CN112312763B - 烟草花叶病毒属抗性茄科植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及属于茄科(Solanaceae)的植物，诸如碧冬茄属(Petunia)和/或舞春花属(Calibrachoa)的植物，并且特别是碧冬茄属植物，所述植物对植物病原体烟草花叶病毒属(Tobamovirus)具有抗性，所述植物病原体烟草花叶病毒属包括植物病原体烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草轻型绿花叶病毒和辣椒轻型斑驳病毒。本发明还涉及用于鉴定茄科的烟草花叶病毒属抗性植物的方法。具体地，本发明涉及属于茄科的植物，所述植物对烟草花叶病毒属具有抗性并且所述植物在其基因组中包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3。

Description

烟草花叶病毒属抗性茄科植物
描述
本发明涉及属于茄科(Solanaceae)的植物，诸如碧冬茄属(Petunia)和/或舞春花属(Calibrachoa)的植物，并且特别是碧冬茄属植物，所述植物对植物病原体烟草花叶病毒属(Tobamovirus)具有抗性，所述植物病原体烟草花叶病毒属包括植物病原体烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草轻型绿花叶病毒和辣椒轻型斑驳病毒。本发明还涉及用于鉴定茄科的烟草花叶病毒属抗性植物的方法。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是烟草花叶病毒属的一种植物病原体物种，感染来自30个科的至少199种不同的植物物种；然而茄科作物从疾病遭受的损失最大。由于TMV容易传播，爆发可以相对快速地建立。据报道，烟草花叶病毒(TMV)感染导致产量和质量下降，作物价值损失60％。据估计，在1960年和1965年之间，TMV每年导致北卡罗来纳州的烤烟损失100万美元。在2000年，TMV导致北卡罗来纳州烟草产量估计损失1.4％，造成1070万美元的损失。
TMV、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobaccomild green mosaic virus,TMGMV)和辣椒轻型斑驳病毒(epper mild mottle virus,PMMoV)是可感染茄科作物的烟草花叶病毒属中最常见的病毒。烟草花叶病毒通过机械作用传播，并且能够在种子表面或土壤中存活一年以上的时间段，并且即使在高温下也能保持传染性。
TMV能够侵入植物的几乎所有组织，除了根和芽尖以及生殖细胞。感染后，植物不能克服病毒感染，但感染通常不会通过种子传给子代幼苗。只有一小部分子代幼苗通过移植过程中幼苗与病毒污染的种皮的摩擦而显示出遗传病毒感染。
在缺乏N基因的烟草栽培品种中，TMV复制和全身地移动，导致植物生长减缓和花叶病症状，其特征是浅绿色和深绿色叶组织的混合区域。相比之下，含N烟草的TMV感染在病毒感染部位产生细胞死亡，并且病毒粒子被限制在紧紧围绕坏死病灶的区域。
已在茄科的若干物种诸如烟草、辣椒(pepper)、番茄、茄子、曼陀罗(Datura)、酸浆属(Physalis)、碧冬茄属(Petunia)和舞春花属(Calibrachoa)中报道了烟草花叶病毒属感染。文献中已经描述了烟草、辣椒和番茄对烟草花叶病毒属的自发抗性，其中一个或更多个抗性基因被鉴定为这种差异的基础。
植物对TMV的抗性机制的特征是一种过敏反应(hypersensitive response,HR)，随后是通过植物抗性基因和病毒无毒基因之间的相互作用而引发的一种通用全身获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。这种防御机制通过在感染部位周围形成局部坏死病灶来防止病毒扩散。
TMV感染的烟草植物在19世纪中叶第一次被描述为带有传染性花叶病或叶斑病。当时对这种致病因子知之甚少，并且它被命名为烟草花叶病。进一步的研究表明，这种疾病是由病毒引起的，并导致在心叶烟(Nicotiana glutinosa)中鉴定出TMV抗性基因N(用于坏死损伤反应)。目前，N基因是对若干烟草花叶病毒属毒株唯一且最佳表征的抗性基因。N基因具有单显性作用模式，该模式包括通过选择性剪接编码两种转录物(NS和NL)。在TMV感染前和感染后的最初几小时，NS转录物占优势，而NL转录物在感染后的4至8小时占优势。对于完全抗性，在TMV感染之前和之后，NS与NL转录物之间的平衡是重要的。
