CN112312762A - 甜瓜白粉病抗性的qtl - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传元件，其包含衍生自甜瓜种植物的赋予白粉病的QTL，或其赋予白粉病的部分或变体。本发明还涉及用于鉴定所述QTL的标志物，其用途以及生产对白粉病抗性增加的植物的方法，以及由此获得的植物。

Description

甜瓜白粉病抗性的QTL
发明背景
甜瓜是一年生、草本、开花植物物种，其早期被驯化，并且在非洲和亚洲国家已经栽培了数千年。目前它们在世界范围内栽培，并提供美味和高营养的果实。甜瓜通常在沙拉中新鲜食用，或制成甜品、开胃菜或饮品，其可与多种其他成分组合。
甜瓜种(species Cucumis melo)的甜瓜植物属于葫芦科，科学上称为葫芦科(Cucurbitaceae)。与重要的食物作物黄瓜(Cucumis sativus)一样，甜瓜(Cucumis melo)属于甜瓜属(genus Cucumis)。甜瓜种已经在分类学上进行了分类，例如使用厚皮甜瓜亚种(subspecies melo)和野甜瓜亚种(subspecies agrestis)的划分，其进一步分类为品种，其中基本上所有栽培的甜瓜都属于厚皮甜瓜亚种(ssp.melo)。
甜瓜是具有十二对染色体的二倍体植物物种。甜瓜种的甜瓜植物主要是自花授粉者，但异花授粉也经常发生。和大多数作物一样，商品甜瓜栽培品种最初是自由授粉的，但如今许多高产杂交品种是可用的。
在长期温暖的阳光季节的气候(相对干燥)中，甜瓜生产最为成功。甜瓜遍布世界各地生长。在露天场地以及在受保护的环境(例如温室)下进行栽培。由于基本上所有栽培的甜瓜都属于厚皮甜瓜亚种，因此不存在杂交障碍，并且不同类型的甜瓜之间的组合已经接受并且正在接受育种程序。
若干种害虫和疾病可以影响甜瓜的生产，包括若干种病毒性疾病、细菌性疾病和真菌性疾病。由病毒性感染引起的典型疾病包括由甜瓜坏死斑点病毒(Melon NecroticSpot Virus，MNSV)、西瓜花叶病毒(Watermelon Mosaic Virus，WMV)和葫芦黄色矮化失调病毒(Cucurbit Yellow Stunting Disorder Virus，CYSDV)的感染。由真菌性感染引起的典型疾病包括霜霉病、白粉病和蔓枯病(gummy stem blight)。
在以上提及的疾病中，白粉病(下文也称为“PM”)是甜瓜属(包括甜瓜(Cucumismelo))的主要真菌性疾病之一。在田间和温室中均观察到该病。
可以容易地鉴定白粉病，因为真菌性感染的症状很特别。被感染的植物在叶和茎上显示出白色粉状斑点。特别是下部叶片受到了影响，但霉可能会出现在暴露于地面之上的植物的任何部分。随着疾病的进展，由于大量孢子的形成，粉状斑点的尺寸增加并变得越来越厚。随着时间的流逝，霉在整个植物上蔓延，并可能感染茎甚至果实。受到严重影响的植物部分(特别是叶片)可能变得干燥和变脆，或可能枯萎和死亡。由于真菌性感染，通常观察到甜瓜果实的尺寸较小、数量较少、难以贮藏、日光灼伤、不完全成熟以及具有较差的风味。还已经提出白粉病可能使植物倾向于更易受到其他病原体的影响。最终，植物会死亡。
在有利的条件下，白粉病会迅速发展，因为在感染和出现症状之间的时间长度通常只有3至7天，并且可以在短时间内产生大量分生孢子(无性孢子)。有利的条件包括密集的植物生长和低光照强度。高相对湿度有利于感染和分生孢子存活，而干燥有利于定殖、孢子形成和扩散。当白天的温度是至少38摄氏度时，白粉病的发展会受阻。
杀真菌剂处理可用于防止甜瓜上白粉病的(进一步)发展。例如，硫是已被使用了数百年的处理。然而，为了获得适当的控制，在叶片的下表面和植物冠层中低的叶片上都需要杀真菌剂，因为真菌在这些表面上发展最好，并且通常需要每周喷雾程序。对流动性杀真菌剂一直的关注是杀真菌剂抗性的发展和随后的控制失败问题。实际上，已经发现了对此类杀真菌剂具有抗性(不敏感)的白粉病真菌菌株。
白粉病通常是由子囊菌纲(ascomycete)真菌的白粉菌目(order Erysiphales)的不同种引起的。已经鉴定了甜瓜上白粉病的两种致病物质(causal agent)：单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)(还被命名为Oidium erysiphoides；曾用名Sphaerothecafuliginea)和二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)(还被命名为Oidiumchrysanthemi；曾用名Erysiphe cichoracearum)。
已经描述了对白粉病显示抗性的甜瓜种植物。例如甜瓜(Cucumis melo L.)PI313970表现出对由Sphaerotheca fuliginea(Schlecht ex Fr.)Poll.race 2引发的白粉病的抗性。同样，PI 124111在温室中对race 2具有抗性(McCreight(2001)CucurbitGenetics Cooperative Report 24:22；McCreight等人(2011)HortScience 46(6):838-840)。同样Pitrat等人描述了甜瓜品系‘90625’对白粉病的可遗传抗性(Cucurbitaceae2008,Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding ofCucurbitaceae(Pitrat M,ed),INRA,Avignon(France),May 21-24th,2008,pp 135-142)。国际专利申请WO2012/116938公开了提供甜瓜属家族(Cucumis family)(并且尤其是甜瓜(Cucumis melo))基因的白粉病抗性，其中所述抗性通过损伤基因来提供。
如上已经讨论的，控制白粉病的杀真菌剂处理相当复杂并且对环境有负面影响，并且可能引起白粉病真菌发展对此类杀真菌剂的抗性(不敏感)。因此，并且考虑到甜瓜属植物物种(特别是甜瓜)的经济重要性，本领域中对于提供非化学替代物来克服甜瓜属植物物种中的白粉病存在持续需要，特别是本领域中对于白粉病抗性植物、遗传元件(包括赋予白粉病的QTL和用于鉴定所述QTL的标志物)、其用途以及用于生产对白粉病抗性增强的植物的方法存在持续需要。
鉴于本领域中的上述需求，本发明的目的之一尤其是满足该需求。因此，在提供用于满足任何以上提及的需求的此类产品、组合物、方法和用途中，可以看出本发明中潜在的技术问题。该技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案解决。
描述
附图简述
参考附图进一步在下文描述了本发明的实施方案，其中：
图1：叶圆片外观及抗性得分的说明图。
图2：基因型和表型之间的相关性(95％置信区)。
定义
本公开的一部分包含受版权保护的材料(例如但不限于图表、设备照片，或是在任何管辖范围都可获得或可能获得其版权保护的本提交的任何其他方面)。版权所有者不反对任何人拓制专利文件或专利公开内容(如专利局专利文件或记录中所显示的那样)，但在其他情况下保留其他所有版权。
贯穿整个说明书和权利要求书使用了与本发明的方法、组合物、用途和其他方面有关的各种术语。除非另外指出，否则此类术语应被给予其在本发明所属领域中的普通含义。其他具体定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式解释。尽管在实践中可以使用与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料用于测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。
出于本发明的目的，以下术语定义如下。
如本文所用，单数形式的“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，用于施用药物的方法包括施用多个分子(例如数10个、数100个、数1000个、数万个、数十万个、数百万个或更多个分子)。
如本文所用，术语“和/或”表示一种或多种所述情况可以单独发生或与至少一种所述情况组合发生，直至与全部所述情况组合发生为止。例如，措辞“QTL-VI和/或QTL-XII”表示“QTL-VI、QTL-XII或QTL-VI和QTL-XII的组合”。
如本文所用，“包括”及其变形以其非限制性意义使用，来表示包括该词之后的项目，但是不排除未特别提及的项目。它也包含了更具限制性的“由......组成”。
如本文所用，术语“构建体”或“核酸构建体”或“载体”是指由使用重组DNA技术产生的人造核酸分子，并且该核酸分子可以用于将外源DNA递送到宿主细胞中，通常目的是在宿主细胞中表达构建体上包含的DNA区域。载体主链可以是例如本领域已知的和如本文其他地方所描述的二元或超二元载体(参见例如US 5591616、US 2002138879和WO95/06722)、共整合载体或T-DNA载体，其中整合有嵌合基因，或如果已经存在合适的转录调节序列，则在转录调节序列的下游仅整合所需的核酸序列(例如编码序列、反义序列或反向重复序列)。构建体的载体主链可以例如是其中整合有(嵌合)基因的质粒，或如果已经存在合适的转录调节序列，则仅整合所需的核酸(例如编码部分)。载体可包含另外的遗传元件以促进其在分子克隆中的使用，例如选择性标志物、多克隆位点等。
