JP2017086016A - メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー、うどんこ病抵抗性メロン植物、およびそれを用いたうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法 - Google Patents

メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー、うどんこ病抵抗性メロン植物、およびそれを用いたうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】新たなメロン植物のうどんこ病抵抗性マ−カー、うどんこ病抵抗性遺伝子座を含むうどんこ病抵抗性メロン植物、およびそれを用いたうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法の提供。【解決手段】第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、下記条件(1)又は(2)の少なくとも一方の条件を満たすメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。条件(1)第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、特定のプライマーセットで増幅される増幅断片の長さで特定され、増幅断片の長さが、133塩基長以上である、特定の塩基配列からなるフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット、条件(2)前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、特定の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、及び327番目の塩基の多型で特定される病抵抗性遺伝子座。【選択図】なし

Description

本発明は、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー、うどんこ病抵抗性メロン植物、およびそれを用いたうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法に関する。
メロン栽培において、うどんこ病菌による病害は、世界的に深刻な問題となっている。うどんこ病菌に感染した植物体は、葉の枯死等により、植物体の生育が減退し、その結果、果実の減収が生じる。
このため、うどんこ病に対する抵抗性遺伝子を利用して、うどんこ病菌に抵抗性を示す品種の育成が試みられている。しかしながら、これらの抵抗性遺伝子を含むメロン植物に対して感染可能なうどんこ病菌が出現し、問題となっている(非特許文献1)。
F. J. Yuste-Lisbona et.al., "Inheritance of resistance to races 1, 2 and 5 of powdery mildew in the melon TGR-1551", Plant Breeding, 2010, vol.129, pp.72-75
そこで、本発明は、新たなメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー、うどんこ病抵抗性遺伝子座を含むうどんこ病抵抗性メロン植物、およびそれを用いたうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーは、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件(1)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
プライマーセット1
配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
条件(2)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件(1)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
プライマーセット1
配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
条件(2)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法は、下記(a)および(b)工程を含むことを特徴とする。
(a)前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物と、他のメロン植物とを交雑する工程
(b)前記(a)工程より得られたメロン植物またはその後代系統から、うどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程
本発明者らは、鋭意研究の結果、メロン植物について、うどんこ病抵抗性を示すうどんこ病抵抗性マーカーとして、新規のうどんこ病抵抗性遺伝子座を見出した。また、前記うどんこ病抵抗性マーカーを含むメロン植物は、うどんこ病抵抗性を示す。このため、本発明のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーによれば、例えば、うどんこ病抵抗性メロン植物を簡便にスクリーニングできる。また、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座を含むため、例えば、うどんこ病抵抗性を示すことが可能である。さらに、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座は、例えば、単一の遺伝子座(単因子)でうどんこ病抵抗性を付与できる。このため、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、他のメロン植物との交雑によって得られたF1またはその後代からも、うどんこ病抵抗性を示す後代を簡便に得ることができる。さらに、前記うどんこ病抵抗性マーカーを含むメロン植物は、例えば、前記先行技術文献のうどんこ病抵抗性遺伝子を含むメロン植物に対して感染可能なうどんこ病菌に対しても抵抗性を示す。このため、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、従来のような農薬による防除が不要であるため、例えば、前記農薬散布の労力および費用の問題も回避できる。
図1は、第6染色体におけるSNP(single nucleotide polymorphism)等の相対的な座乗位置を示す模式図である。 図2は、実施例1におけるメロン植物の発病指数の評価基準を示す写真である。
1.メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー
本発明のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー(以下、「抵抗性マーカー」ともいう。)は、前述のように、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座(以下、「抵抗性遺伝子座」ともいう。)をホモ接合型で含み、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件(1)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
プライマーセット1
配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
条件(2)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
本発明のうどんこ病抵抗性マーカーは、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とし、その他の構成および条件は、特に制限されない。
本発明において、「メロン植物」は、キュウリ属CucumisCucumis meloに分類される植物である。
本発明において、うどんこ病の病原菌は、例えば、Sphaerotheca fuliginea(「Podosphaera xanthii」ともいう)、Erysiphe polygoni等があげられる。
本発明において、「うどんこ病抵抗性」は、例えば、「うどんこ病耐性」ともいう。前記抵抗性は、例えば、うどんこ病の病原菌の感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制(「阻害」ともいう。)等のいずれでもよい。
本発明において、「染色体」は、例えば、「連鎖群」ということもできる。このため、本発明において、前記メロン植物の第1〜12染色体は、それぞれ、例えば、第1〜12連鎖群ということもでき、第6染色体は、例えば、第6連鎖群ということもできる。前記連鎖群は、例えば、メロン植物のゲノムの塩基配列情報に基づき、下記参考文献1を参照し、決定できる。前記メロン植物のゲノムの塩基配列情報は、例えば、メロノミクスプロジェクト(MELONOMICS Project)のwebサイト(https://melonomics.net/)から入手可能である。具体的に、本発明における前記第6染色体(第6連鎖群)は、例えば、メロノミクスプロジェクトのwebサイトに公開されているメロン植物のゲノムの塩基配列情報Melon_genome_v3.5.1に基づき、下記参考文献1を参照し、決定できる。
参考文献1:Jason M Argyris et.al., “Use of targeted SNP selection for an improved anchoring of the melon (Cucumis melo L.) scaffold genome assembly”, BMC Genomics, 2015 vol.16:4
本発明の抵抗性マーカーは、前述のように、前記第6染色体上の抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むが、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、第6染色体に代えて、第6染色体以外のいずれの染色体上に、前記第6染色体上の抵抗性遺伝子座を含んでもよい。すなわち、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、第1染色体、第2染色体、第3染色体、第4染色体、第5染色体、第7染色体、第8染色体、第9染色体、第10染色体、第11染色体、第12染色体のいずれかの染色体上に、前記第6染色体上の前記抵抗性遺伝子座を含んでもよい。前記うどんこ病抵抗性メロン植物が前記抵抗性マーカーを第6染色体以外の染色体上に含む場合、例えば、1つの抵抗性遺伝子座を第6染色体以外の染色体上に含んでもよいし、2つの抵抗性遺伝子座を第6染色体以外の染色体上に含んでもよい。後者の場合、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記2つの抵抗性遺伝子座を同じ染色体上に含んでもよいし、異なる染色体上に含んでもよい。
うどんこ病抵抗性遺伝子座とは、うどんこ病抵抗性を供与する量的形質遺伝子座または遺伝子領域を意味する。前記量的形質遺伝子座(Quantitative Traits Loci ; QTL)は、一般に、量的形質の発現に関与する染色体領域を意味する。QTLは、染色体上の特定の座を示す分子マーカーを使用して規定できる。前記分子マーカーを使用してQTLを規定する技術は、当該技術分野において周知である。
本発明において、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座の規定(以下、「特定」ともいう。)に使用する分子マーカーは、特に制限されない。前記分子マーカーは、例えば、SNPマーカー、AFLP(分子増幅断片長多型、amplified fragment length polymorphism)マーカー、RFLP(restriction fragment length polymorphism)マーカー、マイクロサテライトマーカー、SCAR(sequence-characterized amplified region)マーカーおよびCAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカー等があげられる。前記マイクロサテライトマーカーは、例えば、STR(short tandem repeat)マーカー、SSR(simple sequence repeat)マーカー等があげられる。前記抵抗性遺伝子座は、例えば、1種類のマーカーで特定されてもよいし、2種類以上のマーカーで特定されてもよい。
本発明において、前記SNPマーカーは、例えば、1個のSNPを前記SNPマーカーとしてもよいし、2個以上のSNPの組合せを前記SNPマーカーとしてもよい。
本発明において、前記抵抗性遺伝子座は、(i)プライマーセットで増幅される増幅断片の長さおよび塩基の多型(以下、「SNP」ともいう。)の組合せの少なくとも一方に基づく条件を満たす。すなわち、前記抵抗性遺伝子座は、前述のように、前記条件(1)および前記条件(2)の少なくとも一方の条件を満たす。前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、後述するように、(ii)プライマーセットにより増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方に基づく条件を満たしてもよいし、(iii)プライマーセットで増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方を含む領域の塩基配列に基づく条件を満たしてもよいし、これらの組合せの条件を満たしてもよい。前記組合せの条件を満たす場合、前記組合せは、特に制限されず、例えば、以下の組合せが例示できる。また、前記抵抗性遺伝子座は、前記(i)を満たしているが、本発明はこれに限定されず、例えば、前記(i)に代えて、前記(ii)または前記(iii)を満たしてもよいし、前記(ii)および前記(iii)の組合せた条件を満たしてもよい。