在番茄中，描述了无症状植物，尽管它们的组织中存在TMV。随后鉴定了若干基因，它们赋予番茄对TMV和番茄花叶病毒(ToMV)的抗性。第一种被描述的抗性基因是Tm1，紧接着发现了Tm2。后来发现了第三种基因，命名为Tm-2a或Tm-22。所有三种抗性基因都具有显性作用模式。Tm-22是Tm-2的等位基因，并且在四个氨基酸上不同。它也是最持久和最广泛使用的，因为很少有ToMV分离株能够逃避其抗性，而那些逃避其抗性的分离株通常毒性较低。
在辣椒中，在1934年筛选辣椒(Capsicum annuum)和灌木状辣椒(Capsicumfrutescens)的18个栽培品种时，首次描述了TMV抗性。接种TMV后，塔巴斯科辣椒(Tabascopepper)植物显示出坏死的局部病变，随后受感染的叶片脱落(目前定义为过敏反应)，而其他辣椒栽培品种在全身性感染期间显示出继发性斑驳。进一步的研究导致鉴定出辣椒中的两种TMV抗性基因；一种显性基因，命名为L，代表局部病变反应，和一种次要抗性基因，命名为li。目前，表征了五种L基因等位基因(L1、L2、L3、L4和L1a)。除了L1a表现出不同的温度敏感性外，每一种都表现出提供对不同TMV致病型的抗性。
此外，WO 2007/097574公开了一种与枸杞果辣椒(Capsicum chacoense)对TMV的抗性高度相关的分子标志物。通过外推，此申请还公开了该标志物在其他作物，诸如黄瓜、西瓜、红辣椒、甜瓜、大白菜、烟草、碧冬茄属、棉花和蔷薇属植物中具有预测性。
由抗性基因赋予的对烟草花叶病毒属的抗性通常不是绝对的。例如，在番茄中，已知Tm2-2杂合的植物一般比纯合体抗性低，Tm2-2介导的抗性是剂量依赖性的，并且在番茄(基于Tm-1和Tm2-2)和烟草(基于N)两者中，在较高温度抗性较低。在杂合体中，全身性坏死的发生率随着接种时的年龄而降低，随着暴露于高温的时间长度而增加，并且随着接种后热应激的时间间隔而降低。尽管同一基因具有多效性效应，但不同的抗性代表可能具有不同的潜在遗传。例如，在番茄中，目视症状和对TMV复制的抑制受到Tm1抗性基因的不同影响，因为症状以显性方式被抑制，而TMV增殖是剂量依赖性的。
在碧冬茄属中，TMV的感染自然地发生，并且TMV的爆发确实发生，并且已知它们影响了总计15％的美国市场，并且英国个体种植者由于原种(stock)的破坏已经遭受了高达10万美元的损失。
在无性繁殖的作物中，收获插条时病毒传播的风险很高。有若干降低园艺和花卉栽培中传播TMV的风险的方法。除了基本的卫生措施，诸如佩戴一次性手套、在指定的区域工作和禁止在温室里吸烟，还使用了化学控制。在番茄中，消毒剂诸如2％Virkon和10％Chlorox，以及来苏儿全能清洁剂(Lysol all-purpose cleaner)和脱脂奶粉(20％)有效防止机械传播TMV。在碧冬茄属中，用相似的剂处理剃刀片对防止TMV传播非常有效。然而，这些措施都不能完全地限制病毒的传播，更不能防止TMV的出现，特别是考虑到病毒粒子的高度持久性质。
受TMV感染的碧冬茄属植物可表现出若干症状，诸如叶片花叶状、褪绿脱落、叶脉透化、叶和茎扭曲、生长减缓或发育不良，以及甚至花瓣断裂。五种烟草花叶病毒属物种已被证明能感染碧冬茄(Petunia hybrida)栽培品种：TMV、ToMV、PMMoV、TMGMV和TSAMV(热带苏打苹果花叶病毒(Tropical soda apple mosaic virus))。
到目前为止，在碧冬茄的商业栽培品种中还没有已知的TMV抗性的来源。一项研究报告，一些碧冬茄栽培品种在接种TMV后能够保持无症状，但ELISA结果表明，这些植物仍然受到感染。
还对碧冬茄属物种腋花矮牵牛(Petunia axillaris)和碧冬茄报道了由携带TMV抗性基因的烟草、番茄和辣椒植物对TMV感染表现出的特征性的过敏反应。结果表明，1株腋花矮牵牛和4株碧冬茄在接种后第7天(DAI)在接种的叶片上出现坏死性局部病变，并且1株腋花矮牵牛和2株碧冬茄在接种后第14天未出现全身性感染。在所公开的实验中，抗性系与易感系杂交，并产生易感F1后代。这表明报告的抗性类型是隐性遗传模式。在另一个公开内容中，通过插入黄瓜花叶病毒I17N-卫星DNA转化的碧冬茄栽培品种“Bluepicoti”的植物在感染TMV后表现出延迟的疾病发展。
考虑到以上所述，除其他目的以外，本发明的一个目的是提供茄科植物，并且尤其是碧冬茄属植物和舞春花属植物，所述植物包含对烟草花叶病毒属的遗传编码的抗性，尤其是对TMV、ToMV、TMGMV和PMMoV的抗性。
除其他目的以外，以上目的由如在所附权利要求中概述的本发明来实现。
具体地，本发明通过提供属于茄科的植物来实现除其它目的以外的以上目的，所述植物对烟草花叶病毒属具有抗性，并且所述植物在其基因组中包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3，优选地以纯合形式。