取决于两个序列的长度，可以使用全局或局部比对算法，通过对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定“序列相同性”和“序列相似性”。优选使用全局比对算法(例如，Needleman Wunsch)对相似长度的序列进行比对，该全局比对算法在整个长度上最佳地对序列进行比对，而优选使用局部比对算法(例如，Smith Waterman)对基本上不同长度的序列进行比对。当序列(例如，通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对)共享至少某个最小百分比的序列相同性(如下所定义)时，那么这些序列可以被称为“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度(全长)上进行比对，从而使匹配数最大化并且使缺口数最小化。当两个序列具有相似的长度时，全局比对适用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，其中缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，并且缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所使用的默认得分矩阵为nwsgapdna，并且对于蛋白质，默认得分矩阵为Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,915-919)。针对序列相同性百分比的序列比对和得分可以通过以下来确定：使用计算机程序例如GCG Wisconsin Package,10.3版(可从Accelrys Inc.,9685ScrantonRoad,San Diego,CA 92121-3752USA购得)，或使用开源软件，例如程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)，EmbossWIN 2.10.0版，使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(针对'needle'和‘water’二者，并且针对蛋白质比对和DNA比对，默认缺口开放罚分为10.0，且默认缺口延伸罚分为0.5；默认得分矩阵为针对蛋白质的默认得分矩阵为Blossum62和针对DNA的默认得分矩阵为DNAFull)。当序列具有基本上不同的总长度时，优选局部比对(例如使用Smith Waterman算法的那些)。可替代地，可以通过使用诸如FASTA，BLAST等算法对公共数据库进行检索来确定相似性百分比或相同性百分比。因此，本发明的核酸序列和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”从而对公共数据库进行检索，例如鉴定其他家庭成员或相关序列。可以使用Altschul等人的BLASTn和BLASTx程序(2.0版)进行此类检索(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403—10)。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTx程序进行BLAST蛋白质检索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得缺口比对用于比较目的，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。参见位于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页。
如本文所用，术语“连锁群”是指位于相同染色体上的所有基因或遗传性状。在连锁群内，足够靠近在一起的那些基因座将在遗传杂交中表现出连锁。由于交叉的可能性随着染色体上基因之间的物理距离而增加，因此在连锁群内位置是彼此远离的基因在直接的遗传测试中可能不显示任何可检测的连锁。术语“连锁群”主要用于指在尚未进行染色体分配的遗传系统中表现出连锁行为的遗传基因座。
如本文所用，术语“分子标志物”或“标志物”是指定义特定遗传和染色体位置，即标记染色体上特定位置的指示物。本领域技术人员已知的熟知的实例包括扩增片段长度多态性(AFLP)标志物、限制性片段长度多态性(RFLP)标志物、单核苷酸多态性(SNP)、序列表征的扩增区域(SCAR)、裂解的扩增多态序列(CAPS))标志物或同工酶标志物或本文所述标志物的组合。如果分子标志物与QTL密切连锁(linked)，则其“标记”在DNA上发现QTL的DNA，并因此可以在(分子)标志物测定中使用，从而在例如标志物辅助的育种/选择(MAS)方法中选择QTL或针对QTL的存在进行选择。因此，“与QTL连锁的(分子)标志物”或“用于鉴定QTL的(分子)标志物”可以指例如SNP或本领域中使用的任何其他类型的标志物，并且这些标志物与QTL连锁。换言之，“用于鉴定导致对白粉病具有抗性的QTL的标志物”是指可以用于阳性鉴定与白粉病抗性相关的QTL的标志物。
如本文所用，术语“甜瓜”是指甜瓜种(species Cucumis melo L.)。可以将甜瓜(melon或muskmelon，Cucumis melo)分类为C.melo cantalupensis、C.melo inodorous和C.melo reticulatus。术语包括野生种质(accession)和栽培品种。甜瓜被一些人认为由亚种野甜瓜亚种(Cucumis melo subsp.agrestis)和厚皮甜瓜亚种(Cucumis melosubsp.melo))组成。甜瓜和甜瓜的野生近缘种是二倍体，并具有12对同源染色体，编号为1至12。“甜瓜染色体6”是指甜瓜(C.melo)染色体6(Argyis等人.BMC Genomics(2015)16:4)。
如本文所用的参考基因组是DHL92甜瓜品系(WGS v3.5.1，如描述于Jason MArgyris等人.Use of targeted SNP selection for an improved anchoring of themelon(Cucumis melo L.)scaffold genome assembly.BMC Genomics.2015Jan 22；16:4；http://www.icugi.org/organism/3)的公共假分子序列。
本文中甜瓜染色体6等价于LG VI或连锁群VI和假分子6。本文中甜瓜染色体12等价于LG XII或连锁群XII和假分子12。
如本文所用，“栽培品种”表示具有处于非“野生”状态的生物学状态的植物。“野生”状态指植物或种质的原始或天然状态。栽培品种的实例包括厚皮甜瓜亚种(Cucumismelo subsp.melo)栽培品种，其来自若干植物品种，例如Vedrantais(var.cantalupensis)、Piel de Sapo(var.inodorus)和Dulce(var.reticulatus)。因此，本发明的植物优选是如下植物品种的植物：Vedrantais(var.cantalupensis)、Piel deSapo(var.inodorus)和Dulce(var.reticulatus)。因此，“栽培品种”还表示通过结构或遗传特征可以与相同物种内的其他栽培品种区分开的一组相似的植物。本发明的植物优选不是野甜瓜品种(Cucumis melo var.agrestis)植物，优选不是甜瓜种质PI 313970。
术语“白粉病”以其在本领域中一般和熟知的含义在本文中使用。白粉病是由熟知的白粉病引发物质(causing agent)(例如单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)和/或二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum))引发的。如本文所用，本文所用上下文中的术语“有抗性”和“抗性”涵盖对感染，特别是对通过白粉病引发物质的感染具有部分和完全抗性。具体地，“抗性”是指在类似的环境条件和害虫或病原体压力下，当与易感植物比较时，植物限制特定害虫或病原体的生长和发展和/或它们造成的破坏的能力。在害虫或病原体的沉重压力下，抗性品种可能会表现出一些疾病症状。易感性是指植物无能力限制特定害虫或病原体的生长和发展。因此，术语“对白粉病有抗性”或“白粉病抗性”是指对通过白粉病引发物质(例如单囊壳白粉菌和/或二孢白粉菌)引发的感染具有部分或完全的抗性。可以使用生物测定(例如本文在实施例部分中详细描述的)来测试对白粉病的抗性的表型存在。对白粉病易感的甜瓜植物可以是非抗性的，或对通过所述白粉病引发物质的感染仅具有低水平的抗性。导致抗性或导致抗性增加的QTL或QTL的组合在本文中应被理解为与对照植物相比赋予测试植物PM抗性的QTL或QTL的组合，其中该对照植物优选与测试植物的不同之处仅在于其不携带所述QTL或所述QTL的组合，优选使用本文实施例部分中详述的生物测定进行定量，并且优选其中所述测试植物在抗性得分中的得分与对照植物相比低至少1、1.5、2、2.5、3、3.5或至少4个点。