前記(i)および前記(ii)の組合せ
前記(i)および前記(iii)の組合せ
前記(i)、前記(ii)、および前記(iii)の組合せ
(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件
前記抵抗性遺伝子座は、前記(i)に示すように、プライマーセットで増幅される増幅断片の長さおよびSNPの組合せの少なくとも一方に基づく条件を満たし、具体的には、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たす。以下、各条件における各SNPは、本発明者らが新たに同定したSNPであり、当該技術分野における当業者であれば、後述するこれらのSNPを含む塩基配列に基づき、前記SNPの座乗位置を特定できる。
前記条件(1)において、前記抵抗性遺伝子座は、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さにより特定される。前記増幅断片の長さは、下記プライマーセット1を用いて、例えば、メロン植物について遺伝子増幅を行ない、得られた増幅断片を解析することにより測定できる。前記増幅断片の解析は、例えば、前記増幅断片のシーケンシングでもよいし、電気泳動等による解析でもよい。下記プライマーセット1は、例えば、前述のメロン植物のゲノムの塩基配列情報において、第6染色体上の5857028〜5857159番目の塩基配列を増幅する。
プライマーセット1
フォワードプライマー1 5’-AATCTCAACAAGTGAGCTTTTATTGT-3’ (配列番号1)
リバースプライマー1 5’-CATGATTATCTTCAATTTTCTTTTTGTC-3’ (配列番号2)
前記増幅断片の長さは、133塩基長以上であればよく、その上限は、特に制限されない。前記増幅断片の長さの上限は、例えば、140塩基以下、135塩基以下であり、その範囲は、例えば、133〜140塩基長、133〜135塩基長である。前記増幅断片の長さは、好ましくは、133塩基長である。なお、前記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さとうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規の増幅断片の長さである。
前記条件(2)において、前記抵抗性遺伝子座は、下記配列番号3の塩基配列における9種類のSNPの組合せ(以下、「第1SNPセット」ともいう。)により特定される。前記9種類のSNPは、下記配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目のSNPである。以下、45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目のSNPを、それぞれ、「SNP145」、「SNP148」、「SNP149」、「SNP151」、「SNP1108」、「SNP1120」、「SNP1139」、「SNP1214」、および「SNP1327」ともいう。前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327は、それぞれ、下記配列番号3の塩基配列におけるかっこで囲んだ下線部の1〜8および9番目の塩基である。下記配列番号3の塩基配列は、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。下記配列番号3の塩基配列は、例えば、前述のメロン植物のゲノムの塩基配列情報において、第6染色体上の5586975〜5587541番目の塩基配列に対応する塩基配列である。
前記第1SNPセットは、例えば、前記配列番号3のかっこで囲んだ下線部の塩基において、1〜8および9番目の塩基が、それぞれ、A、A、T、T、T、A、A、TおよびCである多型を示す。つまり、例えば、前記第1SNPセットにおける前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327が、それぞれ、A、A、T、T、T、A、A、T、およびCの場合、メロン植物は、うどんこ病抵抗性であり、前記塩基の組合せ以外の塩基の組合せの場合(例えば、A、T、T、T、T、A、G、およびTの場合、G、A、A、A、G、C、A、C、およびTの場合)、メロン植物は、うどんこ病罹病性であることを示す。なお、前記第1SNPセットとうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規のSNPの組合せである。
前記条件(2)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、前記配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)により特定されてもよい。前記配列番号7の塩基配列は、前記配列番号3の塩基配列における四角で囲んだ塩基配列である。つまり、例えば、前述の第1SNPセットがうどんこ病抵抗性を示す塩基の組合せを含み、且つ前記配列番号3の塩基配列と対応する塩基配列において、前記配列番号7の塩基配列を含む場合、メロン植物は、うどんこ病抵抗性であり、前記配列番号7の塩基配列を含まない場合、メロン植物は、うどんこ病罹病性であることを示す。なお、前記配列番号7の塩基配列とうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規の塩基配列である。
本発明において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(1)および(2)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記SNPの組合せに基づく条件として、さらに、下記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。
条件(3)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号4の塩基配列における50、141、および266番目の塩基の多型で特定される。
条件(4)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目の塩基の多型で特定される。
配列番号5
5’-GTTCGGATCGGAAAATTCAATCAAAGGAATAAGCGCTACAAAACAATAAACACACACATACATCCAAAAATTACAAATCTCCTATCATCATCAAGAAA[C]AGAAAAACCAAACCGAAAACGAAATAAACGCCAAATAATTTCAGAAAATCGATGCGACGGAATAAGAAATGCAT[G]TATCTGGTA[T]GATCGAAAGAGAAA[A][T]ATACGAGATCCGGTGGTTTGCCAGAGCTGCATCTCGCCGTCTTCATAATCGCCTTCGGGACGAACGGCGATGAGAACAAGGTAATCGCCCTTGCGGACAACGTTGTCGATGGCCCATTTGAGGGCTTTAATGCTGCAGGCAGAGAAATCCACCGCGACGCCGACTCTCCGTTGACCGTCCATGCTTTTTGTGGGTTGGGATTTTCAGTGCGTTTGAGCTTTGTGGAAGGAAGGAAGAATGGAATGAATGTCGGAAAGCTTGG-3’
前記条件(3)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記配列番号4の塩基配列における3種類のSNPの組合せ(以下、「第2SNPセット」ともいう。)により特定される。前記3種類のSNPは、例えば、前記配列番号4の塩基配列における50、141、および266番目のSNPである。以下、50、141、および266番目のSNPを、それぞれ、「SNP250」、「SNP2141」、および「SNP2266」ともいう。前記SNP250、前記SNP2141、および前記SNP2266は、それぞれ、前記配列番号4の塩基配列におけるかっこで囲んだ下線部の1、2、および3番目の塩基である。前記配列番号4の塩基配列は、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。前記配列番号4の塩基配列は、例えば、前述のメロン植物のゲノムの塩基配列情報において、第6染色体上の6398131〜6398627番目の塩基配列に対応する塩基配列である。
前記第2SNPセットは、例えば、前記配列番号4のかっこで囲んだ下線部の塩基において、1、2、および3番目の塩基が、それぞれ、C、A、およびTである多型を示す。つまり、例えば、前記第2SNPセットにおける前記SNP250、前記SNP2141、および前記SNP2266が、それぞれ、C、A、およびTの場合、メロン植物は、うどんこ病抵抗性であり、前記塩基の組合せ以外の塩基の組合せの場合(例えば、T、T、およびAの場合)、メロン植物は、うどんこ病罹病性であることを示す。なお、前記第2SNPセットとうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規のSNPの組合せである。
前記条件(3)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、前記配列番号4の塩基配列における132および457番目のSNPの組合せにより特定されてもよい。以下、132および457番目のSNPを、それぞれ、「SNP2132」、および「SNP2457」ともいう。前記SNP2132および前記SNP2457は、それぞれ、前記配列番号4の塩基配列における四角で囲んだ1および2番目の塩基である。
前記SNP2132および前記SNP2457は、例えば、前記配列番号4の四角で囲んだ下線部の塩基において、1および2番目の塩基が、それぞれ、TおよびAである多型を示す。つまり、例えば、前述の第1SNPセットがうどんこ病抵抗性を示す塩基の組合せを含み、且つ前記SNP2132および前記SNP2457が、それぞれ、TおよびAの場合、メロン植物は、うどんこ病抵抗性であり、前記塩基の組合せ以外の塩基の組合せの場合、メロン植物は、うどんこ病罹病性であることを示す。なお、前記SNP2132および前記SNP2457とうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規のSNPの組合せである。
前記条件(4)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記配列番号5の塩基配列における5種類のSNPの組合せ(以下、「第3SNPセット」ともいう。)により特定される。前記5種類のSNPは、例えば、前記配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目のSNPである。以下、99、174、184、199、および200番目のSNPを、それぞれ、「SNP399」、「SNP3174」、「SNP3184」、「SNP3199」、および「SNP3200」ともいう。前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200は、それぞれ、前記配列番号5の塩基配列におけるかっこで囲んだ下線部の1〜4および5番目の塩基である。前記配列番号5の塩基配列は、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。前記配列番号5の塩基配列は、例えば、前述のメロン植物のゲノムの塩基配列情報において、第6染色体上の5269642〜5270103番目の塩基配列に対応する塩基配列である。
前記第3SNPセットは、例えば、前記配列番号5のかっこで囲んだ下線部の塩基において、1〜4および5番目の塩基が、それぞれ、C、G、T、A、およびTである多型を示す。つまり、例えば、前記第3SNPセットにおける前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200が、それぞれ、C、G、T、A、およびTの場合、メロン植物は、うどんこ病抵抗性であり、前記塩基の組合せ以外の塩基の組合せの場合(例えば、T、A、C、T、およびCの場合)、メロン植物は、うどんこ病罹病性であることを示す。なお、前記第3SNPセットとうどんこ病抵抗性との関連性は、これまでに報告されておらず、本発明者らにより初めて見出された、うどんこ病抵抗性に関与する新規のSNPの組合せである。
前記抵抗性遺伝子座が、さらに、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たす場合、前記抵抗性遺伝子座が満たす条件の組合せは、特に制限されず、例えば、以下の組合せが例示できる。
条件(1)および(3)
条件(1)および(4)
条件(2)および(3)
条件(2)および(4)
条件(1)、(2)、および(3)
条件(1)、(2)、および(4)
条件(1)、(2)、(3)および(4)
なお、本発明において、前記抵抗性遺伝子座は、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすが、前記抵抗性遺伝子座はこれに限定されず、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件に代えて、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。この場合、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(3)および(4)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
(ii)塩基配列に基づく条件