SEQ ID No.1包含指示抗性植物的核酸C，而易感植物在对应的基因组位置包含核酸T。类似地，SEQ ID No.3包含指示抗性植物的核酸T，而易感植物在对应的基因组位置包含核酸C。
SEQ ID No.1和SEQ ID No.3位于烟草花叶病毒属抗性提供基因或遗传决定子(genetic determinant)的相对位置，并且相应地，本发明的植物在其基因组中包含这两种序列。此外，因为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3位于烟草花叶病毒属抗性提供基因或遗传决定子的侧翼，所以烟草花叶病毒属抗性提供基因或遗传决定子可以容易地从例如NCIMB42982分离，并使用普遍可用的分子生物学技术进行分析，该技术提供了将本发明的抗性基因引入茄科植物的另外手段，例如使用植物细胞的转化，并且随后使转化的植物细胞生长成成熟植物。还设想了修饰技术，诸如EMS诱变或靶向诱变，以进一步修饰本发明的抗性。保藏物NCIMB 42982于2018年3月6日保藏于国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(NationalCollections of Industrial,Food and Marine Bacteria(NCIMB)),NCIMB Limited,Ferguson Building；Craibstone Estate,Bucksburn Aberdeen,Scotland,AB21 9YAUnited Kingdom。
根据一种优选的实施方案，本发明的植物是茄科的亚科碧冬茄亚科(Petunioideae)的成员。
根据另一种优选的实施方案，本发明的植物是碧冬茄属、舞春花属或Petchoa属的物种。舞春花属是常绿短寿命多年生植物和小灌木，具有蔓生习性，具有小的碧冬茄型花。虽然舞春花属与碧冬茄属关系密切，但已发现在染色体上存在重要差异，对应于区分两个属的外部差异和受精因素。值得注意的是，Petchoa是一个杂交属，源自使舞春花属和碧冬茄属杂交。
根据又另一种优选的实施方案，本发明的植物是碧冬茄属中的物种，选自由以下组成的组：Petunia alpicola、腋花矮牵牛、Petunia bajeensis、Petuniabonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petuniaintegrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petuniamantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana、Petunia violaceae及其杂交种，诸如优选地碧冬茄。
根据一种特别优选的实施方案，本发明的抗性是与抗性基因相同的半显性烟草花叶病毒属抗性，所述抗性基因位于SEQ ID No.1和SEQ ID No.3之间，如在保藏物NCIMB42982中发现的。该保藏物包含使来自群体2的SEQ ID No.1和SEQ ID No.3杂合的植物自交后获得的种子(见下文)。该保藏物含有纯合抗性、杂合抗性和纯合易感性种子，预测孟德尔比分别为1:2:1。
根据另一种特别优选的实施方案，本发明的抗性是源自保藏物NCIMB42982的半显性烟草花叶病毒属抗性，或者本发明的抗性是保藏物NCIMB42982的抗性。
本发明的烟草花叶病毒属抗性优选地选自由TMV抗性、ToMV、TMGMV抗性和PMMoV抗性组成的组，更优选地为烟草花叶病毒抗性。
本发明的植物优选地在其基因组中不包含SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.4。换句话说，偶数编号的SEQ ID No.代表与易感基因相关的基因组序列。
根据本发明最优选的实施方案，本发明的植物是对TMV有抗性的碧冬茄属植物，这是由于它们的基因组中存在SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3，优选地是由于它们的基因组中存在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3。
考虑到以上所述，根据另一方面，本发明涉及用于鉴定烟草花叶病毒属抗性植物的方法，该方法包括确定SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3在所述植物的基因组中的存在，优选地以纯合形式存在的步骤。
根据一种优选的实施方案，本发明的方法包括确定SEQ ID No.2和/或SEQ IDNo.4在基因组中的不存在的另外步骤。
根据又另一种优选的实施方案，本发明的确定各SEQ ID No.的存在或不存在的方法包括核酸扩增和随后对扩增产物的分析。核酸扩增和分析技术容易获得，并且为技术人员所知。