如本文所用，术语“杂合的”是指这样的遗传状况，其中不同等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。如本文所用，术语“纯合的”是指这样的遗传状况，其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文所用，术语“基因渗入(introgression、introgressed和introgressing)”涉及这样的过程，其中一个物种、品种或栽培品种的基因移入另一个物种、品种或栽培品种的基因组中，这通过与那些物种杂交。该过程可以任选地包括与回归亲本的回交。
如本文所用，术语“标志物辅助选择(MAS)”是指如下过程，通过该过程筛选植物的一种或多种遗传标志物和/或表型标志物的存在和/或不存在，以加速将包含标志物(并且任选地缺少侧翼区)的DNA区域转移至(优良的)育种品系的过程。换言之，“MAS”是利用分子标志物的存在，从而选择植物中特定基因座或区域(基因渗入片段)的存在的过程，这些分子标志物与特定基因座或特定染色体区域(例如，基因渗入片段)是遗传连锁的。例如，与白粉病抗性QTL遗传连锁的分子标志物可用于检测和/或选择包含白粉病抗性QTL的甜瓜植物。
如本文所用，术语“分子标志物测定”(或测试)是指(直接或间接)指示植物或植物部分中感兴趣的等位基因(例如QTL)的存在或不存在的任何(基于DNA)测定。此类测试是本领域技术人员熟知的。
如本文所用，术语“核酸”是指嘧啶碱基和嘌呤碱基，优选分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger,Principles of Biochemistry,at 793-800(Worth Pub.1982)，出于全部目的将该文献通过引用以其整体并入本文中)。聚合物或寡聚物(多核苷酸或寡核苷酸)在组成上可以是异源或同源的，并且可以从天然存在的来源中分离出来，或可以是人工或合成产生的。核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且能以单链或双链形式(包括同源双链体、异源双链体和杂合态)永久地或暂时地存在。如本文所用，术语“分离的核酸”是指如下核酸，该核酸与天然伴随该核酸分子的其他细胞组分是基本上分开的。该术语包括已经从其天然存在的环境中移开的核酸(序列)，并且包括重组的或经克隆的核酸分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
如本文所用，术语“表型”是指生物体的可观察到的特征或性状，例如其形态学、发育、生化或生理特性、物候学、行为和行为产物。表型是由基因表达、基因表达的缺乏以及环境因素的影响以及两者之间的相互作用导致的。尽管表型是生物体显示的可观察到的特征的总体，但“表型组(phenome)”一词有时用于指性状的集合，并且它们的研究同时被称为表型组学(phenomics)。例如，一种表型是白粉病抗性，而另一种表型是白粉病易感性。
“启动子”是指起作用控制一个或多个核酸转录的核酸片段。启动子片段位于基因转录起始位点相对于转录方向的上游(5')，并通过DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、(一个或多个)转录起始位点的存在在结构上进行鉴定，并且可以进一步包含任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的、以直接或间接作用调节启动子的转录量的核苷酸的任何其他序列。任选地，术语“启动子”还可以包括5'UTR区(5'非翻译区)(例如，启动子在本文中可以包括转录区的翻译起始密码子上游的一或多个部分，因为该区域可以在调节转录和/或翻译中起作用)。“组成型”启动子是大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是在生理上(例如通过某些化合物的外部应用)或发育上受调节的启动子。“组织特异型”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
如本文所用，术语“数量性状基因座”或“QTL”以其被技术人员认可的含义使用。术语“(在甜瓜中)与白粉病抗性相关的QTL”或“当存在于甜瓜种植物的植物基因组中时，QTL导致对白粉病具有抗性”是指位于甜瓜种植物的特定染色体上、与至少一个赋予白粉病抗性的基因相关的区域，或至少控制一个或多个涉及白粉病抗性的基因表达的染色体的调节区。QTL可以例如包含一个或多个赋予产物抗性的基因。QTL还可例如包含一个或多个受损的基因，即突变的基因，所述基因的损伤引起对白粉病的抗性(即，如与例如野生型、赋予白粉病易感性的基因相比)。这种突变可以通过不同的机制导致损伤。例如，编码DNA序列的蛋白质中的突变可能导致突变的、截短的或非功能性蛋白质。非编码DNA序列中的突变可能导致可变剪接、翻译或蛋白质运输。可替代地，导致基因转录活性发生改变的突变可导致蛋白质水平低或不存在。可替代地，QTL可以包含调节基因或其产物影响基因组中其他基因座上基因表达的序列，从而赋予白粉病抗性。
如本文所用，“转移核酸”是指将例如包含在核酸构建体或载体中的经分离的核酸转移至生物体，通常转移至所述生物体的DNA(通常是染色体DNA或基因组)。
具体实施方式
预期关于本文所述的任何其他方法、用途或组合物，可以实施本文所述的任何方法、用途或组合物。关于本文所述的任何其他方法、用途或组合物，可以采用在本发明的方法、用途和/或组合物的上下文中讨论的实施方案。因此，与一种方法、用途或组合物有关的实施方案也可以应用于本发明的其他方法、用途和组合物。
如本文呈现和广泛描述的，本发明针对与甜瓜中白粉病抗性连锁的迄今未知的遗传区域的令人惊讶的鉴定。由本发明人鉴定的并且与白粉病抗性连锁的数量性状基因座(QTL)，换言之，赋予白粉病的数量性状基因座，在本文中被称为“QTL-VI”。鉴定QTL-VI在NCIMB以保藏号NCIMB 42991(保藏日期：2018年3月26日,保藏人:Vilmorin&Cie,4quai dela Megisserie,75001Paris,France)保藏的甜瓜植物代表性种子中的染色体6上(Argyris等人.BMC Genomics(2015)16:4),在可以使用如下文所述的对相标志物鉴定的位置之间(即，在由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQID NO:4界定的染色体区域内)。本发明人已经鉴定出迄今未知的分子标志物(例如SNP标志物)，这些标志物可用于鉴定QTL-VI，即可用于鉴定白粉病抗性QTL QTL-VI。
因此，本发明的一个方面是将QTL-VI鉴定为涉及白粉病抗性的QTL，即当存在于甜瓜种植物的基因组中时(优选当以纯合形式存在时)，导致白粉病抗性增加。另外的方面是发现(一种或多种)可以单独或组合用于鉴定QTL-VI的标志物。
除此之外，本发明人已经鉴定了与甜瓜中的白粉病抗性连锁的第二遗传区域。鉴定出的、并与白粉病抗性连锁的第二数量性状基因座(QTL)在本文中被称为“QTL-XII”。鉴定QTL-XII在NCIMB以保藏号NCIMB 42991保藏的甜瓜植物代表性种子中的染色体12上(Argyris等人.BMC Genomics(2015)16:4),在可以使用如下文所述的相应标志物鉴定的位置之间(即，在由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的染色体区域内)。本发明人已经鉴定出迄今未知的分子标志物(例如SNP标志物)，这些标志物可用于鉴定QTL-XII，即可用于鉴定第二白粉病抗性QTL QTL-XII。
因此，本发明的一个方面是将QTL-XII鉴定为涉及白粉病抗性的QTL，即当存在于甜瓜种植物的基因组中时(优选当以纯合形式存在时)，导致白粉病抗性。另外的方面是发现(一种或多种)可以单独或组合用于鉴定QTL-XII的标志物。
本发明的另外的方面是将QTL-VI和QTL-XII的组合鉴定为一起涉及白粉病抗性的QTL，即当存在于甜瓜种植物的基因组中时(优选当以纯合形式存在时)，导致白粉病抗性。另外的方面是发现(一种或多种)可以组合用于鉴定QTL-VI和QTL-XII两者的标志物。
本发明的这一方面和其他方面还在(一个或多个)所附实施例中进行了例证。
因此，在实施方案中，本发明涉及用于鉴定QTL-VI的标志物，其中所述QTL-VI当存在于甜瓜种植物的基因组中时导致对白粉病抗性增加，其中该标志物通过分子标志物测定是可检测的，并且该标志物选自：
-SEQ ID NO:1的位置23上的‘G’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,330,645bp；
-SEQ ID NO:2的位置23上的‘A’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置6,006,456bp；
-SEQ ID NO:3的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,414,506bp；和，
-SEQ ID NO:4的位置23上的‘C’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,738,920bp。
