcatga agcaaagttt atcaacaaaa 1500

ttcttggggt ggttaataag ctgttggaca tcaaatccca attagacatc aaacaccctg 1560

ttggaattac ttctcgggtg aaggctttga gtaatcactt acagattgaa aattcaggtt 1620

ctcatcagga tgatgttcgc atgatcggta tttgggggat gggcggcatt gggaaaacaa 1680

cgcttgccaa agccatttat aacgaatttg aacgtagctt tgaaggtagg agtttccttg 1740

aaaacgtgag ggaagtattt gcaaaccaac gcagtaatgg tctggttggt ttgcaagaac 1800

aacttctaaa tgatatcttg aaaagcgagg acctcataaa ggttggctct gttgctaacg 1860

gaatcgatat gataagaaga agacttccct gtaaaagagc acttgtcata attgacgatg 1920

cagatgatct acaccaacta gaagcaatag ctggagctcg tgattggttt ggccctggaa 1980

gtagaattct tataacaaca agaaatcaac atttgctaca gcaagttgga gtggatggca 2040

catatatcgc tgaaaaaatg gatgaggaag aagctctaga gttctttagt tggcaggcct 2100

tcaaaagatg ttatcctgaa taccttgacc tctcaaaacg agtaattcgt tactgtcaag 2160

gcttgccact agcacttcga gttgttgggt cttttctgtt taatagatcc atagcggagt 2220

gggaaagcca tttggagaaa ttgcaaacaa gtcttgatgg agatattcaa aaaatactca 2280

gaataagctt tgacgggcta cctgatgata caacgagaaa gatattcctt gatatatctt 2340

gtttctttat tggagatgac aaggactatg taacaaaaat attagatgga tgtggctttt 2400

atgcaacgat aggaatcagt gtcctcatcg aacggtgcct tgtaactctt agtaagtata 2460

acaagctggg gatgcatgat ttgcttcgag acatgggaag aaagatcgtt tatgaaaatg 2520

tcgatggccg cccagaaaaa tgtagtagat tgtggaaaca tgaagacgta acaaatgtac 2580

tgaacgatga atctgtaagt actttcccaa tgcatcatgc aagagaagca tatgtatccg 2640

gtgtctataa taaattaaaa tgtccttctc catttcttta tttttttttg tttagtacaa 2700

gcgctaaatc aaagtaaaag agggggttct cacacatcca cgctaccaag gtgccatttg 2760

aacatgagac cttagtctgc aagtttagac catttttcac ttcactagac ctatttctta 2820

tattatatcc attaatatca aagctcaatt aggcataacc aacaaaaaaa tatgtgcttt 2880

aattgcaaac acaaactatt aattatacct cttggttaat acatacacgg attttcatgt 2940

ttgtaaatca tttttctaac tcggtatctt ttgttaacag ggaactaaaa aaattgaagg 3000

agttgctcta catggctctt acgggactag attcagtgca caagcattta ccaacatgaa 3060

aaaactgagg ttactccacc tcagcggagt agagctcact ggagagtaca aagattttcc 3120

caaaacgtta atatggttgt gctggcatcg attcccttta gagtccatac cagatgactt 3180

tcctatgcaa ccaaaactag ttgctttaga cctgcagcgg agcgcactca aaatagtttg 3240

gaaggattgg aaggtataat aatctcaacc tagttgttgt tggttctttc cttgtggttc 3300

tatgcatata ttatacttca ccttctcttc atttaggttt aatttctgta tcagagacct 3360

tccttttgga ttttaatttc cattctaatt ttgtttttgt gtaacagttg catcagaatt 3420

tgaaaattct taatctcagt cattcccgtt ggctaacaaa atcaccagac ttttcaaaac 3480

tcccaaatct cgaggaattg atattggaag aatgtacgag tttgtctggg gttcactcat 3540

ccatcgggga tcttggaaga ctttctttgg taaatcttca aggctgcaga atgctaaagg 3600

atctcccact gaatttctat aaatccaagt ctattgaaac tcttctactt aattggggtt 3660

taagttttga aaagtttgct gagggcttag gggacatggt atcattgaca actctgaaag 3720

cggatccttc attgcatagt ttaagctctt taagagaatt agctcttgca aagtgtagtt 3780

taactaatga tgcagtcccc aaggatctcg gtagcctaat ttccttagaa aggttagatc 3840

ttgcaggcaa ttacttttgc agcctaccaa gcctcagtcg tctttcaaag cttcaagatt 3900

tgtctttaca tatgtgcgaa aatcttcgtg caatcccaga tttaccaaca aatttgaaag 3960

tcttacgagc agatggctgc attgcattgg aaaaaatgcc agatttttca gaaatgtcaa 4020

atataagaga attgtatcta cgtgaatcag gcaaattcac tgagattcca ggcctgtata 4080

agtcattaaa ctccatgaca aggattcata tggagaagtg cactaaactc actgccgatt 4140

ttaggaagag catcctacag gtcaatcctt ctctctctct cgcacataca tctttctctt 4200

tcagtcacat acaataagaa cgtatttctt atagaaattt ggctctacat ggtataggga 4260

tggacttctt gcggatatgg tggcattttt ctcagcgtaa atgattttcc tgattggttc 4320

gactgtgtcc atgacgacga tattgtgtat ttcactgtgc ctcgaagtgt tggtcgtaat 4380