前記抵抗性遺伝子座は、前記(ii)に示すように、例えば、プライマーセットにより増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方に基づく条件を満たしてもよく、具体的には、下記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。下記条件(5)において、下記(a2)および(a3)は、それぞれ、前記抵抗性遺伝子座において、前記うどんこ病抵抗性に関して下記(a1)と同等の機能を有するポリヌクレオチドである。下記条件(6)において、下記(b2)および(b3)は、それぞれ、前記抵抗性遺伝子座において、前記うどんこ病抵抗性に関して下記(b1)と同等の機能を有するポリヌクレオチドである。
条件(5)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(a)のポリヌクレオチドで特定される。
(a) 下記(a1)、(a2)、または(a3)のポリヌクレオチド
(a1)配列番号6の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a2)前記(a1)において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(a3)前記(a1)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
条件(6)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(b)のポリヌクレオチドで特定される。
(b) 下記(b1)、(b2)、または(b3)のポリヌクレオチド
(b1)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b2)前記(b1)の45番目の塩基(A)、48番目の塩基(A)、49番目の塩基(T)、51番目の塩基(T)、108番目の塩基(T)、120番目の塩基(A)、139番目の塩基(A)、214番目の塩基(T)、および327番目の塩基(C)が保存され、前記塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b3)前記(b1)の45番目の塩基(A)、48番目の塩基(A)、49番目の塩基(T)、51番目の塩基(T)、108番目の塩基(T)、120番目の塩基(A)、139番目の塩基(A)、214番目の塩基(T)、および327番目の塩基(C)が保存され、前記塩基以外の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記(a1)のポリヌクレオチドにおいて、配列番号6の塩基配列は、以下の通りである。前記(a1)のポリヌクレオチド(配列番号6の塩基配列)は、例えば、前記プライマーセット1を用いて、例えば、メロン植物について遺伝子増幅を行なうことで得られる。前記配列番号6の塩基配列は、例えば、前記増幅断片において、前記フォワードプライマー1を含む増幅断片の塩基配列である。また、前記(a1)のポリヌクレオチドは、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。
配列番号6
5’-AATCTCAACAAGTGAGCTTTTATTGTAAAAAATACAACACAAGTAAGAGTGTGTGTATTTATAATTGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAACAAGACAAAAAGAAAATTGAAGATAATCATG-3’
前記(a2)のポリヌクレオチドにおいて、前記「1もしくは数個」は、例えば、1〜27個、1〜20個、1〜15個、1〜7個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1個または2個である。本発明において、塩基数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「1〜5個」との記載は、「1、2、3、4、5個」の全ての開示を意味する(以下、同様)。
前記(a3)のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、例えば、80%以上、85%以上、89%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上である。前記「同一性」は、2つの塩基配列をアライメントすることによって求めることができる(以下、同様)。
前記(b1)のポリヌクレオチドにおいて、配列番号3におけるかっこで囲んだ下線部の1〜8および9番目の塩基が、前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327の多型に対応する塩基である。前記(b1)のポリヌクレオチドは、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。
前記(b2)のポリヌクレオチドにおいて、前記「1もしくは数個」は、例えば、1〜112個、1〜84個、1〜62個、1〜56個、1〜28個、1〜23個、1〜17個、1〜12個、1〜6個、1〜3個、1個または2個である。
前記(b2)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(b1)における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存されてもよい。この場合、前記(b2)のポリヌクレオチドは、例えば、前記(b1)における45番目の塩基(A)、48番目の塩基(A)、49番目の塩基(T)、51番目の塩基(T)、108番目の塩基(T)、120番目の塩基(A)、139番目の塩基(A)、214番目の塩基(T)、および327番目の塩基(C)、ならびに204〜212および213番目の塩基配列(5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存され、前記塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
前記(b3)のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、例えば、80%以上、85%以上、89%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上である。
前記(b3)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(b1)における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存されてもよい。この場合、前記(b3)のポリヌクレオチドは、例えば、前記(b1)における45番目の塩基(A)、48番目の塩基(A)、49番目の塩基(T)、51番目の塩基(T)、108番目の塩基(T)、120番目の塩基(A)、139番目の塩基(A)、214番目の塩基(T)、および327番目の塩基(C)、ならびに204〜212および213番目の塩基配列(5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存され、前記塩基以外の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
前記抵抗性遺伝子座が下記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たす場合、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(5)および(6)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記塩基配列に基づく条件として、さらに、下記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。下記条件(7)において、下記(c2)および(c3)は、それぞれ、前記抵抗性遺伝子座において、前記うどんこ病抵抗性に関して下記(c1)と同等の機能を有するポリヌクレオチドである。下記条件(8)において、下記(d2)および(d3)は、それぞれ、前記抵抗性遺伝子座において、前記うどんこ病抵抗性に関して下記(d1)と同等の機能を有するポリヌクレオチドである。
条件(7)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(c)のポリヌクレオチドで特定される。
(c) 下記(c1)、(c2)、または(c3)のポリヌクレオチド
(c1)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c2)前記(c1)の50番目の塩基(C)、141番目の塩基(A)、および266番目の塩基(T)が保存され、前記塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(c3)前記(c1)の50番目の塩基(C)、141番目の塩基(A)、および266番目の塩基(T)が保存され、前記塩基以外の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
条件(8)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(d)のポリヌクレオチドで特定される。
(d) 下記(d1)、(d2)、または(d3)のポリヌクレオチド
(d1)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2)前記(d1)の99番目の塩基(C)、174番目の塩基(G)、184番目の塩基(T)、199番目の塩基(A)、および200番目の塩基(T)が保存され、前記塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d3)前記(d1)の99番目の塩基(C)、174番目の塩基(G)、184番目の塩基(T)、199番目の塩基(A)、および200番目の塩基(T)が保存され、前記塩基以外の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
前記(c1)のポリヌクレオチドにおいて、配列番号4におけるかっこで囲んだ下線部の1、2、および3番目の塩基が、前記SNP250、前記SNP2141、および前記SNP2266の多型に対応する塩基である。前記(c1)のポリヌクレオチドは、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。
前記(c2)のポリヌクレオチドにおいて、前記「1もしくは数個」は、例えば、1〜100、1〜75個、1〜55個、1〜50個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜5個、1〜3個、1個または2個である。
前記(c2)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(c1)における132番目の塩基(T)および457番目の塩基(A)が保存されてもよい。この場合、前記(c2)のポリヌクレオチドは、例えば、前記(c1)における50番目の塩基(C)、132番目の塩基(T)、141番目の塩基(A)、266番目の塩基(T)、および457番目の塩基(A)が保存され、前記塩基以外の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
前記(c3)のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、例えば、80%以上、85%以上、89%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上である。
前記(c3)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(c1)における132番目の塩基(T)および457番目の塩基(A)が保存されてもよい。この場合、前記(c3)のポリヌクレオチドは、例えば、前記(c1)における50番目の塩基(C)、132番目の塩基(T)、141番目の塩基(A)、266番目の塩基(T)、および457番目の塩基(A)が保存され、前記塩基以外の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
前記(d1)のポリヌクレオチドにおいて、配列番号5におけるかっこで囲んだ下線部の1〜4および5番目の塩基が、前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200の多型に対応する塩基である。前記(d1)のポリヌクレオチドは、例えば、後述する受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物から得ることができる。
前記(d2)のポリヌクレオチドにおいて、前記「1もしくは数個」は、例えば、1〜93、1〜70個、1〜51個、1〜48個、1〜24個、1〜19個、1〜15個、1〜10個、1〜5個、1〜3個、1個または2個である。
前記(d3)のポリヌクレオチドにおいて、前記「同一性」は、例えば、80%以上、85%以上、89%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上である。
前記抵抗性遺伝子座が、さらに、前記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たす場合、前記抵抗性遺伝子座が満たす条件の組合せは、特に制限されず、例えば、以下の組合せが例示できる。
条件(5)および(7)
条件(5)および(8)
条件(6)および(7)
条件(6)および(8)
条件(5)、(6)、および(7)
条件(5)、(6)、および(8)
条件(5)、(6)、(7)および(8)