在发明人进行的实验过程中，并且在将染色体6上的QTL-VI鉴定为涉及白粉病抗性的QTL期间，特别是在甜瓜种植物中，基因分型导致对可用于鉴定QTL-VI的各种SNP标志物进行定位。
当这些标志物位于甜瓜的公共甜瓜基因组上时，基于DHL92甜瓜品系(参考基因组是DHL92甜瓜品系的公共假分子序列(Jason M Argyris等人，Use of targeted SNPselection for an improved anchoring of the melon(Cucumis melo L.),将其通过引用并入本文)scaffold genome assembly.BMC Genomics 2015 16:4.DOI:10.1186/s12864-014-1196-3))，在SEQ ID NO:1的位置23上的指示性标志物‘G’对应于物理位置5,330,645bp；在SEQ ID NO:2的位置23上的指示性标志物‘A’对应于公共甜瓜基因组的物理位置6,006,456bp；在SEQ ID NO:3的位置23上的指示性标志物‘T’对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,414,506bp；在SEQ ID NO:4的位置23上的指示性标志物‘C’对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,738,920bp；本领域技术人员将理解，QTL-VI的位置也可衍生自公共基因组序列，并且相对于所述物理位置。
SNP标志物由SEQ ID No 1-4代表，并显示中表1中。表1显示了QTL-VI(抗性的)的各种标志物。
表1：用于鉴定QTL-VI的标志物。
指示了SNP的物理位置以及在该位置与QTL-VI(抗性的)或非QTL-VI(敏感的)连锁的相应核苷酸。
标志物QTL-VI SNP<sup>1</sup>的物理位置 敏感的 抗性的
>Cm_477 5,330,645 A G
>Cm_473 6,006,456 G A
长度(bp) 675,811
>Cm_476 5,414,506 C T
>Cm_374 5,738,920 T C
长度(bp) 324,414
1参考基因组是DHL92甜瓜品系的公共假分子序列(Jason M Argyris等人.Use oftargeted SNP selection for an improved anchoring of the melon(Cucumis meloL.)scaffold genome assembly.BMC Genomics 2015 16:4.DOI:10.1186/s12864-014-1196-3)。
在表1中还指示了在不包含QTL-VI的甜瓜种植物中存在于相同位置处的核苷酸，并且如在所附实施例中所使用的。如本领域技术人员将理解的，这些标志物(敏感的)可用于鉴定不包含QTL-VI的甜瓜种植物。SNP标志物由SEQ ID No 9-12代表。
关于可以用于鉴定QTL-VI的标志物，其中当存在于甜瓜种植物的基因组中时，所述QTL-VI导致对白粉病具有抗性，并且由SEQ ID No 1-4代表：
在SEQ ID NO:1的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,330,645bp，存在G，即G指示QTL-VI的存在。
在SEQ ID NO:2的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置6,006,456bp，存在A，即A指示QTL-VI的存在。
在SEQ ID NO:3的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,414,506bp，存在T，即T指示QTL-VI的存在。
在SEQ ID NO:4的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,738,920bp，存在C，即C指示QTL-VI的存在。
如本领域技术人员将理解的，例如，如本文所述，一种或多种上述鉴定的标志物可用于鉴定QTL-VI。因此，在一个实施方案中，用于鉴定QTL-VI的(一个或多个)标志物是以下各项中的一个或多个(由以下各项代表的标志物)：在SEQ ID NO:1的位置23上的‘G’；在SEQID NO:2的位置23上的‘A’；在SEQ ID NO:3的位置23上的‘T’和在SEQ ID NO:4的位置23上的‘C’。同样，本发明还预期了用于鉴定不存在QTL-VI的标志物，这些标志物是以下各项中的一个或多个(由以下各项代表的标志物)：在SEQ ID NO:1的位置23上的‘C’、‘T’或‘A’，优选‘A’；在SEQ ID NO:2的位置23上的‘C、‘T’或‘G’,优选‘G’；在SEQ ID NO:3的位置23上的‘C’、‘A’或‘G’,优选‘C’；在SEQ ID NO:4的位置23上的‘T’、‘A’或‘G’,优选‘T’。
如本文所述，所指示的标志物不仅与植物中特定表型性状的存在相关，它们还指示QTL-VI的位置。通常，QTL的位置可以由表现出与表型性状统计相关的一连串标志物来指示。一旦在该串之外找到标志物，就设置了QTL的边界。因此，还可以通过位于该指定区域内的其他标志物来指示QTL的位置。换言之，QTL-VI的位置对应于由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2界定，优选由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4界定的染色体区域。在表1中，还指示了由所述SEQ ID NO界定的长度(bp)。
根据本发明的标志物优选是可通过分子标志物测定检测的标志物。分子标志物测定是技术人员熟知的，并且包括例如基于RFLP、SSR、SNP和AFLP的测定。
如本领域技术人员将理解的，标志物可以具有适合用于鉴定本文公开的标志物并由此鉴定QTL-VI的分子标志物测定所允许的任何长度。在本发明的实施方案中，用于鉴定QTL-VI的标志物包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。
在由发明人进行的实验的过程中，鉴定了第二QTL(指定为QTL-XII)。所述QTL-XII,位于染色体12上由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内(优选在由SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:7界定的染色体区域内)，当与QTL-VI一起存在于甜瓜种植物的基因组中时，导致对白粉病具有抗性。而且，如与包含QTL-VI但缺少QTL-XII的对照植物相比，在包含QTL-VI的植物中QTL-XII的存在导致对白粉病具有增加的抗性。
同样在此，进一步的基因分型导致对可用于鉴定QTL-XII的各种SNP标志物进行定位。因此，在实施方案中，本发明涉及用于鉴定QTL-XII的标志物，其中所述QTL-XII当与QTL-VI一起存在于甜瓜种植物的基因组中时导致对白粉病具有抗性，其中该标志物通过分子标志物测定是可检测的，并且该标志物选自：
-SEQ ID NO:5的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,675,877bp；
-SEQ ID NO:6的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,923,842bp；
-SEQ ID NO:7的位置23上的‘C’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,781,889bp；和，
-SEQ ID NO:8的位置23上的‘G’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,788,588bp。
当这些标志物位于如上所述甜瓜的公共甜瓜基因组上时，在SEQ ID NO:5的位置23上的指示性标志物‘T’对应于物理位置22,675,877bp；在SEQ ID NO:6的位置23上的指示性标志物‘T’，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,923,842bp；在SEQ ID NO:7的位置23上的指示性标志物‘C’，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,781,889bp；以及在SEQ IDNO:8的位置23上的指示性标志物‘G’，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,788,588bp。技术人员将理解，QTL-XII的位置也可衍生自公共基因组序列，并且相对于所述物理位置。
SNP标志物由SEQ ID No 5-8代表，并显示在表2中。表2显示了QTL-XII(抗性的)的各种标志物。
表2：用于鉴定QTL-XII的标志物。
在本发明的上下文中，指示了SNP的物理位置以及在该位置处与QTL-XII(抗性的)或非QTL-XII(敏感的)连锁的相应核苷酸。
