CN106367505B - 一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR‑3‑1紧密连锁的InDel位点及其应用，所述的InDel位点，InDel24对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第19020017碱基处，该处的碱基序列为T或者TGCAAT；InDel25对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第19031883碱基处，该处的碱基序列为G或者GTTAATG；InDel26对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第19227372碱基处，该处的碱基序列为C或者CTTACGTC。本发明公开的位点和分子标记方法，能够为桃抗蚜分子育种、涉及抗蚜性状的多性状聚合育种及抗蚜资源筛选提供检测位点和高效工具，具有广阔应用前景。

Description

一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点及 其应用
技术领域
本发明涉及与山桃抗绿色桃蚜（Myzus persicae）主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点及其应用方法，属于分子遗传学领域，专用于桃抗蚜分子育种与种质资源的利用。
背景技术
桃原产中国，遗传多样性丰富。桃果为世界大宗水果之一，目前中国、美国、意大利、西班牙、希腊、法国和智利为世界桃主要生产国。中国的栽培面积和产量均占世界的50%以上，位居世界第一位。绿色桃蚜，属于半翅目蚜科，通过口针吸食植物韧皮部汁液，为桃树春季的主要害虫之一，主要危害桃树的叶片、新稍和幼果，造成大量减产和果实品质下降，严重时可引起树体死亡。目前，对桃树蚜虫的防治主要依赖化学农药，此措施不仅每年都要投入大量的人力和物力，增加生产成本，污染环境，同时也不可避免地杀伤大量农业益虫，破坏生物多样性。即便如此，受防治时间和技术水平的限制，蚜虫依然在部分生态区给桃果生产造成极大损失。由于蚜虫繁殖速度快，容易发生变异，很容易对农药产生抗药性。近年来，吡虫啉等常规农药效果越来越差，就是蚜虫抗药性所致。因此，最为经济环保的有效防治措施是挖掘抗蚜种质资源，培育抗蚜品种在生产上应用。
截止目前，已明确的桃抗蚜种质类型有分别受Rm1基因、Rm2基因控制的单基因控制性状类型和来自山桃种质的多基因控制类型。Rm2基因现已被法国研究人员定位，同时也将此基因用于抗蚜育种。Rm1、Rm2基因型的材料在蚜虫取食后，通过自身产生坏死反应，引起局部组织死亡而起到限制蚜虫的营养摄取，阻断蚜虫增殖，其实现抗蚜的同时，以牺牲自己局部组织为代价。以山桃为代表的多基因控制抗蚜性状的材料，通过韧皮部组织特点限制蚜虫营养摄取，抑制蚜虫增殖，本身无明显受害或者轻微受害，亦无组织坏死。同时，考虑到单基因性状的抗性品种长期应用更易被蚜虫所克服，多基因控制的种质类型被认为是最有应用前途的。法国研究人员Sauge 等对来自中国的野生山桃种质P1908的73个子代构成的群体研究表明，山桃存在8个与抗蚜有关的QTLs，其中1个主效QTL位于第3连锁群。
由于抗虫鉴定的周期性长，环境影响因素多，利用常规手段效率太低，将抗虫性状与其它育种目标性状进行聚合难度更大。因此，利用较大山桃抗蚜种质后代群体，精细定位抗蚜QTLs，利用其周围紧密连锁的多态性位点，开发分子标记，借助分子标记辅助选择技术可以有目的地利用抗虫基因进行性状聚合或者抗蚜资源的筛选，加速抗蚜育种进程。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点及其作为分子标记的检测方法，通过检测这些与抗蚜主效基因连锁的分子标记，可以预测山桃抗蚜种质或其后代抗蚜性，加快山桃抗蚜种质的发掘和抗蚜品种选育进度。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点，其特征在于：
所述的位点（1）InDel24对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3 的第19020017碱基处，该处的碱基序列为T或者TGCAAT；
所述的位点（2）InDel25对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3 的第19031883碱基处，该处的碱基序列为G或者GTTAATG；
所述的位点（2）（3）InDel26对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3 的第19227372碱基处，该处的碱基序列为C或者CTTACGTC。序列方向均为5’-3’方向。
通过对上述位点的检测可以知道桃种质对绿色桃蚜的抗性。
一种基于上述InDel位点且与之对应开发的InDel 分子标记及其引物，其特征在于：
（1）InDel-24，对应引物为InDel-24F: 5’-CAAATGAAGCCCAGAAGCTC-3’， InDel-24R: 5’-ACCTTCCGAGGTTGTCTCCT-3’；
（2）InDel-25，对应引物为InDel-25F：5’-GGGACATGATAGCTGCTGGT-3’， InDel-25R：5’-ATCCACATCTCCACTGCACA-3’；
