JP2021518752A

JP2021518752A - トバモウイルス抵抗性ナス科植物

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Publication number: JP2021518752A
Application number: JP2020548627A
Authority: JP
Inventors: ヨハンネス・テオドルス・クート; カミッロ・ベレノス; マヌエラ・エリザベス・シャルロット・ファン・レーウェン−アイテルデイク; パウルス・コルネリス・マリス
Original assignee: Duemmen Group BV
Current assignee: Duemmen Group BV
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2021-08-05
Also published as: IL277029A; WO2019174721A1; CA3091866A1; EP3764775A1; CN112312763A; US20210051910A1; US11659806B2; CN112312763B

Abstract

本発明は、ナス科に属する植物、例えば、ペチュニア属及び/又はカリブラコア属の植物、特にペチュニア属の植物に関し、これらの植物は、植物病原体であるトバモウイルス、その中でも、植物病原体であるタバコモザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス及びトウガラシマイルドモットルウイルスに抵抗性である。本発明は、ナス科のトバモウイルス抵抗性植物を同定するための方法に更に関する。詳細には、本発明は、トバモウイルスに対して抵抗性であり、ゲノム内に配列番号1及び/又は配列番号3を含む、ナス科に属する植物に関する。

Description

本発明は、ナス(Solanaceae)科に属する植物、例えば、ペチュニア(Petunia)属及び/又はカリブラコア(Calibrachoa)属の植物、特にペチュニア属の植物に関し、これらの植物は、植物病原体であるトバモウイルス(Tobamovirus)、その中でも、植物病原体であるタバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus)、トマトモザイクウイルス(Tomato mosaic virus)、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス(Tobacco mild green mosaic)及びトウガラシマイルドモットルウイルス(Pepper mild mottle virus)に対して抵抗性である。本発明は、ナス科のトバモウイルス抵抗性植物を同定するための方法に更に関する。

トバモウイルス属の植物病原体の1種であるタバコモザイクウイルス(TMV)は、30科に由来する少なくとも199種の異なる植物種に感染するが、しかしながら、ナス科作物は、この病害から最も劇的な損失を受ける。TMVが容易に広がるため、比較的短期間でアウトブレイクに達する可能性がある。作物の価値を60%損失させるタバコモザイクウイルス(TMV)感染を原因とする収量及び品質の低下が報告された。ノースカロライナの黄色腫のタバコでは、1960年から1965年の間に、TMVが毎年100万米国ドルの損失をもたらしたと推定された。2000年には、TMVは、1,070万米国ドルの損失をもたらす、ノースカロライナのタバコ収量の推定1.4%の損失の原因となった。

TMV、トマトモザイクウイルス(ToMV)、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス(TMGMV)及びトウガラシマイルドモットルウイルス(PMMoV)は、ナス科作物に感染し得るトバモウイルス属の最も一般的なウイルスである。トバモウイルスは、機械的作用を介して伝染し、1年以上もの期間、種子表面又は土壌中で生存することができ、高温であっても感染性のままであり得る。

根端及び茎頂並びに生殖細胞を除き、TMVは、植物のほとんどすべての組織に侵入することができる。一旦感染すると、植物はウイルス感染を克服することはできないが、感染は、通常、種子から後代の実生までは引き継がれない。わずかなパーセンテージの後代の実生のみが、移植中にウイルスの夾雑した種皮を有する若い実生の傷によりウイルス感染を引き継ぐことが示されている。

N遺伝子を欠くタバコ栽培品種では、TMVが複製して全身的に移動し、植物成長の低下及び薄緑色の葉組織と濃緑色の葉組織の混じった領域によって特徴付けられるモザイク病の症状を引き起こす。対照的に、Nを含有するタバコのTMV感染により、ウイルス感染部位に細胞死が生じ、ウイルス粒子は、壊死病変を直接囲む領域に限定される。

トバモウイルス感染は、ナス科、例えば、タバコ、トウガラシ、トマト、ナス、チョウセンアサガオ属(Datura)、ホオズキ属(Physalis)、ペチュニア属及びカリブラコア属のうちのいくつかの種において報告されている。自発的なトバモウイルス抵抗性は、このような差の根底にあるものとして同定される1つ又は複数の抵抗性遺伝子を有するタバコ、トウガラシ及びトマトに関する文献に記載されている。

植物におけるTMV抵抗性のメカニズムは、過敏応答(HR)と、その後の植物抵抗性遺伝子とウイルスの非病原性遺伝子との間の相互作用によって誘発される一般的な全身獲得抵抗性(SAR)によって特徴付けられる。この防御メカニズムは、感染部位周辺に局在化した壊死病変を創出することによってウイルスの分散を妨げる。

TMVに感染したタバコ植物については、伝染性モザイク病又は斑点病を保有するとして、19世紀中頃に初めて記載された。その当時は、病原体についてあまり知られておらず、タバコモザイクと称された。更なる調査により、この病害がウイルスによって引き起こされることが示され、ニコチアナ・グルチノサ(Nicotiana glutinosa)では、TMV抵抗性遺伝子N(壊死病変応答に関する)が同定されることになった。現在では、N遺伝子は、いくつかのトバモウイルス株に対して唯一且つ最も特徴付けられた抵抗性遺伝子である。N遺伝子は、選択的スプライシングを介して、2つの転写物(NS及びNL)をコードすることを含む単一の優性作用機序を有する。NS転写物は、TMV感染前及びTMV感染後の最初の数時間優勢であるが、一方、NL転写物は、感染の4〜8時間後に優勢である。完全な抵抗性のために、TMV感染前後のNS転写物からNL転写物までの均衡が必要である。