なお、本発明において、前記抵抗性遺伝子座が、前記(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件を満たすが、前記抵抗性遺伝子座はこれに限定されず、前述のように、前記(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件に代えて、前記(ii)塩基配列に基づく条件を満たしてもよい。この場合、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件に代えて、前記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。また、この場合、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(7)および(8)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
(iii)領域の塩基配列に基づく条件
前記抵抗性遺伝子座は、前記(iii)に示すように、例えば、プライマーセットで増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方を含む領域の塩基配列に基づく条件を満たしてもよく、具体的には、下記条件(9)を満たしてもよい。前記領域は、例えば、前記増幅断片の塩基配列および前記SNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方の塩基配列の全体を含む条件でもよいし、一部を含む条件でもよい。
条件(9)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記染色体における下記(A)、(B)および(C)のSNPからなる群から選択された2つのSNPの部位間の塩基配列により特定される。
(A) 配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目のSNPからなる群から選択された1つのSNP
(B) 配列番号4の塩基配列における50、132、141、266、および457番目のSNPからなる群から選択された1つのSNP
(C) 配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目のSNPからなる群から選択された1つのSNP
前記(A)のSNPにおいて、45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目のSNPは、例えば、それぞれ、前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327の多型に対応する塩基である。
前記(B)のSNPにおいて、50、132、141、266、および457番目のSNPは、例えば、それぞれ、前記SNP250、前記SNP2132、前記SNP2141、前記SNP2266、および前記SNP2457の多型に対応する塩基である。
前記(C)のSNPにおいて、99、174、184、199、および200番目のSNPは、例えば、それぞれ、前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200の多型に対応する塩基である。
前記領域は、前述のように、例えば、(A)、(B)および(C)のSNPからなる群から選択された2つのSNPの部位によって、上流側端部と下流側端部とを特定できる。前記領域は、例えば、前記(A)、(B)および(C)のSNPからなる群から選択された2つのSNPの部位間であればよく、例えば、前記2つのSNPの部位の両方または一方を含んでもよいし、含まなくてもよい。また、前記領域が、前記SNPの部位を含む場合、前記領域の前記上流側端部と前記下流側端部とは、前記SNPの部位となるが、前記上流側端部と前記下流側端部との塩基は、例えば、前述した塩基配列における下線部または四角で囲んだ塩基でもよいし、それ以外の塩基でもよい。
具体的に、前記上流側端部と前記下流側端部とのSNPは、例えば、前記(A)、(B)、および(C)のSNPの座乗位置に基づき、決定できる。前記(A)、(B)、および(C)のSNPは、例えば、図1に示すように、メロン植物の第6染色体上において、上流側(SNP399)から下流側(SNP2457)にかけて、前記(C)のSNP、前記(A)のSNP、および前記(B)のSNPがこの順で座乗している。また、図1に示すように、前記増幅断片の塩基配列は、例えば、前記(A)のSNPおよび前記(B)のSNPの間に座乗している。この場合、前記領域を特定する前記2つのSNPは、例えば、以下の組合せが例示できる。
(A)のSNPと(B)のSNPとの組合せ
(A)のSNPと(C)のSNPとの組合せ
(B)のSNPと(C)のSNPとの組合せ
前記組合せのうち、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、好ましくは、例えば、以下の組合せである。
(B)のSNPと(C)のSNPとの組合せ
前記2つのSNPの部位間の領域の塩基配列によって、前記抵抗性遺伝子座を特定する場合、前記抵抗性遺伝子座は、さらに、前記領域の塩基配列に関連する前述の条件を含むことが好ましい。具体的には、前記抵抗性遺伝子座は、前記領域の塩基配列において、例えば、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことが好ましい。また、前記抵抗性遺伝子座は、さらに、前記領域の塩基配列において、例えば、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たすことが好ましい。
前記関連する条件は、例えば、前記領域を特定する上流側端のSNPの部位と前記下流側端のSNPの部位との間の塩基配列に関連する条件があげられ、例えば、前記図1に示す前記(A)、(B)および(C)のSNP、ならびに前記増幅断片の塩基配列の座乗位置に基づき、適宜決定できる。前記関連する条件の数は、例えば、1つ以上であればよく、具体例として、前記領域を特定するSNPの部位間に座乗する塩基配列に関連する全ての条件である。
前記抵抗性遺伝子座が満たす前記2つのSNPの部位間の領域の塩基配列と前記領域の塩基配列に関連する条件との組合せは、特に制限されず、例えば、下記条件(a)、(b)または(c)があげられる。
条件(a)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記染色体における、(A)のSNPおよび(B)のSNPの部位間の領域の塩基配列を含み、且つ、
条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たす。
条件(b)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記染色体における、(B)のSNPおよび(C)のSNPの部位間の領域の塩基配列を含み、且つ、
条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たす。
条件(c)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記染色体における、(B)のSNPおよび(C)のSNPの部位間の領域の塩基配列を含み、且つ、
条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件と条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件とを満たす。
前記条件(a)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(1)および(2)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよい。
前記条件(b)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(1)および(2)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよい。
前記条件(c)において、前記抵抗性遺伝子座が満たす条件の組合せは、特に制限されず、例えば、以下の組合せが例示できる。
条件(1)および(3)
条件(1)および(4)
条件(2)および(3)
条件(2)および(4)
条件(1)、(2)、および(3)
条件(1)、(2)、および(4)
条件(1)、(2)、(3)および(4)
本発明の抵抗性マーカーによれば、例えば、メロン植物に対して、うどんこ病抵抗性を付与することができる。本発明において、メロン植物の前記うどんこ病抵抗性の程度は、例えば、下記参考文献2に記載の方法を参照し、発病指数により表わすことができる。この方法による前記発病指数の算出は、後述する実施例1の説明を援用でき、例えば、発病指数1以下を耐病性(抵抗性)、発病指数2以上を罹病性と設定できる。
参考文献2:LongZhou Liu et.al., “A Sequence-amplified Characterized Region Marker for a Single, Dominant Gene in Melon PI 134198 that Confers Resistance to a Unique Race of Podosphaera xanthii in China”, HORTSCIENCE, 2010, vol.45, No.9, pp.1407-1410
本発明の抵抗性マーカーは、例えば、さらに、他の抵抗性マーカーを含んでもよい。
2.うどんこ病抵抗性メロン植物
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、前述のように、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件(1)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
プライマーセット1
配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
条件(2)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とし、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、前記抵抗性遺伝子座である前記本発明の抵抗性マーカーを含むことから、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーの説明を援用できる。本発明において、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座は、例えば、本発明の抵抗性マーカーにおける抵抗性遺伝子座と読み替え可能である。本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記本発明の抵抗性マーカー等の説明を援用できる。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、うどんこ病に抵抗性を示す。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物において、前記うどんこ病抵抗性は、前記抵抗性遺伝子座によってもたらされる。本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、前記第6染色体上の抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むが、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、第6染色体に代えて、第6染色体以外のいずれの染色体上に、前記第6染色体上の抵抗性遺伝子座を含んでもよい。すなわち、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、第1染色体、第2染色体、第3染色体、第4染色体、第5染色体、第7染色体、第8染色体、第9染色体、第10染色体、第11染色体、第12染色体のいずれかの染色体上に、前記第6染色体上の前記抵抗性遺伝子座を含んでもよい。前記うどんこ病抵抗性メロン植物が前記抵抗性マーカーを第6染色体以外の染色体上に含む場合、例えば、1つの抵抗性遺伝子座を第6染色体以外の染色体上に含んでもよいし、2つの抵抗性遺伝子座を第6染色体以外の染色体上に含んでもよい。後者の場合、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記2つの抵抗性遺伝子座を同じ染色体上に含んでもよいし、異なる染色体上に含んでもよい。なお、前記「染色体」は、例えば、前述のように、「連鎖群」ということもでき、前述の説明を援用できる。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記うどんこ病抵抗性メロン植物の説明を援用できる。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記条件(1)および(2)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、一例として、受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物(Cucumis melo)またはその後代系統があげられる。前記寄託メロン植物は、例えば、前記第6染色体上に前記抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含む。寄託の情報を以下に示す。
寄託の種類:国際寄託
寄託機関名:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
あて名:日本国 〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室
受託番号:FERM BP−22291
識別のための表示:Takii8
受領日:2015年8月14日