（3）InDel-26，对应引物为InDel-26F：5’-GGAGTTGACCTTCCAACGAA-3’， InDel-26R: 5’-TGGTAGGTGGCCATACATGA-3’。
InDel位点位于InDel分子标记扩增产物内部。利用标记的对应引物，以桃材料的基因组DNA扩增分子标记，检测标记条带的大小，可以预知桃材料是否携带有抗蚜主效QTL及是否抗蚜，准确性超过95%。
用上述引物，扩增桃基因组DNA，如果（1）扩增InDel24的大小为225bp，或者（2）扩增InDel25的大小为168bp，或者（3）扩增InDel26的大小为216bp，则标志着该桃材料抗绿色桃蚜主效QTL的存在和抗绿色桃蚜的可能性高达95%以上。
本发明的优点：
本发明提供的与山桃抗绿色桃蚜主效QTL紧密连锁的位点及其应用，具有以下优点：
（1）通过本发明，用InDel标记精细定位了山桃代表性种质帚形山桃基因组中的主效QTL位点qGPAR-3-1，并公开了与之紧密连锁的InDel位点；
（2）公开了检测上述InDel位点的分子标记和对应引物，通过检测这些与抗绿色桃蚜性状连锁的分子标记，可以预测桃材料对蚜虫的抗性，用于桃种质资源筛选或品种检测，以快速筛选抗蚜资源或品系，在聚合育种中提供分子标志。
（3）可高效地用于分子标志辅助选种，早期淘汰非目标植株，节约土地、农药化肥等成本。
（4）可以追踪山桃抗蚜DNA区段在不同核果类材料基因组中的渗入情况。
附图说明
附图为InDel标记检测的抗感蚜带型。
具体实施方式
实施例1帚形山桃后代群体抗蚜植株的筛选
1. 采集来自帚形山桃后代个体叶片，用植物DNA提取试剂盒提取叶片DNA；将DNA进行稀释至20ng/ul；
2. 选用发明中任一位点对应的分子标记引物，通过PCR扩增其分子标记，在此选用InDel25标记引物。PCR 反应体系为 ：总体积 20μl，1×PCR 缓冲液，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPS，0.4mmol/L 引物 InDel25-F和引物 InDel25-R，25ng模板 DNA，1U Tag酶；PCR 反应条件 ：95℃ 变性 3min，然后 94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 20s 共 35 个循环，最后 72℃延伸 5min 。
3. 扩增产物在 6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，检查是否含有大小为 168bp的 InDel25抗性分子标记（附图1）。所用的 6％聚丙烯酰胺凝胶为 100ml 聚丙烯酰胺胶溶液中含有 5.7g 丙烯酰胺和 0.3g 甲叉双丙烯酰胺，通过微量四甲基乙二胺（TEMED）聚合。
4. 如含有大小为 145bp 的 InDel25抗性分子标记，则可预测该植株对绿色桃蚜具有抗性，抗性等级在3级以上（包括1级、2级和3级），准确率在95%以上。
5.桃树对绿色桃蚜的抗性鉴定等级参考《桃种质资源描述规范和数据标准》，具体如下。于4月上中旬，选取长势正常的植株，每株选择长势中庸的新梢5个，每个新梢接种蚜虫300～500头，然后用银灰色防虫网罩住，于1周后进行抗性调查，综合评定新捎生长情况。未发现蚜虫为1级；有蚜虫但未造成危害为2级；轻微危害，仅有少量卷叶为3级；为害较重，卷叶数量超过新梢叶量的50%为4级；危害极重，新梢叶片均卷曲为5级。其中，1、2、3级为抗蚜，4、5级为感蚜。
由此可见，本发明提供了一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel位点及其作为分子标记的检测方法，通过检测这些与抗蚜主效基因连锁的分子标记，可以预测山桃抗蚜种质或其后代抗蚜性，加快山桃抗蚜种质的发掘和抗蚜品种选育进度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
中国农业科学院郑州果树研究所
一组与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel标记及其应用
6
Patent in version 3.5
InDel25-F
1
20bp
DNA
人工序列
1
GGGACATGATAGCTGCTGGT
InDel25-R
2
20bp
DNA
人工序列
2
ATCCACATCTCCACTGCACA

Claims (1)

1.一种与山桃抗蚜主效QTL qGPAR-3-1紧密连锁的InDel分子标记的应用，其特征在于，所述Indel分子标记命名为InDel-25，对应引物为InDel-25F：5’-GGGACATGATAGCTGCTGGT-3’， InDel-25R：5’-ATCCACATCTCCACTGCACA-3’，通过桃树基因DNA为底物，进行PCR扩增获得扩增片段，检测位点对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3 的第19031883碱基插入或缺失，该处碱基序列为G时，桃材料具有山桃类型抗蚜虫特性，该处碱基序列为GTTAATG时，桃材料没有山桃类型抗蚜虫特性。
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