トマトでは、組織中にTMVが存在するにもかかわらず無症状の植物が記載された。次に、トマトのTMV及びトマトモザイクウイルス(ToMV)に対して抵抗性を与えるいくつかの遺伝子が同定された。最初に記載された抵抗性遺伝子はTm₁であり、そのすぐ後にTm₂が発見された。Tm-2^a又はTm-2²と称される第3の遺伝子が後に発見された。3つすべての抵抗性遺伝子が、優性作用機序を有する。Tm-2²はTm-2に対する対立遺伝子であり、4つのアミノ酸が異なる。抵抗性を破壊することができるToMV単離株はほとんど存在せず、破壊するものは一般的にほとんど毒性がないため、Tm-2²はまた、最も持続的且つ最も広く使用される。

トウガラシでは、トウガラシ(Capsicum annuum)及びキダチトウガラシ(Capsicum frutescens)の18栽培品種をスクリーニングした際に、TMV抵抗性について1934年に初めて記載された。TMV接種後、タバスコペッパー植物は、局所的な壊死病変を示し、その後、感染した葉が脱離したが(現在では、過敏応答として定義される)、一方、他のトウガラシ栽培品種は、全身的感染の間に二次的な斑点を示した。更なる研究により、トウガラシにおいて、2つのTMV抵抗性遺伝子として、局所的病変応答に関してLと称される1つの優性遺伝子、及びlⁱと称されるマイナーな抵抗性遺伝子が同定された。現在、特徴付けられた5つのL遺伝子の対立遺伝子(L1、L2、L3、L4及びL1a)が存在する。それぞれ、異なる温度感受性を示すL1aを除き、異なるTMV病原型に対する抵抗性をもたらすことが示された。

更に、WO2007/097574には、アカトウガラシ(カプシクム・チャコエンセ(Capsicum chacoense))のTMV抵抗性に高い関連のある分子マーカーが開示されている。外挿により、この出願はまた、このマーカーが、他の作物、例えば、キュウリ、スイカ、アカトウガラシ、メロン、ハクサイ、タバコ、ペチュニア、ワタ及びバラ植物において予測的であったことも開示している。

抵抗性遺伝子によって付与されるトバモウイルスに対する抵抗性は、典型的には、絶対的ではない。例えば、トマトでは、Tm2-2に関してヘテロ接合性の一般的な植物体はホモ接合体よりも抵抗性が低く、Tm2-2媒介性の抵抗性は用量依存的であり、トマト(Tm-1及びTm2-2ベース)とタバコ(N-ベース)の抵抗性は両方、温度が高いほど低くなることが知られている。ヘテロ接合体では、全身的壊死の発生率は、接種時の年数と共に低下し、高温への曝露の期間と共に増加し、接種後の熱ストレスの時間間隔と共に低下する。抵抗性の様々な代用は、同じ遺伝子の多面的効果にかかわらず、様々な基礎的遺伝学を有し得る。例えば、トマトでは、視覚的症状及びTMV複製の阻害は、症状が優性に抑制され、一方、TMV増殖は用量依存的であるため、Tm1抵抗性遺伝子によって、様々に影響される。

ペチュニアでは、TMVによる感染は自然に生じ、TMVのアウトブレイクが生じ、これらは、米国市場全体の15%に影響を及ぼすことが知られており、英国の個々の栽培者らは、備蓄の崩壊により、最大100,000米国ドルの損失を経験した。

栄養繁殖した作物では、切断部が収穫される場合にウイルス移入のリスクが高い。園芸及び花卉園芸では、TMV伝染のリスクを低減する方法がいくつかある。ディスポーザブル手袋の着用、指定ブロックにおける作業及び温室内での喫煙禁止等の基本的な衛生学的手段の他に、化学的防除も使用される。トマトでは、2%のVirkon及び10%のChlorox等の消毒剤だけでなく、Lysol万能クレンザー及び脱脂粉乳(20%)も、TMVの機械的伝染を妨げるのに有効であった。ペチュニアでは、同様の薬剤でカミソリ刃を処理することが、TMVの伝染の防止に非常に有効であった。しかしながら、これらの手段はいずれも、完全にその蔓延を制限することはもちろん、特に、ウイルス粒子の持続感染性の高い性質を与えられたTMVの出現を妨げることもできない。

TMVに感染したペチュニア植物は、いくつかの症状、例えば、葉のモザイク、萎黄病によるモルティング(chlorotic molting)、葉脈透化、茎葉部の歪み、成長低下又は萎縮、更には花弁の破損を示し得る。5種のトバモウイルス種は、ペチュニア・ヒブリダ(Petunia hybrida)栽培品種:TMV、ToMV、PMMoV、TMGMV及びTSAMV(トロピカルソーダアップルモザイクウイルス)に感染することが示されている。

これまでに知られていないTMV抵抗性の供給源がペチュニア・ヒブリダの市販栽培品種において知られている。1つの研究では、一部のペチュニア・ヒブリダ栽培品種では、TMVの接種後も無症状のままであり得ることが報告されたが、ELISAの結果は、これらの植物がそれにもかかわらず感染していたことを示した。