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、メロン植物に、前記抵抗性遺伝子座を導入することによっても製造できる。前記メロン植物への前記抵抗性遺伝子座の導入方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の遺伝子工学的手法があげられる。導入する前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前述のうどんこ病抵抗性遺伝子座が例示できる。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物について、うどんこ病抵抗性以外の特徴、例えば、形質的、生態的特徴等は、特に限定されない。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、さらに、他の抵抗性を有してもよい。
本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体および前記植物個体の部分のいずれの意味であってもよい。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、1種類の器官、組織および/または細胞でもよいし、2種類以上の器官、組織および/または細胞でもよい。
3.うどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法
つぎに、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法(以下、「製造方法」ともいう。)について説明する。なお、以下の方法は、例示であって、本発明は、これらの方法に制限されない。本発明において、製造方法は、例えば、育成方法ということもできる。また、本発明において、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座は、前記本発明の抵抗性マーカーと言い換えることができる。
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法は、前述のように、下記(a)および(b)工程を含むことを特徴とする。
(a)前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物と、他のメロン植物とを交雑する工程
(b)前記(a)工程より得られたメロン植物またはその後代系統から、うどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程
本発明の製造方法は、前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物を親として使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の抵抗性マーカー等の説明を援用できる。前述のように、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座は、例えば、単一の遺伝子座でうどんこ病抵抗性を付与できる。このため、本発明の製造方法は、例えば、前記抵抗性遺伝子座を用いることにより、他のメロン植物との交雑によって得られたF1またはその後代からも、うどんこ病抵抗性を示す後代を簡便に得ることができる。
前記(a)工程において、第一の親として使用するうどんこ病抵抗性メロン植物は、前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物であればよい。前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前述のような受託番号FERM BP−22291で寄託されたメロン植物またはその後代系統が好ましい。前記(a)工程において、第一の親として使用するうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により得ることもできる。このため、前記うどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記(a)工程に先立って、例えば、被検メロン植物(以下、「候補メロン植物」ともいう。)から、下記(x)工程により選抜して準備してもよい。
(x)被検メロン植物から、前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程
前記(x)工程において、前記うどんこ病抵抗性メロン植物の選抜は、前記抵抗性遺伝子座を含むメロン植物の選抜ということができる。このため、前記(x)工程は、例えば、下記(x1)工程および(x2)工程により行うことができる。
(x1)前記被検メロン植物の染色体上における、ホモ接合型のうどんこ病抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
(x2)前記ホモ接合型のうどんこ病抵抗性遺伝子座の存在により、前記被検メロン植物を、うどんこ病抵抗性メロン植物として選抜する選抜工程
前記(x)工程における前記選抜は、前述のように、例えば、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座を含むメロン植物の選抜であり、具体的には、前記被検メロン植物について、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座を検出することによって、前記うどんこ病抵抗性メロン植物を選抜できる。前記うどんこ病抵抗性遺伝子座の検出は、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおいて説明したように、前記抵抗性遺伝子座が満たす、(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件、(ii)塩基配列に基づく条件、(iii)領域の塩基配列に基づく条件およびこれらの条件の組合せを用いて検出できる。
前記(x)工程における前記選抜について、以下の具体例をあげるが、本発明は、これらには限定されない。また、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座に関しては、前記本発明の抵抗性マーカーにおける説明を援用できる。
前記(x)工程における前記選抜は、例えば、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜であり、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たす。
前記(x)工程において、前記抵抗性遺伝子座は、前述のように、例えば、(i)プライマーセットで増幅される増幅断片の長さおよびSNPの組合せの少なくとも一方に基づく条件により選抜される。前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、後述するように、(ii)プライマーセットにより増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方に基づく条件により選抜されてもよいし、(iii)プライマーセットで増幅される増幅断片の塩基配列およびSNPの組合せを含む塩基配列の少なくとも一方を含む領域の塩基配列に基づく条件により選抜されてもよいし、これらの組合せの条件により選抜されてもよい。前記組合せの条件により選抜する場合、前記組合せは、特に制限されず、例えば、以下の組合せが例示できる。また、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記(i)により選抜されるが、本発明はこれに限定されず、例えば、前記(i)に代えて、前記(ii)または前記(iii)により選抜されてもよいし、前記(ii)および前記(iii)の組合せた条件により選抜されてもよい。
前記(i)および前記(ii)の組合せ
前記(i)および前記(iii)の組合せ
前記(i)、前記(ii)、および前記(iii)の組合せ
(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件による選抜
前記抵抗性遺伝子座において、前記選抜に用いる(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件は、特に制限されず、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおける「(i)増幅断片の長さおよびSNPの組合せに基づく条件」の説明を援用できる。
具体例として、前記(x)工程における前記選抜は、例えば、前記条件(1)および(2)の一方の条件を満たすうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜でもよいし、両条件を満たすうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜でもよい。前記条件(2)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、前記配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)により特定されてもよい。
さらに、前記(x)工程において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記SNPの組合せに基づく条件として、さらに、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。また、前記条件(3)において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、さらに、前記配列番号4の塩基配列における132および457番目のSNPの組合せにより特定されてもよい。
前記抵抗性遺伝子座が、さらに、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たす場合、前記抵抗性遺伝子座が満たす条件の組合せは、特に制限されず、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおける組合せの例示を援用できる。
なお、本発明の製造方法において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすが、前記抵抗性遺伝子座はこれに限定されず、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件に代えて、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。この場合、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(3)および(4)の一方の条件を満たしてもよいし、両条件を満たしてもよく、うどんこ病抵抗性との相関性がより高いことから、両条件を満たすことが好ましい。
(ii)塩基配列に基づく条件による選抜
前記(x)工程における選抜は、例えば、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜であり、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。前記抵抗性遺伝子座において、前記選抜に用いる(ii)塩基配列に基づく条件は、特に制限されず、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおける「(ii)塩基配列に基づく条件」の説明を援用できる。
具体例として、前記(x)工程における前記選抜は、例えば、前記条件(5)および(6)の一方の条件を満たすうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜でもよいし、両条件を満たすうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜でもよい。
前記条件(6)において、前記(b2)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(b1)における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存されてもよい。また、前記条件(6)において、前記(b4)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(b1)における204〜212および213番目の塩基配列(配列番号7:5’-AAAAGCTCCA-3’)が保存されてもよい。
さらに、前記(x)工程において、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記塩基配列に基づく条件として、さらに、前記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たしてもよい。また、前記条件(7)において、前記(c2)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(c1)における132番目の塩基(T)および457番目の塩基(A)が保存されてもよい。また、前記条件(7)において、前記(c3)のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、前記(c1)における132番目の塩基(T)および457番目の塩基(A)が保存されてもよい。
前記抵抗性遺伝子座が、さらに、前記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たす場合、前記抵抗性遺伝子座が満たす条件の組合せは、特に制限されず、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおける組合せの例示を援用できる。
(iii)領域の塩基配列に基づく条件による選抜
前記(x)工程における選抜は、例えば、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜であり、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、前記条件(9)を満たしてもよい。前記抵抗性遺伝子座において、前記選抜に用いる(iii)領域の塩基配列に基づく条件は、特に制限されず、例えば、前記本発明の抵抗性マーカーにおける「(iii)領域の塩基配列に基づく条件」の説明を援用できる。