Figure GDA0002850457200000141
Figure GDA0002850457200000151
1参考基因组是DHL92甜瓜品系的公共假分子序列(Jason M Argyris等人.Use oftargeted SNP selection for an improved anchoring of the melon(Cucumis meloL.)scaffold genome assembly.BMC Genomics 2015 16:4.DOI:10.1186/s12864-014-1196-3)。
在表2中还指示了在不包含QTL-XII的甜瓜种植物中存在于相同位置处的核苷酸，并且如在所附实施例中所使用的。如本领域技术人员将理解的，这些标志物(敏感的)可用于鉴定不包含QTL-XII的甜瓜种植物。SNP标志物由SEQ ID NO:13-16代表。
关于可以用于鉴定QTL-XII的标志物，其中所述QTL-XII当与QTL-VI一起存在于甜瓜种植物的基因组中时导致对白粉病具有抗性，并且由SEQ ID No 5-8代表。
在SEQ ID NO:5的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,675,877bp，存在T，即T指示QTL-XII的存在。
在SEQ ID NO:6的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,923,842bp，存在T，即T指示QTL-XII的存在。
在SEQ ID NO:7的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,781,889bp，存在C，即C指示QTL-XII的存在。
在SEQ ID NO:8的位置23上，对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,788,588bp，存在G，即G指示QTL-XII的存在。
如本领域技术人员将理解的，例如，如本文所述，一种或多种以上鉴定的标志物可用于鉴定QTL-XII。因此，在一个实施方案中，用于鉴定QTL-XII的(一个或多个)标志物是以下各项中的一个或多个(由以下各项代表的标志物)：在SEQ ID NO:5的位置23上的‘T’；在SEQ ID NO:6的位置23上的‘T’；在SEQ ID NO:7的位置23上的‘C’和在SEQ ID NO:8的位置23上的‘G’。同样，本发明还预期了用于鉴定不存在QTL-XII的标志物，这些标志物是以下各项中的一个或多个(由以下各项代表的标志物)：在SEQ ID NO:5的位置23上的‘C’、‘G’或‘A’，优选‘G’；在SEQ ID NO:6的位置23上的‘C’、‘A’或‘G’,优选‘C’；在SEQ ID NO:7的位置23上的G’、‘A’或‘T’，优选‘A’；在SEQ ID NO:8的位置23上的‘T’、‘A’或‘C’,优选‘A’。
如本文所述，所指示的QTL-XII的标志物不仅与植物中特定表型性状的存在相关，特别是当QTL-VI包含在甜瓜种的相同植物的基因组中时(优选以纯合形式)，它们还指示了QTL-XII的位置。如本领域技术人员将理解的，还可能通过位于该指定区域内的其他标志物来指示QTL的位置。换言之，QTL-XII的位置对应于由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6界定(优选由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8界定)的染色体区域。在表2中，还指示了由所述SEQ ID NO界定的长度(bp)。
如本领域技术人员将理解的，针对QTL-XII的标志物可以具有适合用于鉴定本文公开的标志物并由此鉴定QTL-XII的分子标志物测定所允许的任何长度。在本发明的实施方案中，用于鉴定QTL-VI的标志物包含选自以下的序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8.。
在优选的实施方案中，本发明涉及一个或多个如本文所述的用于鉴定QTL-VI的标志物和一个或多个如本文所述的用于鉴定QTL-XII的标志物。本发明还涉及与一个或多个如本文所述的用于鉴定QTL-XII的标志物组合的一个或多个如本文所述的用于鉴定QTL-VI的标志物。
如上所指示，染色体6上的QTL-VI的位置在由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的染色体区域内，如包含在NCIMB以保藏号NCIMB 42991保藏的甜瓜植物代表性种子中。因此，甜瓜种质NCIMB 42991代表本发明的QTL的天然遗传背景。
本发明的QTL-VI的核酸序列可以通过本领域技术人员已知的方法来确定。例如，可以从供体植物中分离包含QTL-VI或其赋予抗性的部分或变体的核酸序列。例如，这可以将所述植物的基因组片段化，并选择包含一个或多个指示QTL-VI的标志物(例如包含由SEQID NO:1-4中任一个代表的标志物，或其至少两个的组合)的片段来完成。例如，由SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2，或SED NO 3和4代表的标志物。标志物序列还可以用作扩增引物以扩增包含QTL-VI的核酸序列。然后可以将经扩增的序列进行纯化以获得分离的QTL-VI或其部分或变体。然后可以通过本领域技术人员熟知的标准测序方法获得QTL-VI的核苷酸序列。
因此，在本发明的实施方案中提供了包含导致白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体的(分离的)核酸(或构建体)，如包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的区域内。
换言之，还提供了分离的核酸或包含这种核酸的载体或构建体，其包含本发明的QTL-VI或其赋予白粉病抗性的部分或变体。因此，如本文所述针对QTL-VI的标志物可以用于对一个或多个包含在QTL-VI中并赋予白粉病抗性的基因进行鉴定和分离。
如上所指示，染色体12上的QTL-XII的位置在由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的染色体区域内，如包含在NCIMB以保藏号NCIMB 42991保藏的甜瓜植物代表性种子中。因此，甜瓜种质NCIMB 42991代表QTL(包括本发明的QTL-XII)的天然遗传背景。
可以按如上所述针对QTL-VI的类似方式测定本发明的QTL-XII的核酸序列。
因此，在本发明的实施方案中提供了包含导致白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体的(分离的)核酸(或构建体)(当存在于进一步包含优选处于纯合形式的QTL-VII的植物中时)，如包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内。
换言之，还提供了分离的核酸或包含这种核酸的载体或构建体，其酸包含本发明的QTL-XII或其赋予白粉病抗性的部分或变体。因此，如本文所述针对QTL-XII的标志物可以用于对包含在QTL-XII中并赋予白粉病抗性的一个或多个基因(特别是与QTL-VI组合)或包含在QTL-VI中并赋予白粉病抗性的一个或多个基因进行鉴定和分离。
QTL-VI的部分或变体在本文中被理解为能够赋予基本上与QTL-VI达到相同程度的白粉病抗性的部分或变体，其中所述部分或变体优选包含与QTL-VI具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。类似地，QTL-XII的部分或变体在本文中被理解为能够赋予基本上与QTL-VI达到相同程度的白粉病抗性的部分或变体，其中所述部分或变体优选包含与QTL-XII具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的序列。
任选地，本发明的核酸、载体或构建体可以是非天然存在的，例如包含自然中非可操作地连接的序列。例如，这种核酸、载体或构建体可以是用于检测的包含至少一个如本文所定义的标志物的探针，和非天然存在的引物结合序列和/或辅助检测的用于条形编码或索引的序列。该核酸、载体或构建体还可以用于表达，并包含与非天然启动子(即，通常未与所述QTL可操作地连接的启动子序列)可操作地连接的，用于赋予白粉病抗性的一个或多个如本文所定义的QTL-VI或其部分或变体，和/或用于赋予白粉病抗性的如本文所定义的QTL-XII或其部分或变体。任选地，所述构建体包含如本文所定义的用于赋予白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体，和如本文所定义的用于赋予白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体。
所述启动子优选是适合于在植物细胞(优选在甜瓜种植物中)表达的启动子。用于在植物细胞中表达的启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。优选地，启动子是组成型启动子。
