CN107604095A - 一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记及其应用。所述分子标记Pp‑InDel‑23检测的InDel位点，对应于Lovell基因组组装的Scaffold 1 的第44057689碱基处，该处的碱基序列为A或者AGTCAAAT，位点处碱基为A的为抗性标记。本发明公开的位点和分子标记方法，能够为桃抗绿色桃蚜分子育种、涉及抗蚜性状的多性状聚合育种及抗蚜资源筛选提供检测位点和高效工具，应用前景广阔。

Description

一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记及其 应用

技术领域

本发明涉及与毛桃种质抗绿色桃蚜（Myzus persicae）性状紧密连锁的InDel标记及其应用方法，属于分子育种学领域，专用于桃抗蚜分子育种与种质资源筛选利用。

背景技术

桃原产中国，遗传多样性丰富。中国桃栽培面积和产量均占世界的50%以上，位居世界首位。绿色桃蚜，属于半翅目蚜科，通过口针吸食植物韧皮部汁液，为桃树春季的主要害虫之一。很多核果类病毒可以通过蚜虫传播。目前，对桃树蚜虫的防治主要依赖化学农药。化学农药使用过程中，不可避免地杀伤大量农业益虫，破坏生物多样性。受气候条件影响和植保技术水平的限制，蚜虫每年都在部分生态区给桃果生产造成大量损失。由于繁殖速度快，群体数量大，群体内变异多，蚜虫很容易对农药产生抗性。近年来，噻虫嗪和吡虫啉等防治蚜虫的农药效果逐渐变差，就与蚜虫变异产生抗药性有关。因此，最为经济环保的措施是利用挖掘的抗蚜资源，培育抗蚜品种在生产上应用。

毛桃种质2013-04-20R是从200多份地方种质中筛选出来的抗蚜材料。该材料被绿色桃蚜刺吸取食后，自身产生坏死反应，引起局部组织死亡而起到限制蚜虫的营养摄取，阻断蚜虫增殖。通过配置杂交组合和分子生物学研究，我们找到了能够对该种质抗性类型和抗性后代进行分子鉴定的插入/缺失标记，也就是InDel标记。该标记与抗绿色桃蚜性状紧密连锁，在验证群体中准确性在95%以上，利用该标记可以缩短该类型抗蚜材料的鉴定周期，进行分子标记辅助育种和包含该性状的多目标聚合育种，有广阔应用前景。

发明内容

本发明人通过大量的田间和实验室研究，获得了与毛桃种质2013-04-20R抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记Pp-InDel-23和利用其进行检测同一抗性类型的抗性材料的方法。通过检测与抗蚜性状连锁的分子标记，可以预测抗蚜种质或其后代抗蚜性，加快抗蚜种质的发掘和抗蚜品种选育进度。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于：

所述标记Pp-InDel-23检测的InDel位点对应于Lovell基因组组装的Scaffold 1 的第44057689碱基处，该处的碱基序列为A或者AGTCAAAT，序列方向为5’-3’方向；位点处碱基为A的为抗性标记。

通过对上述位点的检测可以预测桃种质对绿色桃蚜的抗性。

一种基于上述InDel位点且与之对应开发的InDel 分子标记及其引物，其特征在于：

Pp-InDel-23标记对应扩增引物为Pp-InDel-23F: 5’-AACCTATCTACACCATTCACCATCC-3’，Pp-InDel-23R: 5’-AGGATGGATGACAACACATAGGAG-3’。

检测的InDel位点位于InDel分子标记扩增产物内部。利用标记的对应引物，以桃材料的基因组DNA扩增分子标记，检测标记条带的大小和带型，可以预知桃材料是否携带有抗蚜基因及是否抗蚜。在验证群体中准确性超过95%。

用上述引物，以抗性纯合、抗性杂合和感性纯合位点的材料DNA为对照，扩增桃基因组DNA，扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果为杂合带型（检测位点表现为2条条带），则标志着该桃材料抗绿色桃蚜基因的存在，抗绿色桃蚜；如果为纯合带型（检测位点表现为1条条带），且对应抗性纯合位点材料DNA扩增的条带（片段较小条带，93bp），则标志着该桃材料抗绿色桃蚜基因的存在，且检测位点为纯合。利用标记Pp-InDel-23引物对目标扩展产物进行序列测序，含有较小DNA片段（位点处碱基为A，对应大小为93bp）的来源材料可预知具有绿色桃蚜抗性。