具体例として、前記抵抗性遺伝子座は、前記領域の塩基配列において、例えば、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことが好ましい。また、前記抵抗性遺伝子座は、さらに、前記領域の塩基配列において、例えば、前記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たすことが好ましい。
また、前記抵抗性遺伝子座は、例えば、前記条件(a)、(b)または(c)を満たしてもよい。
前記ホモ接合型の抵抗性遺伝子座の有無を検出する染色体は、好ましくは、第6染色体である。
また、前記(a)工程において、他方の親として使用するメロン植物は、特に制限されず、例えば、既知のうどんこ病抵抗性遺伝子を含むメロン植物でもよいし、他の抵抗性を有するメロン植物でもよいし、前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物でもよい。
前記(a)工程において、前記うどんこ病抵抗性メロン植物と前記他のメロン植物との交雑方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
前記(b)工程において、うどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する対象は、例えば、前記(a)工程より得られたメロン植物でもよいし、さらに、そのメロン植物から得られた後代系統でもよい。具体的に、前記対象は、例えば、前記(a)工程の交雑によって得られたF1のメロン植物でもよいし、その後代系統でもよい。前記後代系統は、例えば、前記(a)工程の交雑によって得られたF1のメロン植物の自殖交雑後代または戻し交雑後代でもよいし、前記F1のメロン植物と他のメロン植物とを交雑することによって得られたメロン植物であってもよい。
前記(b)工程において、うどんこ病抵抗性メロン植物の選抜は、例えば、うどんこ病抵抗性を、直接的または間接的に確認することにより行うことができる。
前記(b)工程において、前記直接的な確認は、得られた前記F1のメロン植物またはその後代系統について、例えば、うどんこ病抵抗性を、前述のような発病指数によって評価することで行える。具体的には、例えば、前記F1のメロン植物またはその後代系統に対して、例えば、うどんこ病菌を接種して、うどんこ病抵抗性を、前記発病指数によって評価することで確認できる。この場合、例えば、1以下の発病度を示す前記F1のメロン植物またはその後代系統を、うどんこ病抵抗性メロン植物として選抜できる。
また、前記(b)工程において、前記間接的な確認による選抜は、例えば、下記(b1)および(b2)工程によって行うことができる。
(b1)前記(a)工程より得られたメロン植物またはその後代系統について、染色体上における、ホモ接合型のうどんこ病抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
(b2)前記うどんこ病抵抗性遺伝子座の存在により、前記(a)工程により得られたメロン植物またはその後代系統を、うどんこ病抵抗性メロン植物として選抜する選抜工程
前記(b)工程におけるうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜は、例えば、前記(x)工程において説明した方法と同様であり、前記ホモ接合型のうどんこ病抵抗性遺伝子座の有無の検出によって、より具体的には、前記分子マーカーを使用した前記ホモ接合型のうどんこ病抵抗性遺伝子座の有無の検出によって、行うことができる。
本発明の製造方法は、前記(b)工程において選抜されたうどんこ病抵抗性メロン植物を、さらに育成することが好ましい。
このように、前記うどんこ病抵抗性が確認された前記メロン植物またはその後代系統を、うどんこ病抵抗性メロン植物として選抜できる。
本発明の製造方法は、さらに、交雑により得られた前記後代系統から、種子を採取する採種工程を含んでもよい。
4.うどんこ病抵抗性メロン植物のスクリーニング方法
本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物のスクリーニング方法(以下、「スクリーニング方法」ともいう。)は、交雑によりうどんこ病抵抗性メロン植物を生産するための親として、被検メロン植物から、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーとして第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程を含み、
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする。
条件(1)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
プライマーセット1
配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー
配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー
条件(2)
前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
本発明のスクリーニング方法は、被検メロン植物から、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーとして第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程を含み、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、前記本発明の抵抗性マーカーによって、うどんこ病抵抗性の親を得ることができる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の抵抗性マーカー等の説明を援用できる。
前記親の選抜は、例えば、前記本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法における前記(x)工程の説明を援用できる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
[実施例1]
新規なうどんこ病抵抗性メロン植物について、うどんこ病抵抗性遺伝子座の遺伝様式の解析、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座の特定、および前記うどんこ病抵抗性遺伝子座とうどんこ病抵抗性との相関を確認することで、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座が、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーとなること、前記抵抗性遺伝子座を含むメロン植物が、うどんこ病抵抗性メロン植物であること、ならびに前記メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーを使用し、うどんこ病抵抗性メロン植物をスクリーニングできることを確認した。
(1)寄託系統
うどんこ病抵抗性を示す新規メロン植物を開発するために、タキイ種苗株式会社農場で継代育種により採取された大量のメロン系統の種子について、育種を行い、うどんこ病抵抗性の試験を行った。その結果、うどんこ病抵抗性を示す、新規のうどんこ病抵抗性メロン系統(Cucumis melo)を製造(以下、「生産」ともいう。)した。この新規うどんこ病抵抗性メロン植物は、受託番号FERM BP−22291で寄託した。以下、このうどんこ病抵抗性メロン植物を寄託系統という。
(2)うどんこ病抵抗性の遺伝様式
前記寄託系統のメロン植物(受託番号FERM BP−22291)と、うどんこ病罹病性メロン植物「春系3号(農業生物資源ジ−ンバンクからアクセッション番号JP32097の植物として入手可能、Cucumis melo)」(以下、「罹病性メロン植物」ともいう。)とを交雑することによって、61個体のF2分離集団(以下、「61系統」ともいう。)を生産した。さらに、前記61系統を使用し、以下に示すように、うどんこ病菌の接種試験を行った。なお、前記寄託系統は、第6染色体上の前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327、前記SNP250、前記SNP2132、前記SNP2141、前記SNP2266、および前記SNP2457、ならびに前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200を抵抗性のホモ接合型で含む。すなわち、前記寄託系統は、前記条件(1)〜(8)および(9)を満たすメロン植物である。また、前記寄託系統は、2本の第6染色体が前記配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列を含み、且つ、前記プライマーセットで増幅される増幅断片の長さが、133塩基である。他方、前記罹病性メロン植物は、第6染色体上の前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327、前記SNP250、前記SNP2132、前記SNP2141、前記SNP2266、および前記SNP2457、ならびに前記SNP399、前記SNP3174、前記SNP3184、前記SNP3199、および前記SNP3200を罹病性のホモ接合型で含む。また、前記罹病性メロン植物は、2本の第6染色体が前記配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列を含まず、且つ、前記プライマーセットで増幅される増幅断片の長さが、132塩基である。すなわち、前記罹病性メロン植物は、前記条件(1)〜(8)および(9)を満たさないメロン植物である。
うどんこ病菌の接種試験は、前記参考文献2に記載の方法を参照し、以下のように行った。
前記うどんこ病菌系統1(レース3.5)は、隔離した培養器内で生育させたメロン植物(オトメの祈り、タキイ種苗株式会社)上で培養した。前記メロン植物の葉上の前記うどんこ病菌の菌叢を掻き取ることにより分生子を回収後、滅菌蒸留水を添加した。前記添加後、得られた懸濁液をキムワイプ(登録商標)で濾過し、濾液を回収した。さらに、前記分生子が、5×10個/mLとなるように滅菌蒸留水で希釈し、分生子懸濁液を調製し、接種源として使用した。前記61系統は、予めもみ殻燻炭に播種後、殺菌土壌を詰めた10000分の1aワグネルポットに鉢植えした。そして、前記接種試験には、本葉第3展開期のメロン植物を使用した。ハンドスプレーを用い、前記分生子懸濁液を前記メロン植物の株全体に均一に噴霧した。前記噴霧後、前記メロン植物を、20−25℃、湿度60−80%、14000Lux、12時間日長の条件下の人工気象室において、2週間生育した。そして、生育したメロン植物について、以下のように発病調査を行った。また、10系統の寄託系統および10系統の前記罹病性メロン植物について、同様に発病調査を行った。なお、前記うどんこ病菌のレースは、下記参考文献3に基づき、決定した。
参考文献3:Fernando J. Yuste-Lisbona et.al., “Codominant PCR-based markers and candidate genes for powdery mildew resistance in melon (Cucumis melo L.)”, Theor. Appl. Genet., 2011, vol.122, pp.747-758
発病調査は、前記参考文献2の方法を参照し、メロン植物の調査した葉の発病指数を、以下の基準にしたがって評価した。また、図2に、前記発病指数の評価基準として、発病指数0(図2(A))、発病指数1(図2(B))、発病指数2(図2(C))、および発病指数3(図2(D))のメロン植物の葉の代表例の写真に示す。なお、各図において、胞子形成が観察される領域は、矢印で示した囲んだ領域である。
発病指数0:胞子形成が認められない(高い抵抗性)
発病指数1:わずかな胞子形成が認められる(抵抗性)
発病指数2:限定的な胞子形成が見られる
発病指数3:広範囲に多量の胞子形成が見られる
これらの結果を下記表1に示す。下記表1に示すように、前記61系統において、発病指数が1以下、すなわちうどんこ病抵抗性である個体は、15個体であり、全体の24.6%を占めた。前記61系統の発病指数と、その個体の出現頻度との関係から、前記寄託系統のうどんこ病抵抗性の遺伝様式は、1因子の劣性であることがわかった。また、同条件で試験した前記罹病性メロン植物は、罹病性を示した。前記寄託系統は、抵抗性を示すことが確認できた。さらに、1因子の劣性のうどんこ病抵抗性遺伝子座は知られていないことから、前記寄託系統が含むうどんこ病抵抗性遺伝子座は、新規なうどんこ病抵抗性遺伝子座であることが分かった。
(3)新規なうどんこ病抵抗性遺伝子座の特定
つぎに、前記61系統から、常法により、それぞれの系統のDNAを抽出した。さらに、前記DNAについて、DNAアッセイに供した。そして、前記(2)の発病指数および前記DNAアッセイの結果に基づき、解析ソフトウェア(QTL cartographer、NC STATE University製)を用い、QTL解析を行った。その結果、第6染色体において、前記発病指数と相関性の高い領域が、1箇所特定された。前記相関性の高い領域は、前記プライマーセット1で増幅される増幅断片および第1SNPセットを含む領域であった。これらの結果から、新規なうどんこ病抵抗性遺伝子座は、第6染色体上の1因子の劣性遺伝子を含むことが分かった。また、前記相関性の高い領域の塩基配列の解析から、うどんこ病抵抗性メロン植物は、2本の第6染色体から前記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さが133塩基であり、前記2本の第6染色体上において、前記SNP145、前記SNP148、前記SNP149、前記SNP151、前記SNP1108、前記SNP1120、前記SNP1139、前記SNP1214、および前記SNP1327が、それぞれ、A、A、T、T、T、A、A、TおよびCであり、前記2本の第6染色体が、それぞれ、前記配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列を含むことがわかった。