待使用本发明方法鉴定的植物优选地为烟草花叶病毒属抗性碧冬茄属植物，选自由以下组成的组：Petunia alpicola、腋花矮牵牛、Petunia bajeensis、Petuniabonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petuniaintegrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petuniamantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana、Petunia violaceae及其杂交种，优选地碧冬茄。
待使用本发明方法鉴定的抗性表型优选地为提供对由以下组成的组中的一种或更多种病毒的抗性的表型：烟草花叶病毒抗性、番茄花叶病毒抗性、烟草轻型绿花叶病毒抗性和辣椒轻型斑驳病毒抗性。
本发明将在以下实施例中进一步详细描述。在实施例中，参考了附图，其中：
图1：示出了TMV感染的症状。-)接种的叶片上没有病变；+)接种的叶片上小的局部病变；++)大的局部病变，部分地为黑色叶脉；+++)严重的局部病变、叶脉感染和坏死的叶片；全身性头部症状，显示上部叶片有坏死斑点，花叶模式；上部叶片卷曲；
图2：分别示出了TMV-A分离株和TMV-U分离株在接种后2周(2WAI)在生物测定2中具有ELISA阳性结果的植物比例随温度的变化。在生物测定1中，基于ELISA检测到TMV的时机对F1基因型进行分组；
图3：示出的图显示了在群体1中具有独特分离模式的SNP芯片上20个最显著相关的SNP中每一个的ELISA阴性和ELISA阳性植物的数目。在标志物-性状分析中，基于其关联强度的降序，从左到右和从上到下对结果进行排序。
实施例
引言
本实施例公开了碧冬茄的分离二倍体F1群体中TMV抗性基础的数量性状基因座(QTL)的数量、效应大小和遗传位置。公开了一个连锁群上的主要效应QTL，表明为单基因遗传。与抗性的关联很强，因为在接种后2周(2WAI)使用ELISA，一种基因型的所有个体中有70％被检测为全身性TMV感染阴性，而2WAI携带另一种易感基因型的个体中有98％被检测为TMV感染阳性。定量抗性是温度依赖性的，因此当植物保持在较低温度(21℃)时，抗性高于在较高温度(31℃)时。
方法
群体开发
使用机械接种测试了登记物TT-0115的两个插条对TMV的抗性。一个插条确实显示出明显的症状，并且在接种后5周检测呈阳性。另一个插条在接种后7周无症状。建立了一个母本植物，并编码为TT15-001414-001。再次接种来自该母本植物的四个插条，并保持无症状5周，用阴性ELISA结果证实。
来自该母本植物的新插条被用作与两个易感品种：TT07-005643-044和TT08-003356-033杂交的亲本。
生物测定
生物测定1：映射群体的筛选
将从来源于F1植物(来源于上述杂交)的母株植物获取的新鲜插条插在椰子泥炭塞中，并生长两周以便根建立。插入五个插条，其中四个被接种，并且一个用作阴性对照。将插条在28孔托盘中生根2周，对于接种的材料，每4株植物对应一个标签。将对照植物单独标记。在移植到10cm的盆中后一周，用TMV-A接种植物。TMV的一种实验宿主黄花烟草(Nicotiana rustica)用作对照植物，以证实所用TMV接种物的感染性。温室条件是20℃/18℃日/夜，昼长14小时。对于♀TT15-001414-001×♂TT07-005643-044(以及正反交，以下称为群体1)和TT15-001414-001x TT08-003356-033(以及正反交，以下称为群体2)，F1-群体大小分别为208和295。7个易感基因型(包括两个易感亲本)、抗性亲本和抗性祖父母用作参照。
TMV的最初来源是2012年在荷兰的一个温室里发现的一株受感染的碧冬茄1820。该病毒被内部维养在易感的碧冬茄1820上。该分离株被命名为TMV-A。从受感染的接种物植物收集叶片，并与接种缓冲液(NaH2PO4)一起研磨。接种期间，将过滤后的接种物保持在冰上。
接种前，将碳化硅粉末撒在植物的叶片上。通过将一根手指(带手套)浸入接种物中，并摩擦两片完全展开的叶片，各5-7次，从而接种植物。在每片叶片之后，将手指再次浸入接种物中。
接种后两周(WAI)，使用两个目视评分量表对植物进行表型评分。接种的叶片基于其在四个不同类别中的局部病变进行评分，并且植物的上部基于全身性头部症状和上部叶片卷曲的存在进行评分(图1)。目视筛选后，对植物取样以便使用ELISA进行血清学测试。对于该测试，每种基因型的4株植物被批量化(bulk)并作为一个样品进行测试。基于OD405NM值的血清学ELISA有四种可能的结果，并针对阴性对照进行了校正(表1)。