tttaaagggt tgactttgtt cttcgtttcc tctccaggct tttttatcat tagcattaaa 4440

aacttgacca agggtgctga gcttgaagcc aggatcatac ccgattgtcg aactatgggt 4500

tattatcttt ggcagggaca gttatcaaat gacgagctca aattgcaaga cggtgataaa 4560

gtcttgattg aaataatacc caaacaggat tgggtgaagg tgaagaaaac aggtgttagt 4620

ctggtatggg acaaatttat gaacgaaaat atgattgatt accatctttg tcgatatgaa 4680

cgacgcccat ctcaaaatct ggtcaatgat gatgacatca ttcatgtcga agatgataat 4740

cacataacaa aatcaccaga cttttcaaaa ttcccaaatc tcgagaagtt gatattgaaa 4800

ggttgtaaga agttgattaa ggttcactca tacatcgggg atcttggaag actttctttg 4860

gtaaatcttg aagactgcga aatgctaagg gatctcccac tgaatttcta taaatccaag 4920

tctattgaaa ctcttatact gaatggttgt tcaagatttg aaaagttggc tgatggctta 4980

ggggacatgg tatcattgac aattttgaaa gcagataaca cagccatcag aaaaattcca 5040

agtctcgctg ttctttcaaa gctcaaggtc ttgtgtttaa atgcatgcag agaacttcat 5100

gcaatcctag atttaccaac gaatttgtat gttctgaaag caaatggctg cccaaaattg 5160

gaaacaattc cagatttttc aaaaatgtgg aatatgagag aattgtatct ctgtgattcg 5220

ttcaaactca ctgaggttcc aggcttggat aagtcattaa actccatgac aaggattcat 5280

atggaaggct gcaccaatct gactgccgat tttaggaaca acatccaaca ggtctctctc 5340

tctctctctc tctctctctc tctctctcac tcacacacac acacacagag gcacagctgc 5400

agatgcggcc catgtaaatt gcatatgcat gtataagaat gtgttgcttc tggtgtgcag 5460

agatggactt cttgcggatt tggtggaatt tatttgaatg gaatttatga tattcctgag 5520

tggttcaaaa tcgtcaatga tgcggacaat atcgtcttct ttgaagttcc tcaaagaatc 5580

atgggtcgtg atttaaaagg gttgactata tgcttcgttt actcttattt tggttttggc 5640

ccaaaacatg aagattctga aggtcctgtt ggcataatcg ttagaaatct taccaaacaa 5700

actactttgc acgccaatat agtgtttgcc agatacggaa gatcaggacc ggatttgctt 5760

attcggagac tattgccaac cagacttaaa gaccgttatc tttggcaggg acaattgtca 5820

aacgatgtga tctgtttgga aggtggtgac cacgtatcga ttcttgtaag gcctcatgat 5880

gtggattttg tgagagtgaa gaagacgggg gttcatttag aatgggacaa agtcatgaag 5940

gaaaatatgg ataatctgga tcctcatttg tatgattgga aaacgaatcg ggatttttga 6000

tggggagttg atgaatccat ttcaagaaat tgttgtcact g 6041

Claims (10)

1.一种与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于：所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于检测桃抗蚜性状的引物，其特征在于：所述引物的扩增区域覆盖与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的插入位点，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812-45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的用于检测桃抗蚜性状的引物，其特征在于：所述引物的扩增区域还覆盖控制桃抗蚜性状的抗性基因所在的区域，所述抗性基因位于桃基因组1号染色体Pp01:45,727,868-45,733,266 bp的位置。

4.根据权利要求2所述的用于检测桃抗蚜性状的引物，其特征在于：所述引物的序列如下所示：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’。

5.根据权利要求3所述的用于检测桃抗蚜性状的引物，其特征在于：所述引物的序列如下所示：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

6.用于检测桃抗蚜性状的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求2或3所述的用于检测桃抗蚜性状的引物。

7.一种桃抗蚜性状的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）根据与桃抗蚜性状紧密连锁的InDel分子标记的插入位点的前后序列设计引物，所述分子标记为长度20bp的特异插入片段，插入位点在桃基因组1号染色体45,733,812 -45,733,813 bp的位置，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

提取待测桃的基因组DNA，利用设计的引物进行PCR扩增；

2）根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状。

8.根据权利要求7所述的桃抗蚜性状的检测方法，其特征在于：所述根据扩增结果判定待测桃的抗蚜性状为：当扩增条带都不包含20bp的特异插入片段的序列时，为感蚜性状；当扩增条带中至少有一条包含20bp的特异插入片段的序列时，为抗蚜性状。

9.根据权利要求7所述的桃抗蚜性状的检测方法，其特征在于：所述引物的序列如下所示：

P62F：5’-AGTTAATTTCCCAAGGTGTTCTT-3’；

P62R：5’-TGCAAATTGTAGAGAAATTGAGAG-3’；

或者所述引物的序列如下所示：

Rm3-0001F：5’-CCATCTCGCAAGTTTGGTCTGA-3’；

Rm3-9027R：5’-ACTAGTGATTGGCTTAGAGCGGACG-3’。

10.如权利要求2-5任一项所述的用于检测桃抗蚜性状的引物、权利要求6所述的用于检测桃抗蚜性状的试剂盒或者权利要求7-9任一项所述的桃抗蚜性状的检测方法在筛选桃种质资源或品种检测中的应用。