(4)新規なうどんこ病抵抗性遺伝子座とうどんこ病抵抗性
前記61系統のDNAについて、前記プライマーセット1を用いPCRを行い、増幅された増幅断片の長さを測定した。また、前記61系統のDNAについて、下記プライマーセット2を用いPCRを行い、増幅された増幅断片において、前記第1SNPセットに対応する多型の塩基を特定した。なお、前記プライマーセット1を用いた増幅は、94℃で3分間インキュベート後、94℃30秒、57℃30秒、および72℃60秒を1サイクルとし、35サイクル行い、前記35サイクル後、72℃で3分間インキュベートすることにより実施した。また、前記プライマーセット2を用いた増幅は、94℃で3分間インキュベート後、94℃30秒、56℃30秒、および72℃60秒を1サイクルとし、35サイクル行い、前記35サイクル後、72℃で3分間インキュベートすることにより実施した。そして、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットに対応する多型の塩基により、前記61系統を抵抗性のホモ接合型(A)、ヘテロ接合型(H)、および罹病性のホモ接合型(B)に分類した。これらの結果を下記表2に示す。なお、下記表2において、Aは、2本の第6染色体から増幅される前記増幅断片の長さが共に133塩基以上であり、且つ前記第1SNPセットを抵抗性のホモ接合型で有する個体を示す。また、Hは、1本の第6染色体から増幅される増幅断片の長さが133塩基以上であり、他方の第6染色体から増幅される増幅断片の長さが133塩基未満であり、且つ、前記第1SNPセットをヘテロ接合型で有する個体を示す。さらに、Bは、2本の第6染色体から増幅される前記増幅断片の長さが共に133塩基未満であり、且つ前記第1SNPセットを罹病性のホモ接合型で有する個体を示す。
プライマーセット2
フォワードプライマー2 5’-GGAAAAATGCAGGGGAAG-3’ (配列番号8)
リバースプライマー2 5’-CTGCCAAAAGCGACTTAACC-3’ (配列番号9)
前記表2に示すように、Aでは、全ての個体が、発病指数が1以下であった。他方、HおよびBは、全ての個体が、発病指数が2以上であった。これらの結果から、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットで特定される新規なうどんこ病抵抗性遺伝子座が、うどんこ病抵抗性を担っていることが確認できた。また、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットで特定される抵抗性遺伝子座、すなわち、前記条件(1)および(2)の両条件を満たす抵抗性遺伝子座が、うどんこ病抵抗性を担っていることから、前記抵抗性遺伝子座が、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーとなること、ならびに前記メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーを使用し、うどんこ病抵抗性メロン植物をスクリーニングできることがわかった。
(5)公知のうどんこ病菌への抵抗性の確認
前記61系統から、前記抵抗性のホモ接合型の個体10系統を選抜した。つぎに、前記10系統をそれぞれ自殖させることにより、F3選抜系統を生産した。さらに、10系統のF3選抜系統(F3−1〜F3−10)について、それぞれ10個体使用し、前記(2)と同様にして、うどんこ病菌の接種試験を行った。そして、F3選抜系統の各系統について発病指数を求め、下記式より、それぞれ対応するF3選抜系統の発病指数とした。
発病指数=[(0×n)+(1×n)+(2×n)+(3×n)]/調査個体数
前記式において、「0、1、2、3」は、それぞれ発病指数を示し、「n、n、n、n」は、それぞれ、発病指数0、発病指数1、発病指数2、発病指数3の個体数を示す。
また、前記うどんこ病菌の接種試験では、前記うどんこ病菌系統1に加え、うどんこ病菌系統2(レース2F)、うどんこ病菌系統3(レース5)、うどんこ病菌系統4(レースG)をそれぞれ使用して実施した。また、前記F3選抜系統に代えて、公知のうどんこ病罹病性メロン植物であるVedrantais(Webサイト(http://www.burpee.com/heirloom-seeds-and-plants/heirloom-melons/melon-vedrantais-prod002040.html)において入手可能)、PMR45(PI601383としてUSDA(United States Department of Agriculture)から入手可能)、および前記罹病性メロン植物を、公知のうどんこ病抵抗性であるPMR5(Ames26809としてUSDAから入手可能)、WMR29(INRA(Institut National de la Recherche Agronomique)から入手可能)、Edisto47(NSL34600としてUSDAから入手可能)、PI414723(USDAから入手可能)、MR1(INRAから入手可能)、およびPI124112(USDAから入手可能)、ならびに前記寄託系統を用いた以外は同様にしてうどんこ病菌の接種試験を行い、発病指数を評価した。なお、前記うどんこ病菌のレースは、前記参考文献3に基づき、決定した。これらの結果を表3に示す。
前記表3に示すように、公知のうどんこ病罹病性メロン植物であるVedrantais、PMR45、および前記罹病性メロン植物は、いずれのうどんこ病菌に対しても罹病性を示した。また、公知のうどんこ病抵抗性メロン植物であるPMR5およびPI124112は、前記うどんこ病菌系統2および3に対して抵抗性を示したのに対し、前記うどんこ病菌系統1および4に対しては罹病性を示した。WMR29およびEdisto47は、前記うどんこ病菌系統2に対して抵抗性を示したのに対し、前記うどんこ病菌系統1、3、および4に対しては罹病性を示した。PI1414723は、前記うどんこ病菌系統1〜3に対して抵抗性を示したのに対し、前記うどんこ病菌系統4に対して罹病性を示した。MR1は、前記うどんこ病菌系統2〜4に対して抵抗性を示したのに対し、前記うどんこ病菌系統1に対しては罹病性を示した。これに対し、前記F3選抜系統および前記寄託系統は、いずれのうどんこ病菌対しても、抵抗性を示した。さらに、前記うどんこ病菌系統1〜4は、いずれも公知のうどんこ病抵抗性遺伝子を含むメロン植物に対して感染可能なうどんこ病菌であることから、前記抵抗性遺伝子座は、公知のうどんこ病抵抗性遺伝子を含むメロン植物に対して感染可能なうどんこ病菌に対しても有効であることがわかった。これらの結果から、前記F3選抜系統および前記寄託系統が、公知の複数のレースのうどんこ病菌に対して抵抗性を示すことがわかった。また、公知のうどんこ病抵抗性メロン植物は、うどんこ病菌系統1〜4のいずれかに対して罹病性を示すのに対し、前記F3選抜系統および前記寄託系統は、うどんこ病菌系統1〜4のいずれに対しても抵抗性を示した。これらの結果から、前記条件(1)および(2)の両条件を満たす抵抗性遺伝子座が、公知のうどんこ病抵抗性メロン植物が含む抵抗性遺伝子座と異なる新規のうどんこ病抵抗性遺伝子座であることが確認できた。
(6)第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座
前記(2)と同様にして、F2分離集団を作製した。そして、前記F2分離集団について、前記(4)と同様にして、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットに対応する多型の塩基を特定した。さらに、前記F2分離集団のDNAについて、下記プライマーセット3および4を用い、PCRを行い、増幅された増幅断片において、前記第2SNPセットおよび前記第3SNPセットに対応する多型の塩基を特定した。なお、前記プライマーセット3を用いた増幅は、94℃で3分間インキュベート後、94℃30秒、51℃30秒、および72℃60秒を1サイクルとし、35サイクル行い、前記35サイクル後、72℃で3分間インキュベートすることにより実施した。また、前記プライマーセット4を用いた増幅は、94℃で3分間インキュベート後、94℃30秒、58℃30秒、および72℃60秒を1サイクルとし、35サイクル行い、前記35サイクル後、72℃で3分間インキュベートすることにより実施した。
プライマーセット3
フォワードプライマー3 5’-AGGAAACGAAGAATAGACG-3’ (配列番号10)
リバースプライマー3 5’-TGAGAACCGGAAAGAGAAGC-3’ (配列番号11)
プライマーセット4
フォワードプライマー4 5’-GTTCGGATCGGAAAATTCAA-3’ (配列番号12)
リバースプライマー4 5’-CCAAGCTTTCCGACATTCAT-3’ (配列番号13)
そして、前記F2分離集団の前記増幅断片の長さ、前記第1SNPセット、前記第2SNPセット、および前記第3SNPセットについて、遺伝子型を分類した。また、前記F2分離集団について、前記(2)と同様にして、うどんこ病菌の接種試験を行い、発病指数を評価した。得られた結果の内、前記増幅断片の長さ、前記第1SNPセット、前記第2SNPセット、および前記第3SNPセットの遺伝子型が互いに異なる4個体(系統X1〜X4)、前記寄託系統、前記罹病性系統、および前記寄託系統と前記罹病性系統とのF1系統の結果を表4に示す。なお、下記表4の増幅断片の長さにおいて、Aは、2本の第6染色体から前記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さが共に133塩基以上であることを示し、Hは、1本の第6染色体から前記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さが133塩基以上であり、他方の染色体から前記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さが133塩基未満であることを示し、Bは、2本の第6染色体から増幅される前記増幅断片の長さが共に133塩基未満であることを示す。また、下記表4の第1SNPセット、第2SNPセット、および第3SNPセットにおいて、Aは、各SNPセットが抵抗性のホモ接合型であることを示し、Hは、各SNPセットがヘテロ接合型であることを示し、Hは、各SNPセットが罹病性のホモ接合型であることを示す。下記表4において、Aは網掛けで示している。
前記表4に示すように、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットが、Aである個体においては、いずれの個体も発病指数が、1以下であった。これらの結果から、前記抵抗性遺伝子座において、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットが、前記うどんこ病抵抗性と高い相関を示すこと、すなわち、前記条件(1)および(2)が、前記うどんこ病抵抗性と高い相関を示す条件であることがわかった。また、前記増幅断片の長さおよび前記第1SNPセットと高い相関性を示すことから、これらを含む領域である前記第2SNPセットおよび前記第3SNPセットのいずれかのSNPの部位間の領域が、前記うどんこ病抵抗性と高い相関を示すこと、すなわち、前記条件(9)が、前記うどんこ病抵抗性と高い相関を示す条件であることがわかった。これらの結果から、前記条件(1)および(2)の少なくとも一方を満たす抵抗性遺伝子座、ならびに前記条件(9)を満たす抵抗性遺伝子座が、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーとなること、ならびに前記メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーを使用し、うどんこ病抵抗性メロン植物をスクリーニングできることがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
本発明のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカーによれば、例えば、うどんこ病抵抗性メロン植物を簡便にスクリーニングできる。また、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座を含むため、例えば、うどんこ病抵抗性を示すことが可能である。さらに、前記うどんこ病抵抗性遺伝子座は、例えば、単一の遺伝子座でうどんこ病抵抗性を付与できる。このため、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、例えば、他のメロン植物との交雑によって得られたF1またはその後代からも、うどんこ病抵抗性を示す後代を簡便に得ることができる。さらに、前記うどんこ病抵抗性マーカーを含むメロン植物は、例えば、前記先行技術文献のうどんこ病抵抗性遺伝子を含むメロン植物に対して感染可能なうどんこ病菌に対しても抵抗性を示す。このため、本発明のうどんこ病抵抗性メロン植物は、従来のような農薬による防除が不要であるため、例えば、前記農薬散布の労力および費用の問題も回避できる。

Claims (20)

  1. 第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする、メロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。
    条件(1)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