表1：如何基于针对空白数据校正的OD405NM值对ELISA评分进行分类的概述。
接种后四周(群体2)和五周(群体1)，再次对植物进行头部症状评分，并取样进行ELISA测试。对于ELISA测试为阴性的每种基因型，将一株植物保存用于长期测定，将其保持直到扦插后27周，或者在ELISA测试为阳性时更早地将其丢弃。如果植物仍然有足够的活力，则生物测定中包括的所有抗性和易感参照也被保留。修剪植物并将其栽种在13cm的盆里。接种后九周(群体2)和十周(群体1)，再次对个体植物进行头部症状评分，并丢弃阳性植物。使用与最初接种方法相同的方法再次接种无症状植物。
在再次接种后2周，对植物接种叶片上的局部病变和头部症状进行评分。使用ELISA对植物测试病毒抗原的存在2次，即17WAI和22WAI。
生物测定2：确定温度对TMV抗性的影响
在最初的表型分型之后，进行试验来评估抗性的温度依赖性。使用了来自群体2的4个不同组的基因型：1)2WAI ELISA阳性；2)17WAI ELISA阳性；3)整个实验中ELISA阴性(分别为N＝15、3、16和9种基因型)。包括抗性祖父母(TT-0115)、抗性亲本(TT15-001414-001)和易感亲本(TT08-003356-033)作为对照。应用了两种昼夜温度方案：21℃/19℃和31℃/25℃。使用了两种TMV分离株，原始的碧冬茄分离株(TMV-A)和一种从番茄分离的分离株(TMV-WU)。对于每个温度/TMV分离株组合，每种基因型接种两株植物。在每个温度方案内，每种基因型有一株模拟接种的对照植物。每株植物被单独标记、评分和取样。
用上述相同的评分量表对植物进行评分(图1)，并在接种后两周和四周对植物进行基于个体的取样。
进行2WAI ELISA，并在混合模型中使用R包MASS中的glmmPQL函数对数据(ELISA阴性编码为1，ELISA阳性编码为0)进行分析。模型中包括的固定效应是温度、生物测定1中的抗性分组和病毒分离株。系谱项被拟合为随机效应，以考虑每种基因型的重复测量，并使用二项式误差结构。
现有技术筛选
测试了在WO 2007/097574中公开的SEQ ID No和一个由抗性来源和对TMV和/或ToMV测试为ELISA阳性的3种碧冬茄基因型组成的组。以两组不同的引物对进行了两次PCR反应。使用公开的Seq ID 6和Seq ID 8进行第一反应，并使用公开的Seq ID 9和Seq ID 10进行第二反应。红辣椒用作阳性对照。如果本发明的植物中的抗性与WO 2007/097574的公开内容一致，则抗性和易感的碧冬茄登记物之间扩增子的片段长度会不同。
连锁作图
所有F1植物及其亲本使用定制的包含45,000个单核苷酸多态性(SNP)的45KAffymetrix SNP阵列进行基因分型。对于每个亲本，对两个重复进行基因分型。质量控制如下进行。首先，仅保留了具有Affy调用PHR_notPassingPSgenotypes和notPHR_notPassingPSgenotypes的SNP。然后，使用GenABEL中的check.marker函数，去除了调用率<90％的基因座、与另一个SNP 100％相同地分离的SNP和调用率<95％的个体。还去除了显示状态一致性>99％的个体。所得到的数据集分别由群体1和群体2的1,565个SNP和920个标志物组成。
随后，仅对群体1使用R onemap包构建了连锁图。仅使用分离AB×AA(来源杂合，易感亲本纯合)或分离AB×AB(双亲本杂合)的SNP标志物，并且在连锁作图之前，还排除了显示孟德尔误差或严重分离失真(P<0.000000005)的SNP。
使用group函数将SNP标志物分配到连锁群，LOD评分为30，并且最大重组频率为0.4。在连锁群内，SNP标志物用record函数(LOD＝10，最大rf＝0.4)排序，并使用Kosambi映射函数。随后，由于与其他SNP的共分离而在连锁作图之前被排除的SNP标志物被赋予相同的连锁群和位置。
关联映射
2WAI ELISA结果被用作TMV抗性的代表，并在两个群体中独立使用二项式误差分布进行建模。从分析中删除了ELISA结果不确定的植物。首先，由通过了质量控制(QC)的所有SNP标志物解释的表型变异的比例使用GenABEL中的多基因函数进行分析，权重设置为“否”。其次，使用qtscore函数分析该模型的残差。
标志物验证、精细作图和种质筛选
对于跨QTL区域的独特重叠群，挖掘在来源中是杂合的并且在其基因组或转录组序列数据可得的所有其他登记物中是纯合的SNP。针对在17个重叠群中发现的24个SNP标志物设计了KASP测定(在表2中示出)。将这些对亲本和84株F1植物运行，以确认亲本基因型和预期的分离模式。确实符合这些标准的SNP随后对总共464株个体运行，195株个体来自群体1并且269株个体来自群体2。使用卡方检验用ELISA结果来检验关联的强度。利用KASP测定，利用7个最显著相关的SNP，筛选出代表碧冬茄栽培品种中存在的遗传多样性的145个不同登记物。