如上所说明，如本文所述的用于鉴定QTL-VI的标志物特别有用于鉴定甜瓜种植物的基因组中QTL-VI的存在。因此，本发明的实施方案涉及如本文所述的QTL-VI的标志物用于鉴定甜瓜种植物的基因组中的QTL-VI的用途。
如上所说明，如本文所述的用于鉴定QTL-XII的标志物特别有用于鉴定甜瓜种植物的基因组中QTL-XII的存在。因此，本发明的实施方案涉及如本文所述的QTL-XII的标志物用于鉴定在甜瓜种植物的基因组中的QTL-XII的用途。
如本领域技术人员将理解的，本文中针对QTL-VI和/或QTL-XII鉴定的标志物可用于指示QTL-VI和/或QTL-XII的存在(并因此指示相关的白粉病抗性表型的存在)。本文针对QTL-VI和QTL-XII鉴定的标志物的组合可用于指示QTL-VI和QTL-XII的组合的存在。这可以在单个植物中或在许多植物中完成，并照此它们可以用于标志物辅助选择(MAS)程序，例如，在育种程序中旨在提供对白粉病抗性具有增加抗性的甜瓜种植物。
可以预期，与QTL连锁的任何标志物(例如落在QTL的各个标志物之间的基因组区域的界限内)可以用于标志物辅助选择。因为用于建立白粉病感染的可靠且可再现的表型测定是耗时的，因此与本文鉴定的QTL连锁的标志物的使用在针对甜瓜种植物的白粉病抗性的育种中是所希望的。如本领域技术人员将理解的，可以使用已知方法(包括使用如本文所述的标志物)来进行标志物辅助选择。
因此，本发明的一个实施方案涉及选择抗白粉病的植物(优选甜瓜种植物)的方法，其中该方法包括检测如文本所述针对QTL-VI的至少一个标记的存在，并且任选地进一步包括检测针如本文所述针对QTL-XII的至少一种标志物的存在。优选地，所选择的是包含处于纯合形式的QTL-VI的植物，任选地与以杂合或纯合形式存在的QTL-XII组合。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于选择具有增加的白粉病抗性的植物(优选甜瓜种植物)，其中该方法包括检测至少一种如本文所述针对QTL-XII的标志物的存在。选择可以针对包含处于杂合或纯合形式的QTL-XII的植物。包含QTL-XII的植物的增加的白粉病抗性在本文中被理解为与不携带QTL-XII的对照植物相比，在生物测定中得分低至少1、1.5、2、2.5或3个点，其中优选所述植物和对照植物均包含如本文所定义的QTL-VI。
本发明的另一个实施方案涉及生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中该方法包括向植物中引入QTL-VI，该QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的区域内；任选地该方法与向植物引入QTL-XII组合，该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内。
本发明的另一个实施方案涉及生产具有白粉病抗性增加的植物的方法，其中该方法包括向植物中引入QTL-XII，该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8界定的染色体区域内。
将QTL-VI和/或QTL-XII，或包含QTL-VI和/或QTL-XII的分离的核酸，或其赋予白粉病抗性的部分或变体引入另一植物(优选是甜瓜种植物，甚至更优选是易受白粉病感染的甜瓜种植物)可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。在一个实施方案中，通过基因渗入(杂交)，通过引入QTL-VI和/或QTL-XII或其赋予白粉病抗性的部分或变体来产生抗白粉病的植物(优选甜瓜种植物)。可以通过使甜瓜种质NCIMB 42991的植物，或包含如本文详述的QTL-VI和/或QTL-XII或其部分或变体或其赋予白粉病抗性的部分或变体的甜瓜种的任何其他植物，与白粉病易感植物(优选与不包含QTL-VI和/或QTL-XII或其赋予白粉病抗性的部分或变体的甜瓜种植物)杂交来进行基因渗入。本领域技术人员充分了解根据本文所述的本发明的合适的杂交/基因渗入方法。例如，在一些实施方案中，可以将来自初始杂交的所得植物种群(代表F1种群)进行自花授粉并使其结实(F2种子)。然后可以针对白粉病抗性、和/或QTL-VI和/或QTL-XII或用于鉴定如本文所述的QTL-VI和/或QTL-XII的标志物的存在，对由F2种子生长的F2植物进行筛选。因此在子代(例如F1或F2，或后代)中QTL-VI和/或QTL-XII的存在可以通过检测所述子代的基因组中与QTL-VI和/或QTL-XII连锁的标志物(优选如本文公开的标志物)的存在来确认。
本发明的实施方案涉及生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中该方法包括向植物(优选易受白粉病感染的甜瓜种植物)中转移包含导致白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体的(分离的)核酸(或构建体)，该QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4界定的区域内，其中所述转移任选地通过转化、原生质体融合、双单倍体技术或胚胎拯救进行。优选地，该方法导致QTL-VI以纯合形式存在。
该方法还涵盖单独的或与前述提及的实施方案组合的用于生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中该方法包括向植物(优选易受白粉病感染的甜瓜种植物)中转移包含导致白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体的(分离的)核酸(或构建体)，该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内，其中所述转移任选地通过转化、原生质体融合、双单倍体技术或胚胎拯救进行。优选地，该方法导致QTL-XII以杂合或纯合形式存在。该方法可以进一步包括向植物中转移如本文详述的QTL-VI(优选处于纯合形式)。
该方法还涵盖生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中该方法包括向植物(优选易受白粉病感染的甜瓜种植物)转移(分离的)核酸(或构建体)，其包含导致白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体和导致白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体，其中QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的区域内，并且其中QTL-XII包含在NCIMB42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内，其中所述转移任选地通过转化、原生质体融合、双单倍体技术或胚胎拯救进行。优选地，该方法导致QTL-VI以纯合形式的存在和QTL-XII以杂合或纯合形式的存在。
如本文所述，QTL-VI和QTL-XII首次在甜瓜种质NCIMB 42991中识别出，但本领域技术人员将认识到包含QTL-VI和/或QTL-XII或其赋予白粉病抗性的部分或变体，并且如使用本文所述的标志物可以鉴定的任何其他甜瓜种植物，可以用于分离核酸和/或制备构建体，其包含导致白粉病抗性的QTL-VI和/或QTL-XII或其部分或变体。一旦分离，可以通过本领域技术人员可用的任何方法将QTL-VI和/或QTL-XII或其赋予白粉病抗性的部分或变体转移至适合的植物或生物体中。优选地，所述植物易受白粉病感染，优选是甜瓜种植物。
然而，重要的是注意，在一些实施方案中，涉及使用遗传方式(即，不涉及杂交)进行的如上所述的基因渗入和/或涉及包含导致白粉病抗性的QTL-VI和/或QTL-XII或其部分或变体的(分离的)核酸(或构建体)的转移，受体植物可以是已经包含与白粉病抗性相关的其他基因或QTL的植物。在此类实施方案中，与白粉病抗性连锁的若干个独立性或相互依赖性的遗传区域组合在同一植物中，以便于增加对白粉病感染的抗性。
如所提及的，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将包含导致白粉病抗性的QTL-VI和/或QTL-XII或其部分或变体的分离的核酸转移至甜瓜植物中。此类方法的非限制性实例包括转化和原生质体融合。然而，可以使用任何其他合适的核酸转移系统。在一些实施方案中，在选择包含QTL-VI和/或QTL-XII或其赋予白粉病的部分或变体的后代植物之后进行转移。可以使用植物细胞进行转移。对于一些方法，可以例如通过载体、配子或以任何其他合适的转移元件的方式将分离的核酸转移至受体植物。用于将表达载体引入植物中的一个熟知的方法是基于农杆菌(Agrobacterium)的转化系统(参见例如Horsch等人,1985)。
还提供了包含基因渗入其基因组QTL-VI中的抗白粉病的甜瓜植物，该QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定(优选由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定)的染色体区域内。优选地，所述植物是栽培品种，更优选地是厚皮甜瓜亚种(Cucumis melo subsp.melo)栽培品种，其来自若干植物品种，例如Vedrantais(var.cantalupensis)、Piel de Sapo(var.inodorus)和Dulce(var.reticulatus)。