    前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
    プライマーセット1
    配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
    配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
    条件(2)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
  2. 前記条件(2)において、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列により特定される、請求項1記載のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。
  3. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項1または2記載のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。
    条件(3)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号4の塩基配列における50、141、および266番目の塩基の多型で特定される。
    条件(4)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目の塩基の多型で特定される。
  4. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項1から3のいずれか一項に記載のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。
    条件(5)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(a)のポリヌクレオチドで特定される。
    (a) 下記(a1)のポリヌクレオチド
    (a1)配列番号6の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(6)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(b)のポリヌクレオチドで特定される。
    (b) 下記(b1)のポリヌクレオチド
    (b1)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド
  5. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項1から4のいずれか一項に記載のメロン植物のうどんこ病抵抗性マーカー。
    条件(7)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(c)のポリヌクレオチドで特定される。
    (c) 下記(c1)のポリヌクレオチド
    (c1)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(8)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(d)のポリヌクレオチドで特定される。
    (d) 下記(d1)のポリヌクレオチド
    (d1)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド
  6. 第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含み、
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たすことを特徴とする、うどんこ病抵抗性メロン植物。
    条件(1)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
    前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
    プライマーセット1
    配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
    配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
    条件(2)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
  7. 前記条件(2)において、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列により特定される、請求項6記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
  8. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項6または7記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
    条件(3)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号4の塩基配列における50、141、および266番目の塩基の多型で特定される。
    条件(4)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目の塩基の多型で特定される。
  9. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項6から8のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
    条件(5)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(a)のポリヌクレオチドで特定される。
    (a) 下記(a1)のポリヌクレオチド
    (a1)配列番号6の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(6)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(b)のポリヌクレオチドで特定される。
    (b) 下記(b1)のポリヌクレオチド
    (b1)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド
  10. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項6から9のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
    条件(7)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(c)のポリヌクレオチドで特定される。
    (c) 下記(c1)のポリヌクレオチド
    (c1)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(8)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(d)のポリヌクレオチドで特定される。
    (d) 下記(d1)のポリヌクレオチド
    (d1)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド
  11. 前記うどんこ病抵抗性メロン植物が、受託番号FERM BP−22291で特定されるメロン植物またはその後代系統である、請求項6から10のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
  12. 前記うどんこ病抵抗性メロン植物が、植物体またはその部分である、請求項6から11のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
  13. 前記うどんこ病抵抗性メロン植物が、種子である、請求項6から12のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物。
  14. 下記(a)および(b)工程を含むことを特徴とする、うどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    (a)請求項6から13のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物と、他のメロン植物とを交雑する工程
    (b)前記(a)工程より得られたメロン植物またはその後代系統から、うどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程
  15. 前記(a)工程に先立って、下記(x)工程を含む、請求項14記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    (x)被検メロン植物から、請求項6から13のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物を選抜する工程
  16. 前記(x)工程における前記選抜が、第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座をホモ接合型で含むうどんこ病抵抗性メロン植物の選抜であり、
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(1)および(2)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項15記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    条件(1)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記プライマーセット1で増幅される増幅断片の長さで特定され、
    前記増幅断片の長さが、133塩基長以上である。
    プライマーセット1
    配列番号1の塩基配列からなるフォワードプライマー1
    配列番号2の塩基配列からなるリバースプライマー1
    条件(2)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における45、48、49、51、108、120、139、214、および327番目の塩基の多型で特定される。
  17. 前記条件(2)において、前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号3の塩基配列における204〜212および213番目の塩基配列により特定される、請求項16記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
  18. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(3)および(4)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項16または17記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    条件(3)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号4の塩基配列における50、141、および266番目の塩基の多型で特定される。
    条件(4)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、配列番号5の塩基配列における99、174、184、199、および200番目の塩基の多型で特定される。
  19. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(5)および(6)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項16から18のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    条件(5)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(a)のポリヌクレオチドで特定される。
    (a) 下記(a1)のポリヌクレオチド
    (a1)配列番号6の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(6)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(b)のポリヌクレオチドで特定される。
    (b) 下記(b1)のポリヌクレオチド
    (b1)配列番号3の塩基配列からなるポリヌクレオチド
  20. 前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記条件(7)および(8)の少なくとも一方の条件を満たす、請求項16から19のいずれか一項に記載のうどんこ病抵抗性メロン植物の製造方法。
    条件(7)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(c)のポリヌクレオチドで特定される。
    (c) 下記(c1)のポリヌクレオチド
    (c1)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    条件(8)
    前記第6染色体上のうどんこ病抵抗性遺伝子座が、下記(d)のポリヌクレオチドで特定される。
    (d) 下記(d1)のポリヌクレオチド
    (d1)配列番号5の塩基配列からなるポリヌクレオチド
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