TMV抵抗性遺伝子を有するタバコ、トマト及びトウガラシ植物で示されたTMV感染に対する特徴的な過敏応答が、ペチュニア種のペチュニア・アキシラリス(Petunia axillaris)及びペチュニア・ヒブリダについても報告されている。ペチュニア・アキシラリスのうちの1株及びペチュニア・ヒブリダのうちの4株は、接種後日数(DAI)7日目に接種葉に局所的壊死病変を示し、ペチュニア・アキシラリス植物のうちの1株及びペチュニア・ヒブリダ植物のうちの2株は、14DAIに全身的感染を示さなかったことが示された。開示された実験では、抵抗性株が感受性株と交雑され、感受性のF1子孫を生じた。このことは、報告されたタイプの抵抗性に関する劣性遺伝形式を示す。別の開示では、キュウリモザイクウイルスI17N-サテライトDNAを挿入することによって形質転換されたペチュニア・ヒブリダの栽培品種「Bluepicoti」の植物が、TMVに感染した際に病害の発症の遅延を示した。

WO2007/097574

上記を考慮すると、とりわけ、遺伝子にコードされたトバモウイルスに対する抵抗性、特に、TMV、ToMV、TMGMV及びPMMoVに対する抵抗性を含む、ナス科植物、特に、ペチュニア属及びカリブラコア属の植物を提供することが、本発明の目的である。

とりわけ、添付の特許請求の範囲に概説されるように、上記目的は本発明によって満たされる。

詳細には、とりわけ、トバモウイルスに対して抵抗性であり、ゲノム内に、配列番号1及び/又は配列番号3を、好ましくはホモ接合形態で含む、ナス科に属する植物を提供することにより、上記目的は本発明によって満たされる。

配列番号1は、抵抗性植物を示す核酸Cを含むが、一方、感受性植物は、対応するゲノム位置に核酸Tを含む。同様に、配列番号3は、抵抗性植物を示す核酸Tを含むが、一方、感受性植物は、対応するゲノム位置に核酸Cを含む。

配列番号1及び配列番号3は、トバモウイルス抵抗性を付与する遺伝子、又は遺伝的決定因子の反対側の部位に位置し、したがって、本発明の植物は、ゲノム内に、両方の配列を含む。更に、配列番号1及び配列番号3は、トバモウイルス抵抗性を付与する遺伝子、又は遺伝的決定因子に隣接するため、トバモウイルス抵抗性を付与する遺伝子、又は遺伝的決定因子は、例えば、NCIMB 42982から容易に単離され、一般的に利用可能な分子生物学の技法を使用して分析され、本発明の抵抗性遺伝子をナス科の植物中に導入する、例えば、植物細胞の形質転換を使用し、次に、形質転換された植物細胞を成熟した植物へと成長させる、更なる手段を提供することができる。本発明の抵抗性を更に改変するEMS突然変異誘発又は標的変異誘発等の改変技法も予想される。寄託株NCIMB 42982は、National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB), NCIMB Limited, Ferguson Building; Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland, AB21 9YA United Kingdomに、2018年3月6日に寄託された。

好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ナス科ペチュニア亜科(Petunioideae)のメンバーである。

別の好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ペチュニア属、カリブラコア属又はペトコア属(Petchoa)内の種である。カリブラコア属は、小さなペチュニア型の花を有する、常緑で短命の多年生植物及び亜低木である。カリブラコア属はペチュニア属に密接に関連するが、染色体に重要な差があることが分かっており、この差は、外観の差と2つの属を識別する受精因子に相当する。ペトコア属は、カリブラコア属とペチュニア属を交雑して得られるハイブリッドの属であることに留意されたい。

更に別の好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ペチュニア・アルピコラ(Petunia alpicola)、ペチュニア・アキシラリス、ペチュニア・バジェーンシス(Petunia bajeensis)、ペチュニア・ボンジャージネンシス(Petunia bonjardinensis)、ペチュニア・エクスセルタ(Petunia exserta)、ペチュニア・グアラプアベンシス(Petunia guarapuavensis)、ペチュニア・インフラータ(Petunia inflate)、ペチュニア・インテグリフォリア(Petunia integrifolia)、ペチュニア・インテリア(Petunia interior)、ペチュニア・レディフォリア(Petunia ledifolia)、ペチュニア・リットラリス(Petunia littoralis)、ペチュニア・マンチクエイレンシス(Petunia mantiqueirensis)、ペチュニア・オクシデンタリス(Petunia occidentalis)、ペチュニア・パタゴニカ(Petunia patagonica)、ペチュニア・レイツィー(Petunia reitzii)、ペチュニア・リオグランデンシス(Petunia riograndensis)、ペチュニア・サクシコーラ(Petunia saxicola)、ペチュニア・シェイデアーナ(Petunia scheideana)、ペチュニア・ビラディアーナ(Petunia villadiana)、ペチュニア・ビオラセア(Petunia violaceae)及びそのハイブリッド、例えば、好ましくはペチュニア・ヒブリダからなる群から選択されるペチュニア属内の種である。