表2：用于对与碧冬茄F1群体的TMV抗性显著相关的SNP进行KASP测定的引物。显示了每个正向引物靶向的单倍型，以及围绕SNP的侧翼序列。
粗体标记的单倍型靶向抗性单倍型。
结果
生物测定1结果
在第一次接种后两周(2WAI)进行表型分型，在同一周取样进行ELISA。2WAI的ELISA结果在表3中呈现。测试呈阴性和不确定的植物被重新接种，并进行另外的ELISA测试。对于群体1，这得到65株植物，而对于群体2，使用ELISA 13WAI检测了83株植物，其中53株和74株分别测试为ELISA阴性(表4)。
在13WAI测试为阴性和不确定的所有植物四周后(17WAI)再次测试。在群体1中57个中的19个测试为阴性，而在群体2中77个中的37个测试为阴性(表5)。最后一次ELISA测试是在22WAI。对于群体1，12株植物仍被测试为ELISA阴性，而对于群体2，18株植物仍为阴性(表6)。
表3：接种后两周(2WAI)取样的植物的ELISA结果。每个基因型的4株植物被批量化(bulk)并作为一个样品进行测试。
*在ELISA期间，OD405NM>0.2
**在ELISA期间，OD405NM<0.1
***不确定的：在ELISA期间，OD405NM在0.101和0.2之间
****植物太小，无法接种和/或取样用于ELISA测试
表4：在13WAI取样的植物的ELISA结果。
表5：在17WAI取样的植物的ELISA结果。植物在10WAI换盆，并在14WAI重新接种。
表6：在22WAI取样的植物的ELISA结果。植物在10WAI换盆，并在14WAI重新接种。
生物测定2结果
接种后两周，在用TMV-A分离株测试的易感组中，在21℃和31℃的ELISA结果之间没有观察到差异(表7)。在生物测定1中在ELISA 2WAI中评分为阳性的几乎所有基因型在生物测定2中接种后两周评分为阳性，并且没有观察到温度处理或分离株之间的差异。然而，在17WAI显示出第一次ELISA阳性结果或在生物测定1的整个实验中没有显示出ELISA阳性结果的组中，在较高温度具有ELISA阳性结果的个体的比例较高，表明在较高温度时抗性不能保持。总的来说，31℃时的抗性显著低于21℃时的抗性(表7、表8和图2)。
植物对TMV-A分离株(用于群体筛选)和TMV-WU分离株的反应也有显著差异。用于接种用于QTL作图的群体的TMV-A分离株，显示出能够在两种温度感染更多的植物(表7和表8)。总的来说，使用TMV-A分离株，具有单拷贝的抗性等位基因且在2WAI ELISA结果为阴性的F1个体的比例从21℃时的75％下降到31℃时的62％。使用TMV-WU分离株，在杂合F1植物中观察到的抗性下降显著较小(21℃：2WAI 93％ELISA阴性；31℃：2WAI 92％ELISA阴性)，尽管温度和分离株之间的相互作用不显著(结果未示出)。
表7：接种后2周(2WAI)取样的热依赖性抗性实验的个体植物的ELISA结果。分别呈现了对于TMV-A和TMV-WU分离株在低温(21℃)和高温(31℃)具有ELISA阴性结果的植物比例的汇总统计数据。
表8：分析2WAI ELISA结果的混合模型的参数估计值随温度、病毒分离株和生物测定1中ELISA结果的变化。水对照被排除在该分析之外。该模型表明，抗性的表达受到温度的负影响，并且也可能受到所用的病毒分离株的影响。阳性参数估计值表明抗性水平增加(使用ELISA的2WAI阴性结果)。
证实该抗性来源未在WO 2007/097574中公开
对于使用引物Seq ID 6和Seq ID 8的PCR，在抗性登记物和易感登记物之间没有观察到片段长度的差异。用引物Seq ID 9和Seq ID 10进行的PCR没有在任何碧冬茄样品中产生扩增。对于两组引物对，在红辣椒中都观察到了片段。这明确地确定了，本发明的抗性来源没有在WO2007/097574中公开。
连锁作图
总共1,064个独特分离的SNP被分配到16个连锁群。向图中添加共分离的SNP导致了5635个分离的SNP的连锁。添加在SNP芯片上存在但在QC后被删除的SNP，导致在4572个独特的重叠群上总共有10973x SNP。共有8个LG包含多于200个SNP，而其余的连锁群包含少于40个SNP。
关联映射
ELISA结果(病毒抗原存在)在群体1中是高度可遗传的，因为90％的表型变异得到SNP的解释。群体2的基因组遗传率略低，因为67％的表型变异得到基因分型的SNP的解释，这可以用通过质量控制的SNP数量显著更低来解释。最显著相关的SNP均存在于LG 6上，并且P值的分布呈现陡峭的单峰形状(unimodal shape)，表明可能存在影响TMV抗性的单一QTL。
