CN109371158B - 与小麦茎基腐病抗性qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记Xwmc388‑205及其应用，该分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物对进行PCR扩增后，再以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为205bp DNA片段；分子标记Xwmc388‑205在室内就可通过检测分子标记对小麦茎基腐病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，提高育种效率。

Description

与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，特别是一种与小麦茎基腐病抗性 QTL紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
小麦茎基腐病(wheat crown rot)，又称镰刀茎基腐病(Fusarium crown rot) 是发生在干旱和半干旱地区的世界性小麦重要病害，该病害在澳大利亚、新西兰、南美洲、美国西北部太平洋沿岸、加拿大、意大利、中东、北非和中国均有发生(Molecular PlantPathology,2018,19(7):1547-1562)。该病害在澳大利亚主要由假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)引起(Plant Breeding, 2015,134:365-372)，在中国主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum)引起，但假禾谷镰刀菌近几年呈上升趋势(麦类作物学报,2016,36(11):1547-1552)。病原菌在小麦的茎基部开始侵染，苗期出现茎基部叶鞘和茎秆变褐，有时可引起根部褐变腐烂，病菌沿茎秆继续向上扩展，使茎基以上的多个节和节间出现褐变，严重时可在小麦成熟期造成枯白穗，从而导致小麦减产。在澳大利亚，由于该病害的侵染，小麦和大麦每年的损失超过9700 万澳元；美国西北部太平洋沿岸严重田块，小麦产量损失达35％；近年来，随着常年秸秆还田，土壤中菌源积累，我国河北中南部、山西南部、陕西中东部、河南和山东大部、江苏和安徽北部小麦茎基腐病有加重趋势，河南沁阳以及江苏沿海部分田块小麦损失高达30％以上(河南农业科学,2014,43(5):114-117；麦类作物学报,2016,36(11):1547-1552)。
目前对小麦茎基腐病的防治主要采用农业措施与药剂防治相结合的方法，虽然取得部分成效，也存在很多问题，田间残留秸秆的焚烧以及深耕处理是减少菌原积累的有效方法，但秸秆焚烧造成环境污染，深耕不仅增加农本，而且造成土壤表面水分的丧失，对于干旱和半干旱地区下茬作物的种植影响很大。轮作，特别是非病原菌寄主作物的种植是减少该病害危害的另一重要途径，但也势必会影响经济收入。化学防治虽可取得一定效果，但也不可避免地影响环境和增加农本。抗病品种的种植无疑是防治小麦茎基腐病最经济和有效的途径。
抗病品种的培育需要抗性稳定的抗源用于配组以及明确的抗性机理指导育种，国内外研究人员对小麦茎基腐病的抗性鉴定方法、抗源的筛选以及抗性机理的解析进行了不懈努力并取得了一些研究成果。采用病麦粒接种、菌液直接浸泡接种等方法先后建立了田间成株期以及室内苗期的抗性鉴定方法；运用这些鉴定方法对3400余份常规小麦、硬粒小麦、小黑麦和野生小麦进行茎基腐病的抗性筛选，虽然没有发现免疫和高抗材料，但筛选到2-49、Sunco、CI12633等一批中抗材料(植物遗传资源学报,2009,10(3):431-435；西北农业学报,2011,20(9):31-34；麦类作物学报,2015,35(3):339-345；Plant Breeding,2015,134:365-372；植物遗传资源学报,2016,17(2):377-382)；发现小麦对茎基腐病的抗性是一数量性状，并对 2-49、Sunco等抗源的抗病QTL进行了分子定位，在小麦的13条染色体上发现了抗病QTL，虽然大多抗病QTL对抗病性表型解释率不高，但也发现在染色体 3BL和4B存在抗病主效QTL(Plant Breeding,2015,134:365-372)，通过分子标记辅助选择，可以将主效QTL和微效QTL进行聚合，从而提高小麦对茎基腐病的抗性，有效降低小麦茎基腐病的危害。此外，目前已经报道的QTL标记均是从国外的抗病种质中获得，针对国内小麦育种中使用的QTL尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种检测小麦植株是否存在与小麦品种CI12633 茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记，判断小麦植株是否含有茎基腐病抗性 QTL，进而预测小麦植株对茎基腐病的抗性，加快抗茎基腐病小麦的选择进度，具体步骤如下：
一种与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列如SEQNo.1和SEQNo.2所示的引物对进行PCR 扩增后，再以质量分数为12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为205bp 的DNA片段，申请人将其自命名为Xwmc388-205。