特に好ましい実施形態によれば、本発明の抵抗性は、寄託株NCIMB 42982に見られる配列番号1と配列番号3の間の抵抗性遺伝子と同一である半優性トバモウイルス抵抗性である。寄託株は、配列番号1及び配列番号3に対してヘテロ接合である個体群2(以下を参照されたい)に由来する植物を自家受粉した後に得られる種子を含む。寄託株は、それぞれ、1:2:1の予測されたメンデル比で、ホモ接合抵抗性、ヘテロ接合抵抗性及びホモ接合感受性の種子を含有する。

別の特に好ましい実施形態によれば、本発明の抵抗性は、寄託株NCIMB 42982に由来する半優性トバモウイルス抵抗性であるか又は本発明の抵抗性は、寄託株NCIMB 42982の抵抗性である。

本発明のトバモウイルスの抵抗性は、TMV抵抗性、ToMV、TMGMV抵抗性及びPMMoV抵抗性、より好ましくはタバコモザイクウイルス抵抗性からなる群から好ましくは選択される。

本発明の植物は、ゲノム内に、配列番号2及び/又は配列番号4を含まないのが好ましい。別に系統的に表された、更に番号付けされた配列番号は、感受性遺伝子と関連するゲノム配列を表す。

本発明の最も好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ゲノム内に配列番号1及び/又は配列番号3が存在するため、好ましくはゲノム内に配列番号1及び配列番号3が存在するため、TMVに対して抵抗性であるペチュニア属の植物である。

上記を考慮すると、本発明は、別の態様によれば、トバモウイルス抵抗性植物を同定するための方法であって、前記植物のゲノム内に配列番号1及び/又は配列番号3が、好ましくはホモ接合型として、存在することを確立する工程を含む方法に関する。

好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、ゲノム内に、配列番号2及び/又は配列番号4が存在しないことを確立する工程を更に含む。

更に別の好ましい実施形態によれば、それぞれの配列番号の有無を確立する本発明の方法は、核酸増幅及びそれに続く増幅産物の分析を含む。核酸増幅及び分析技法は、容易に利用可能であり、当業者に公知である。

本発明の方法を使用して同定される植物は、好ましくは、ペチュニア・アルピコラ、ペチュニア・アキシラリス、ペチュニア・バジェーンシス、ペチュニア・ボンジャージネンシス、ペチュニア・エクスセルタ、ペチュニア・グアラプアベンシス、ペチュニア・インフラータ、ペチュニア・インテグリフォリア、ペチュニア・インテリア、ペチュニア・レディフォリア、ペチュニア・リットラリス、ペチュニア・マンチクエイレンシス、ペチュニア・オクシデンタリス、ペチュニア・パタゴニカ、ペチュニア・レイツィー、ペチュニア・リオグランデンシス、ペチュニア・サクシコーラ、ペチュニア・シェイデアーナ、ペチュニア・ビラディアーナ、ペチュニア・ビオラセア及びそのハイブリッド、好ましくはペチュニア・ヒブリダからなる群から選択されるトバモウイルス抵抗性のペチュニア属の植物である。

本発明の方法を使用して同定される抵抗性の表現型は、好ましくは、タバコモザイクウイルス抵抗性、トマトモザイクウイルス抵抗性、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス抵抗性及びトウガラシマイルドモットルウイルス抵抗性からなる群のうちの1つ又は複数のウイルスに対する抵抗性をもたらす表現型である。

本発明は、以下の実施例に更に詳述される。実施例では、以下の図に言及される。

TMV感染の症状を示す図である。-)接種葉に病変なし;+)接種葉に小さな局所的病変;++)大きな局所的病変、部分的に黒色の葉脈;+++)重度の局所的病変、葉脈の感染及び壊死葉;上部の葉に壊疽斑点を示す全体的な上端部の症状、モザイクパターン;上部の葉の湾曲。それぞれ、TMV-A単離株及びTMV-U単離株に関する温度の関数として、バイオアッセイ2において、接種の2週間後(2WAI)にELISA陽性の結果を有する植物の比率を示すグラフである。F1遺伝子型は、バイオアッセイ1において、ELISAによるTMV検出のタイミングに基づいて群分けした。個体群1において特有の分離パターンを有するSNPチップ上の20個の最も有意に関連するSNPのそれぞれに関してELISA陰性植物とELISA陽性植物の数を示すグラフを示す。結果を、マーカー形質分析における関連の強さの降順に基づいて、左から右へ且つ上から下へ順番に並べる。図３−１の続きである。

導入
本実施例は、ペチュニア・ヒブリダの分離二倍体F1個体群におけるTMV抵抗性の基礎となる量的形質遺伝子座(QTL)の数、効果量及び遺伝的位置を開示する。一遺伝子遺伝を示す1つの連鎖群に関する主要効果QTLが開示される。一遺伝子型のすべての個体の70%が、接種の2週間後(2WAI)にELISAを使用して試験して、全体的なTMV感染に関して陰性であり、他の感受性遺伝子型を有する個体の98%が、2WAIに試験してTMV感染に関して陽性であったため、抵抗性との関連は強力であった。定量的抵抗性は、温度依存的であり、そのため、植物がより高い温度(31℃)よりもより低い温度(21℃)に維持される場合に、抵抗性はより高い。

方法
個体群の推移(population development)
アクセションTT-0115の2つの切断部を、機械的接種を使用してTMV抵抗性について試験した。1つの切断部は、明らかな症状を示し、接種の5週間後に試験して陽性であった。他の切断部は、接種の7週間後に無症状であった。母本を確立し、TT15-001414-001とコード化した。この母本由来の4つの切断部に再度接種したところ、5週間無症状のままであり、陰性のELISAの結果を確認した。母本由来の新たな切断部を2つの感受性の変種:TT07-005643-044及びTT08-003356-033との交雑のための親として使用した。