包含显示出最强关联的SNP的重叠群在群体1和群体2之间共有，证实了仅在群体1中获得的结果。最显著的SNP(位于LG 6上80.3cM处)在群体1中表现出2个基因型类别，并且具有一个基因型的个体的71.6％为ELISA阴性，而具有另一个基因型的个体的96.7％为ELISA阳性。其他SNP的预测力较弱，如基于它们较低的P值预期的(图3)。
通过KASP测定和精细作图进行验证
在设计的24个KASP测定中，有19个观察到了明显分离的聚类，并且可以置信地调用基因型。在使用KASP测定对这19个SNP进行了基因分型的总共464株F1植物中(其中430株具有明确的TMV ELISA数据，并且34株具有不确定的ELISA结果)：195株个体来自群体1，并且269株个体来自群体2。还测试了36株F2植物，以筛选携带纯合抗性单倍型的个体。发现了三个具有纯合抗性单倍型的个体，它们被用作另外的样品来改进基因型的调用。来自两个群体的亲本以及TT-0115(F1群体的抗性祖父母)被用作对照样品。在所有KASP测定中，抗性亲本和祖父母(分别为TT15-001414-001和TT-0115)评分为杂合，且易感亲本(TT07-005643-044和TT08-00356-033)为易感单倍型纯合。
KASP测定之间的调用率不同，但是对于每个SNP，用2WAI ELISA数据对406株直到423株之间的F1植物成功地进行了基因分型。当查看KASP基因型和2WAI ELISA结果(病毒抗原存在)之间的关联时，发现预测性抗性基因型的准确率在58％和66％之间，并且易感基因型的准确率在95％和98％之间(表9)。
总的来说，当跨两个F1群体预测抗性时(具有抗性基因型的植物的65.8％为ELISA阴性)，以及当涉及到易感性时(具有易感基因型的F1植物的97.5％为ELISA阳性，结果在表9中示出)，PET_T36154|C53573_29679(在79.584cM处)具有最高的预测力。该SNP也与2WAIELISA结果关联最强(逻辑回归，P＝1*10-42)，紧接着是75.931cM处的PET_T310214|C62940_5790(P＝2.84*10-42)。其他SNP的关联显著较低，证实了连锁图的位置，并表明这两个SNP可能位于因果基因(causal gene)的侧翼(表9)。使用连锁图遗传距离，PET_T36154|C53573_29679和PET_T310214|C62940_5790之间的距离仅为3.6cM，这意味着任一标志物与因果基因的接近度都小于1.8cM。
表9：使用KASP测定，2WAI ELISA(病毒抗原存在)与QTL区域中单个SNP之间的关联的结果。来自群体1和群体2两者的基因型数据被合并用于分析。以2WAI ELISA结果为二元响应变量，并以SNP基因型为因变量，通过拟合逻辑回归得到P值。行值代表：位置(cM)、预测准确性抗性表型、预测准确性抗性表型、样本大小和P值。
结论
·公开了解释碧冬茄的TMV抗性的单个基因组区域，其不同于WO2007/097574；
·公开了一种半显性基因，因为在未控制温度的条件，群体1中约70％的植物和跨两个F1群体中65.8％的具有单拷贝抗性等位基因的植物是抗性的(如通过ELISA 2WAI测量的)，而约95％的隐性等位基因纯合的个体是易感的(2WAI的ELISA阳性结果)。
·公开了，抗性依赖于温度和病毒分离株。携带单拷贝的抗性等位基因的个体在31℃保持时(23％)比在21℃保持时(17％)更可能发展全身性感染。
序列表
<110> 多盟集团公司
<120> 烟草花叶病毒属抗性茄科植物
<130> 4/2WR57/36
<160> 6
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 1
gccaaattgt ccaactactc agc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 2
aagccaaatt gtccaactac tcagt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 3
ctctgatcgt acctgtttct tcgtt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 4
ctctgatcgt acctgtttct tcgtc 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 5
attccaataa cctcagcaac actg 24
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 碧冬茄属(Petunia)
<400> 6
acctgtgaag ataaaartta agaatagcac 30