优选的，本发明所述与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所述质量分数为12％聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有11.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺；所述小麦DNA为模板是以小麦植株的叶片分离获取的DNA，该叶片DNA提取方法为本领域常规方法，如采用CTAB方法提取 (参见文献：Proc Natl Acad Sci USA,1984,81(24):8014-8018)。
优选的，本发明所述与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所使用的小麦DNA模板来自小麦品种CI12633。
其次，本发明还提供了一对用于检测小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁分子标记的引物，该引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明同时提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物在检测小麦品种或品系茎基腐病抗性中的应用，其具体步骤为：采用小麦植株叶片 DNA为模板，以SEQ No.1和SEQ No.2为引物进行PCR扩增，PCR反应体系：总体积20ul，包括10×buffer 2μl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SEQ NO:1 和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng。PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环；最后 72℃延伸5min，获得扩增产物；然后将扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，若电泳产物存在大小为205bp的条带，则说明该样品带有分子标记Xwmc388-205，则预测该小麦植株具有茎基腐病抗性，该样品小麦茎基腐病平均病级可以降低 9.7％左右；否则，则该样品不带有分子标记Xwmc388-205；所述小麦植株为小麦CI12633、小麦CI12633的衍生品种或品系、以小麦CI12633为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上的小麦植株、以小麦CI12633的衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上的小麦植株中的至少一种。
本发明所述小麦CI1263的衍生品种或品系是指：以小麦CI12633为亲本，通过常规杂交或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体的小麦品种或品系。
本发明小麦茎基腐病抗性QTL来自我国引进品种CI12633，该品种同时具有白粉病和纹枯病的抗性，可以作为小麦育种亲本使用，所发现的抗病QTL位于7A染色体，与现有已知报道的QTL不同，为新发现QTL，扩展了小麦抗性的基因资源。本发明克服常规育种中小麦茎基腐病抗性鉴定易受环境影响，并且只能在特定生育时期鉴定筛选的缺点，在室内就可通过检测分子标记对小麦茎基腐病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率；此外，本发明使用的分子标记为SSR标记，简单易操作，PCR扩增稳定，便于不同单位使用。
附图说明
图1为实施例1Xwmc388-205聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。
实施例所涉及的引物对：
SEQ NO.1：5’TGTGCGGAATGATTCAATCTGT3’；
SEQ NO.2：5’GGCCATTAGACTGCAATGGTTT3’；
实施例所涉及的小麦样本来源：
CI12633为引进品种，江苏省种质资源库编号为苏13292。
实施例中自定义为C01～C67的品系是以CI12633为父本，以扬麦158为母本，杂交并繁衍至F8代的高代品系，申请人将其依次自命名为C01～C67。
12％聚丙烯酰胺凝胶：100ml聚丙烯酰胺胶溶液中加入有11.6g丙烯酰胺和 0.4g甲叉双丙烯酰胺。
实施例1
采用CI12633(抗茎基腐病)与扬麦158(感茎基腐病)配制杂交，获得的种子繁殖F2植株，F2植株的后代采用单粒传的方法繁殖，最终获得F6重组自交系群体；采用SSR等标记对获得的重组自交系群体进行基因型分析，采用JoinMap等作图软件构建遗传连锁图；同时对重组自交系群体进行多年多次茎基腐病抗性鉴定；综合遗传连锁图和茎基腐病抗性鉴定资料采用MapQTL等QTL 分析软件分析，定位抗病QTL并获得与抗病QTL紧密的分子标记。本发明所示 Xwmc388-205是与CI12633的7A染色体抗病QTL紧密连锁的分子标记。该标记可以通过以下方法获取：
以CTAB的方法(Proc Natl Acad Sci USA,1984,81(24):8014-8018)提取CI12633叶片DNA。
采用下列反应体系和运行程序进行PCR扩增。
PCR反应体系：总体积20ul，包括10×buffer 2μl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SEQNO:1和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng，余量为ddH2O；
PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec， 72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min。