バイオアッセイ
バイオアッセイ1:マッピング個体群のスクリーニング
上記交雑に由来するF1植物由来の母株の植物から得た新たな切断部をココナッツピートのプラグ中に固着させ、根が確立するまで2週間成長させた。5つの切断部を固着させ、そのうちの4つに接種し、1つは陰性対照として使用した。切断部を28ウェルのトレイにおいて2週間根付かせ、接種した材料毎に4つの植物それぞれは1つの標識を付した。対照の植物を個別に標識した。10cmのポットに移植した1週間後に、植物にTMV-Aを接種した。TMVに関する実験の宿主であるニコチアナ・ルスティカ(Nicotiana rustica)を対照植物として使用し、使用したTMV接種原の感染性を確認した。温室の条件は、日長14時間で20℃/18℃のD/Nであった。F1個体群数は、雌性TT15-001414-001×雄性TT07-005643-044(逆交雑も同様、以降、個体群1と称する)及びTT15-001414-001×TT08-003356-033(逆交雑も同様、以降、個体群2と称する)に関してそれぞれ、208及び295であった。7つの感受性遺伝子型(両方の感受性の親も含む)、抵抗性の親及びその親株を参照として使用した。

TMVの起源となる供給源は、オランダの温室で2012年に見出された感染したペチュニア1820であった。ウイルスは、感受性のペチュニア1820においてハウス内で維持された。単離株をTMV-Aと命名した。感染した接種原の植物からの葉を採取し、接種緩衝液(NaH₂PO₄)と一緒にすり潰した。濾過した接種原を接種中氷上で保持した。

接種前に、カーボランダムパウダーを植物の葉の上に振りかけた。指(グローブをはめた)を接種原中に浸し、2枚の十分に開いた葉をそれぞれ5〜7回こすることによって、植物に接種した。各葉の後に、指を接種原に再度浸した。

接種後(WAI)の2週目、2点の視覚的スコアリング尺度を使用して、植物を表現型的にスコア化した。接種葉を、4つの異なる分類において、それらの局所的病変に基づいてスコア化し、植物の上部については、全体的な上端部の症状及び上部の葉の湾曲の存在に基づいてスコア化した(図1)。視覚的スコアリングの後、ELISAを使用する血清学的試験のために植物をサンプリングした。この試験のために、各遺伝子型の4つの植物をひとまとめにし、1つの試料として試験した。OD_405NM値に基づいて、血清学的ELISA試験について4つの起こり得る結果があり、これらを陰性対照に対して補正した(Table 1(表1))。

接種の4週間後(個体群2)と5週間後(個体群1)に、植物を上端部の症状について再度スコア化し、ELISA試験のためにサンプリングした。ELISAで試験して陰性であった各遺伝子型について、1つの植物を延長されたアッセイのために保持し、固着の27週後まで維持するか、又はELISAで試験して陽性であった場合には早期に廃棄した。植物が依然として十分に生存可能である場合、バイオアッセイに含まれたすべての抵抗性及び感受性の参照も保持した。植物を整えて、13cmのポットに植えた。接種の9週間後(個体群2)及び10週間後(個体群1)に、個々の植物を上端部の症状について再度スコア化し、陽性植物を廃棄した。初期の接種方法と同じ方法を使用して、無症状の植物に再度接種した。

接種した葉の局所的病変について及び再接種の2週間後の上端部の症状に関して、植物をスコア化した。ELISAを2回、すなわち、17WAIと22WAIに使用して、ウイルス抗原の存在について植物を試験した。

バイオアッセイ2:TMV抵抗性に関する温度の効果の決定
最初の表現型決定の後に、抵抗性の温度依存性を評価するために試験を実施した。個体群2の4つの異なる群からの遺伝子型を使用した:1)2WAIの陽性ELISA;2)17WAIの陽性ELISA;及び3)実験全体を通してELISA陰性(それぞれ、N=15、3、16及び9個の遺伝子型)。抵抗性の親の親(TT-0115)、抵抗性の親(TT15-001414-001)及び感受性の親(TT08-003356-033)を対照として含んだ。2つの日中/夜の温度レジームを適用した:21℃/19℃及び31℃/25℃。2種のTMV単離株:元のペチュニア単離株(TMV-A)及びトマトから単離されたもの(TMV-WU)を使用した。それぞれの温度/TMV単離株の組合せに対して、遺伝子型当たり2つの植物に接種した。各温度レジームでは、各遺伝子型に対して偽接種対照植物が存在した。各植物を個々に標識し、スコア化し、サンプリングした。

植物は、上述の同じスコアリング尺度でスコア化し(図1)、個別に接種の2週間後及び4週間後にサンプリングした。

2WAIのELISAを実施し、ELISA陰性に対して1及びELISA陽性に対して0とコードしたデータをRパッケージMASSにおいてglmmPQL関数を使用する混合モデルで分析した。このモデルに含まれる固定効果は、温度、バイオアッセイ1での抵抗性についての群分け及びウイルス単離株であった。各遺伝子型に関する繰り返し測定を考慮するために、Pedigree Itemを変量効果としてフィッティングし、二項誤差構造を使用した。