Claims (10)

1. 用于鉴定烟草花叶病毒属抗性植物的方法，所述方法包括通过使用以下寡核苷酸引物对：正向引物SEQ ID No. 1和反向引物SEQ ID No. 5，和/或正向引物SEQ ID No. 3和反向引物SEQ ID No. 6扩增DNA片段来确定SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 3在所述植物的基因组中的存在的步骤，其中所述植物是碧冬茄属，并且所述烟草花叶病毒属是烟草花叶病毒，并且其中所述植物包含从保藏物NCIMB 42982分离的烟草花叶病毒属抗性提供基因或遗传决定子。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述存在是SEQ ID No. 1和/或SEQ ID No. 3在所述植物的基因组中的纯合存在。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括通过使用以下寡核苷酸引物对：正向引物SEQ ID No. 2和反向引物SEQ ID No. 5, 和/或正向引物SEQ ID No. 4和反向引物ID No. 6扩增DNA片段来确定SEQ ID No. 2和/或SEQ ID No. 4在所述植物的基因组中的不存在的步骤。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述确定包括核酸扩增和扩增产物的随后分析。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述确定包括核酸扩增和扩增产物的随后分析。
6. 根据权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：Petunia alpicola、腋花矮牵牛(Petunia axillaris)、Petunia bajeensis、Petunia bonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petunia integrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petunia mantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana、Petunia violaceae及其杂交种。
7. 根据权利要求3所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：Petunia alpicola、腋花矮牵牛(Petunia axillaris)、Petunia bajeensis、Petunia bonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petunia integrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petunia mantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana、Petunia violaceae及其杂交种。
8. 根据权利要求4所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：Petunia alpicola、腋花矮牵牛(Petunia axillaris)、Petunia bajeensis、Petunia bonjardinensis、Petunia exserta、Petunia guarapuavensis、Petunia inflata、Petunia integrifolia、Petunia interior、Petunia ledifolia、Petunia littoralis、Petunia mantiqueirensis、Petunia occidentalis、Petunia patagonica、Petunia reitzii、Petunia riograndensis、Petunia saxicola、Petunia scheideana、Petunia villadiana、Petunia violaceae及其杂交种。
9. 根据权利要求6所述的方法，其中所述植物是碧冬茄(Petunia hybrida)。
10. 根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述植物是碧冬茄(Petunia hybrida)。
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