还提供了以上所述的抗白粉病的甜瓜植物，其中该植物进一步包含基因渗入其基因组的QTL-XII，该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6界定(优选由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定)的染色体区域内。因此本发明还提供了抗白粉病的甜瓜种植物，其中该植物包含基因渗入其基因组中的QTL-VI和QTL-XII，该QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQID NO:2界定(优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定)的染色体区域内，并且该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定(优选由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定)的染色体区域内。优选地，所述植物是栽培品种，更优选地是厚皮甜瓜亚种(Cucumis melo subsp.melo)栽培品种，其来自若干植物品种，例如Vedrantais(var.cantalupensis)、Piel de Sapo(var.inodorus)和Dulce(var.reticulatus)。
还提供了抗白粉病的甜瓜植物，该植物包含基因渗入其基因组的QTL-XII，该QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定(优选由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定)的染色体区域内。优选地，所述植物是栽培品种，更优选地是厚皮甜瓜亚种(Cucumis melo subsp.melo)栽培品种，其来自若干植物品种，例如Vedrantais(var.cantalupensis)、Piel de Sapo(var.inodorus)和Dulce(var.reticulatus)。
最后，提供了如本文所述的标志物、如本文所述的(分离的)核酸、如本文所述的用途、或如本文所述的方法或植物，其中该白粉病致病物质是真菌单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)，特别地其中该白粉病致病物质是真菌单囊壳白粉菌小种(race)3.5(Sf3.5)(M.Pitrat and D.Besombes.Inheritance of Podosphaera xanthiiresistance in melon line‘90625’.Cucurbitaceae 2008,Proceedings of the IXthEUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae(Pitrat M,ed),INRA,Avignon(France),May 21-24th,2008:135-142)，甚至更特别地Sf3.5A或Sf3.5B。
考虑到本发明的植物的益处，即在甜瓜植物中提供白粉病抗性，本发明还涉及能够提供本发明的抗白粉病的甜瓜植物的种子、植物部分或繁殖材料，这些种子、植物部分或繁殖材料包含如本文所述的一个或多个本发明的白粉病抗性QTL或其部分。本发明还涉及来衍生自本发明的抗白粉病的甜瓜植物、种子或植物部分的非繁殖材料(即饮料、果汁、蛋白质、糖等)。优选地，所述繁殖材料和/或非繁殖材料的特征在于，其包含本文所定义的QTL-VI和/或QTL-XII，或其赋予白粉病抗性的部分或变体。任选地，所述繁殖材料和/或非繁殖材料的特征在于，其包含含有如本文定义的QTL-VI和/或QTL-XII的非天然存在的序列。
本发明还涉及本发明的植物(其包含QTL-VI、QTL-XII或QTL-VI和QTL-XII的组合)作为繁殖材料的来源的用途。本发明还涉及本发明植物(其包含QTL-VI、QTL-XII或QTL-VI和QTL-XII的组合)在植物育种中的用途。
本发明还涉及所要求保护的植物的细胞。这样的细胞包含或提供有导致对白粉病具有抗性的遗传信息(QTL-VI和/或QTL-XII，或其赋予白粉病的(一个或多个)部分)。本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的子代。
将理解的是，关于本发明实施方案的一个方面所讨论的所有细节、实施方案和偏好同样适用于本发明的任何其他方面或实施方案，并因此不需要针对所有方面分开详述所有这些细节、实施方案和偏好。
现在已经大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是通过举例说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。
实施例
实施例
Sf3.5A和Sf3.5B繁殖
将8-10日龄的甜瓜Vedrantais的经分离的子叶用于Sf3.5A或Sf3.5B繁殖。10天后，将这些经接种的子叶用于接种。
对白粉病的抗性进行表型分型(Sf3.5A和Sf3.5B)
将待测试的种子播种在装有草皮的塑料托盘中，并使其在温室中生长直至3叶阶段。随后，使用经接种的甜瓜Vedrantais的子叶，通过将装有待测植物的塑料托盘放在洁净室的地板上，并轻轻吹动Sf3.5A或Sf3.5B接种的甜瓜Vedrantais的子叶的孢子，对这些植株进行接种(在顶部装有空气压缩机)。孢子的浓度在100至400个孢子/cm2之间。随后，将装有植株的塑料托盘放入20℃的气候室内，12h光照持续10至12天。在10至12天的孵育期后，对植物进行抗性的表型分型。对于表型分型，从植物的最幼小的叶片中按一个叶圆片/植物进行取样。根据表1对抗性评分。图1举例说明了分别被记录为抗性得分3、4、6和8的叶圆片。
表1：对抗性得分的观察和解释。
Figure GDA0002850457200000241
白粉病抗性(Sf3.5A和Sf3.5B)基因渗入的表型分型的抗性得分
对衍生自所选择的RIL(重组自交系，以NCIMB 42991保藏)的F3植物的白粉病抗性进行表型分型。对于两个菌株Sf3.5(Sf3.5A和Sf3.5B)，在两次增殖中对白粉病抗性进行评分。在第一个增殖中，测试了2649株F3植物的Sf3.5A抗性，并测试了2654株F3植物的Sf3.5B抗性。在第二次增殖中，测试了1952株F3植物的Sf3.5A抗性，并测试了1961株F3植物的Sf3.5B抗性。这些植物的基因分型在表型分型的当天进行，使用由针对QTL-VI的SEQ IDNO:3和4和针对QTL-XII的SEQ ID NO:7和8代表的标志物，其中这些标志物的存在鉴定了衍生自NCIMB 42991的这些QTL的抗性等位基因的存在。表2给出了每种经组合的QTL基因型类中的观察数。
表2：每种经组合的QTL基因型类中的观察数(A易感甜瓜株Vedrantais的QTL-VI或QTL-XII是纯合的；B抗性甜瓜株NCIMB 42991的QTL-VI或QTL-XII是纯合的；H易感甜瓜株Vedrantais和抗性甜瓜株NCIMB 42991的QTL-VI或QTL-XII是杂合的)。
Figure GDA0002850457200000251
对于基因型和表型之间的相关性(LOD-drop 2，Baysian置信区间和Bootstrap置信区间)确定95％置信区。与经评分的Sf3.5B抗性相关的基因型BA、AB、BB和BH的结果(根据表2第一个字母与QTL-VI的基因型有关，根据表2第二个字母与QTL-XII的基因型有关)呈现在图2中。基因型HB导致的易感表型与基因型AB相当(数据未显示)。对于Sf3.5A的抗性获得了相似的结果(数据未显示)。
在已经完全描述了本发明的情况下，本领域技术人员将理解，可以在相当宽的等价参数、浓度和条件范围内进行本发明，而不背离本发明的精神和范围，并且无需过多的实验。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明能够做出进一步的修改。本申请旨在覆盖总体上遵循发明的原理并包括相对于本公开有偏差在本发明所属领域内为已知或惯用实践方式的任何本发明的变化、使用或修改，且可以在如下所附权利要求书的范围内应用于这里提出的实质性特征。
本文引用的所有参考文献(包括期刊文章或摘要，已公布的或相应的专利申请、专利或任何其他参考文献)，均通过引用整体并入本文中(包括在所引用参考文献中呈现的所有数据、表、图和文本)。另外，在本文引用的参考文献中所引用的参考文献的全部内容也通过引用整体并入。对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用不以任何方式承认在相关领域中公开、教导或建议了本发明的任何方面、描述或实施方案。