本发明的优点：

本发明提供的与毛桃抗绿色桃蚜性状紧密连锁的Pp-InDel-23标记及其应用，具有以下优点：

（1）通过检测Pp-InDel-23分子标记，可以预测桃材料对蚜虫的抗性，用于桃种质资源筛选或品种检测，以快速筛选抗蚜资源或品系，在聚合育种中提供分子标志。

（2）可高效地用于分子标志辅助选种，早期淘汰非目标植株，节约土地、农药化肥和人员管理等成本。

（3）可以追踪抗蚜DNA区段在基因组中的渗入情况。

附图说明

附图1为InDel标记检测的抗、感蚜带型。

具体实施方式

实施例1：毛桃种质2013-04-20R后代群体抗蚜植株的筛选

1. 采集来自2013-04-20R后代个体叶片，用植物DNA提取试剂盒提取叶片DNA；将DNA进行稀释至20ng/ul；

2. 选用发明中检测位点分子标记引物Pp-InDel-23F和Pp-InDel-23R，通过PCR扩增其分子标记。PCR 反应体系为：总体积 20μl，1×PCR 缓冲液，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/LdNTPS，0.4mmol/L 引物Pp-InDel-23F和Pp-InDel-23R，25ng模板 DNA，1U Tag 酶；PCR 反应条件：95℃变性 3min，然后 94℃ 30s，53℃ 25s，72℃ 15s 共 35 个循环，最后 72℃延伸 5min 。

3. 扩增产物在 6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，检测带型，看是否为杂合带型或含有大小为 93bp 的抗性条带（附图1）。所用的 6％聚丙烯酰胺凝胶为 100ml 聚丙烯酰胺胶溶液中含有 5.7g 丙烯酰胺和 0.3g 甲叉双丙烯酰胺，通过微量四甲基乙二胺（TEMED）聚合。

4. 如为杂合带型或含有大小为 93bp 的条带，则可预测该植株对绿色桃蚜具有抗性。

由此可见，本发明提供了一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记及其应用方法，通过检测分子标记Pp-InDel-23，可以预测桃抗蚜种质或其后代抗蚜性，加快桃抗蚜种质的发掘和抗蚜品种选育进度。在育种中，通过抗性种质后代幼苗DNA中标记位点的检测，及早将非抗性植株淘汰，可以极大地节约土地和后续管理等成本，提高育种效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于：

所述标记Pp-InDel-23检测的InDel位点对应于Lovell基因组组装的Scaffold 1 的第44057689碱基处，该处的碱基序列为A或者AGTCAAAT，序列方向为5’-3’方向；位点处碱基为A的为抗性标记；Pp-InDel-23标记对应扩增引物为Pp-InDel-23F: 5’-AACCTATCTACACCATTCACCATCC-3’ ，Pp-InDel-23R: 5’-AGGATGGATGACAACACATAGGAG-3’；所述标记与一类毛桃种质或其后代抗绿色桃蚜性状紧密连锁，通过对标记Pp-InDel-23检测可以知道毛桃类型种质及其后代是否携带标记检测类型的抗绿色桃蚜基因。

2.根据权利要求1所述的一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，所述的分子标记及其应用，其特征在于：

所述InDel位点位于Pp-InDel-23分子标记扩增产物内部，利用标记的对应扩增引物，以毛桃材料的基因组DNA扩增分子标记，检测标记条带的大小或条带类型，可以预知毛桃材料是否携带抗绿色桃蚜基因及是否抗绿色桃蚜。

3.根据权利要求1所述的一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于：利用Pp-InDel-23标记进行种质检测、基因分型或抗性筛选的应用。

4.根据权利要求1所述的一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于：利用所述的标记位点进行抗绿色桃蚜性状整合、构建重组材料、载体的应用。

5.根据权利要求1所述的一个与毛桃种质抗绿色桃蚜性状紧密连锁的InDel标记，其特征在于：利用所述的标记特征进行检测的检测试剂盒开发。