先行技術のスクリーニング
WO2007/097574に開示された配列番号並びに抵抗性の供給源及びTMV及び/又はToMVに関して試験してELISA陽性であった3つのペチュニア属の遺伝子型からなるパネルについて試験した。2つの異なるプライマー対に関して、2回のPCR反応を実施した。第1の反応を開示された配列番号6及び配列番号8を使用して実行し、第2の反応を開示された配列番号9及び配列番号10を使用して実行した。アカトウガラシを陽性対照として使用した。本発明の植物の抵抗性が、WO2007/097574の開示と一致する場合、アンプリコンの断片長は抵抗性のペチュニア属のアクセションと感受性のペチュニア属のアクセションとの間で異なることになるであろう。

リンケージマッピング
45,000個の一塩基多型(SNP)を含有するカスタムメイドの45K Affymetrix SNPアレイを使用して、すべてのF1植物とその親の遺伝子型を特定した。各親に対して、2つの複製の遺伝子型を特定した。品質管理を以下のように実施した。初めに、Affyを有するSNPのみをPHR_notPassingPS遺伝子型と称し、notPHR_notPassingPS遺伝子型は保持した。次いで、GenABELのチェックマーカー機能を使用して、コールレートが90%未満の遺伝子座、別のSNPと100%同じように分離したSNP及びコールレートが95%未満の個体を除去した。対立遺伝子の共有状態(identical-by-state)が99%超を示す個体も除去した。得られたデータセットは、個体群1及び個体群2に対して、それぞれ、1,565個のSNP及び920個のマーカーからなった。

次に、個体群1についてのみ、Rパッケージワンマップを使用してリンケージマップを構築した。AB×AA(ヘテロ接合性の供給源、ホモ接合性の感受性の親)を分離したか又はAB×AB(両方の親がヘテロ接合性)を分離したSNPマーカーのみを使用して、リンケージマッピングの前に、メンデル誤差又は深刻な分離異常(P<0.000000005)を示したSNPも排除した。

LODスコアが30で、最大組換え頻度が0.4である群関数を使用して、SNPマーカーを連鎖群に割り当てた。連鎖群内では、記録関数(LOD=10、max.rf=0.4)に関してSNPマーカーを配列させ、Kosambiマッピング関数を使用した。次に、他のSNPとの同時分離によりリンケージマッピングの前に排除されたSNPマーカーに、同じ連鎖群と位置を与えた。

関連マッピング
2WAIのELISAの結果をTMV抵抗性に関するプロキシとして使用し、両方の個体群において独立して、二項誤差分布を使用してモデル化した。非確定的なELISAの結果を有する植物は、分析から省いた。第1に、品質管理(QC)を通過したすべてのSNPマーカーによって説明される表現型分散を、質量を「no」に設定したGenABELにおいてポリジェニック関数を使用して分析した。第2に、このモデルの残留物をqtscore関数を使用して分析した。

マーカーの検証、微細マッピング及び生殖質スクリーニング
QTL領域に及ぶ特有のコンティグとして、供給源においてヘテロ接合性であり、ゲノム又はトランスクリプトーム配列データが利用可能であるすべての他のアクセションにおいてホモ接合性であるSNPを抽出した。17個のコンティグに見られた24個のSNPマーカーに関して、KASPアッセイを設計した(Table 2(表2)に示す)。これらを親及び84個のF1植物に関して実行し、親の遺伝子型と予測される分離パターンを確認した。次いで、これらの基準を満たさなかったSNPを、個体群1からの195個体及び個体群2からの269個体の合計464個体に関して実行した。関連の強度をカイ二乗検定を使用して、ELISAの結果に関して試験した。ペチュニア属の栽培品種に存在する遺伝的多様性を表す145個の様々なアクセションを、KASPアッセイを使用して、7つの最も有意に関連するSNPを使用してスクリーニングした。

結果
バイオアッセイ1の結果
1回目の接種の2週間後(2WAI)に表現型の特定を行い、同じ週にELISAのためのサンプリングを行った。2WAIに関するELISAの結果をTable 3(表3)に表す。試験して陰性であった植物と不確定であった植物に再接種し、更なるELISA試験を行った。個体群1では、これが65個の植物に生じ、個体群2では、13WAIにELISAを使用して試験した83個の植物が存在し、これらのうち、それぞれ、53個及び74個が試験してELISA陰性であった。(Table 4(表4))

13WAIに試験して陰性であった植物と不確定であった植物のすべてを、4週間後(17WAI)に再度試験した。個体群1では、57個体のうちの19個体が試験して陰性であり、個体群2では、77個体のうちの37個体が試験して陰性であった(Table 5(表5))。最後のELISA試験は22WAIであった。個体群1では、12個の植物が依然として試験しても陰性であり、個体群2では、18個の個体が陰性のままであった(Table 6(表6))。

バイオアッセイ2の結果
接種の2週間後には、TMV-A単離株に関して試験した感受性群における21℃のELISAの結果と31℃のELISAの結果の間に差は観察されなかった(Table 7(表7))。バイオアッセイ1で2WAIのELISAに対して陽性とスコア化された遺伝子型のほとんどすべてが、バイオアッセイ2での接種の2週間後に陽性とスコア化され、温度処理又は単離株の間に差は観察されなかった。しかし、17WAIの1回目のELISAで陽性の結果を示したか又はバイオアッセイ1の実験全体を通してELISAで陽性の結果を示さなかった群では、ELISA陽性の結果を有する個体の比率は、より高温で高く、より高い温度では抵抗性がその時間保たれなかったことを示した。全体として、抵抗性は、21℃よりも31℃で有意に低かった(Table 7(表7)、Table 8(表8)、及び図2)。