具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识(包括本文引用的参考文献的内容)来容易地修改和/或改适于各种应用，此类具体的实施方案，无需过多的实验，而不会脱离本发明的一般构思。因此，基于本文呈现的教导和指导，这样的改适和修改旨在落入与所公开的实施方案等价的含义和范围内。应当理解，本文中的措词或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据本文给出的教导和指导结合本领域普通技术人员的知识来解释。
序列表
<110> 主基因有限公司
<120> 甜瓜白粉病抗性的QTL
<130> P6069739PCT
<150> EP18165317.1
<151> 2018-03-30
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<400> 1
aaataccaga caagatatca tcgccatgat tggccttcct tctgc 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> Cucumis melo
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<210> 4
<211> 45
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<213> Cucumis melo
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<213> Cucumis melo
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Cucumis melo
<400> 10
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<213> Cucumis melo
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<213> Cucumis melo
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tgaagttact tcgagtgtgt atatctatga actgttcaat gagga 45
PCT/RO/134表
Figure 0000011

Claims (18)

1.一种用于鉴定QTL-VI的标志物，其中所述QTL-VI当存在于甜瓜种(species Cucumismelo)植物的基因组中时，导致对白粉病具有抗性，其中所述标志物选自：
-SEQ ID NO:1的位置23上的‘G’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,330,645bp；
-SEQ ID NO:2的位置23上的‘A’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置6,006,456bp；
-SEQ ID NO:3的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,414,506bp；和，
-SEQ ID NO:4的位置23上的‘C’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置5,738,920bp。
2.根据权利要求1所述的标志物，其中所述标志物包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
3.一种用于鉴定QTL-XII的标志物，其中所述QTL-XII当与QTL-VI一起存在于甜瓜种植物的基因组中时，导致对白粉病具有抗性，其中所述标志物选自：
-SEQ ID NO:5的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,675,877bp；
-SEQ ID NO:6的位置23上的‘T’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,923,842bp；
-SEQ ID NO:7的位置23上的‘C’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,781,889bp；和，
-SEQ ID NO:8的位置23上的‘G’，其对应于公共甜瓜基因组的物理位置22,788,588bp。
4.根据权利要求3所述的标志物，其中所述标志物包含选自以下的序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
5.根据权利要求1或2所述的标志物与根据权利要求3或4所述的标志物的组合。
6.一种核酸或构建体，其包含导致白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体，所述QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的区域内。
7.一种核酸或构建体，其包含导致白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体，所述QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内。
8.一种核酸或构建体，其包含导致白粉病抗性的QTL-VI或其部分或变体和导致白粉病抗性的QTL-XII或其部分或变体，所述QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4界定的区域内，并且所述QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内。
9.根据权利要求1或2所述的标志物用于鉴定甜瓜种植物的基因组中的QTL-VI的用途。
10.根据权利要求3或4所述的标志物用于鉴定甜瓜种植物的基因组中的QTL-XII的用途。
11.根据权利要求1或2所述的标志物与根据权利要求3或4所述的标志物的组合用于鉴定甜瓜种植物的基因组中的QTL-VI和QTL-XII的组合的用途。
12.一种用于选择抗白粉病植物的方法，其中所述方法包括检测根据权利要求1或2所述的至少一种标志物的存在，并且任选地进一步包括检测根据权利要求3或4所述的至少一种标志物的存在。
13.一种生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中所述方法包括向植物中基因渗入QTL-VI，所述QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQID NO:2界定的染色体区域内，优选在由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的区域内。
14.一种生产抗白粉病的甜瓜种植物的方法，其中所述方法包括向植物中转移根据权利要求6所述的核酸，其中所述转移任选地通过转化或原生质体融合进行。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述植物中基因渗入或转移QTL-XII或根据权利要求7所述的核酸，所述QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的位于染色体12上的由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选在由SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8界定的区域内。
16.一种抗白粉病的甜瓜(Cucumis melo)植物，其包含基因渗入其基因组中的QTL-VI，所述QTL-VI包含在NCIMB 42991的基因组的染色体6上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2界定的染色体区域内，优选由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4界定的染色体区域内，其中优选所述植物是栽培品种。
17.根据权利要求16所述的抗白粉病的甜瓜植物，其中所述植物进一步包含基因渗入其基因组中的QTL-XII，所述QTL-XII包含在NCIMB 42991的基因组的染色体12上的由SEQID NO:5和SEQ ID NO:6界定的染色体区域内，优选由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8界定的染色体区域内。
18.一种根据权利要求1-4中任一项所述的标志物、根据权利要求5所述的标志物的组合、根据权利要求6-8中任一项所述的核酸、根据权利要求9-11中任一项所述的用途、根据权利要求12-15中任一项所述的方法、或根据权利要求16或17所述的植物，其中白粉病致病物质是真菌单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)。
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