PCR扩增产物加入3μl 10×Loading buffer，混匀，于12％聚丙烯酰胺凝胶加样5μl，400V电泳1小时，银染观察。结果见图1。
图1中1-4泳道均为扬麦158，泳道6-9为CI12633；泳道5为20bpDNA分子量标准梯度，该条带从下至上分别为120bp、140bp、160bp、180bp、200bp 和300bp。
图1箭头所指为标记CI12633扩增出的Xwmc388-205标记，大小为205bp，申请人将其自命名为Xwmc388-205，该分子标记Xwmc388-205与小麦茎腐病抗性紧密连锁，扬麦158对应位置无扩增产物。
实施例2
1、预测C01～C67的品系抗性
实施例中自定义为C01～C67的品系是以CI12633为父本，以扬麦158为母本，杂交并繁衍至F8代的高代品系。
(1)以CTAB的方法提取C01～C67的品系叶片DNA。
(2)以步骤(1)中获得的小麦DNA为模板，以SEQ NO:1和SEQ NO:2为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系：总体积20μl，包括10×buffer 2μl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SEQNO:1和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng。
PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec， 72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min。
(3)扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，检查是否含有大小为205bp的Xwmc388-205分子标记,如含有Xwmc388-205分子标记，则可预测该小麦幼苗具有茎基腐病抗性，根据申请人在CI12633和扬麦158的重组自交系群体分析的结果，小麦茎基腐病平均病级可以降低9.7％左右。
2、在室内，根据文献(植物遗传资源学报,2016,17(2):377-382)提供的小麦茎腐病抗性室内鉴定方法，对C01～C67高代品系进行茎基腐病抗性鉴定，病情严重度判定标准如下：1级是第1叶鞘病斑长度小于1.0cm，2级是第1叶鞘病斑长度为1.0～2.0cm，3级是第1叶鞘病斑长度大于2.0cm但幼苗未萎焉，4级是幼苗出现萎焉病症，5级是幼苗死亡。每个品系调查20株幼苗，重复2次，计算平均病级。
3、将步骤1利用Xwmc388-205分子标记检测结果与步骤2茎基腐病抗性鉴定实际结果比对，结果见附表1：
表1 分子标记检测结果与茎基腐病抗性鉴定结果比较
Figure BDA0001895928390000061
Figure BDA0001895928390000071
+：表示有Xwmc388-205分子标记；-：表示无Xwmc388-205分子标记
表1中，有Xwmc388-205分子标记的高代品系茎基腐病平均病级为2.0，没有Xwmc388-205分子标记的高代品系茎基腐病平均病级为2.7，表明具有 Xwmc388-205分子标记的高代品系茎基腐病抗性高，茎基腐病平均病级比没有 Xwmc388-205分子标记的高代品系茎基腐病平均病级降低25.9％，预测结果与实测结果非常吻合。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 与小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgcggaat gattcaatct gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggccattaga ctgcaatggt tt 22

Claims (3)

1.用于检测小麦茎基腐病抗性QTL紧密连锁分子标记的引物对在检测小麦品种或品系茎基腐病抗性中的应用，其特征在于，具体步骤如下：以小麦植株叶片DNA为模板，以SEQNo.1和SEQ No.2为引物进行PCR扩增后，将扩增产物进行凝胶电泳，若电泳产物存在大小为205bp的条带，则说明该样品带有所述分子标记，则预测该小麦植株具有茎基腐病抗性;所述分子标记位于7A染色体；所述小麦植株为小麦CI12633及其小麦衍生品种或品系、以小麦CI12633或其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上的小麦植株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCR反应体系：10×buffer 2μl，1.5mMMgCl2，0.2mM dNTPs，SEQ NO:1和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng，ddH2O补足至20ul；
PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃退火30sec， 72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min，即获得扩增产物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小麦衍生品种或品系是指：以CI12633为亲本，通过常规杂交或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体的小麦品种或品系。
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