また、TMV-A単離株(個体群のスクリーニングで使用した)及びTMV-WU単離株に対する植物の応答にも有意な差はなかった。QTLマッピングに使用した個体群に接種するために使用したTMV-A単離株は、両方の温度でより多くの植物に感染し得ることを示した(Table 7(表7)及びTable 8(表8))。全体として、TMV-A単離株を使用すると、2WAIのELISAで陰性の結果を有する抵抗性対立遺伝子の単一の複製を有するF1個体の比率は、21℃の75%から31℃の62%まで低下した。TMV-WU単離株を使用すると、ヘテロ接合性F1植物において、実質的により小さな抵抗性の低下が観察されたが(21℃:2WAIのELISAで93%が陰性;31℃:2WAIのELISAで92%が陰性)、温度と単離株の間の相互作用は有意ではなかった(結果は示さず)。

抵抗性の供給源がWO2007/097574に開示されていないことの確認
配列番号6及び配列番号8のプライマーを使用するPCRでは、抵抗性アクセションと感受性アクセションの間に断片長の差は観察されなかった。配列番号9及び配列番号10のプライマーを用いるPCRでは、ペチュニア属の試料のいずれにおいても増幅が得られなかった。アカトウガラシでは、両方のプライマー対で断片が観察された。このことは、本発明の抵抗性の供給源がWO2007/097574に開示されていないことを明確に確立する。

リンケージマッピング
合計1,064個の独自に分離するSNPを16の連鎖群に分配した。同時分離するSNPをマップに加えて、5635個の分離するSNPを得た。QCの後に省かれなかったSNPチップ上に存在するSNPを添加することにより、4572個の特有のコンティグ上に合計10973×SNPを得た。合計8個のLGが200個を超えるSNPを含有し、残りの連鎖群は、40個未満のSNPを含有した。

関連マッピング
SNPによって表現型分散の90%が説明されたため、ELISAの結果(ウイルス抗原の存在)は、個体群1において非常に遺伝性が高かった。表現型分散の67%が遺伝子型を特定したSNPによって説明されたため(これは、品質管理を通過するSNPの量が実質的に少ないことによって説明することができる)、ゲノムの遺伝率は、個体群2ではわずかに低かった。最も有意に関連するSNPは、LG6においてすべて見出され、P値の分布は、急勾配の単峰形を示し、これは、TMV抵抗性に影響を及ぼす単一のQTLが存在する可能性を示した。

最も強い関連を示したSNPを含有するコンティグは、個体群1と2の間で共有され、個体群1のみで得られた結果を裏付けるものであった。最も有意なSNP(LG6上の80.3cMに位置する)は、個体群1において2つの遺伝子型の分類を示し、一方の遺伝子型を有する個体の71.6%がELISA陰性であったのに対し、もう一方の遺伝子型を有する個体の96.7%がELISA陽性であった。他のSNPの予測力は、より低いP値に基づいて予測されるように、より弱かった(図3)。

KASPアッセイによる検証及び微細マッピング
設計した24のKASPアッセイのうちの19に対して、明確に分離されたクラスターが観察され、遺伝子型を確信的に判定することができた。合計464のうち、F1植物(そのうち、明確なTMV ELISAデータを有する430と不確定なELISAの結果を有する34)をKASPアッセイを使用してこれらの19個のSNPで遺伝子型を特定した:195個は個体群1由来であり、269個は個体群2由来であった。36のF2植物も試験して、ホモ接合性の抵抗性ハプロタイプを有する個体についてスクリーニングした。ホモ接合性の抵抗性ハプロタイプを有する3つの個体を見出し、遺伝子型判定を改善するための追加の試料として使用した。両個体群由来の親を、F1個体群の抵抗性の親の親であるTT-0115と同様に、対照試料として使用した。すべてのKASPアッセイにおいて、抵抗性の親及びその親(それぞれ、TT15-001414-001及びTT-0115)をヘテロ接合性としてスコア化し、感受性の親(TT07-005643-044及びTT08-00356-033)を感受性ハプロタイプに対してホモ接合性としてスコア化した。

KASPアッセイの間にコールレートは変化したが、406から423までの間の各SNPについて、2WAIのELISAデータを有するF1植物の遺伝子型を特定することに成功した。KASP遺伝子型と2WAIのELISAの結果(ウイルス抗原の存在)の間の関連を見ると、予測抵抗性遺伝子型に関しては58から66%の間の精度が見られ、感受性遺伝子型に関しては95から98%の間の精度が見られた(Table 9(表9))。

全体として、両方のF1個体群にわたって抵抗性を予測する場合に、PET_T36154|C53573_29679(79.584cMにおける)が最も高い予測力を有し(抵抗性遺伝子型を有する植物の65.8%がELISA陰性であった)、これは感受性についても同様となる(感受性遺伝子型を有するF1植物の97.5%がELISA陽性であった(Table 9(表9)に示された結果))。このSNPはまた、2WAIのELISAの結果と最も強く関連し(ロジスティック回帰、P = 1*10^-42))、その後に75.931 cMのPET_T310214|C62940_5790(P = 2.84*10^-42)が続いた。他のSNPは、実質的に有意性の低い関連であり、リンケージマップの位置を確認し、これら2つのSNPが原因遺伝子に隣接している可能性があることを示した(Table 9(表9))。PET_T36154|C53573_29679とPET_T310214|C62940_5790の間の距離は、リンケージマップの遺伝子距離を使用して3.6cMに過ぎず、これは、いずれかのマーカーが、原因遺伝子から1.8cMより近位にあることを示す。

結論
- WO2007/097574とは異なるペチュニア・ヒブリダにおけるTMV抵抗性を説明する単一ゲノム領域が開示されている。
- 温度が制御されていない条件下等で、半優性遺伝子が開示されており、個体群1の植物の約70%及び抵抗性対立遺伝子の単一の複製を有する両F1個体群にわたる65.8%が抵抗性であり(2WAIのELISAによって測定した場合)、劣性遺伝子に対してホモ接合性である個体の約95%が感受性である(2WAIのELISAの結果が陽性)。
- 抵抗性が温度及びウイルス単離株に依存することが開示されている。抵抗性対立遺伝子の単一の複製を有する個体は、21℃に維持される場合(17%)よりも31℃で維持される場合(23%)に全体的感染をより発症し易い。

Claims

トバモウイルスに対して抵抗性であり、ゲノム内に配列番号1及び/又は配列番号3を含む、ナス科に属する植物。
ペチュニア亜科に由来する植物である、ナス科に属する植物。
ペチュニア属又はカリブラコア属又はペトコア属に由来する植物である、請求項1に記載の植物。
ペチュニア・アルピコラ、ペチュニア・アキシラリス、ペチュニア・バジェーンシス、ペチュニア・ボンジャージネンシス、ペチュニア・エクスセルタ、ペチュニア・グアラプアベンシス、ペチュニア・インフラータ、ペチュニア・インテグリフォリア、ペチュニア・インテリア、ペチュニア・レディフォリア、ペチュニア・リットラリス、ペチュニア・マンチクエイレンシス、ペチュニア・オクシデンタリス、ペチュニア・パタゴニカ、ペチュニア・レイツィー、ペチュニア・リオグランデンシス、ペチュニア・サクシコーラ、ペチュニア・シェイデアーナ、ペチュニア・ビラディアーナ、ペチュニア・ビオラセア及びそのハイブリッドからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の植物。
ペチュニア・ヒブリダである、請求項1から4のいずれか一項に記載の植物。
前記抵抗性が、寄託株NCIMB 42982に見られる半優性トバモウイルス抵抗性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の植物。
前記抵抗性が、寄託株NCIMB 42982に由来する半優性トバモウイルス抵抗性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の植物。
前記抵抗性が、寄託株NCIMB 42982の半優性トバモウイルス抵抗性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の植物。
トバモウイルスに対する抵抗性が、タバコモザイクウイルス抵抗性、トマトモザイクウイルス抵抗性、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス抵抗性及びトウガラシマイルドモットルウイルス抵抗性からなる群のうちの1つ又は複数から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の植物。
トバモウイルスに対する抵抗性が、タバコモザイクウイルス抵抗性である、請求項1から8のいずれか一項に記載の植物。
ゲノム内に配列番号2及び/又は配列番号4を含まない、請求項1から10のいずれか一項に記載の植物。
前記植物がペチュニア属であり、前記トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項1から11のいずれか一項に記載の植物。
前記TMV抵抗性が、前記植物にホモ接合として存在する半優性遺伝子によってコードされている、請求項1から12のいずれか一項に記載の植物。
トバモウイルス抵抗性植物を同定するための方法であって、前記植物のゲノム内に配列番号1及び/又は配列番号3が存在すること、好ましくはホモ接合として存在することを確立する工程を含む方法。
前記植物のゲノム内に配列番号2及び/又は配列番号4が存在しないことを確立する工程を更に含む、請求項14に記載の方法。
前記確立する工程が、核酸増幅及びそれに続く増幅産物の分析を含む、請求項14又は請求項15に記載の方法。
前記植物が、ペチュニア・アルピコラ、ペチュニア・アキシラリス、ペチュニア・バジェーンシス、ペチュニア・ボンジャージネンシス、ペチュニア・エクスセルタ、ペチュニア・グアラプアベンシス、ペチュニア・インフラータ、ペチュニア・インテグリフォリア、ペチュニア・インテリア、ペチュニア・レディフォリア、ペチュニア・リットラリス、ペチュニア・マンチクエイレンシス、ペチュニア・オクシデンタリス、ペチュニア・パタゴニカ、ペチュニア・レイツィー、ペチュニア・リオグランデンシス、ペチュニア・サクシコーラ、ペチュニア・シェイデアーナ、ペチュニア・ビラディアーナ、ペチュニア・ビオラセア及びそのハイブリッド、好ましくはペチュニア・ヒブリダからなる群から選択される、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
同定されるトバモウイルスに対する抵抗性が、タバコモザイクウイルス抵抗性、トマトモザイクウイルス抵抗性、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス抵抗性及びトウガラシマイルドモットルウイルス抵抗性からなる群のうちの1つ又は複数から選択される、請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
前記植物がペチュニア属であり、前記トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項14から18のいずれか一項に記載の方法。